用于治疗骨相关病症的硬化蛋白结合配偶体调节剂的制作方法

专利名称：用于治疗骨相关病症的硬化蛋白结合配偶体调节剂的制作方法
用于治疗骨相关病症的硬化蛋白结合配偶体调节剂
背景技术：
骨质疏松症(OP)是系统性骨骼病症，其特征是骨量低以及骨组织的微 结构退变，随之出现骨脆性升高并且容易发生骨折。据估计50岁龄的妇女 在其绝经后有50。/。的机会发生骨质疏松性骨折。骨质疏松综合症是多方面 的，包括原发性病症，如绝经后或年龄相关性OP，以及伴随疾病状态或药 物治疗的继发性状况。低骨矿物质密度(BMD)对于OP来说是最重要的危 险因素。它是在青春期由于骨获取峰值减弱或随着年龄增长骨流失而发生 的。
骨再吸收加速或骨形成受损可以导致骨流失，这两种过程通常是在成 年期伴随发生的。由于雌激素缺乏和骨再吸收加速导致快速骨流失是OP 最常见的原因，但是所有早期绝经后妇女中仅有约四分之一的人有高度骨 周转骨质疏^^症。因而骨质疏松症主要是由遗传因素引发的。若干连锁分 析已经鉴定出与骨周转增强或骨量低相关的基因，但是显而易见没有单个 基因缺陷会导致，例如该疾病最常见的形式——绝经后OP(Ralston SH.(2003)Curr. Opin. Pharmacol. 3(3):286)。
目前在主要市场骨质疏松症的患者为50，900，000人，预计到2010升 至55,800,000人，到2015升至61,500,000人。由于人口的老龄化，有稳 定的增长。
目前对于OP治疗的大多数疗法是基于抑制骨再吸收以防止进一步的 骨流失。对此的原因是骨再吸收(降解)细胞-破骨细胞-是骨特异性的 高度特异化细胞，并且已经鉴定了其募集和激活的关键机制。破骨细胞是 造血源的细胞并且由骨髓中的干细胞发育而来；成熟的功能性破骨细胞是 多核细胞，并且位于这些特异化细胞能够再吸收的矿化骨表面上。
8新的骨基质是由成骨细胞形成的，其起源自间叶细胞系。这些骨形成
细胞具有三种推定的最终命运:它们进行凋亡(细胞死亡)，变成衬细胞(在 矿化骨表面上的扁平细胞)，或者被捕获至骨基质中。被捕获的末期分化 细胞称为骨细胞，它是最丰富的骨细胞。它们以规则的间隔被包埋在矿化 骨基质内，并且通过称作树突的长细胞结构彼此相互联系，所述树突与相 邻的骨细胞和在表面上的骨细胞通过缝隙连接相偶联。它们据认为是骨造 型和再造的关键调节物，尽管根本的分子机制尚未充分了解。
尽管骨质疏松症由于骨量减少而被定义为骨折危险升高，但是目前已 有的骨骨病症治疗还没有能够实质上增加成人骨密度的。目前的骨质疏松 性治疗原则反而是抗再吸收的，能够将新脊推骨折危险减少大约35到
60%(Haeuselmann HJ， Rizzoli R(2003)Osteoporos. Int.; 14:2; Chesnut CH， III，等(2004). J Bone Min Res; 19(8))。髋骨骨折危险只是通过一种抗再吸 收治疗原则来减小，导致骨折危险减小大约50%。能够提高成人骨密度、 特别是处于骨量减少和骨质疏松症危险的腕骨，脊柱和髋骨中提高成人骨 密度的药物代表了在该领域长期未得到满足的需求。因此，由于许多OP 患者在诊断时已经有相当量的骨流失，需要开发这样的试剂，其通过刺激 新的骨形成来增加骨量，并且其应该能够减少骨折危险超过50%。
相反，有多种骨骼病症与骨过度生长和骨矿物质密度(BMD)异常高相 关联，其中骨形成和沉积超过了再吸收，潜在性地导致骨量和强度病理性 地提高。例如，硬化性狭窄一种隐性性状病症，即使是在杂合的携带者中 其也显示了骨量提高。同样地，患有Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS) 的患者通常具有宽、矮的外形，其特征是面部骨骼增大(例如，导致颚部 突出和鼻梁增大)。类似的，VanBuchem病是一种常染色体隐性性状疾 病，其特征是骨骼过度生长。这种疾病的特征为骨骼的厚度对称性提高， 最常见的是颚骨增大，还有头骨、肋骨、长骨骨干，以及手和足部的管状 骨增大，导致骨皮质密度提高。头骨厚度增加的临床后果包括面部神经瘫 痪，引发听力丧失、视力问题、神经痛，以及非常罕见地，作为视神经萎 缩的后果引发失明。本发明旨在提供与骨矿物质密度(BMD)异常相关病症的组合物，治疗 方法，和i貪断方法。
发明概述
本发明提供了治疗、改善骨矿物质密度异常病症和/或硬化蛋白 (sclerostin)相关病症的症状，以及保护免受该病的方法，包4舌施用包含 硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节剂的组合物，所述调节剂为例如硬化 蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用的调节剂。所述调节剂可以包括针对(i) 硬化蛋白；(ii)硬化蛋白结合配偶体;(iii)由硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相 互作用生成的新位点(例如，新生成的表位决定簇)，或(iv)包含任何上述物 质的蛋白质复合体的抗体、抗体样支架、小分子、嵌合或融合蛋白、肽、 模拟物、或抑制性核苷酸(例如，RNAi)。所述组合物包括本文所定义的"药 物组合物"。"硬化蛋白相关病症，""骨矿物质密度异常病症"和"硬化蛋白结 合配偶体"是本文进一步定义的术语。
作为非限制性实例，本发明提供通过施用硬化蛋白ALPL、硬化蛋 白Frem2或硬化蛋白LRP4相互作用的调节剂来治疗硬化蛋白相关病症 (例如，骨质疏;卜>症或硬化性狭窄)和/或骨矿物质密度异常病症的方法。
本发明进一步提供鉴定能够调节硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互 作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂《1起的硬化蛋白与硬化蛋 白结合配偶体相互作用的变化。优选地所述方法包括以下步骤a)在允许硬 化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条件下，在测试剂存在和缺失的 情况下，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相接触；和b)在所述测试剂存 在和缺失的情况下，测量硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的相互作用，其 中(i)相对于测试剂缺失情况下的相互作用，在测试剂存在情况下硬化蛋白: 硬化蛋白结合配偶体相互作用的减小，将测试剂鉴定为硬化蛋白:硬化蛋白 结合配偶体相互作用的拮抗剂；并且其中:(ii)相对于测试剂缺失情况下的相 互作用，在测试剂存在情况下相互作用的增加，将测试剂鉴定为硬化蛋白 硬化蛋白结合配偶体相互作用的激动剂。作为非限制性实例，本发明提供鉴定能够调节硬化蛋白:LRP4相互作 用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合LRP4 的变化。在一个实施方案中，该测试剂直接或间接地结合LRP4并由此调节 硬化蛋白LRP4相互作用。在一个实施方案中，该测试剂为小分子。在另 一个实施方案中，该测试剂为抑制性核苷酸。在又一个实施方案中，该测试 剂为包含LRP4蛋白的融合蛋白。
硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用、硬化蛋白或硬化蛋白结合配 偶体蛋白质活性,和/或硬化蛋白途径活性的变化可以通过PCR, T叫man PCR，噬菌体展示系统，凝胶电泳，酵母双杂交测定，报告基因测试，RNA 印迹分析或蛋白质印迹分析，免疫组织化学，传统闪烁相机，y相机，线 性扫描器，PET扫描器，SPECT扫描器，MRI扫描器，NMR扫描器，或X 射线机来测量。硬化蛋白、硬化蛋白结合配偶体蛋白质活性，和/或硬化蛋白 途径活性的改变可以通过检测硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体之间相互作 用变化，通过检测硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的表达或蛋白质水平的 变化，通过检测石更化蛋白途径中 一种或多种蛋白质的表达或蛋白质水平的 变化，优选地通过检测Wnt信号途径的变化来测量。上述可以检测的细胞 可以是骨、间充质、肾(例如，HEK)，或造血组织起源的，可以是培养的细 胞，或者可以获自转基因生物或可以在转基因生物内。这种转基因生物包 括，但不限于小鼠、大鼠、兔、绵羊、奶牛或灵长类动物。
本发明还提供鉴定能够调节硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用 的试剂的方法，该方法包括测量在所述试剂存在时由硬化蛋白:硬化蛋白结 合配偶体相互作用诱导的信号反应，并且将它与在所述试剂缺失情况下由
硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号反应相比较。优选地， 所述方法包括以下步骤a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作 用的条件下，在测试剂存在和缺失的情况下，将硬化蛋白与硬化蛋白结合 配偶体相接触；和b)测量由硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的 信号或酶学反应，其中在测试剂存在时的反应与测试剂缺失时的反应相比 有至少10%， 20%或30%的变化表明该测试剂能够调节硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用。优选地，在步骤b)中测量的信号反应是Wnt信号反应。
在测试剂存在时的信号反应与测试剂缺失时的反应相比有至少10%, 20%或30%的提高表明该测试剂为硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作 用的激动剂。在测试剂存在时的信号反应与测试剂缺失时的反应相比有至 少10%, 20%或30%的降低表明该测试剂为硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体 相互作用的拮抗剂。
作为非限制性实例，本发明提供鉴定能够调节硬化蛋白丄RP4相互作 用的试剂的方法，该方法包括测量在所述试剂存在时由硬化蛋白LRP4相 互作用诱导的信号反应，并且将它与在所述试剂缺失时由硬化蛋白LRP4 相互作用诱导的信号反应相比较。在一个实施方案中，该测试剂直接或间 接地结合LRP4并由此调节硬化蛋白LRP4相互作用。在一个实施方案中， 该测试剂为小分子。在另一个实施方案中，该测试剂为抑制性核苷酸。
另外，本发明提供了组合物，其包括根据上述方法鉴定的能够调节硬 化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用的试剂。所述组合物包括本文所定义 的"药物组合物"。
优选的能够调节硬化蛋白结合配偶体的试剂是特异性结合所述硬化蛋 白结合配偶体的抗体或抗体样支架，或是包含所述抗体或所述抗体样支架 的抗原结合部分的功能性蛋白质。
本发明还提供在受试者中诊断硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度 异常病症，或硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症的倾向的方法，
其包括以下步骤:(a)测量所述受试者中的硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相 互作用，和(b)将步骤(a)中的相互作用与健康个体的硬化蛋白:硬化蛋白结合 配偶体相互作用相比较，差异提示在所述受试者中有硬化蛋白相关病症或倾向。
作为非限制性实例，本发明提供了在受试者中诊断骨质疏松症或硬化 性狭窄或其倾向的方法，包括(a)在所述受试者中测量硬化蛋白LRP4结合, 和(b)将步骤(a)中的结合与健康个体(即，没有患或倾向患硬化性狭窄的人)的硬化蛋白LRP4结合相比较，差异提示在所述受试者中有骨质疏松症或 硬化性狭窄或其倾向。
本发明提供鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟物与硬 化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用具有相同、类似或改进的功能效 应，其中该方法包括测量候选模拟物与硬化蛋白的相互作用。优选地，所 述方法包括:(a)在允许模拟物与硬化蛋白相互作用的条件下将硬化蛋白与 候选模拟物相接触;和(b)测量模拟物与硬化蛋白的相互作用，其中对于本文 所述各种硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体所观察到的相互作用的至少10%， 20%或30%的相互作用即表明该候选模拟物为本发明的硬化蛋白结合配 偶体的模拟物。
另外，本发明提供鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟 物与硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用具有相同、类似或改进的 功能效应，其中该方法包括测量由硬化蛋白模拟物相互作用诱导的信号反 应并且将它与由本文所述的硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导 的信号反应相比较。优选地，所述方法包括:(a)在允许模拟物与硬化蛋白相 互作用的条件下将硬化蛋白与候选模拟物相接触;和(b)测量由硬化蛋白模 拟物相互作用诱导的信号反应，其中对于本文所述各种硬化蛋白:硬化蛋白 结合配偶体相互作用所观察到的信号反应的至少10%， 20%或30%的信号 反应即表明该候选模拟物为本发明的硬化蛋白结合配偶体的模拟物。
作为非限制性实例，本发明提供鉴定LRP4模拟物的方法，所述LRP4 模拟物在正常生理条件下与LRP4和硬化蛋白之间相互作用具有相同、类 似或改进的功能效应。所述模拟物可以通过采用本文所述的方法进行鉴定。
本发明进一步提供能够调节蛋白质表达，例如，在哺乳动物细胞中降 低硬化蛋白结合配偶体蛋白质表达的siRNA。
另夕卜，本发明提供包含根据上述方法鉴定的硬化蛋白结合配偶体模拟 物的组合物。所述组合物包括本文所定义的"药物组合物"。
本发明提供治疗、改善硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症 的症状，以及保护免受该病的方法，包括施用包含硬化蛋白结合配偶体模拟物的组合物，该才莫拟物与硬化蛋白结合配偶体和本文所述的硬化蛋白的 相互作用具有相同、类似或改进的功能效应。通过本文所述的方法(以及 本文进一步的细节)可以容易地鉴定所述模拟物。在某些实施方案中，所 述模拟物可以是针对所述硬化蛋白结合配偶体的抗体或抗体样支架或其片
段(例如，抗LRP4抗体或片段)。
此外本发明提供在受试者中诊断硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密 度异常病症或倾向的方法，其包括以下步骤:(a)获取在所述受试者中的硬化 蛋白结合配偶体基因的核苷M列，和(b)将它与健康个体的序列相比较，
'石更4匕蛋白结合酉己4禺体基因中的穸变差印 骨矿物质密度异常病症或其倾向
法。作为非限制性实例，本发明包括调节硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体 之间相互作用，以《更调节硬化蛋白途径活性，或调节硬化蛋白或硬化蛋白结 合配偶体蛋白质水平的方法。
天然序列。另外，本发明的方法和组合物包括本文所详述的硬化蛋白或任 何硬化蛋白结合配偶体的衍生物和剪接变体。即使是在采用部分或片段时， 这些部分或片段也可以具有改变的氨基酸序列。
本发明进一步提供包含硬化蛋白结合配偶体片段的可溶性多肽，其中 所述可溶性多肽特异性结合硬化蛋白结合配偶体，例如LRP4，或硬化蛋 白。在一个实施方案中，所述可溶性多肽由LRP4的细胞外部分组成，优选 地该多肽由SEQ ID NO 3组成(LRP4 aa 21-1763)。
本发明还提供抗体或抗体样支架，或包含所述抗体或所述抗体样支架 的抗原结合部分的功能性蛋白质，其中所述抗体或抗体样支架或功能性蛋 白质特异性结合硬化蛋白结合配偶体。在一个实施方案中，所述抗体或抗 体样支架或功能性蛋白质抑制硬化蛋白与所述硬化蛋白结合配偶体的结 合。在另一个实施方案中，如在基于细胞的测试中测量到的，所述抗体或 抗体样支架或功能性蛋白质调节Wnt信号途径。在一个相关实施方案中，所述抗体或抗体样支架或功能性蛋白质特异性结合LRP4或ALPL。 附图简述


图1显示抗LRP4 siRNAs，以及它们击倒(knockdown ) LRP4 mRNA
的能力。
图2显示LRP4 mRNA击倒减弱了硬化蛋白在HEK293细胞中抑制 supertopflash(STF)活性的能力。
图3显示在LRP4 mRNA击倒后的硬化蛋白剂量反应研究。
图4a显示LRP4过表达对在Hek293细胞中Wntl-谦导的 supertopflash(STF)-Luc的影响；图4b显示LRP4过表达对硬化蛋白和 Dkkl对于在Hek293细胞中Wntl-诱导的supertopflash(STF)-Luc的作 用的影响；图4c显示LRP4和LRP5过表达对>5更化蛋白和Dkkl对于在 Hek293细胞中Wntl-诱导的s叩ertopflash(STF)-Luc的作用的影响；图 4d显示LRP4和LRP6过表达对硬化蛋白和Dkkl对于在Hek293细胞中 Wntl-诱导的supertopflash(STF)-Luc的作用的影响。
图5a显示LRP4过表达对在C28a2细胞中Wntl-诱导的 supertopflash(STF)-Luc的影响；图5b显示LRP4过表达对硬化蛋白和 Dkkl对于在C28a2细胞中Wntl-诱导的supertopflash(STF)-Luc的作用 的影响。
图6显示硬化蛋白对在MC3T3细胞中GSK3P抑制剂诱导的碱性磷酸
酶活性的影响。
图7显示硬化蛋白对在基于无细胞测试中的碱性磷酸酶活性的影响。 发明详述
在本说明书中，术语"治疗"包括治疗性或预防性治疗以及治愈性或疾 病抑制性治疗，包括易感疾病(例如，易感硬化蛋白相关病症和/或骨矿物 质密度异常病症)的患者以及患病患者的治疗。此术语进一步包括对疾病 进程的延緩治疗。本文所用的"硬化蛋白结合配偶体"包括，但不限于下列蛋白质:多功 能蛋白聚糖(CSPG2)、 FREM2、肌原纤蛋白2(FBN2)、 C6orf93、多配体 蛋白聚糖-4(Sdc4)、聚集蛋白(AGRN)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)、 LRP2、 LRP4、 LRP6、 SLIT2、生腱蛋白C、 TRIM26、 TRIM41、磷脂 酰肌醇蛋白聚糖l、碱性磷酸酶(ALPL)和IL-17受体。在一个实施方案中， LRP4和ALPL分别指具有SEQ ID NO:l和2的相应人LRP4和ALPL。
"硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用"意指本文所定义的硬化蛋 白和硬化蛋白结合配偶体之间的直接或间接的相互作用。相互作用的非限 制性例子包括直接的物理结合和间接的空间抑制。
本文所用的"硬化蛋白相关病症"包括这样的病症，其中骨矿物质密 度(BMD)相对于健康受试者异常和/或病理性地高，以及这样的病症，其中 骨矿物质密度(BMD)相对于健康受试者异常和/或病理性地低。以高BMD 为特征的病症包括但不限于硬化性狭窄，Van Buchem病、骨骼过度生长 病、和Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS)。以低BMD和/或骨脆性为 特征的病症包括但不限于原发和继发性的骨质疏松症、骨量减少、骨软化 症、成骨不全(OI)、无血管性坏死(骨坏死)、骨折和植入物愈合(牙齿植入 物和髋骨植入物)、由于其它病症造成的骨流失(例如，与HIV感染，癌症， 或关节炎相关联的)。其它的"硬化蛋白相关病症"包括但不限于类风湿性 关节炎、骨关节炎、关节炎、和溶骨性病变的形成和/或出现。
本文所用的"硬化蛋白相关病症"包括由硬化蛋白介导的或与硬化蛋 白水平异常相关的或其特征为硬化蛋白水平异常的病症。这些病症包括癌 症和骨质疏松性病症(例如，骨质疏松症或骨量减少)，其中一些与本文所 定义的"硬化蛋白相关病症"相重叠。硬化蛋白相关癌症可以包括骨髓瘤(例 如，伴随着溶骨性病变的多发性骨髓瘤)，乳腺癌，结肠癌，黑素瘤，肝细胞 癌，上皮癌，食管癌，脑癌，肺癌，前列腺癌，或胰腺癌，以及其任何转移 灶。
"硬化蛋白相关病症，，还可以包括肾和心血管病症，其至少是由在肾和 心血管中的硬化蛋白表达所引起的。所述病症包括但不限于肾脏病症，诸如肾小球病(例如，急性和慢性肾小球肾炎，急进性肾小球肾炎，肾病综合 征，局灶增生性肾小球肾炎，与系统性疾病相关的肾小球损伤，如系统性红 斑狼疮，古德帕斯丘综合征，多发性骨髓瘤，糖尿病，多囊肾病，瘤形成， 镰状细胞病，和'隄性炎性疾病)，管性疾病(例如，急性肾小管坏死和急性肾 功能衰竭，多嚢肾病，髓质海绵肾，髓质嚢性病，肾原性糖尿病,和肾小管性 酸中毒)，小管间质性疾病(例如，肾盂肾炎，药物和毒素诱导的小管间质性 肾炎，高钙血症肾病，和低钾血症性肾病)，急进性肾衰竭，慢性肾衰竭，肾 石病，痛风，脉管疾病(例如，高血压和肾硬化，孩t血管病性溶血性贫血，粥 样硬化栓塞性肾病，弥漫性皮层坏死，和肾梗死)，或肿瘤(例如，肾细胞癌和 肾胚细胞瘤)。
所述病症还包括但不限于心血管病症，诸如缺血性心脏病(例如，心绞 痛，心力几梗塞，和'隄性缺血性心脏病)，高血压性心脏病，肺原性心脏病，心 脏瓣膜疾病(例如，风湿热和风湿性心脏病，心内膜炎，二尖瓣脱垂，和主动 脉瓣狭窄)，先天性心脏病(例如，脉管和脉管闭塞性损伤，心房或心室间隔 缺损，和动脉导管未闭)，或心肌病(例如，心肌炎，充血性心肌病，和肥厚性心 肌病)。
本文所用的"治愈"意指通过治疗导致病症，例如，硬化蛋白相关病症和 /或骨矿物质密度异常病症的减轻，或进行性发作的减轻。
术语"预防"或"防止"意指阻抗硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质密 度异常病症，例如，骨质疏松症，硬化性狭窄，或癌症的发病或复发。
本文所用的"调节"表示直接或间接控制或影响的能力，并且作为非 限制性实例，可以备选地意指抑制或刺激，激动或拮抗，阻碍或促进，以 及强化或弱化。
本文所用的"小有机分子，，或"小分子，，是有机化合物(或与无机化合物
(例如，金属)相络合的有机化合物)，其具有小于3千道尔顿的分子量， 优选小于1.5千道尔顿。
本文所用的"报告"基因可与术语"标记基因"相互交换使用，并且是易 于检测和/或编码易于检测的基因产物如萤光素酶的核酸。转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子，增强子，终止子， 等等，其提供编码序列在宿主细胞中的表达。在真核细胞中，多聚腺苷化信 号是控制序列。
"启动子序列，，是在细胞中能够结合RNA聚合酶并且启动下游(3，方 向)编码序列的转录的DNA调控区。为了定义本发明，将启动子序列在其 3，末端被转录起始位点结合并向上游(5，方向)延伸以包括最小数目的碱基 或元件，所述碱基或元件是在背景之上以可检测的水平起始转录所必需的。 在启动子序列内将会发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1作图来方 便地定义)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。
当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列是在细胞中转 录和翻译控制序列"控制下"的，其随后进行tRNA的剪切并翻译成由编码 序列编码的蛋白质。
用语"可药用的，，是指在向人给药时，在生理学上可耐受的并且通常不 会产生不希望的反应，如心嘈，头晕等等的分子实体以及组合物。优选地， 本文所用的术语"可药用的"意指联邦或州政府的监管机构所批准的或者在 美国药典或其它 一般公认的药典中的所列举适用于动物，更特别是适用于 人。
术语"载体"是指与所述化合物一起施用的稀释剂、佐剂，赋形剂或载 体。这类药物载体可以是无菌液体，如水和和油类，包括石油、动物、植 物或合成来源的油类，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选采 用水或水性盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液作为载体，特别是对于注射性 溶液。合适的药物载体在由E. W. Martin所著"Remington's Pharmaceutical Sciences"中有描述。
用语"治疗有效量"和"有效量，，在这里用来指足够使宿主的活性、功能 和反应的临床上显著缺陷降低至少约15%，优选地至少50%,更优选地至 少卯％，最优选地完全阻止所述缺陷的量。备选地，治疗有效量足以引起 宿主中临床上显著病情/症状的改善。
根据本发明，"试剂"指所有可以用来制备药物或诊断组合物的物质，
18或者可以是化合物，核酸(包括抑制性核酸如shRNA、 RNAi，等等)、抗 体、抗体样支架、小分子、多肽、片段、同种型、变体，或可以独立用于这 些目的的其它物质。
"衍生物"指包含亲本蛋白质或多肽的氨基酸序列的化合物、蛋白质或 多肽，所述氨基酸序列已经通过导入氨基酸残基取代、缺失或添加而进行
失，添加或突变而进行修饰。衍生的核酸，核苷酸,蛋白质或多肽与亲本多 肽具有类似或相同的功能。
"抑制剂"或"拮抗剂"指硬化蛋白和/或硬化蛋白结合配偶体活性，或相 关蛋白质或途径(例如，BMP， Wnt,等等)的活性的抑制性分子，包括利用 本文所述的硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体筛选方法鉴定的那些。抑制剂和 拮抗剂可以是通过一种途径来减小、阻抑，或阻止信号传递和/或阻止蛋白 质相互作用和复合体形成的试剂。
根据本发明，"模拟物"包括，但不限于多肽，肽，脂类，碳水化合物， 核苷酸，小有机分子，和抗体或其抗原结合片段。模拟物可以用来反映(提高) 目标蛋白质，肽，或多肽(例如，硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体)的活性，以 便于例如，复制、激动，或加强硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用的作 用。
候选模拟物可以是天然或合成的化合物，包括，例如，合成性小分子， 包含在动物、植物、细菌或真菌细胞中的化合物，以及用于这些细胞的条 件培养基。模拟物化合物可以利用下面描述的方法来确定。模拟物可以基 于主题蛋白质，肽，多肽的关键残基的知识来生成，其可以模仿正常多肽 功能。模拟物在其设计后可以具有与多肽，肽，或蛋白质相同、类似或提高 的功能效应。
本文所用的术语"双链RNA"或"dsRNA"指核糖核酸分子复合体，具 有双螺旋结构，其包含如上所定义的两个反向平行并且基本上互补的核酸 链。形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或 者它们可以是分离的RNA分子。对于分离的RNA分子来说，这样的siRNA在文献中通常被称作siRNA("短千扰RNA")。当两条链是一个较大 分子的部分，并因此在形成双链体结构的一条链的3'端与另一条链的5，端 之间通过核苷酸连续链连接时，连接RNA链被称作"发夹环"，"短发夹 RNA，"或"shRNA"。当在形成双链体结构的一条链的3，端与另一条链的5， 端之间通过核苷酸连续链之外的方式共价连接时，连接结构被称作"连接 体"。RNA链可以具有相同或不同的核苷酸数目。碱基对的最大数目是 siRNA中最短链中的核苷酸数目减去双链体中存在的任何突出端。除了双 链体结构以外，siRNA可以包含一个或多个核苷酸突出端。此外，本说明书 中所用的"siRNA，，可以包括对核糖核苷酸所进行的化学修饰，包括在多个 核苷酸上的实质性修饰，并且包括本文所公开的或本领域已知的所有类型 的修饰。为了本说明书和权利要求书的目的，当用于siRNA型分子时，任 何这种修饰都被"siRNA"所包括。
本文所用的"核苷酸突出端"指未配对的核苷酸，当siRNA的一条链的 3'端延伸超过另一条链的5，链时，所述核苷酸从siRNA的双链体结构中突 出出来，或者反之亦然。"平的"或"平末端"意指在siRNA的该末端没有 未配对的核苷酸，即，没有核苷酸突出端。"平末端的"siRNA是这样的 siRNA,在其全长上都是双链的，即，在分子任一末端上都没有核苷酸突出 端。为了清楚，在确定siRNA是否具有突出端或是平末端时，未考虑缀合 到siRNA的3'末端或5，末端上的化学帽或非核苷酸化学部分。
术语"反义链"指siRNA的链，其包括与耙序列基本上互补的区域。本 文所用的术语"互补区"指在反义链上这样的区，其与一种序列，例如，本 文所定义的靶序列基本互补。当互补区与耙序列并不完全互补时，错配大 多在末端区被容许，并且，如果存在的话， 一般是在末端区，例如，在5， 和/或3'末端的6， 5， 4， 3，或2个核苷酸内。
本文所用的术语"有义链，，指siRNA的链，其包括与反义链的区基本 上互补的区。
"导入细胞中"，当用在siRNA上时，如本领域技术人员所理解的，意 指促进向细胞内的才聂取或吸收。siRNA的吸收或4聂取可以通过独立扩散或主动细胞过程，或通过辅助试剂或装置而发生。这一术语的意义并不限于
体外细胞；siRNA还可以"导入细胞中"，其中该细胞是活体生物的部分。 在这种情况下，导入细胞中将包括向生物的递送。例如，对于体内递送来 说，可以将siRNA注射入组织部位中或全身施用。体外导入细胞中的方法 包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂转染。
在本文中术语"沉默"和"抑制其表达"就它们指SOST基因(即，编码硬 化蛋白的基因)，编码硬化蛋白结合配偶体的基因(例如，编码多功能蛋白 聚糖(CSPG2)， FREM2，肌原纤蛋白2(FBN2)， C6orf93，多配体聚糖 -4(Sdc4)，聚集蛋白(AGRN),丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1), LRP2， LRP4， LRP6, SLIT2，生腱蛋白C， TRIM26, TRIM41，磷脂酰肌醇蛋白聚 糖1，碱性磷酸酶(ALPL)和IL-17受体的基因)，或任何参与硬化蛋白，BMP, 或Wnt信号途径的基因而言，这里指所述基因的表达的至少部分抑制，如 通过由所述基因转录的mRNA量减少显示，所述mRNA可以分离自第一 种细胞或细胞群，其中所述基因转录并且已经进行了处理从而使所述基因 的表达与第二种细胞或细胞群相比受到抑制，所述第二种细胞或细胞群与 第一种细胞或细胞群基本相同但是其未进行过如此处理(对照细胞)。抑 制的程度通常按照
(对照细胞中的mRNA)-(经处理细胞中的mRNA) !画 (对照细胞中的mRNA) 0
或者，抑制的程度可以通过一种参数减小的方式来给出，所述参数与
SOST基因、编码硬化蛋白结合配偶体的基因、或任何参与硬化蛋白，BMP, 或Wnt信号途径转录的基因功能连接，例如细胞分泌的由所述基因编码的 蛋白质的量，或展现某一表型的细胞的数目。理论上，可以通过任何合适 的测定法测定组成型表达或通过基因组工程表达靶标的细胞中SOST基 因、编码硬化蛋白结合配偶体的基因、或任何参与硬化蛋白、BMP或Wnt 信号途径的基因的沉默。不过，当需要参照以便测定给定siRNA是否在一 定程度上抑制SOST基因，编码硬化蛋白结合配偶体的基因，或任何参与 硬化蛋白，BMP,或Wnt信号途径的基因的表达，并因此被本发明所包括 时，下面实施例中所提供的测定法将作为这种参照。例如，在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸抑制SOST基 因、编码硬化蛋白结合配偶体的基因、或任何参与硬化蛋白，BMP，或Wnt 信号途径的基因的表达至少大约20%, 25%， 35%，或50%。在某些实施方 案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸至少抑制所述基因大约60%, 70%, 或80%。在某些实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸至少抑制所 述基因大约85%, 90%，或95%。
术语"结合"指一种组分(例如，硬化蛋白)与另一种组分(例如，硬化蛋 白结合配偶体)的物理结合。测量结合可以得到数值如解离常数，结合常数， 结合率或解离率。
本文所用的术语"允许结合的条件"指例如，温度，盐浓度，pH和蛋 白质浓度的条件，在这种条件下将出现结合。精确的结合条件将取决于测 定的性质，例如，测定是否使用纯蛋白或仅仅是部分纯化的蛋白质。结合 温度可以从15。C到37X:变化，但是优选地将介于室温和大约30。C之间。 在结合反应中硬化蛋白的浓度也将变化，但是将优选地为大约10 pM到 10 nM(例如，在利用放射性标记组分的反应中)。
本文所用的术语结合是"特异性的"，如果它以lmM或更小的Kd发 生的话， 一般是100nM到10pM。例如，如果Kd为100 nM， 50 nM， 10 nM， lnM， 950 pM, 900 pM, 850 pM, 800 pM， 750 pM, 700 pM， 650 pM， 600 pM, 550 pM, 500 pM, 450 pM, 350 pM， 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM， 100 pM， 75 pM， 50 pM， 25 pM， 10 pM或更小，则结合是特异性的。
本发明涉及硬化蛋白的蛋白质结合剂的发现(本文称作"硬化蛋白结合 配偶体")。当结合到(或者是与其相互作用)所述硬化蛋白结合配偶体上 时，硬化蛋白能够抑制骨沉积，并且在所述结合或相互作用缺失时，骨沉 积的抑制作用部分缩减或提高，其取决于所述结合配偶体是否作为硬化蛋 白作用的阳性介体或抑制剂起作用。本领域已知硬化蛋白调节其它蛋白质 和信号途径。例如，研究已经显示硬化蛋白能够作为骨形态发生蛋白(BMP) 信号传递的环境依赖型拮抗剂。另外，硬化蛋白还能够作为 Wingless/INT(Wnt)信号途径的抑制剂，可能是通过结合LRP5和LRP6Wnt共同受体。硬化蛋白调节成人骨形成的能力可以通过Wnt信号抑制 来实现，这一理论被与硬化蛋白功能丧失突变和LRP5功能获得突变相关 的人骨过度生长病症的高度表型重叠所支持。
由于本领域已知硬化蛋白调节其它蛋白质和信号途径，硬化蛋白:硬化 蛋白结合配偶体相互作用的调节同样可以影响，或者对其它蛋白质和信号 途径(例如，Wnt和BMP)发挥作用。因此硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相 互作用的调节(例如，通过本发明的方法和组合物)可以导致硬化蛋白水平 变化，或提高或降低骨密度，并且可以分别影响硬化蛋白相关病症，或骨矿 物质密度异常病症的治疗。这在本文的实施例部分阐明。
尽管在过去的研究中其它因素已经通过Wnt和BMP信号途径牵涉到 骨沉积，但本文所详述的(以及在本发明中所体现的)发现是关键性的， 因为它们揭示了通过硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用调节这些途 径。换句话说，硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用是关键性的以便激 活或抑制硬化蛋白，由此能够实现其生物学活性(例如，抑制骨沉积)。
例如，如本文所述，肌原纤蛋白2是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是 至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分。这种相互作用可以诱导硬化蛋白 再折叠成更加稳定的构像，和/或可以起始肌原纤蛋白-2和BMP信号转导 之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和BMP信号转导之间的联系。 同样地，肌原纤蛋白2和硬化蛋白之间的相互作用可以起始肌原纤蛋白-2 和BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号 转导之间的联系。通过NMR"N-硬化蛋白制品显示只有25%的结构，可 能是由于硬化蛋白在结合配体如肌原纤蛋白2上折叠造成的。
这些发现产生了本发明的方法和组合物，其可以治疗、预防和诊断硬 化蛋白相关病症和/或骨矿物质密度异常病症等。例如，特征为骨矿物质密 度异常低的病症(例如，骨质疏松症)可以通过调节(例如，破坏)硬化蛋白 硬化蛋白结合配偶体相互作用来进行预防、治疗或改善。
例如，破坏硬化蛋白:肌原纤蛋白2相互作用(例如，通过使用抗肌原纤 蛋白2抗体或抑制性核苷酸)可以用来预防，治疗，或改善骨质疏松症。或者，特征为骨矿物质密度异常高的病症(例如，硬化性狭窄)可以通过调节
(例如，增强或激动)硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用，或通过施用 与肌原纤蛋白2结合硬化蛋白具有相同或类似功能效应的肌原纤蛋白2 模拟物来进行预防，治疗，或改善。例如，以此方式激动硬化蛋白:肌原纤 蛋白2相互作用(例如，通过提供肌原纤蛋白2模拟物)以便增强硬化 蛋白作用，可以用来预防，治疗，或改善硬化性狭窄。
另外，在许多情况下，硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间的相互作 用可以起始硬化蛋白结合配偶体和BMP信号转导之间的功能性相互作用， 由此形成硬化蛋白和BMP信号转导之间的联系。同样地，硬化蛋白:硬化 蛋白结合配偶体相互作用可以起始硬化蛋白结合配偶体和Wnt信号转导 之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导之间的关系。
例如，硬化蛋白和聚集蛋白之间的相互作用可以起始聚集蛋白和 BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此形成硬化蛋白和BMP信号转 导之间的联系。同样的，硬化蛋白-聚集蛋白相互作用可以起始聚集蛋白和 Wnt信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导 之间的关系。
硬化蛋白/SOST
硬化蛋白，由SOST基因编码的蛋白质，是骨细胞分泌的骨形成的有 效负调节剂(Swiss-Prot检索号Q9BQB4)。由于硬化蛋白在其半胱氨酸结 节结构上与TGF-p拮抗剂的DAN家族的相似性，硬化蛋白最初仅被假定 为一种骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂(Brunkow等(2001)Am J Hum Genet 68:577-589);但是，它直接与BMP体内相互作用的能力一直是推测性的。
硬化蛋白或SOST表达的缺失导致骨形成失控，例如，硬化性狭窄 (Brunkow等(2001)Am J H體Genet.:68m:577)。患硬化性狭窄的患者终 生要忍受骨过度生长的折磨，导致骨量和强度提高。这种隐性疾病的杂合 携带者也表现出骨量增多(Gardner等2005 J Clin Endocrinol Metab. 90(12):6392)。这种表型可以在SOST缺陷型小鼠中重复出现并且其过度表达导致骨质减少(Loots等2005fGenome Res. 2005 15f7):928)。另外，已经 发现Van Buchem病-硬化性狭窄的一种表型副本-是由SOST误调控引 起的，所述误调控是由远程骨增强子的基因组缺失所造成的(Loots等 2005(Genome Res. 2005 15卩):928、.)。最后，研究显示骨形成过程中SOST 通过骨增强子被副曱状腺激素下调-唯一临床确认的骨形成理论(Keller, Kneissel 2005， Bone. 2005 37(2):148)。因此硬化蛋白作用的抑制将导致骨质 疏;^症的理想治疗。
尽管还不清楚硬化蛋白是如何精确地发挥其骨形成负调节剂的作用， 但是研究显示硬化蛋白抑制骨形态发生蛋白(BMP)和Wingless/INT(WNT) 信号转导，二者对于骨形成都是关键性的。硬化蛋白能够作为BMP信号转 导的环境依赖型拮抗剂。另外，硬化蛋白还可以作为Wnt信号途径的抑制 剂，可能是通过在尚未鉴定的辅因子存在情况下结合Lrp5和 Lrp6(S匿,MV, He X. J Biol Chem. 2006 ;281(50):3827)Wnt共同受 体。硬化蛋白可能通过Wnt信号转导抑制来影响成人骨形成的假说被与硬 化蛋白功能丧失突变和LRP5功能获得突变相关的人骨过度生长病症的高 度表型重叠所支持。
硬化蛋白可能在出生后的一生中具有其它作用。硬化性狭窄患者身材 异乎寻常地高(Van Hul等(2001)European Journal of Radiology 40 198)， 提示硬化蛋白在软骨生物学中的推定作用。另外硬化蛋白在肾中表达，暗 示它可能在此器官中发挥尚未表征的作用(Balemans等2001Hum Mol
GeneU0(5):537, Balemans and Van Hul(2002)Developmental Biology 250, 231)。最后它已经显示在心血管系统中至少在胚胎发育期间表达(van Bezooijen等(2006)Dev Dyn. 2006;236(2):606)。
多功能蛋白聚糖(CSPG2)
多功能蛋白聚糖(Versican )是包括聚集蛋白聚糖，神经蛋白聚糖和短 小蛋白聚糖的lectican家族成员。它是大的硫酸软骨素蛋白聚糖。它的N 末端球形结构域(G1)结合糖胺聚糖乙酰透明质酸，并且其羧基末端球形结
25构域(G3)由两个EGF样结构域， 一个凝集素样结构域，和一个补体调控蛋 白质样结构域组成。已知多功能蛋白聚糖的四种剪接变体(V0-V4)(Wight， TN(2002)Curr.Opin.Ce11 Biol.; 14(5):617-23)。多功能蛋白聚糖V0和VI 是由ADAMTS1和4(聚集蛋白聚糖酶-1)剪切的(Sandy，等 (2001)J.Biol.Chem.; 276(16): 13372-8)(Russell,等(2003)J. Biol. Chem.; 278(43):42330-9)而多功能蛋白聚糖V2是由ADAMTS4剪切的(Westling, 等(2004)Biochem,J.; 377(Pt. 3):787-95)。
多功能蛋白聚糖具有广泛的组织分布。Nakamura等在发育中的下颌 骨和后肢中研究多功能蛋白聚糖的表达。基于他们的结果，他们提出下列 结论。多功能蛋白聚糖在成骨细胞分化之前表达并且在膜内骨化期间位于 类骨质中。在软骨内骨化中，多功能蛋白聚糖在骨膜细胞中表达，所述骨膜 细胞覆盖在钾化软骨表面上的活性生骨区。此后，骨进行了两种类型的骨 化，随后进行骨发育的共同连续过程。骨基质延伸并且形成富含多功能蛋 白聚糖的编织骨。在成骨细胞，在限制性的骨细胞群以及在骨基质中检测 到多功能蛋白聚糖mRNA和蛋白质。当编织骨改变成板层骨时，在骨基质 中的多功能蛋白聚糖表达减少。ADAMTS1 ， 4和5的时间和空间mRNA表 达模式与多功能蛋白聚糖相当。他们假设成骨细胞和骨细胞可能通过分泌 ADAMTS参与多功能蛋白聚糖的生产和降解(Nakamura，等(2005)J. Histochem. Cytochem.; 53(12):1553-62)。最后，多功能蛋白聚糖和BMP 信号转导被联系在一起，如这样的事实所示，即BMP-2将大鼠推间盘细胞 中多功能蛋白聚糖基因表达减半(Li，等(2004)J.Spinal Disord.Tech.; 17(5):423-8)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞培养 物上清液级分中，多功能蛋白聚糖(CSPG， IPI00009802.1)已经被鉴定为结 合配偶体。据认为多功能蛋白聚糖是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少 由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋 白再折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。硬化蛋白多功能蛋 白聚糖相互作用还作为硬化蛋白和Wnt信号转导之间的联系。
2FREM2
由my基因(mydencephalic blebs基因)编码的Frem2，是一种被提议 的ECM组分，与Frasl和Freml相关(Frasl相关的细胞外基质)并且据认 为与海胆ECM3蛋白同源。它的预测蛋白质排列由下列组成N末端信号 肽后接13个串联排列的硫酸软骨素蛋白聚糖结构域(CSPG)， 5个串联排列 的CALXB结构域，1个跨膜螺旋和一个具有共有PDZ相互作用基序的短 的细胞质尾部。
在起泡突变体(myU")和两个弗雷泽综合征个体中已经检测到Frem2 的错义突变，所述弗雷泽综合征是一种多系统畸形，通常包括隐眼，皮肤性 并指(趾)，耳朵畸形，肾发育不全和先天性心脏缺陷。有趣的是，myU"小 鼠表现出皮肤性并指(趾)，偶而伴随多骨并指(趾)和多指畸形。导致 氨基酸取代E1972K的核苷酸转换5914G)A，已经在两个不相关的家族 中被鉴定出来。这种突变在五个连续CALXB结构域的第二个中出现并且 取代了在所有已知CALXB结构域中保守的残基。序列相似性检索显示 CALXB与钙黏着蛋白结构域相关，已知所述钓黏着蛋白结构域在连续结 构域之间的负电荷口袋中插入钓离子。序列到结构的比对已经显示 Glul972位于CALXJJ结构域2和3交界处的Ca2+结合口袋中并且对应 于直接参与Ca"配位的保守性位置。这提示在CALXB-钩黏着蛋白基序中 的钙结合对于FREM2的正常功能是重要的(Jadeja S，等(2005)Nat.Genet.; 37(5):520画5)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞膜纯 化级分中，Frem2(IPI00180707.7)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。 据认为Frem2是^_化蛋白的重要结合配偶体，或是由至少硬化蛋白组成的 多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白再折叠成更加稳 定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。
肌原纤蛋白2(FBN2)糖蛋白肌原纤蛋白-1和2是细胞外钙结合微纤维的主要结构成分，平 均直径为IO iim。肌原纤蛋白共有保守性多结构域结构，具有高度氨基酸 序列同源性。肌原纤蛋白-2由47个EGF样结构域组成，独特的C和N 末端结构域和小的富含甘氨酸的结构域,这47个EGF样结构域中43个具 有共有钙结合序列，被包含8个半胱氨酸的模块中断，其也在休眠TGF-B1 结合蛋白质(LTBP)中发现。肌原纤蛋白-2优选位于弹性组织中，如弹性 软骨和主动脉的血管中膜层(Putnam，等(1995)Nat.Genet.; 11(4):456-8)。在 骨中，肌原纤蛋白-2mRNA，与肌原纤蛋白-1 一起，由源自近端大腿骨的人 小梁骨并且由原始培养物中的成熟骨来源的人成骨细胞丰富地表达 (Kitahama，等(2000)Bone; 27(1):61-7)。
肌原纤蛋白-2突变导致先天性挛缩性细长指(CCA)， 一种常染色体显 性病症，其特征是细长指，蜘蛛脚样指，脊柱侧凸，多发性先天性挛缩和外 耳异常。CCA在表型上类似于马方综合征，其由肌原纤蛋白-1突变导致， 但是并不影响主动脉和眼睛。在两名CCA患者中，FBN2错义突变在单 独的EGF样重复中引发不同半胱氨酸残基的取代(Putnam，等1995)。无 肌原纤蛋白-2的鼠以双侧并指(趾)的形式表现出四肢形状缺陷，主要是 由于缺陷型间叶细胞分化所造成的。并指(趾)与紊乱的基质相关联，但 是与正常BMP基因表达相关。对于无效Fbn2和BMP7等位基因的小鼠 双杂合子表现出两种失效合子的组合的足趾表型(并指(趾)和多指畸 形)(Arteaga-Solis，等(2001)J.Ce11 Biol.; 154(2):275-81)。由于多指畸形是纯 合子的特征，而非杂合的BMP-7无效小鼠的特征，并且由于杂合型肌原纤 蛋白-2小鼠是正常的，双杂合型小鼠的表型提示在四肢生长过程中富含肌 原纤蛋白-2的微纤维和BMP-7信号转导之间的功能性相互作用。
肌原纤蛋白-2可以在发育生物的细胞间空间提供排列形态发生信息 的结构支架。这一功能可以通过直接结合失活生长因子(如对于休眠 TGF-B复合体来说)，间接地通过与其它基质组分(如蛋白聚糖)相互作 用，或通过两种机制的结合来实现(Arteaga-Solis，同上)。近来，显示在肌 原纤蛋白-1无效小鼠中，BMP-7与肌原纤蛋白-2共同定位(Gregory，等(2005)J.Biol.Chem.; 280(30):27970國80)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞的膜 纯化级分中，肌原纤蛋白2前体(FBN2，IPI00019439.1)已经被鉴定为硬化
蛋白的结合配偶体。肌原纤蛋白2被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体， 或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分。这种结合可以诱导硬化蛋白 重新折叠成更加稳定的构象，并且可以起始肌原纤蛋白-2和BMP信号转 导之间的功能性相互作用，由此形成硬化蛋白和BMP信号转导之间的联 系。同样的，硬化蛋白-肌原纤蛋白2相互作用可以起始肌原纤蛋白-2和 Wnt信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导 之间的联系。
C6orf93
C6orf93是一种假想蛋白，也叫作LTV1同源物(酿酒酵母(S. ccrcvisiac ))。在人中，2002年在NIHMGC项目框架中首次对它进行描 述(Strausberg，等(2002)PNAS; 99(26): 16899-卯3)。在酿酒酵母中，低温活 性蛋白质LTV1编码非必需的，非核糖体蛋白质。缺少LTV1和YAR1 的菌林对各种环境胁迫，像渗透和氧化胁迫，低温和高温以及某些蛋白质 合成抑制剂的存在表现出超敏性，揭示出核糖体生物发生因素与环境胁迫 敏感性之间的未知联系(Loar，等(2004)Genetics.; 168(4): 1877-89)。 Ltvl与 小核糖体亚基输出因子Yrb2的基因在遗传上相互作用，提示Ltvl作为若 干可能的衔接蛋白之一，所述衔接蛋白将核输出机器与小亚基联系起来 (Seiser,等(2006)Genetics.; 174(2):679-691)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293和 UMR106细胞膜纯化级分中，C6orf93(IPI0053032.1)已经被鉴定为硬化蛋 白的结合配偶体。C6orf93被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少 由硬化蛋白组成的多复合体的部分。硬化蛋白C6orf93相互作用可以诱导 硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)，起始 C6orf93和BMP或Wnt信号转导之间的功能性相互作用，并且作为石更化蛋白和这些途径之间的联系。硬化蛋白C6orf93相互作用还涉及骨细胞对 环境胁迫的敏感性。
多配体聚糖-4(Sdc4)
多配体聚糖(Syndecan) -1到-4是单通内在膜组分，硫酸乙酰肝素 蛋白聚糖家族的成员。每种多配体聚糖都具有短的细胞质结构域，单跨越 跨膜结构域和具有3到5个糖胺聚糖链的附着位点的细胞外结构域，让它 们可以直接将细胞周围环境与细胞内部连接起来。多配体聚糖-4，也叫做双 栖蛋白聚糖或抗凝蛋白聚糖，是一个独特的成员，因为它具有激活细胞内 信号级联并在哺乳动物细胞中形成勦着斑位点的能力。它通过其糖胺聚糖 链结合纤连蛋白，激活PKCa和小GTP酶RhoA，并与整联蛋白一起稳定 黏着斑位点(Tkachenko E，等(2005)Circ.Res.; 96(5):488-500)。在爪蟾中， 纤连蛋白调控多配体聚糖-4将Dsh转位至质膜上的能力，其是激活非常 规Wnt信号转导的标志(Munoz R，等(2006)Nat.Ce11 Biol.; 8(5):492-500)。
多配体聚糖-4在若千细胞型中广泛表达，包括原代大鼠颅顶成骨细 胞，在这里其mRNA表达被FGF2处理所上调。这种上调并非像放线酮处 理后多配体聚糖-4mRNA减少那样的立即反应。成骨细胞增殖和矿化，以 及ERK激活，也被FGF2所增强，但是却被抗多配体聚糖-4抗体预处理 特异性减弱(SongSJ，等(2007)J.Ce11 Biochem.; 100(2):402-411)。在C2C12 细胞中，多配体聚糖-2和-3被BMP-2所上调(Gutierrez J，等(2006)J.Ce11 Physiol.; 206(1):58-67)，但是多配体聚糖-3在软骨发生过程中是BMP-2信 号转导的负调节剂(FisherMC，等(2006)Matrix Biol.; 25(1):27-39)。在果蝇 (Drosophila)中，多配体聚糖位于发育中的轴突，在遗传上和物理上与 SLIT和Robo相互作用并通过SLIT/Robo信号转导促进轴突和肌管导向 (Johnson KG,等(2004)Curr.Biol.; 14(6):499-504)(Steigemann P，等 (2004)Curr.BioI.; 14(3):225-30)。最后，当接种多配体聚糖-4抗体时，多配 体聚糖-4可以在激活的B淋巴细胞中诱导丝足样结构(Yamashita Y,等 (1999)J.Imm腦l.; 162(10):5940-8)。
30如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的大鼠骨肉瘤
UMR106细胞培养物上清液级分中，多配体聚糖-4(sdc4， IPI00199629.1)已
经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。多配体聚糖被认为是硬化蛋白的重要 结合配偶体(本文定义为"硬化蛋白结合配偶体")，或是至少由硬化蛋白， SLIT，和多配体聚糖-4组成的多复合体的部分。这种结合可以调节骨细胞 树突样过程的起始，或诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象并因此调 节硬化蛋白作用。另外，多配体聚糖-4可以作为硬化蛋白和Wnt和/或 BMP信号转导之间的联系。
SLIT2
SLLIT2是一种分泌型蛋白质，其在细胞迁移中作为分子导向杆，并 且其功能是通过与间接同源受体的相互作用来介导的。它在脊髓中表达并 且参与早期体轴形成和神经管的细胞模式发育。
与硬化蛋白在结构上相关的Gremlin和Dan，与Slitl和Slit2蛋白在 物理上和功能上相互作用并由此作为单核细胞趋化性的抑制剂(Chen等 (2004)J Immunol.;173(10):5914)。另外Slit蛋白是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 碌月旨醜月几醇蛋白聚糖-1 的高亲和'l"生酉己体(Ronca 等(2001)J Biol Chem. 276(31):29141)，其在本发明所述的实验中也被鉴定为硬化蛋白相互作用配 偶体。另外也在本发明中描述过的多配体聚糖，通过slit/robo信号转导促 进轴突和肌管导向(Johnson KG， 等(2004)Curr.Bio1. 14(6):499-504)(SteigemannP，等(2004)Curr.Bio1. 14(3):225-30)。
在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞膜级分中， SLIT2(IPI00006288.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。SLIT2被认 为是硬化蛋白的重要结合配偶体(本文定义为"硬化蛋白结合配偶体，，)，或 是至少由硬化蛋白，SLIT，可能有多配体聚糖-4和磷脂酰肌醇蛋白聚糖1 组成的多复合体的部分。这种结合可以调节骨细胞树突样过程的起始，或 诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象并因此调节硬化蛋白作用。另夕卜， SLIT2可以作为硬化蛋白和Wnt和/或BMP信号转导之间的联系。磷脂酰肌醇蛋白聚糖l(Gpcl)
磷脂酰肌醇蛋白聚糖调节细胞外蛋白质配体与其作为共同受体的受体 的接触。已知它们调节Wnt信号转导(Capurro等(2005)， Cancer Res.;65(14):6245)和BMP信号转导[例如通过与BMP拮抗剂相互作用 (Paine-Saunders等(2000)Dev Biol.;225(l):179)。例如磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3中的突变导致与骨过度生长相关联的各种综合征。例如， Simpson-Golabi-Behmel 过度生长综合征(Pilia 等(1996)， Nat GeneU2(3):241)是丧失Gpc3对Wnt信号转导控制的结果((Song等 (2005);Bio1 Chem 280(3):2116))。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖由成骨细胞的细胞表达并被提议为骨重塑的潜在 调节剂(Sheu等(2002)J Bone Miner Res.l7(5):915)。
另外磷脂酰肌醇蛋白聚糖1结合SLIT(Ronca等(2001)J Biol Chem. 276(31):29141)，其也在本发明中^皮描述为硬化蛋白相互作用配偶体。
在串联亲和纯化结合测定的成骨细胞UMR106细胞培养物上清液级 分中，Gpcl(IPI00137336.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。Gpcl 被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体(本文定义为"硬化蛋白结合配偶体")， 或是至少由硬化蛋白，Gpcl，并且可能地多配体聚糖-4和SLIT2组成的 多复合体的部分。这种结合可以调节骨细胞树突样过程的起始，或诱导硬 化蛋白重新折叠成更加稳定的构象并因此调节硬化蛋白作用。另外，磷脂 酰肌醇蛋白聚糖1可以作为硬化蛋白和Wnt和/或BMP信号转导之间的联 系。
聚集蛋白(AGRN)
聚集蛋白是一种大的细胞外基质硫酸肝素蛋白聚糖，分子量大约600 kDa(200kDa蛋白质核心)。备选的信使RNA剪接产生同种型，其编码剪 切的信号序列，后接氨基末端聚集蛋白结构域，产生聚集蛋白(NtA-聚集蛋 白)的分泌形式，以及同种型，其包含较短的氨基末端与内部未剪切的信号 肽，将蛋白质转变成II型跨膜蛋白质(TM-聚集蛋白)。两种同种型都是差别表达的:NtA-聚集蛋白在大多数包含基片的组织中广泛表达而TM-聚集 蛋白优先在中枢神经系统中表达(Burgess,等(2000)J.Cell Biol.; 151(1):41-52)(Neumann，等(2001)Mol.Ce11 Neurosci.; 17(1):208-25)。近来， 据显示聚集蛋白在小鼠软骨细胞中表达并定位于生长板(Hausser等 (2007)Histochem Cell Biol.; 127:363)。 NtA-聚集蛋白缺陷型小鼠已经提供 证据，证明聚集蛋白在骨骼肌的神经肌肉连接处的突触后发育中对于乙酰 胆碱受体的聚积是必需的(Gautam,等(1996)Cell.; 85(4):525-35)。这一能力 需要肌肉特异性受体酪氨酸激酶MuSK，如通过聚集蛋白和MuSK缺陷型 小鼠表型的相似性所证明(DeChiara，等(1996)Cell.; 85(4):501-12)。聚集蛋 白在大鼠骨骼肌细胞中的过表达诱导丝足的形成(Uhm，等 (2001)J.Neurosci.; 21(24):9678-89)。抗体-诱导的内源性TM-聚集蛋白的聚 簇导致沿着中枢和外周神经元的丝足样过程的形成增多(Annies,等 (2006)Mol.CellNeurosci.; 31(3):515-24)。在海马神经元培养物中TM-聚集 蛋白的过表达和通过TM-聚集蛋白siRNA的下调提示TM-聚集蛋白正向 调节发育中的神经突上丝足的数目，这种调节是通过其对于丝足的起始和 稳定化作用来实现的(McCroskery，等(2006)Mol.Cel1 Neurosci,; 33(1):15画28)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293细胞培养 物上清液级分中，聚集蛋白(IPI00374563.2)已经被鉴定为硬化蛋白的结合 配偶体。聚集蛋白被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋 白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够调节骨细胞丝足样过 程的起始和稳定，或诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象(由此调节硬 化蛋白作用)。
丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)
丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(Serpine)2编码丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制 剂，也称作蛋白酶连接蛋白1(PN-1)或神经胶质来源的连接蛋白前体(PI7)。 它是43 kDa的分泌型蛋白质，丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)超家族的成员并且已经被描述为由星形胶质细胞、平滑肌、内皮细胞，和成纤维细胞合
成(Scott, 等(1985)J.Biol,Chem.; 260(11):7029-34)(Rosenblatt， 等 (1987)Brain Res.; 415(1):40-8)(Festoff， 等(1991)J.Cel1 Physiol.; 147(1):76画86)(Bouton， 等 (2003)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.; 23(1):142-7)。它是凝血酶和尿纤溶酶原激活物(uPA)的强抑制剂并且，为 纤溶酶和胰蛋白酶的强度较小但仍然有效的抑制剂(Scott，等(1985)DNA Cell Biol.; 22(2):95-105)。凝血酶-PN-l复合体的有效分解代谢是一种协同 机制，其需要LRP-1和肝素:首先凝血酶-PN-l复合体被肝素浓集到细胞表 面，随后在被细胞降解前被LRP-1内化(Knauer，等(1997)J. Biol. Chem.; 272(46):2卯39画45， Scott，等(2003)DNA Cell Biol.; 22(2):95-105)。
在小鼠胚胎成纤维细胞中，N-l复合体的选择性内化作用是由多配体 聚糖-l介导的，并激活Ras-ERK信号转导途径。游离的PN-1也可以被内 化(Li,等(2006)J.Ce11 Biochem,; 99(3):936-51)。 PN-1调节脉管平滑肌细胞 附着，铺展和迁移(Richard，等(2006)J. Thromb. Haemost.; 4(2):322-8)。在 人骨骼肌中PN-1表达被损伤相关因子像TNFa、TGF(5和IL-1上调(Mbebi， 等(1999)丄Ce11 Physiol.; 179(3):305-14)。 PN-1也已孝皮才艮告通过抑制凝血酶 参与神经突延伸(F ^1990)Dev.Neurosci.; 12(2):73画80)。最后，在
NIH3T3细胞中，PN-1被显示为Prx2的耙基因，已知所述Prx2是正确的 骨骼形成所必需的(Scott，等(2003)DNA CellBiol.; 22(2):95-105)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的UMR106细胞培养 物上清液级分中，卩1\-1(^100203479.3)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶 体。PN-1被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成 的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白重新折叠成更 加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。硬化蛋白:PN-1相互作用还参与骨 细胞生长或硬化蛋白内化和降解。
低密度脂蛋白受体相关蛋白2(LRP2，巨蛋白)
低密度脂蛋白受体家族是一类高度保守的细胞表面受体，在物质运输，大分子从细胞表面的内化以及细胞信号转导中具有广泛功能。巨蛋白是一 种多配体的上皮内吞作用受体，其在成人肾和回肠中被充分表征，在所述 成人肾和回肠中它们形成对于蛋白质、脂类和维生素吸收所必需的复合体。
(大鼠)中表达，在精嚢中它作为精嚢的内吞作用受体。巨蛋白敲除小鼠
出现维生素D缺陷和骨疾病，这是由于肾中的近端小管不能从肾小球滤液 中捕荻DBP/25-(OH)D3复合体造成的(Willnow等(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93， 8460)。以相同的方式，肾特异性的巨蛋白敲除小鼠具有严重 的血浆维生素D缺陷、低血4丐症和严重的骨疾病，像完全巨蛋白敲除小鼠 一样(Leheste等(2003)FASEB J. 17(2):247)。它们的骨骼特征是骨矿物质含 量减少，类骨质表面增多，并且缺乏矿化活性。这些特征与作为维生素D 缺乏引起的骨软化是一致的，表明巨蛋白途径对于系统性钙动态平衡和骨 代谢是非常重要的。
在串联亲和纯化结合测定的人胚肾Hek293膜纯化和上清液级分中， LRP2(IPI00024292.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。LRP2被认为 是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部 分。硬化蛋白在肾中表达(Balemans and Van Hul(2002)Developmental Biology 250， 231)。因此，LRP2在肾调节中可以与硬化蛋白相互作用，尽 管此外的作用尚未被表征。另夕卜LRP2能够参与骨中的硬化蛋白内化以及 随后的降解，调节其作用。
低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4,也叫做Megf7) Megf7是低密度脂蛋白受体家族的一员。LRP4缺陷型小鼠表现出前 后肢的多趾畸形。并指(趾)也是硬化蛋白水平异常的典型特征(在硬化性 狭窄患者中硬化蛋白的缺失和小鼠中硬化蛋白的过表达都导致并指(趾))。 LRP4和硬化蛋白蛋白质都在顶端外胚层嵴(AER)形成中发挥作用并在胚 龄9.5天时表达。另外，硬化蛋白和LRP4都可以拮抗常规Wnt信号转导 (Joh励n EB,等(2005)Hum Mol Genet. 14(22):3523)(Simon-Chazottes D， 等(2006)Genomics87(5):673)(LootsGG，等(2005)Genome Res.
3515(7):928-35)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的UMR106和 Hek293细胞的细胞膜级分中，LRP4(IPI00306851.3)已经被鉴定为硬化蛋 白的结合配偶体。LRP4被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由 硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋白 重新折叠成更加稳定的构象(由此调节硬化蛋白作用)。另外，已经显示 LRP4在其作为Wnt信号转导抑制剂时作为硬化蛋白作用的增强剂。
低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)
LRP6通过与Frizzled —起作为Wnt. LRP6高亲和性结合DKK1的 共同受体，是Wnt/p联蛋白信号途径所必需的。这种与DKK1的相互作用 阻抑了 LRP6介导的Wnt/p联蛋白信号转导。近来已经显示硬化蛋白样的 DKK1在体外作为LRP6的结合配偶体并由此抑制Wnt信号转导 (Semenov等(2005)J Biol Chem. 280(29):26770)。
在串联亲和纯化结合测定的Hek293和成骨细胞UMR106细胞培养物 膜级分中，LRP6(IPI00000203.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。这 些发现提示硬化蛋白在体内通过LRP6相互作用发挥其部分作用。这也强 调了来自串联亲和纯化结合测定实验的发现的相关性，因此可视作阳性对 照、。
生腱蛋白C
生腱蛋白C是240 kDa的大的多聚体细胞外基质蛋白，包括七残基重 复序列，EGF样序列，纤连蛋白III型结构域,和与血纤蛋白原共有的C末 端球形结构域。生腱蛋白主要是由结締组织中的细胞合成的 (Chiquet-Ehrismann R(2004)Int.J.Biochem.Ce11 Biol.; 36(6):986)。它们被 分类为附着调节蛋白质是因为，与其它细胞外基质蛋白质相反，生腱蛋白 只促进弱细胞附着并且细胞平铺受限(Orend G and Chiquet-Ehrismann R(2000)Exp.Ce11 Res.; 261(1):104)。说明书第30/72页
生腱蛋白C可以影响若千细胞内信号分子，像FAK, RhoA， cGMP依 赖型蛋白质激酶和14-3-3tau。它还可以直接结合并激活EGF受体 (Chiquet國Ehrismann R and Tucker RP(2004)Int.J.Biochem.Ce11 Biol.; 36(6):1085)。生腱蛋白C支持培养的成骨细胞样细胞的分化(Mackie EJ and Ramsey S(1996)J.Ce11 Sci.; 109(Pt 6):1597)。在大鼠尺骨中，免疫组化 检测显示只有响应负荷形成的新骨内的骨细胞才对生腱蛋白C强烈染色。 最近被包埋的骨细胞，即离骨膜表面较近的骨细胞未被染色(Webb CM，等 (1997)J.BoneMiner.Res.; 12(1):52)。生腱蛋白C影响整联蛋白和多配体蛋 白聚糖信号转导(Huang W，等(2001)Cancer Res.; 61(23):8586)。
在高血压患者中，生腱蛋白C响应于突变的BMPR2而被诱导 (Ihida-Stansbury K， 等(2006)Am.J.Physio1 Lung Cell Mol.Physiol.; 291(4):L694)。在高密度的鸡肢芽细胞培养物中生腱蛋白C表达被Wnt7a 所抑制(Stott NS， Jiang TX and Chuong CM(1999)J.Cdl Physiol.; 180(3):314)，而在鸡胚成纤维细胞中，TGFb诱导生腱蛋白表达。(P CA，等(1988)EMBO J，； 7(10):2977)。生腱蛋白C通过与整联蛋白a7卩l相 互作用提高大鼠小脑颗粒神经元的神经突生长(Mercado ML，等 (2004)丄Neurosci.; 24(1):238)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的UMR106细胞培养 物上清液级分中，生腱蛋白C(IPI00403938.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结 合配偶体。生腱蛋白C被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由 硬化蛋白组成的多复合体的部分。这种相互作用诱导硬化蛋白重新折叠成 更加稳定的构象，和/或起始生腱蛋白C和BMP信号转导之间的功能性相互 作用，由此提供硬化蛋白和BMP信号转导之间的的联系。同样的，生腱蛋 白C和硬化蛋白之间的相互作用起始生腱蛋白C和Wnt信号转导之间的 功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号转导之间的联系。另外， 它参与骨细胞生长或这些机制的结合。
三联基序(TRIM)蛋白质(TRIM26, TRIM41)
37三联基序(TRIM)蛋白质家族是RING("真正令人感兴趣的新基因")蛋 白的扩展家族，也叫做RBCC蛋白，因为它们包含RBCC基序，其包括 RING结构域， 一个或两个B-盒和预测的巻曲螺;旋区。TRIM/RBCC蛋白 质涉及广泛的生物学过程，包括细胞增殖，分化，发育，瘤形成和凋亡。 RING结构域的存在及其与泛素化作用的强烈关联提示这个蛋白家族在 泛素化过程中发挥作用(Meroni G，等(2005)Bioessays. 27(11):1147)(Nisole S,等(2005)Nat,Rev.Microbio1. 3(10):799)。
如本文进一步详述的，TRIM26(IPI00010948.2)已经在串联亲和纯化结 合测定的Hek293膜级分中，TRIM41(IPI00414021.1)已经在串联亲和纯化 结合测定的Hek293和UMR106膜级分中被鉴定为硬化蛋白的结合配偶 体。据认为TRIM26和TRIM41是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少 由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用能够诱导硬化蛋 白降解。TRIM与LRP2—起可以参与硬化蛋白内化作用和随后的降解。
IL-17受体
IL-17A的受体(IL17RA)是大约130 kDa的单通跨膜蛋白质，并且具有 不同寻常的大细胞质尾部。尽管IL-17A细胞因子只由T细胞表达，但其 受体是广泛表达的。因此，IL-17可以对许多种细胞作用以触发炎症效应 物的表达。大多数这些效应物已经显示通过促进破骨细胞发生或发挥骨保 护性作用而对骨代谢具有影响(Gaffen SL(2004)Arthritis Res.Ther.; 6(6):240)。
大多数IL-17-诱导的基因趋于是骨再吸收性的。例如，已经显示IL-6 对于雌激素介导的骨流失是一种贡献因素(Jilka RL，等(1992)Science.; 257(5066):88)。在过表达IL-17的小鼠中，骨侵蚀是由RANKL介导的 (LubbertsE，等(2003)丄Immunol.; 170(5):2655)。 IL-17并不参与骨动态平 衡的生理调节，这是由于与野生型同窝出生的小鼠相比，IL-1"小鼠不存 在骨矿物质密度，骨駱发育以及骨再吸收和骨形成参数的差异。但是，在炎 性骨破坏的LPS-诱导模型中，与野生型小鼠相比，在IL-17;小鼠中骨再吸收的水平弱得多并且破骨细胞形成被显著减弱，提示Thl7细胞参与T 细胞介导的破骨细胞发生。
IL-17介导的RANKL和炎性细胞因子，如TNFa和IL-1的导入，已 经被提示参与该过程(Sato K，等(2006)J.Exp.Med.; 203(12):2673)。 IL-17 还是嗜中性粒细胞募集和激活的强诱导剂，大部分是由于其促进趋化因子 分泌的能力所致。据认为嗜中性粒细胞在慢性炎症过程中促进骨破坏。但 是，在牙周疾病诱导的骨流失中嗜中性粒细胞一般被认为是骨保护性的 (Kantarci A， Oyaizu Z and Van Dyke TE(2003)J.Periodontol.; 74(1):66)。 对于IL-17RA的信号转导知之甚少。涉及的途径可能包括NF-KB途径， 参与C/EBP磷酸化作用的C/EBP家族以及MAPK和GSK3B， ERK1和 2， JNK， p38 和 PI-3K/Akt(Gaffen SL，等(2006)Vitam，Horm.; 74:255-82.:255)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的Hek293膜级分中， IL-17RA(IPI00304993.3)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶体。IL-17RA， 或IL-17RB， IL-17RC， IL-17RD和IL-17RE被认为是硬化蛋白的重要结合 配偶体，或是至少由硬化蛋白组成的多复合体的部分，它们之间的相互作用 能够诱导硬化蛋白重新折叠成更加稳定的构象，和/或起始IL-17受体和 BMP信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和BMP信号转 导之间的联系。同样的，IL-17受体和硬化蛋白之间相互作用起始IL-17受 体和Wnt信号转导之间的功能性相互作用，由此提供硬化蛋白和Wnt信号 转导之间的联系。另外，它参与骨细胞生长或这些机制的组合。
碱性磷酸酶(ALPL)
在大多数哺乳动物中，有四种不同的同工酶:胎盘，胎盘样，肠和组织 非特异性(肝/骨/肾，ALPL)的。碱性磷酸酶肝/骨/肾(ALPL)的缺陷是婴儿低 磷酸酯酶症的病因，这是一种遗传代谢性骨疾病，特征是骨骼矿化缺陷， 提示ALPL在骨駱矿化中发挥作用(Fedde KN等(1999)JBMR 14(12):2015-2026)。ALPL是骨形成标记。在骨生成过程中，在骨原细胞中并未检测到碱 性磷酸酶。它的表达在前成骨细胞集落的增殖能力丧失以及节结形成起始 时开始。从那时起表达就一直得到维持(Liu等(1994)Devel Biol. 166:220-234)。已经描述过几种BMP在成骨细胞样细胞中诱导碱性磷酸酶 (Cheng H等(2003)J Bone Joint Surg Am. 85:1544-1552)。此夕卜，Rawadi G 等(2003)表明BMP-2通过Wnt自分泌环控制碱性磷酸酶表达(JBMR 18(10):1842画1853)。
如本文进一步详述的，在串联亲和纯化结合测定的UMR106细胞培养 物上清液级分中，ALPL(IPI00327143.1)已经被鉴定为硬化蛋白的结合配偶 体。ALPL被认为是硬化蛋白的重要结合配偶体，或是至少由硬化蛋白组成 的多复合体的部分。另外，已经显示SOST在基于无细胞的测定中直接抑 制ALPL酶活性。
筛选测定
本发明提供鉴定调节剂的方法(本文也称作"筛选测定")，所述调节剂 例如，候选或测试化合物或试剂(抗体，抗体样支架，小分子，融合蛋白，肽， 模拟物,或抑制性核苷酸(例如，RNAi))，其结合硬化蛋白或硬化蛋白结合配 偶体，或相关复合体的蛋白质成员，并且对例如，硬化蛋白表达或活性具有 刺激性或抑制性作用。
所述方法包括用于鉴定能够调节硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互 作用的候选或测试化合物或试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂《J起 的硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体的相互作用变化。优选地所述方法包括 以下步骤a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条件下，在 测试剂存在或缺失时，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相接触;和b)在所 述测试剂存在或缺失时测量硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的相互作用， 其中(i)与测试剂缺失时的相互作用相比，在测试剂存在时的硬化蛋白:硬化 蛋白结合配偶体相互作用的减弱，将该测试剂鉴定为硬化蛋白:硬化蛋白结 合配偶体相互作用的激动剂，并且其中(ii)与测试剂缺失时的相互作用相比，在测试剂存在时的相互作用的增强，将该测试剂鉴定为硬化蛋白:硬化 蛋白结合配偶体相互作用的拮抗剂。
在硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的拮抗剂，抑制剂，负调节剂，或负 调控剂的情况下，发生硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用的抑制。拮 抗剂具有减弱或完全阻抑硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的结合的作用。 与拮抗剂缺失时的结合相比，在拮抗剂存在时，拮抗剂可以将硬化蛋白与 硬化蛋白结合配偶体的结合减弱至少10%, 20%， 30%, 40%, 50%, 60%, 70%， 80%,卯％，或减弱任「何两个前述数值之间的范围中的量。优选地， 拮抗剂将所述结合减弱至少10%。结合可以通过，例如利用本文所述的生 物化学和/或生物物理方法测量结合常数来进行测定。
在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白Frem2 相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂f 1起的硬化蛋白结合 Frem2的变化。在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化 蛋白多功能蛋白聚糖(CSPG2)相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由 所述试剂引起的硬化蛋白结合Versi的变化。在又一个实施方案中，本发 明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白肌原纤蛋白2(FBN2)相互作用的试剂 的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合肌原纤蛋白2的 变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋 白C6orf93相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬 化蛋白结合C6orf93的变化。在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定 能够调节硬化蛋白多配体聚糖-4(Sdc4)相互作用的试剂的方法，该方法包 括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合多配体聚糖-4的变化。在又一个实 施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白聚集蛋白(AGRN)相互 作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂51起的硬化蛋白结合聚集 蛋白的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋 白丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2(PN-1)相互作用的试剂的方法，该方法包括测 量由所述试剂引起的硬化蛋白结合丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2的变化。
在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:SLIT2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂51起的硬化蛋白结合
SLIT2的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化 蛋白:磷脂酰肌醇蛋白聚糖l相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所 述试剂引起的硬化蛋白结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的变化。在又一个实施 方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:LRP2相互作用的试剂的 方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合LRP2的变化。在 又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:LRP4相互作 用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合LRP4 的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋 白LRP6相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化 蛋白结合LRP6的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够 调节硬化蛋白生腱蛋白C相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所 述试剂引起的硬化蛋白结合生腱蛋白C的变化。在又一个实施方案中，本 发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:TRIM26相互作用的试剂的方法，该 方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合TRIM26的变化。在又一个 实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:TRIM41相互作用的 试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬化蛋白结合TRIM41的 变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋 白IL17-R相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述试剂引起的硬 化蛋白结合IL17-R的变化。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定 能够调节硬化蛋白ALPL相互作用的试剂的方法，该方法包括测量由所述 试剂引起的硬化蛋白结合ALPL的变化。
候选或测试化合物或试剂可以是针对(i)硬化蛋白；(ii)硬化蛋白结合配 偶体;(iii)硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用生成的新位点(例如，新 生成的表位决定簇)，或(iv)包含任何上述物质的蛋白质复合体的抗体，抗体 样支架，小分子，融合蛋白，肽，模拟物，或抑制性核苷酸(例如，RNAi)。
硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用，硬化蛋白或硬化蛋白结合配 偶体蛋白质活性，和/或硬化蛋白途径活性的变化可以通过PCR， TaqmanPCR，噬菌体展示系统，凝胶电泳，报告基因测定，酶母双杂交测定，RNA 印迹或蛋白质印迹分析，免疫组化，常规闪烁照相机，y相机，直线扫描 器，PET扫描器，SPECT扫描器，MRI扫描器，NMR扫描器，或X射线机 来测量。所述变化还可以通过使用选自标记位移，表面等离振子共振，焚 光共振能量转移(FRET)或生物发光共振能量转移(BRET)，荧光猝灭，和荧 光偏振来测量。的改变可以通过检测硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体之间相互作用的变化， 通过检测硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体水平的变化，或通过检测硬化蛋 白途径中 一种或多种蛋白质水平的变化来检测。上面描述可以检测的细胞 可以是骨、间质、肾细胞(例如，HEK)，或造血来源的，可以是经培养的细 胞，或可以获自或可以在转基因生物内。这些转基因生物包括，但不限于 小鼠、大鼠、兔、绵羊、奶牛或灵长类动物。对于涉及硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用变化的筛选实验，可 以在提高浓度的候选试剂存在或缺失时，将表达硬化蛋白或硬化蛋白结合 配偶体的细胞在结合緩沖液中与标记的硬化蛋白结合配偶体一起温育。为 了验证和校准该测定，可以使用提高浓度的未标记硬化蛋白结合配偶体来 进行对照竟争反应。温育后，进行洗涤步骤以去除未结合的硬化蛋白结合 配偶体。对于给定的标记(例如，闪烁计数，荧光，抗体染料等等)根据 需要来测量结合的、标记的硬化蛋白结合配偶体。在候选试剂存在时，结 合的标记硬化蛋白结合配偶体的量减少至少10%(例如，至少20%， 30%， 40%, 50 %，或60%)提示结合被候选试剂置换了 。在本文所述的这个或其它测定中，如果候选试剂在lmM或更低的浓 度置换了至少10%， 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,优选至少10%的标记的 硬化蛋白结合配偶体(亚饱和硬化蛋白结合配偶体剂量)，则候选试剂被 认为是特异性结合的。当然，硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的角色可以 转换；熟练技术人员可以修改该方法，在多种浓度候选试剂存在时将硬化 蛋白应用到硬化蛋白结合配偶体以测定硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用的变化。通过表面等离子振子共振(SPR)可以监测硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶 体相互作用的变化。表面等离子振子共振测定可以用作一种定量方法，以 便通过测量两个分子之间的结合，该测量是通过来自水相的硬化蛋白结合 配偶体与固定在传感器上的硬化蛋白的结合或者结合的丧失引发固定的传 感器附近质量的改变实现的。该质量的改变被测量为注射或除去硬化蛋白 结合配偶体或候选试剂后相对于时间的共振单位并且使用Biacore生物 传感器(Biacore AB)测量。根据Salamon等人(Salamon等人，1996， Biophys丄71:283-294; Salamon等人，2001， Biophys.J.80:1557國1567; Salamon等人，1999, Trends Biochem.Sci. 24:213-219，每一篇都被并入 本文作为参考)描述的方法，可以将硬化蛋白固定在传感器芯片(例如，研 究级CM5芯片，BiacoreAB)上。Sarrio等人阐明SPR可用于检测配体与 固定在芯片上的液体层中的GPCRA(1)腺苷受体的结合(Sarrio等人， 2000， Mol.Cell.Biol.20: 5164-5174，被并入本文作为参考)。本领域技术人 员使用Sarrio等人报导的条件作为起点可以微调SPR测定中硬化蛋白结 合配偶体结合硬化蛋白的条件。SPR可以以至少两种方法测定结合抑制剂。首先，硬化蛋白结合配偶 体可以预结合到固定的硬化蛋白上，然后注射浓度为O.lnM到1jiM的候 选试剂。可以定量所结合的硬化蛋白结合配偶体的置换，从而可以检测抑 制剂结合。备选地，芯片结合的硬化蛋白可以与候选试剂预孵育并用硬化 蛋白结合配偶体刺激。与没有预接触抑制剂的芯片上的结合相比，接触了 抑制剂的硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白结合的差异将表明在抑制剂存在 下硬化蛋白结合配偶体的结合或置换。在任一测定中，相对于不存在候选 试剂时结合的硬化蛋白结合配偶体的量，存在候选试剂时结合的硬化蛋白 结合配偶体的量降低10%或以上(例如，20%， 30%, 40%， 50%， 60%)表明 该候选试剂抑制硬化蛋白和硬化蛋白结合配偶体的相互作用。尽管上面是 将硬化蛋白固定，但技术人员可以容易地修改该方法，从而使硬化蛋白结 合配偶体成为被固定的组分。44检测硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白结合的抑制的另 一种方法4吏用荧光共振能量转移(FRET)。 FRET是一种量子力学现象，如果荧光供体(D) 的发射光谱与荧光受体(A)的激发光谱重叠，在相互非常接近的荧光供体(D) 和荧光受体(A)(通常相隔〈100埃)间发生FRET。待试验的分子，例如， 硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白被供体和受体荧光团的互补对标记。尽管 被硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用紧密结合，但是当硬化蛋白结合 配偶体和硬化蛋白不结合时，供体荧光团的激发所发出的荧光将与应答该激发波长所发生的荧光具有不同的波长，从而通过测量每个波长下发射强 度就可以定量结合的和未结合的分子。用于标记硬化蛋白的供体荧光团是 本领域中熟知的。特别感兴趣的是A.Victoria GFP的变体，它们已知为 CyanFP(CFP，供体(D))和Yellow FP(YFP,受体(A))。作为实例，可以将 YFP变体与硬化蛋白制成融合蛋白。用于表达GFP变体为融合物的载体 (Clontech)以及荧光团标记的硬化蛋白结合配偶体化合物(Molecular Probes)是本领域中乂>知的。将候选试剂加入标记的硬化蛋白结合配偶体和YFP-硬化蛋白的混合 物将导致能量转移的抑制，这可以通过例如，相对于没有候选试剂的样品 YFP荧光的降低来证明。在使用FRET检测硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶 体相互作用的测定中，相对于没有候选试剂的样品，含有候选试剂的样品 中受体波长下的荧光发射强度降低10 %或更大(例如等于或大于20%, 30%, 40%, 50%， 60%)，表明该候选试剂抑制硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相 互作用。相反，相对于没有候选试剂的样品，含有候选试剂的样品中受体 波长下的荧光发射强度提高10%或更大(例如等于或大于20%， 30%， 40%， 50%, 60%)，表明该候选试剂诱导构象变化并增强硬化蛋白硬化蛋白结合 配偶体相互作用。FRET的一种变型使用荧光摔灭来监测分子相互作用。相互作用对中 的一个分子可以用荧光团标记，并且另一个分子用当与其靠近并列时猝灭 所述荧光团的荧光的分子标记。当激发时荧光的变化表明在标记焚光团的 分子:醉灭剂对的締合中的变化。通常，标记的硬化蛋白的焚光中的增加是携带猝灭剂的硬化蛋白结合配偶体分子已被置换的指示。当然，当硬化蛋 白结合配偶体被荧光标记并且硬化蛋白带有淬灭剂时，将产生类似的效果。 对于猝灭检测，相对于没有候选试剂的样品，在包含候选试剂的样品中焚光发射强度增加10%或更多(例如等于或大于20%， 30%, 40°/。， 50%, 60%)，表明所述候选试剂抑制硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用。 相反，相对于没有候选试剂的样品，在包含候选试剂的样品中荧光发射强 度减少10%或更多(例如等于或大于20%，30%，40%，50%，60%),表明所 述候选试剂诱导构象变化并增强硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用。除了表面等离振子共振和FRET方法之外，荧光偏振检测可用于量化 结合。对于荧光-标记的分子的荧光偏振值取决于旋光相关时间(rotational correlation time)或转动速率(tumbling rate )。复合体，i者^口由石更4匕蛋白 与荧光标记的硬化蛋白结合配偶体締合形成的那些，具有比未复合的、标 记的硬化蛋白结合配偶体更高的偏振值。如果候选试剂破坏或抑制硬化蛋 白与硬化蛋白结合配偶体的相互作用，那么，相对于没有候选试剂的混合 物，包含硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用的候选试剂导致荧光偏振 的减少。荧光偏振非常适用于鉴定破坏复合体形成的小分子。相对于缺少 候选试剂的样品中的荧光偏振，在包含所述候选试剂的样品中的焚光偏振 减少10%或更多(例如等于或大于20%，30%，40%，50%，60%)，表明所述 候选试剂抑制硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用。另 一种检测系统是生物发光共振能量转移(BRET)，其使用包含生物 发光萤光素酶和荧光受体的融合蛋白之间的光转移。 一般地，将一个分子 的硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用对融合到荄光素酶(例如 Renilla安光素酶(Rluc))上，在萤光素酶底物(例如DeepBlueC)存在时，所 述萤光素酶是发射~395 nm波长光的供体。相互作用对的另一个分子融合 到受体荧光蛋白质上，其可以吸收来自供体的光，并在不同的波长下发射 光。荧光蛋白质的例子为GFP(绿色荧光蛋白)，其在 510nm发光。向供 体融合的硬化蛋白结合配偶体和受体融合的硬化蛋白的混合物添加候选试 剂将导致能量转移的抑制，其通过相对于没有候选试剂的样品，受体荧光等于或大于20%， 30%, 40%, 50%, 60%),表明所述候选试剂抑制硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体 相互作用。相反地，相对于没有所述候选试剂的样品，在包含候选试剂的 样品中受体波长下荧光发射强度10%或更多的提高(例如等于或大于20%， 30%, 40%， 50%， 60%)，表明所述候选试剂诱导构象变化并增强硬化蛋白 硬化蛋白结合配偶体相互作用。应当理解本文所述的任何结合测定都能以硬化蛋白的非硬化蛋白结合 配偶体配体(例如，激动剂，拮抗剂，等等)来实施，所述非硬化蛋白结合配 偶体配体例如，如本文所述鉴定的小分子或硬化蛋白结合配偶体模拟物， 包括但不限于任何天然或合成性肽，多肽，抗体或其抗原结合片段，脂类， 碳水化合物，和小有机分子。所述的任何结合测定都可以用于检测样品，例如组织样品中抑制剂的 存在，所述抑制剂结合硬化蛋白，或影响硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的 结合。对此，在样品存在或缺失的情况下将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶 体反应，并根据所用结合测定的需要来测量结合。硬化蛋白结合配偶体结 合的10%或更多(例如，等于或大于20%, 30%， 40%, 50%, 60%)的减少表 明样品包含调节硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白结合的抑制剂。所述的 FRET和BRET结合测定也可以用于测定样品，例如組织样品中增强剂的 存在，所述增强剂结合硬化蛋白，或影响硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白的 结合。对此，在样品存在或缺失的情况下将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶 体反应，并根据所用结合测定的需要来测量结合。硬化蛋白结合配偶体结 合的10%或更多(例如，等于或大于20%, 30%, 40%, 50%， 60%)的提高表 明样品包含调节硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白结合的增强剂。所述的任何结合测定都可以用于测定化合物文库中抑制剂的存在。所 述的FRET和BRET结合测定也可以用于测定化合物文库中增强剂的存 在。这些使用，例如高通量筛选的筛选技术是本领域所公知的。本发明还提供鉴定能够调节硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用 的试剂的方法，该方法包括在所述试剂存在时测量由硬化蛋白:硬化蛋白结 合配偶体相互作用诱导的信号应答，并将它与在所述试剂缺失时由硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答相比较。优选地所述方 法包括以下步骤a)在允许硬化蛋白结合配偶体与硬化蛋白相互作用的条 件下，在测试剂存在和缺失的情况下，将硬化蛋白与硬化蛋白结合配偶体 相接触；和b)测量硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答, 其中与缺失测试剂时的反应相比，存在测试剂时应答至少10%的变化表明 该测试剂被鉴定为能够调节硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用。与缺失测试剂时的应答相比，存在测试剂时信号应答提高至少10% 将该测试剂鉴定为硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用的激动剂。与缺 失测试剂时的应答相比，存在测试剂时信号应答降低至少10%将该测试 剂鉴定为硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用的拮抗剂。与缺失调节剂时的信号转导相比，在调节剂存在时，硬化蛋白:硬化蛋 白结合配偶体相互作用的调节剂(例如，通过本发明的方法所鉴定的那些) 可以将硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答改变至少 10%, 20%, 30%, 40%， 50%， 60%, 70%， 80%, 90%，或改变任何两个前述 数值之间的范围的量。优选地，调节剂将所述信号改变至少10%。改变可以 是提高或降低，这取决于监测的活性。信号可以通过本领域公知的方法进 行测定，例如，通过利用下面所述的报告基因构建体来测量信号水平。本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白Frem2相互作用的试剂的方 法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白:Frem2相互作用诱导的信号 应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白Frem2相互作用诱导的信号应答 相比较。在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白多功 能蛋白聚糖相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化 蛋白多功能蛋白聚糖相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时 硬化蛋白多功能蛋白聚糖相互作用诱导的信号应答相比较。在另一个实施 方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:肌原纤蛋白2相互作用法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白肌原纤蛋白2 相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白:肌原纤蛋白 2相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于 鉴定能够调节硬化蛋白C6orf93相互作用的试剂的方法，该方法包括测量 所述试剂存在时硬化蛋白C6orf93相互作用诱导的信号应答，并将它与所 述试剂缺失时硬化蛋白C6orf93相互作用诱导的信号应答相比较。在又一 个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:多配体聚糖-4相互 作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白多配体聚糖 -4相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白.，多配体聚 糖-4相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供 用于鉴定能够调节硬化蛋白:聚集蛋白相互作用的试剂的方法，该方法包括 测量所述试剂存在时硬化蛋白聚集蛋白相互作用诱导的信号应答，并将它 与所述试剂缺失时硬化蛋白:聚集蛋白相互作用诱导的信号应答相比较。在 又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:丝氨酸蛋白酶 抑制蛋白2相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化 蛋白丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试 剂缺失时硬化蛋白丝氨酸蛋白酶抑制蛋白2相互作用诱导的信号应答相比 较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:LRP2 相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白LRP2 相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白:LRP2相互 作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定 能够调节硬化蛋白LRP4相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试 剂存在时硬化蛋白:LRP4相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺 失时硬化蛋白LRP4相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案 中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:LRP6相互作用的试剂的方 法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白LRP6相互作用诱导的信号 应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白:LRP6诱导的信号应答相比较。49够调节硬化蛋白:磷脂酰肌醇 蛋白聚糖1相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化 蛋白:磷脂酰肌醇蛋白聚糖1相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂 缺失时硬化蛋白:磷脂酰肌醇蛋白聚糖1相互作用诱导的信号应答相比较。 在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:SLIT2相互 作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白SLIT2相互 作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白SLIT2相互作用 诱导的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够 调节硬化蛋白生腱蛋白C相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述 试剂存在时硬化蛋白:生腱蛋白C相互作用诱导的信号应答，并将它与所 述试剂缺失时硬化蛋白生腱蛋白C相互作用诱导的信号应答相比较。在 又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白:IL17-R相互 作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白:IL17-R相 互作用诱导的信号转导，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白:IL17-R相互 作用诱导的信号转导相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定 能够调节硬化蛋白TRIM26相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述 试剂存在时硬化蛋白:TRIM26相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试 剂缺失时硬化蛋白TRIM26相互作用诱导的信号应答相比较。在又一个实 施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节硬化蛋白TRIM41相互作用的试 剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时硬化蛋白TRIM41相互作用诱 导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化蛋白:TRIM41相互作用诱导 的信号应答相比较。在又一个实施方案中，本发明提供用于鉴定能够调节 硬化蛋白:ALPL相互作用的试剂的方法，该方法包括测量所述试剂存在时 硬化蛋白:ALPL相互作用诱导的信号应答，并将它与所述试剂缺失时硬化 蛋白:ALPL相互作用诱导的信号应答相比较。信号应答优选为Wnt和/或BMP途径的反应，其中抑制剂将会引发 Wnt和/或BMP途径活性的提高。信号转导可以通过例如使用报告基因构 建体测量信号水平来进行测定。例如，可以将展示硬化蛋白结合配偶体或硬化蛋白的合适哺乳动物细胞用报告基因构建体来转染，所述构建体包含对Wnt和/或BMP响应的启动子。当硬化蛋白结合硬化蛋白结合配偶体时， 抑制Wnt和/或BMP途径，报告蛋白的表达受到抑制，其减弱可以例如通 过免疫测定，荧光，光测量等等来进行测量，测量方式取决于报告蛋白的 性质。在候选试剂存在或缺失时测量表达。作为测量Wnt信号的基于细胞的测定法的特定例子，才艮告基因构建体 可以是包含十个TCF-结合位点，驱动荧火虫萤光素酶的表达的Wnt/p-联 蛋白依赖型SuperTOPFlash(STF)萤光素酶报告基因载体。这与Wnt表达 载体(如小鼠Wntl的表达构建体)和Renilla表达载体(SV40驱动，用于归 一化)一起可以转染入Hek293细胞或任何其它合适的细胞系。转染的细胞 导致STF萤光素酶报告基因的激活，这种激活可以被硬化蛋白所阻抑。本发明提供鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟物与硬 化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用具有相同、相似或改进的功能效 应，其中该方法包括测量候选模拟物与硬化蛋白的相互作用。优选地，所 述方法包括:a)在允许模拟物与硬化蛋白相互作用的条件下，将硬化蛋白与 候选模拟物接触;和b)测量模拟物与硬化蛋白的相互作用，其中该相互作 用为对于本文所述多种硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用的至少 10%,将候选模拟物鉴定为本发明的硬化蛋白结合配偶体模拟物。另夕卜，本发明提供鉴定硬化蛋白结合配偶体模拟物的方法，所述模拟 物与硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白的相互作用具有相同、相似或改进的 功能效应，其中该方法包括测量由硬化蛋白-模拟物相互作用诱导的信号应 答，并将它与硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作用诱导的信号应答相比 较。优选地，所述方法包括:a)在允许模拟物与硬化蛋白相互作用的条件下， 将硬化蛋白与候选才莫拟物接触;和b)测量由硬化蛋白-模拟物相互作用诱导 的信号应答，其中对于本文所述各种硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互作 用所观察到信号应答的至少10%的信号应答，将候选模拟物鉴定为本发明 的硬化蛋白结合配偶体模拟物。作为非限制性实例，本发明提供鉴定Frem2或LRP4模拟物的方法，在正常生理条件下所述模拟物具有与Frem2或LRP4和硬化蛋白之间的相 互作用相同、相似或改进的功能效应。硬化蛋白结合配偶体模拟物是与具有硬化蛋白结合配偶体结合硬化蛋 白相同、相似或改进的功能效应的化合物。它可以是这样的化合物，其包 含官能团的排列，经常具有额外的疏水或带电基团以模仿天然硬化蛋白结 合配偶体结构的结合区的活性构象。要理解硬化蛋白结合配偶体^^莫拟物也 可以包括天然硬化蛋白结合配偶体或其衍生物。根据本发明的 一个方面，模拟物展现硬化蛋白结合配偶体对硬化蛋白 结合的至少10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%， 90%,或是任何 两个上述值之间的范围中的值。优选地，模拟物展现硬化蛋白结合配偶体对 硬化蛋白结合活性的至少20%。根据本发明的一个方面，模拟物展现硬化蛋白结合配偶体信号转导活 性的至少10%, 20%， 30%, 40%， 50%, 60%， 70%, 80%， 90%，或是4壬何两 个上述值之间的范围中的值。优选地，模拟物展现硬化蛋白结合配偶体信号 转导活性的至少20%。可以通过本文对于其它测定所述的方法，如SPR和FRET进行模拟物 与硬化蛋白的相互作用的信号转导活性的测量。根据本发明的一个实施方案，可以通过这样的方法来鉴定模拟物，其 包括以下步骤:a)将硬化蛋白与候选模拟物接触;和b)测量由石更化蛋白-模拟 物相互作用诱导的信号应答，其中对于硬化蛋白:硬化蛋白结合配偶体相互 作用所测量的信号应答的至少10%(例如，等于或大于20%， 30%， 40%, 50%, 60%)的信号应答，表明该候选模拟物被鉴定为本发明的硬化蛋白结 合配偶体模拟物。信号应答优选为Wnt和/或BMP途径的应答，其中与非刺激性状态 相比，模拟物将会引发Wnt和/或BMP途径活性的降低。信号应答可以 通过例如使用上述的^^艮告基因构建体测量信号转导水平来进行测定。当硬 化蛋白结合硬化蛋白结合配偶体模拟物时，抑制Wnt和/或BMP途径，报 告蛋白的表达受到抑制，其减弱可以例如通过免疫测定，荧光，光测量等等来进行测量，测量方式取决于报告蛋白的性质。对于硬化蛋白:硬化蛋白 结合配偶体相互作用也可以测量所述表达。所述的任何结合测定都可以用于检测样品，例如组织样品中结合硬化 蛋白的模拟物的存在。对此，在样品存在或缺失的情况下将硬化蛋白进行 反应，并根据所用结合测定的需要来测量信号转导。硬化蛋白信号转导的 10%或更多(例如，等于或大于20%, 30%， 40%， 50%， 60。/。)的提高表明样 品包含结合硬化蛋白的模拟物。所述的任何结合测定都可以用于测定化合物文库中模拟物的存在。这 些使用，例如高通量筛选的筛选技术是本领域所公知的。此外本发明提供用于在受试者中诊断硬化蛋白相关病症和/或骨矿物 质密度异常病症的病症或倾向的方法，其包括下列步骤:(a)获得所述受试者 中硬化蛋白结合配偶体基因的核苷酸序歹'J，和(b)将它与健康受试者的核苷 酸序列比较，其中在各个硬化蛋白结合配偶体基因中的突变表明硬化蛋白 相关病症或其倾向。在受试者中SOST或编码硬化蛋白结合配偶体的基因的突变可以是与 骨量异常相关病症发展的预测子，和/或可以用于做诊断。这种突变改变硬 化蛋白和硬化蛋白结合配偶体之间的相互作用，例如，与健康受试者相比， 引起结合和信号转导的提高或降低。本发明的一个实施方案是用于诊断与骨量异常相关的病症的病症或倾 向的方法，其包括下列步骤:获得所述受试者中SOST或编码硬化蛋白结合 配偶体的基因的DNA核苷酸序列，并将它与健康受试者的核苷酸序列比 较，其中在各个硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的基因中的突变表明与骨 量异常相关病症或其倾向。本发明的另一个实施方案是用于诊断受试者中与骨量异常相关的病症 或病症倾向的方法，其包括下列步骤:获得所述受试者中SOST或编码硬化 蛋白结合配偶体的基因的DNA核苷酸序列，并将它与健康受试者的核苷 酸序列比较，其中与健康受试者相比，分别改变与硬化蛋白或硬化蛋白结 合配偶体结合的突变的存在表明与骨量异常相关病症或其倾向。突变可以存在于基因的非翻译部分(例如，在内含子、控制序列、启 动子中)，因为这些也导致所表达蛋白质的功能异常。这些突变可以是单核苷酸多态性(SNPs)。效应。与健康受试者相比，所述结合可以比健康受试者相比中观察到的结 合低至少10%, 20%， 30%， 40%， 50%, 60%, 70%， 80%，和优选地至少 20%。当观察到结合降低时，对于提高硬化蛋白作用的硬化蛋白结合配偶 体来说，就可以i貪断或预测与低骨量相关的病症。相反，对于减弱硬化蛋 白作用的硬化蛋白结合配偶体来说，当观察到结合的减弱时，就可以诊断 或预测与高骨量相关的病症。突变可以具有提高Wnt和/或BMP途径的信号应答的作用。与健康 受试者相比，信号应答可以比健康受试者中观察到的应答高至少10%, 20%, 30%, 40%, 50%， 60%， 70%, 80%，优选地至少20%。当观察到应答 的提高时，就可以诊断或预测与高骨量相关的病症。或者，突变可以具有提高硬化蛋白结合配偶体和硬化蛋白之间相互作 用的效应。与健康受试者相比，结合可以比健康受试者中观察到的结合高 至少10%， 20%， 30%， 40%, 50%, 60%， 70%， 80%,优选地至少20%。当 观察到结合提高时，对于提高硬化蛋白作用的硬化蛋白结合配偶体来说， 就可以诊断或预测与低骨量相关的病症。相反，对于减弱硬化蛋白作用的 硬化蛋白结合配偶体来说，当观察到结合的减弱时，就可以诊断或预测与 高骨量相关的病症。突变可以具有减弱Wnt和/或BMP途径的信号应答的作用。与健康受 试者相比，信号转导可以比健康受试者中观察到的应答低至少10%， 20%， 30%, 40%, 50%, 60°/。， 70%， 80%，优选地至少20%。当观察到应答减弱 时，就可以诊断或预测与低骨量相关的病症。结合和信号转导测定是技术人员的常规实践，并且在上文描述过。特 定基因的测序方法是公知的，并在例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,剂和化合物本发明的或本发明采用的候选或测试化合物或试剂可以使用本领域已 知的组合文库方法中的多种方法来获得，包括:生物文库；空间可寻址的平 行固相或溶液相文库；需要去巻曲的合成文库方法；"一珠一化合物"文库 方法；以及用亲和层析选择的合成文库方法。生物学文库方法限于肽文库， 而其他四种方法可应用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam等 (1997)Anticancer Drug Des. 12:145)。分子文库的合成方法的例子在本领域下述文献中可以查找到，例 如DeWitt等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.卯:6卯9; Erb等 (1994)Proc, Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann等(1994)' J. Med. Chem. 37:2678; Cho等(1993)Science 261:1303; Carrell等(1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell等(1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;和Gallop等(1994)J. Med. Chem. 37:1233。化合物文库可存在溶液中(例如 ， Houghten(1992)Biotochniquesl3:412)， 或 存 在 于 小 珠 (Lam(1991)Nature 354:82)、 芯片(Fodor(1993)Nature 364:555)、 细菌 (Ladner USP 5，223，409)、 孢子(Ladner USP 409)、 质粒(Cull 等 (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:1865)或噬菌体上(Scott 和 Smith(19卯)Science 249:386); (Devlin(1990)Science 249:404); (Cwirla等 (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87:6378); (Flici(1991)J.Mol.Biol.222:301); (Lader同上)。一个实施方案中，测定是基于细胞的测定，包括将表达硬化蛋白结合 配偶体的细胞与候选或测试化合物或试剂接触，并测定测试化合物调节(例 如刺激或抑制)所述硬化蛋白结合配偶体的活性的能力。可以通过，例如测 定候选或测试化合物或试剂调节硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用 的能力来实现测定测试化合物调节硬化蛋白结合配偶体的能力。通过测定直接结合可以实现测定候选或测试化合物或试剂调节硬化蛋 白结合配偶体的能力。这些测定可以例如，通过将硬化蛋白结合配偶体蛋 白质与放射性同位素或酶标记偶联，从而可以通过检测复合体中标记的蛋 白质测定蛋白质与候选或测试化合物或试剂的结合来实现。例如，分子，例如，蛋白质可以用1251，358，"(:，或3 [直接或间接标记，并通过》文射发射直 接的计数，或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，可以用酶标记分 子，例如，用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，或萤光素酶标记，并通过测 定合适的底物转化为产物来检测酶标记。测定候选或测试化合物或试剂调节硬化蛋白结合配偶体(或硬化蛋白 硬化蛋白结合配偶体相互作用)的能力也属于本发明的范围，其中任何相互 作用物均未标记。例如，在任何相互作用物均未标记的情况下，可以采用 微量生理测定计来检测测试化合物与硬化蛋白结合配偶体的相互作用 (McConnell等(1992)Science 257:1卯6)。本文所用的"微量生理测定计，，(例 如，Cytosenosor)是一种分析仪器，它使用光可寻址的电势传感器(LAPS) 测定细胞使其环境酸化的速度。该酸化速度的变化可作为化合物与受体之 间相互作用的指示剂。在又一个实施方案中，本发明的测定是无细胞测定，其中蛋白质或其 生物活性部分与候选或测试化合物或试剂(例如，或 一种化合物，测试其调节 硬化蛋白结合配偶体，或调节由硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用产 生的信号转导的能力)相接触，并测定测试化合物结合硬化蛋白结合配偶体， 或其生物活性部分的能力。可以如上所述直接或间接地测定测试化合物与 硬化蛋白结合配偶体蛋白质的结合。这种测定可以使用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)的技术来实 现。Sjolander等，1991Anal. Chem. 63:2338-2345和Szabo等，1995 Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本文所用的"BIA"是一种实时研究生物特异 性相互作用的技术，未对任何相互作用物进行标记(例如BIAcore)。表面等 离振子共振(SPR)的光学现象改变可以用作生物分子间实时反应的指示。在本发明以上测定方法的又一个实施方案中，可能希望固定硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体以促进蛋白质的复合形式与非复合形式相分离，以 及适应测定的自动化。测试化合物与硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体的结 合可以在任何适于包含反应物的容器中完成。这种容器的例子包括微量滴 定板、试管、和微量离心管。在一个实施例方案中，可以提供添加了一种结构域的融合蛋白，所述结构域使蛋白质结合在基质上。例如谷胱甘肽s-转移酶/激酶融合蛋白，或谷胱甘肽s-转移酶/靶融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠(Sigma Chemical, St丄ousis， Mo)或谷胱甘肽衍生的微 量滴定板上，然后与测试化合物，或测试化合物和非吸附的硬化蛋白或硬 化蛋白结合配偶体蛋白质混合，将混合物在诱导复合体形成的条件下(例如 在生理条件的盐浓度和pH下)温育。温育后，洗涤珠或微量滴定板的孔， 以除去未结合的组分，在小珠的情况下基质是固定的，如以上所述，例如 直接或间接测定复合体。或者，可将复合体与基质解离，并用标准技术测 定结合水平。其他将蛋白固定在基质上的技术也用在本发明的筛选测定中。例如， 硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体可以利用与生物素和链霉抗生物素蛋白的 缀合而固定化。生物素化的硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质或耙分 子可以用本领域众所周知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals, Rockford， IL),从生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)制备，并固定在链霉抗 生物素蛋白包被的96孔板(PierceChemical)的孔中。或者，与硬化蛋白或 硬化蛋白结合配偶体蛋白质或靶分子反应的抗体可以衍生化在该滴定板的 孔上，并通过抗体缀合将未结合的硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质 捕获在孔中。除了上述GST-固定化复合体的方法之外，检测这种复合体的应进行复合体的免疫检测。本发明的再一方面，在双杂交测定或三杂交测定法(参见例如美国专利 号5,283,317; Zervos等(1993)Cdl 72:223-232 ; Madura等(1993)J. Biol.Chem.268:12046画12054;Bartel等(1993)Biotechniquesl4:920-924; Iwabuchi等(1993)Oncogene 8:1693-1696;和Brent WO 94/10300)中硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质可用作"饰蛋白"，以鉴定结合硬化蛋白 或硬化蛋白结合配偶体蛋白质的其它蛋白质。这些硬化蛋白或硬化蛋白结 合配偶体-结合蛋白质也有可能参与硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶体蛋白质的信号的放大。双杂交系统是基于大多数转录因子的模块特性，大多数转录因子由独立的DNA结合结构域和活化结构域组成。简而言之，所述测定利用两种 不同DNA构建体。在一个构建体中，编码硬化蛋白或硬化蛋白结合配偶 体蛋白质的基因与编码已知转录因子(例如GAL-4)的DNA结合结构域的 基因融合。在另一个构建体中，使编码未鉴定蛋白("捕获物"或"样品")的 来自自DNA序列文库的DNA序列与编码已知转录因子的活化结构域的基 因融合。如果"饰"和"捕获"蛋白能够在体内相互作用形成激酶依赖性复合 体，则所述转录因子的DNA结合和活化结构域紧密靠近。这种密切靠近 使得与转录调节位点有效连接的报道基因(例如LacZ)响应转录因子发生 转录。可检测报道基因的表达，分离含有功能性转录因子的细胞集落，用克隆基因。本发明进一步涉及通过上述筛选测定鉴定的新试剂。因此，在合适的 动物模型中进一步使用根据本文所述鉴定出来的试剂在本发明的范围内。 例如，可以将根据本文所述鉴定的试剂(例如能够调节硬化蛋白:硬化蛋白 结合配偶体相互作用的试剂)用在动物模型中以测定用这种试剂治疗的效 力、毒性，或副作用。或者，可以将根据本文所述鉴定的试剂用在动物模 型中以测定这种试剂的作用机制。另外，本发明涉及通过上述筛选测定鉴 定的新试剂用于本文所述治疗中的用途。药物组合物本文所述的组合物可以是药物组合物。本发明提供药物组合物，其包 含与生理学相容的载体混合的(i)硬化蛋白硬化蛋白结合配偶体相互作用 的调节剂(例如，小分子调节剂)，或(ii)根据本发明的硬化蛋白 合配偶体模拟物。除了活性成分之外，这些药物组合物可以包含显著量的能够药用的 一种或多种无机或有机的固体或液体的可药用载体，以及生理上可接受的 稀释剂(如水，磷酸緩冲盐水，或盐水)。根据本发明的药物组合物适于施用于温血哺乳动物，特别是人(或施 用于源自温血哺乳动物，特别是人的细胞或细胞系，例如成骨细胞或破骨 细胞)，用于治疗，改善，诊断，或预防硬化蛋白相关病症和/或骨矿物质 密度异常病症。根据本发明的药物组合物是经肠道，如鼻，直肠或口，或肠胃外，如 肌内或静脉内施用于温血哺乳动物(特别是人)的那些药物组合物。活性 成分的剂量取决于温血哺乳动物的物种、体重、年龄和个体条件，个别的 药物动力学数据，待治疗的疾病和施用方式。例如，给温血哺乳动物，例如体重约为70kg的人施用的调节剂(例如，小分子调节剂)或其可药用的盐 的剂量优选地为从大约3 mg到大约10 g，更为优选地从大约10 mg到大 约1.5g，最优选地从大约100 mg到大约1000 mg/人/天，优选地分成1 ~ 3个单次剂量，所述单次剂量可以是，例如相同大小的。通常，儿童服用 成人剂量的一半。合适的剂量也可以在试验中确定，首先在合适的动物模型中，随后在 待治疗的物种中。施用的量和频率当然将取决于这些因素，诸如待治疗适 应症的性质和严重性，预期反应，待治疗个体的状况等等。合适的剂量是 在从大约10ng/kg/天到大约100jig/kg/天的范围内，可单独或组合给药。 优选地可以预期从100 ng/kg/天到大约1000 ng/kg/天的剂量持续1-20天诱 导以适当的生物学效应。或者，可以在大约4天的间隔内进行从大约 lHg/kg/天大约100 fig/kg/天的快速浓注以通过免疫加强由巨噬细月包/单核 细胞介导的免疫和/或炎性反应来发挥抗微生物作用。药物组合物包含从大约1%到大约95%，优选地从大约20%到大 约90%的活性成分。根据本发明的药物组合物可以是，例如，单位剂型， 如安瓿，小瓶型，栓剂，糖锭剂，片剂或胶嚢剂的形式。本发明的药物组合物可以本身已知的一种方法制得，例如用常规的溶解、冻干、混合、粒化或成型的方法。优选应用活性成分的溶液和混悬液，以及尤其优选应用等渗水溶液或 混悬液，例如，在只包含活性成分或还含有载体如甘露醇的冻干组合物情 形中，使用前配制成此类溶液或混悬液。药物组合物必须灭菌和/或可以含 有赋形剂，例如防腐剂，稳定剂，润湿剂和/或乳化剂，增溶剂，调节渗透 压的盐和/或緩冲剂，并且可按本来已知的方式制得，例如用通常的溶解或 冻干的方法。所述溶液或混悬液可含有粘性增强物质，如羧甲基纤维素钠， 羧曱基纤维素，葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮或凝胶。油中的混悬液包含作为油组分的常用于注射目的的植物油，合成油或半合成油。尤其提及的是液态脂肪酸酯，其含有作为酸组分的具有8~22， 尤其12~22个碳原子的长链脂肪酸，例如月桂酸，十三酸，十四酸，十五 酸，棕榈酸，十七酸，硬脂酸，花生酸，二十二烷酸或相应的不饱和酸， 例如油酸，反油酸，芥酸，巴西酸(brasidic)或亚油酸，如果需要的话， 加入抗氧剂，例如维生素E， p-胡萝卜素或3， 5-二叔丁基-4-羟基曱苯。这 些脂肪酸酯的醇组分最多有6个碳原子且是单-或多-幾基的，例如单-,二-或三-羟基的，醇，例如曱醇，乙醇，丙醇，丁醇或戊醇或其异构体，但尤 其是乙二醇和甘油。因此，脂肪酯的例子如下:油酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯， 棕榈酸异丙酯，"LabrafilM2375 "(三油酸聚氧乙烯甘油酯，Gattefosse， 法国)，"Miglyol 812"(链长为C 8 ~ C 12的饱和脂肪酸的甘油三酯，Huls AG，德国)，但尤其是植物油，如棉籽油，杏仁油，橄榄油，荒麻油，芝 麻油，大豆油，和特别是花生油。在无菌条件下，用通常的方式可制得注射组合物;同样也适用于把组合 物装入安瓿或小瓶中并密封容器。用于口服的药物组合物可如下得到将活性成分和固体载体组合，需 要的话，粒化得到的混合物，以及需要或必要的话，在加入适当的赋形剂 后，把混合物加工成片剂、糖锭剂核心或胶嚢剂。也可能把药物组合物掺 入塑料栽体中，其使活性成分以可测的量扩散或释放出。合适的载体尤其是填充剂，如糖，例如乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨醇，纤维素制剂和/或磷酸钩，例如磷酸三钓或磷酸氬钓，以及粘合剂，如淀粉 糊剂，例如使用玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤 维素，羟丙基曱基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮，和/或， 如果需要的话，崩解剂，如上述的淀粉，及羧甲基淀粉，交联的聚乙烯吡 咯烷酮，琼脂，藻酸或其盐，如藻酸钠。赋形剂尤其是流动调节剂和润滑 剂，例如硅酸，滑石，硬脂酸或其盐，如镁或钩的硬脂酸盐，和/或聚乙二 醇。糖锭剂具有合适的、任选肠的包衣，特别用的是浓的糖溶液，其中含 有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化钛，或合适 有机溶剂中的包衣溶液，或对于肠包衣的制备，合适的纤维素制剂的溶液， 如乙基纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基曱基纤维素邻苯二甲酸酯。胶嚢是由明胶制成的千填胶嚢和由明胶和增塑剂如丙三醇或山梨醇制成的软密封胶 嚢。干填的胶嚢含有颗粒状的活性成分，和填充剂，如乳糖，粘合剂，如 淀粉，和/或助流剂，如滑石或硬脂酸镁，且需要的话，还有稳定剂。在软 胶嚢中，活性成分优选溶于或悬浮于合适的油性赋形剂中，如脂肪油，石 蜡油或液态聚乙二醇，也可能加入稳定剂和/或抗菌剂。例如，为了鉴定目 的或指出活性成分的不同剂量，可在片剂或糖锭剂包衣或胶嚢外壳中加入 染料或色素。抗体利用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，可以将硬化蛋白结合配偶 体用作免疫原来产生抗体。可以使用全长多肽或蛋白质，或者，备选地，本 发明提供抗原肽片段用作免疫原。本发明的蛋白质的抗原肽包含硬化蛋白结合配偶体的氨基酸序列的至少8个(优选地10， 15， 20，或30个)氨基酸残 基，并包括蛋白质的表位，从而使得针对该肽生成的抗体与所述蛋白形成 特异性免疫复合体。抗原肽所包含的优选的表位是位于蛋白质表面上的区域，例如，亲水 区。可以利用亲水性图或类似分析来鉴定亲水区。一般通过免疫合适的受试者(例如，兔，山羊，小鼠或其它哺乳动物)利用免疫原来制备抗体。合适的免疫原制品可以包含，例如，重组表达或化 学合成的多肽。该制品可以进一步包括佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂， 或类似的免疫刺激剂。本文所用的术语抗体指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性 部分，即，包含抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点特异性结合抗原， 如硬化蛋白结合配偶体。抗体包括常规免疫免疫球蛋白分子，及其片段， 所述片段也与硬化蛋白结合配偶体和/或硬化蛋白特异性反应。可以利用常 规技术将抗体片段化并以下面对于完整抗体所述的相同方式对片段篩选用途。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab，)2片段， 其可以通过用酶如胃蛋白酶处理抗体来生成。本发明提供多克隆和单克隆 抗体。本文所用的术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"，指只包含一 种抗原结合位点的抗体分子群体，所述抗原结合位点能够与特定表位免疫 反应。多克隆抗体可以如上所述通过用本发明的多肽作为免疫原来免疫合适 的受试者来制备。在经免疫的受试者中抗体效价可以通过标准技术来监测， 如使用固定化多肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)。如果必要，可以从哺乳 动物体内(例如从血液中)分离抗体分子，并且通过公知技术进一步纯化， 如蛋白A层析，以便获得IgG级分。可以在免疫之后的适当时间，例如， 在特异性抗体效价最高时，从所述受试者体内获得抗体生产细胞，并且用 于通过标准技术制备单克隆抗体，如最初由 Kohler和 Milstein((1975)Nature256:495-497)所披露的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤 技术(Kozbor等(1983)Immuno1 Today 4:72)， EBV杂交瘤技术(Cole等 (1985)， Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy, Alan R丄iss， Inc., pp.77-96)或三瘤技术。用于生产杂交瘤的技术是众所周知的(一般参见 Current Protocols in Imiminology(1994)Coligan等(eds.)John Wiley & Sons, Inc., New York, NY)。例如，利用标准ELISA测定，通过对杂交瘤 培养上清液筛选结合目标多肽的抗体来检测产生本发明的单克隆抗体的杂 交瘤细胞。作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的备选方案，针对本发明的多肽的 单克隆抗体可以通过用目标多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如，抗 体噬菌体展示文库)来进行鉴定和分离。可以通过商业渠道获得用于制备
和篩选嗟菌体展示文库的试剂盒((例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System,目录号27 9400 Ol;和Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit,目录号240612))。另夕卜，特别适用于制备和筛选抗体展示文库 的方法和试剂的例子可以参见以下文献，例如，美国专利号5,223,409; PCT
发明者C·X·吕, C·阿勒, M·克奈塞尔, S-I·胡 申请人:诺瓦提斯公司