专利名称：用于治疗软骨疾病的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含兽医用等的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物等。
背景技术：
例如关节软骨是透明软骨，含有少量的细胞、胶原性的胞外基质，较多的蛋白聚糖 和水。骨骼中存在血管或神经网络，具有自身修复能力，因此即使骨折时，骨折部分大多可 以充分修复。但是，关节软骨中不存在血管和神经网络。因此几乎没有自身修复能力，特别 是形成了大的软骨缺损部位时，软骨缺损部位无法充分修复，即使有被修复的部分，也形成 与透明软骨力学特性不同的纤维软骨。因此，如果形成了软骨缺损，则导致关节痛以及关节 功能的丧失，常进展为骨关节炎。另外，由于老龄或关节的过度使用，病状由关节软骨表面 开始磨损的骨关节炎的初期阶段逐步进展，结果导致大范围的软骨缺损。如上所述，关节软骨的自身修复能力不足，因此必须进行自体骨软骨镶嵌移植术 (Mosaicplasty)、用钻打孔的方法(微骨折术microfracture)、钻孔术(drilling)、用棒 削除软骨下骨的方法(磨削术abrasion法)、以及切除损伤软骨(清创术debridement) 等治疗软骨损伤的外科处置。其中，微骨折术、钻孔术、磨削术被称为骨髓刺激法(marrow stimulation technique)，促进骨髓出血，诱导来自骨髓的软骨前体细胞，期待其分化成软 骨。但是，它们对于大范围的软骨缺损是有极限的，通过该方法再生的是与透明软骨力学特 性不同的纤维软骨。Peterson等人以及Grande等人于1984年在兔的关节软骨的非完全层中试验了自 体软骨细胞移植(ACI)法。ACI法是由自身的正常软骨中采集组织并培养、在将培养的细 胞悬浮于培养基中的状态下移植到患部、用骨膜覆盖软骨缺损部位、使细胞不漏出的方法。 ACI法最早于1994年应用于临床，目前已超过15年。目前为止临床已有几例成功病例的报 告。但是，在最近的临床试验中，也有报告指出对于关节软骨缺损的修复，与其它手术相比， ACI法并未显示显著优异的结果。上述ACI法并不优异的结果有两个主要的原因。一是细胞和支架与关节缺损部位 的固定、以及骨膜瓣的覆盖有技术性困难。ACI法中，是将细胞悬浮液用骨膜瓣覆盖并缝合， 因此必须通过关节切开使关节较大幅度露出。并且也报道了包含骨膜肥厚、缺损形成、关节 内粘连的骨膜瓣相关的几种复杂的问题。另一个理由是软骨细胞的应用是有极限的。软骨 细胞由于单层培养而急速地丧失其分化表型，转化为成纤维细胞。还有另一问题，ACI法必 须是从患部关节的不负荷重量的部位采集软骨，但是供应部位由于被采集了软骨细胞而保 持有问题的状态。另一方面，将胶原、壳聚糖、琼脂糖、褐藻酸等天然聚合物利用于关节软骨的再 生医疗的尝试正在取得进展。其中，褐藻酸是由空茎昆布(Ecklonia cava)、褐藻羽叶藻 (Eisenia bicyclis)、海带(Laminaria)等褐藻类提取的多糖类，具有加入钙等2价金属 离子则形成交联的性质，人们尝试利用该性质，将软骨细胞等细胞、生长因子等包埋到凝胶 中，应用于损伤部位(例如参照文献1、文献2、3、4、5等)。
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例如，文献1中公开了将可溶性褐藻酸盐与不溶性褐藻酸盐/凝胶混合而成的褐 藻酸凝胶，文献2、3、4中公开了褐藻酸微球的应用。文献2中认为，褐藻酸可作为不会对损 伤部位有任何不利影响的载体使用，褐藻酸本身不具有任何治疗效果。文献4中公开了包 埋在褐藻酸微球中的软骨细胞在移植到兔软骨缺损部位后未见与宿主组织的融合。另外， 褐藻酸微球必须按压在缺损部位上应用，必须制成适合缺损部位的大小，这在实际临床应 用时存在技术性困难。文献5中公开在将软骨细胞悬浮于褐藻酸钠溶液中注射到兔软骨 缺损部位后、用CaCl2溶液使表面固化的移植物中，形成了正常的软骨组织，但是，在不含有 细胞而只将褐藻酸应用于软骨缺损部位时，则形成了纤维软骨。作为将间叶系干细胞应用于软骨再生医疗的尝试，例如对于将胶原海绵等作为细 胞的支架等的研究取得了进展。有在机体外分化成软骨细胞然后移植的方法；和不分化成 软骨细胞即进行移植的方法，对于哪种利用方法最佳尚有争论(文献6)。骨关节炎(OA)中的软骨缺损是在广泛且负荷区域内发生，因此难以通过移植或 再生医疗进行修复。上述的可通过细胞移植成为软骨再生对象的主要限于由于运动或外伤 等产生的部分软骨缺损。骨关节炎的治疗主要着眼于消除患部的疼痛或炎症，国外的主流 方法是给予非类固醇性抗炎症药。但是老年患者肾功能降低，从安全性的角度考虑，难以连 续口服给予非类固醇性抗炎症药。将软骨关节液的成分之一透明质酸制成制剂得到的产品 通过给予关节腔内，具有改善关节的润滑功能、并且抑制疼痛的作用，因此大多作为骨关节 炎中关节功能改善药使用。但是，对于软骨损伤进一步进展形成的重度骨关节炎，最终除了 进行人工关节置换以外别无它法，人们期待有新型的治疗药物的开发。[文献]1.国际公开2006/044342号小册子2.Cay M. Mierisch 等 人.,"Transforming Growth Factor-β inCalcium Alginate Beads for the Treatment of Articular Cartilage Defectsin the Rabbit 酸钙微球中的TGF-β用于治疗兔的关节软骨缺损)”，The Journal of Arthroscopic and Related Surgery, 18 卷，No. 8 (10 月)，2002 892 900 页3. David R. Diduch ^A · , "Marrow Stromal Cells Embedded inAlginate for Repair of Osteochondral Defects (包埋有骨髓间充质干细胞的藻酸盐用于修复骨软骨 缺损)，，，The Journal of Arthroscopic andRelated Surgery, 16 卷，No. 6 (9 月)，2000 571 577页4.David R. Diduch 等 人.,"Chondrocyte Transplantation intoArticular Cartilage Defects with Use of Calcium Alginate (将软骨细胞和藻酸钙一起移植到关 节软骨缺损部位):The Fate of the Cells”，J BoneJoint Surg. Am. 85 :2003，1757 1767 页5. Ε. Fragonas 等 人.,"Articular Cartilage Repair in Rabbits by UsingSuspensions of Allogenic Chondrocytes in Alginate ( i^^M^^MWi^^fk 的藻酸盐修复兔的关节软骨)”，Biomaterials，21卷，2000 795 801页6. Life Science Report No. 4，2005 (编辑东京医科齿科大学知识产权部，发行 丸善株式会社)，235 243页，编辑助理关矢一郎
发明内容
发明所要解决的课题如上所述，在软骨缺损部位的再生医疗中，在考虑到实际临床应用时，从细胞毒性 的问题、与机体的亲和性、容易采用的程度、治疗效果等角度考虑并不适合实际应用。即，人 们希望能够开发无需采取ACI法等过度的外科方法、手术方法简便、对机体没有软骨细胞 或骨膜采集等产生过度的负担、可有效促进软骨再生、对于各种形态的软骨损伤部位无需 选择适用条件均可广泛利用、可降低施加到软骨损伤部位的交联剂等的负面影响、与机体 亲和性优异的、可克服上述软骨再生医疗领域课题、实际应用性优异的用于软骨再生或用 于治疗软骨疾病的组合物，以及使用该组合物的治疗方法。特别是，不包埋细胞而只用聚合 物即可以再生透明软骨的组合物目前尚不存在。骨关节炎是由于老龄或关节的过度使用使关节软骨磨损减少的退行性疾病，认为 这并不只是磨损等力学原因，滑膜细胞或软骨细胞生成炎症性细胞因子、炎症性细胞因子 诱导发痛物质或蛋白质分解酶等的局部炎症反应也参与了关节破坏。即，伴随关节软骨的 磨损(机械损伤)，在关节组织内弓I发炎症反应，炎症反应使自身破坏性软骨损伤进展，关 节功能降低，由此使机械损伤进一步进展，由于该恶性循环使病态恶化。因此，对于骨关节 炎的治疗药物，需求兼具在磨损中保护软骨的效果、抑制磨损或炎症导致的软骨退行性改 变的效果、修复软骨损伤部位的效果、抑制炎症或疼痛的效果等复合性的效果。如果可获得 可抑制关节的炎症、可抑制疼痛的药物，也可以应用于肩周炎的治疗或慢性风湿性关节炎 中的关节痛的抑制。透明质酸原本是关节液的主要成分之一，通过补充该成分可改善关节 机能。目前，对软骨组织具有复合性的治疗效果的药物除透明质酸外并无其它药物。透明 质酸制剂是由动物组织提取或通过发酵方法制备的，人们需求制备更容易、安全性更高的 新型材料。另外，透明质酸制剂必须是初期每周给药一次、连续给药五次，和之后的持续给 药，为了减少对膝关节的注射次数，人们需求持续时间更长、治疗效果更高的新型组合物。解决课题的方法本发明人等为解决上述课题进行了深入的研究。通过将含有使内毒素水平降低至 实质上不会引发炎症或发热的程度的褐藻酸的1价金属盐、粘度为400 20000mPa · s的 具流动性的组合物应用于软骨损伤部位，得知无需过度的外科方法，通过简便的方法即可 促进软骨再生。将上述组合物应用于关节软骨的缺损部位，在其表面应用CaCl2溶液，则该组合物 不会从所应用的位置上移动。令人惊讶的结果是它可应用于如关节软骨这样的有负荷、活 动剧烈的严酷条件的部位。通过使本发明的组合物的粘度为约2000mPa 以上，即使在损 伤面朝向下方的姿势下也可应用。本发明的组合物在包埋有骨髓间充质干细胞或间质细胞时，获得了明显优异的软 骨再生。还发现，在不包埋这些细胞时，本发明的组合物也获得了透明软骨细胞带来的良好 的透明软骨再生，从而完成了本发明。另外，将含有使内毒素水平降低至实质上不会引发炎症或发热的程度的褐藻酸的 1价金属盐的组合物应用于骨关节炎模型的软骨损伤部位，发现可抑制软骨退行性改变、获 得保护软骨的效果。并且，在试验性关节炎疼痛模型中，发现该组合物具有抑制关节炎引起 的疼痛的效果，从而完成了本发明。
关节液的主要成分-透明质酸以外的物质对上述软骨组织具有复合性的效果，这 首次得到证实。来自海藻的聚合物、在动物体内原本不存在的褐藻酸具有上述效果，这是另 人惊讶的。S卩，本发明提供应用于软骨损伤部位的、以下的用于软骨再生的组合物。(1-1)用于软骨再生的组合物，该组合物应用于软骨损伤部位而在患部固化，该组 合物含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐、粘度为400mPa · s 20000mPa · s、具有流动性。(1-2)上述(1-1)所述的组合物，其中，上述褐藻酸的1价金属盐为褐藻酸钠。(1-3)上述(1-2)所述的组合物，其中，上述褐藻酸钠是通过凝胶过滤色谱测得的 重均分子量为50万以上的褐藻酸钠。(1-4)上述(1-1) (1-3)中任一项所述的组合物，其中，对上述软骨损伤部位的 应用为以下任意形式a)应用于软骨缺损部位、b)在软骨损伤部位或软骨缺损部位形成一 个以上的孔，应用于该形成的孔。(1-5)上述(1-1) (1-4)中任一项所述的组合物，其特征在于该组合物中不含 有用于软骨组织再生的细胞。(1-6)上述(1-1) (1-4)中任一项所述的组合物，其中，该组合物中包埋有用于 软骨组织再生的细胞。(1-7)上述(1-6)所述的组合物，其中，上述含有包埋了细胞的褐藻酸的1价金属 盐的组合物在应用于软骨损伤部位之前，包埋体外培养至选自下述的1种以上的状态的细 胞a)细胞数为IXlO6个/mL以上的状态、b)通过番红0染色或H-E染色检测出透明软 骨组织的状态、c)通过抗胶原II型抗体或基因分析检测出II型胶原的状态、d)通过抗糖 苷配基抗体或基因分析检测出糖苷配基的状态、e)分泌胞外基质(胶原、透明质酸、蛋白聚 糖)的状态。(1-8)上述(1-6)或(1-7)所述的组合物，其中，用于上述软骨组织再生的细胞包 含骨髓间充质干细胞。(1-9)上述(1-1) (1-8)中任一项所述的组合物，其中，在将上述组合物应用于 上述软骨缺损部位的开口部、或者在上述软骨损伤部位或软骨缺损部位上形成的孔的开口 部倾斜的、或者是朝向下方的状态的软骨损伤部位时，至少在损伤部位附着5秒以上。(1-10)上述(1-1) (1-9)中任一项所述的组合物，其中，该组合物可用16G的注 射针应用于软骨损伤部位。(1-11)上述(1-1) (1-10)中任一项所述的组合物，其中，将上述组合物应用于 软骨损伤部位，并在该组合物的表面应用交联剂。(1-12)上述(1-11)所述的组合物，其中，上述交联剂是CaCl2溶液。(1-13)上述(1-1) (1-12)中任一项所述的组合物，其中，上述软骨损伤部位是 关节软骨的损伤部位。(1-14)上述(1-1) (1-13)中任一项所述的组合物，其中，上述软骨的再生是以 透明软骨的再生为目的。本发明还提供可通过向软骨疾病患者的关节内注入给药来获得治疗效果的组合 物。(2-1)用于治疗软骨疾病的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含有
6低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-2)用于抑制软骨退行性改变的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在 于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-3)用于保护软骨的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含有低内 毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-4)用于修复软骨的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含有低内 毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-5)用于抑制关节疼痛的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含有 低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-6)用于抑制关节炎症的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含有 低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-7)用于改善关节机能的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含有 低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-8)用于治疗骨关节炎的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含有 低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-9)用于治疗肩周炎的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含有低 内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-10)用于抑制风湿性关节炎的关节痛的组合物，该组合物关节内注入给药，其 特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-11)用于关节内注入的组合物，该组合物具有缓解、改善或治愈与软骨疾病相 关的病态的效果，其特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(2-12) (2-11)所述的组合物，其中，上述的缓解、改善或治愈与软骨疾病相关的病 态的效果选自抑制软骨退行性改变、保护软骨、修复软骨、抑制关节痛、抑制关节炎症和改 善关节机能的至少一种。(2-13)上述(2-1) (2_12)中任一项所述的组合物，其中，上述褐藻酸的1价金 属盐为褐藻酸钠。(2-14)上述(2-13)所述的组合物，其中，上述褐藻酸钠是凝胶过滤色谱测得的重 均分子量为50万以上的褐藻酸钠。(2-15)用于治疗软骨疾病的组合物，该组合物关节内注入给药，其特征在于含 有凝胶过滤色谱测得的重均分子量为50万以上的低内毒素褐藻酸钠作为有效成分。本发明进一步提供以下的软骨损伤部位的治疗方法和用于该治疗方法的组合物。(3-1)软骨损伤部位的治疗方法，该方法是将组合物应用于软骨损伤部位，所述组 合物含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐、粘度为400mPa · s 20000mPa · s、具有流动性。(3-2)上述(3-1)所述的方法，该方法是将含有上述褐藻酸的1价金属盐的组合物 应用于软骨损伤部位，并在该组合物的表面应用交联剂，使其固化。(3-3)上述(3-1)或(3-2)所述的方法，该方法是在上述含有褐藻酸的1价金属盐 的组合物中包埋用于软骨组织再生的细胞，并将其应用于软骨损伤部位。(3-4)上述(3-1) (3-3)中任一项所述的方法，该方法是在上述含有褐藻酸的1 价金属盐的组合物中包埋用于软骨组织再生的细胞，在体外培养至选自下述的1种以上的状态，然后应用于软骨损伤部位a)细胞数为1 X IO6个/mL以上的状态、b)通过番红0染 色或H-E染色检测出透明软骨组织的状态、c)通过抗胶原II型抗体或基因分析检测出II 型胶原的状态、d)通过抗糖苷配基抗体或基因分析检测出糖苷配基的状态、e)分泌胞外基 质(胶原、透明质酸、蛋白聚糖)的状态。(3-5)上述(3-2) (3_4)中任一项所述的方法，其中，上述交联剂是CaCl2溶液。(3-6)上述(3-1) (3-5)中任一项所述的方法，其中，上述应用于软骨损伤部位 是下述的任意一种应用a)应用于软骨缺损部位、b)进一步在上述软骨损伤部位或软骨缺 损部位形成一个以上的孔，应用于该形成的孔。(3-7)组合物，其特征在于将该组合物应用于上述(3-1) (3-6)中任一项所述 的方法，所述组合物含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐，粘度为400mPa 20000mPa *s， 具有流动性。(3-8)上述(3-7)所述的组合物，其中，含有褐藻酸的1价金属盐的组合物中含有 用于软骨组织再生的细胞。(3-9)上述(3-7)或(3_8)所述的组合物，其中，上述褐藻酸的1价金属盐是褐藻 酸钠。(3-10)用于治疗软骨损伤部位的组合物，其特征在于该组合物含有使内毒素水 平降低至实质上不会引发炎症或发热的程度的褐藻酸的1价金属盐，粘度为400mPa · s 20000mPa*S，具有流动性，将所述组合物应用于预先在关节镜下经清洗并干燥的、作为软骨 损伤部位应用部位的患部的孔洞，使组合物充分填满孔洞容积，并在该应用的组合物的表 面应用CaCl2溶液，然后除去残留在该应用的组合物的表面的CaCl2溶液，使该组合物在患 部固化。本发明进一步提供软骨疾病以及相关的病态的治疗方法。(4-1)治疗软骨疾病的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所述组合 物的特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-2)抑制软骨退行性改变的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所 述组合物的特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-3)保护软骨的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所述组合物的 特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-4)修复软骨的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所述组合物的 特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-5)抑制关节痛的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所述组合物 的特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-6)抑制关节炎症的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所述组合 物的特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-7)改善关节机能的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所述组合 物的特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-8)治疗骨关节炎的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所述组合 物的特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-9)治疗肩周炎的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，其中，所述组合物的特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-10)抑制风湿性关节炎的关节痛的方法，该方法是将组合物关节内注入给药， 其中，所述组合物的特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。(4-11)上述(4-1) (4-10)中任一项所述的方法，其中，上述褐藻酸的1价金属 盐是褐藻酸钠。(4-12)上述(4-11)所述的方法，其中，上述褐藻酸钠是凝胶过滤色谱测得的重均 分子量为50万以上的褐藻酸钠。(4-13)治疗软骨疾病的方法，该方法是将组合物关节内注入给药，该组合物的特 征在于含有凝胶过滤色谱测得的重均分子量为50万以上的低内毒素褐藻酸钠作为有效 成分。发明效果本发明的用于软骨再生的组合物无需采用过度的外科方法即可以注入到软骨损 伤部位，因此手术方法简便。在可以不会对机体施加软骨细胞采集、骨膜采集等过度的负担 的情形下有效地促进软骨再生、特别是透明软骨再生。本发明的用于软骨再生的组合物通过在患部与Ca离子接触，而具有凝胶固化性。 利用该性质使表面固化，由此可以使组合物停留在患部。本发明的组合物中包埋有用于软 骨组织再生的细胞时，细胞容易在固化的凝胶中分散。可利用于各种形式的软骨损伤部位， 也可对应于各种应用条件。本发明的用于治疗软骨疾病的组合物通过以液体状态注入到关节内，可对于广范 的软骨损伤部位发挥治疗效果。可在老龄、外伤或骨关节炎、椎间盘损伤、半月板损伤、剥脱 性骨软骨炎等中所见的软骨损伤部位发挥修复软骨、抑制软骨的退行性改变、以及保护软 骨的至少一种效果。另外，本发明的用于治疗软骨疾病的组合物具有抑制关节的炎症和伴随炎症的疼 痛的效果。可抑制骨关节炎、肩周炎、风湿性关节炎等中的关节的炎症反应，而发挥镇痛作用。本发明的用于治疗软骨疾病的组合物在发挥对软骨的机械损伤进行修复、保护、 抑制变性的效果的同时，通过抑制关节组织内的炎症反应和疼痛，可抑制软骨疾病的进展， 缓解或治愈症状。特别是对于骨关节炎的治疗、肩周炎的治疗、风湿性关节炎的关节痛的缓 解有效。
图1是表示在各种浓度的CaCl2溶液下的细胞存活率的图表(实施例4)。图2是表示纯化和食品级的各褐藻酸微球中的细胞存活率的比较结果的图表(实 施例5)。图3是表示实施例6的体外培养中的RT-PCR分析结果的图表。图4是表示实施例6的体外培养中的染色结果的照片。(A)纯化褐藻酸钠，培养 21天；(B)纯化褐藻酸钠，培养28天；(C)食品级褐藻酸钠，培养21天；(D)食品级褐藻酸 钠，培养28天。由左至右依次为用H-E、番红-0、抗I型、抗II型、抗X型的抗胶原抗体进 行的染色。
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图5是表示实施例7的兔软骨修复模型在手术时的情形的照片。图6是表示实施例7的兔软骨修复模型的全体观察评分标准的图。图7是表示实施例7的兔软骨修复模型的染色评分标准的图。图8是实施例7的兔软骨修复模型中、A)对照组(空白)的组织染色照片。(A) 表示4周后，(B)表示12周后。至左向右依次为H-E染色、番红0染色、I型胶原、II型胶 原免疫染色的结果。图9是实施例7的兔软骨修复模型中、C)食品级褐藻酸+细胞的组的染色照片。 (A)表示4周后，(B)表示12周后，染色方法与图8相同。图10是实施例7的兔软骨修复模型中、D)纯化褐藻酸组(无细胞)的染色照片。 (A)为4周后，⑶为12周后，染色方法与图8相同。图11是实施例7的兔软骨修复模型中、E)纯化褐藻酸+细胞的组的染色照片。 (A)表示4周后，(B)表示12周后，染色方法与图8相同。图12是表示实施例7的兔软骨修复模型中的全体观察和染色的评分结果的图。图13是实施例7的兔软骨修复模型中、对纯化褐藻酸组的D)组、E)组的机械强 度测定结果的图。图14是表示实施例8的尸体模型试验的情形的照片。图15是表示各种褐藻酸钠的浓度(％ )与附着时间(秒)的关系的图表。图16是表示褐藻酸钠水溶液的粘度(mPa · s)与附着时间(秒)的关系的图表。图17是表示实施例12的兔骨关节炎模型中的膝关节外观的照片。图18是表示实施例12的兔骨关节炎模型中的膝关节组织的染色照片。图19是表示对实施例13的兔骨关节炎模型中的膝关节进行墨汁染色后的外观的 照片。图中，用圆圈圈起的部分表示通过墨汁着色的软骨损伤部位和正常软骨的边界。A) 对照组，B) 透明质酸钠给药组，C)2%褐藻酸钠给药组(分子量40万)，D)2%褐藻酸钠 给药组(分子量100万)，E)2%褐藻酸钠给药组(分子量170万)。照片是多个标本中的 一例。图20是实施例13的兔骨关节炎模型中、对墨汁染色的膝关节进行肉眼评分的 结果。NS、HA、AL40、AL100和AL170分别与A) E)(与图19相同)对应。1级表示无 墨夕十染色以及无损伤的表面(nouptake of India ink, indicating intact surface)。2 级表示墨汁局部染色以及表面有轻微损伤(minimal focal uptake of India ink, mild surfaceirregularity)。3级表示墨汁的大而清晰的染色以及明显的原纤化形成(evident large focal dark patches of India ink, overt fibrillation)。 4a 级表不低于 2mm 的 软骨损伤(erosion of cartilage < 2mm)。4b 级表不 2mm 5mm 的软骨损伤(erosion of cartilage 2 5mm)。4c 级表不超过 5mm 的软骨损伤(erosion of cartilage > 5mm)。图21是实施例13的兔骨关节炎模型中的膝关节组织的番红0染色的照片。A) E)与图19相同。照片是多个标本中的一例。图22是对实施例13的兔骨关节炎模型的病理组织综合评价进行评分的结果。NS、 HA、AL40、AL100和AL170分别与A) E)(与图19相同)对应。图23是表示实施例15的大鼠实验性关节炎疼痛模型的步行状态评分随时间变化 的图。A)对照组(NS)，B) 透明质酸钠给药组(1% HA)，C) 2%褐藻酸钠给药组(分子量100万)(2% AL100)，D)1%褐藻酸钠给药组(分子量170万)(1 % AL170)，E) 2%褐藻酸钠 给药组(分子量 170 万)(2% AL170)。* :p < 0. 05 对 NS序列表的自由文本
SEQIDNO.1 合成DNA
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SEQIDNO.9 ；合成DNA
SEQIDNO.10合成DNA
具体实施例方式以下详细说明本发明，以下的实施方式是为了说明本发明而举例，本发明只要不 脱离其宗旨即可，可以以各种方式实施。1.概要“软骨”在关节、胸壁、椎间盘、半月板、或者喉头、呼吸道、耳等管状结构中可见，可 分类为透明软骨、弹性软骨、纤维软骨三种。例如关节软骨是透明软骨，含有软骨细胞、胶原 性的胞外基质、蛋白聚糖和水，没有血管分布。透明软骨富含II型胶原，具有可被抗II型 胶原抗体染色、被可染色蛋白聚糖的番红0染色成红色等特征。“软骨损伤”是指由于老龄 或外伤、其它各种因素使软骨受到障碍的状态，例如包含由于某种原因，软骨的独特的粘弹 性(施加负荷时缓慢收缩，撤去负荷时缓慢复原)降低；虽然保持可活动性，但支撑负荷方 面产生问题等软骨功能降低的状态。在骨关节炎、风湿性关节炎等疾病中也可见软骨损伤。 本发明涉及可适用于该软骨损伤部位的、用于软骨再生的固化性组合物。“软骨缺损部位” 是指软骨损伤部位中，有一部分缺损、消失的部分，是指软骨组织的空洞部位、以及形成该 空洞部位的周边的组织。本发明的组合物优选用于“软骨缺损部位”的治疗。更具体地说，本发明是应用于软骨损伤部位的用于软骨再生的组合物，含有使 内毒素水平降低至实质上不会引发炎症或发热的程度的褐藻酸的1价金属盐，粘度为 400mPa · s 20000mPa · s。因此，本发明的组合物可以有效促进患部的软骨再生，而且与软骨损伤部位的附 着性良好，并且可应用注射器等，因此容易应用于软骨损伤部位。本发明中，“软骨再生”或“软骨组织再生”是指对已出现功能障碍或功能不全的软 骨损伤部位谋求功能的再生。本发明中，功能的再生不一定要完全的功能再生，只要是与应 用本组合物之前的软骨损伤部位的状态相比较，其功能有所恢复即可。当将受到损伤之前 的正常软骨的状态看作100%、应用本组合物之前的软骨损伤部位的状态看作0%时，优选 软骨功能恢复至30%以上的再生，更优选50%以上，进一步优选80%以上，尤其优选几乎 恢复至损伤前的状态。优选再生软骨中除透明软骨之外的软骨、例如纤维软骨等所产生的比例少。另外，“软骨损伤部位的治疗”或“软骨缺损部位的治疗”是指通过在老龄或外伤、 骨关节炎、椎间盘损伤、半月板损伤、剥脱性骨软骨炎等中所见的软骨损伤部位或软骨缺损 部位使软骨再生，由此缓解或治愈这些症状。另外，“应用于软骨损伤部位”是指将用于软骨再生的组合物等与软骨损伤部位接 触而进行的使用，优选向软骨缺损部位注入本发明的组合物，包埋该缺损部而进行的使用。 或者可以在软骨损伤部位、优选软骨缺损部位进一步形成一个以上的较小的孔，向该孔注 入本发明的组合物，包埋孔而进行的使用。对软骨损伤部位的应用优选将患部的空洞容积 充分注满。在应用本组合物之前，优选对患部实施必要的前处置，如果有需要，可清洗患部。 “清洗患部”是指例如用生理盐水等清除要应用本发明的组合物的部位的血液成分、其它不 需要的组织等。优选患部在清洗后可通过擦去残留的不需要的液体成分等进行干燥，然后 应用本发明的组合物。本发明中，“软骨疾病”是指软骨、软骨组织和/或关节组织(滑膜、关节囊、软骨下 骨等)由于机械刺激或炎症反应受到伤害而产生的疾病。“软骨疾病治疗”是指缓解、改善 和/或治愈由于机械刺激或炎症反应而产生伤害的组织的各种病态。例如，在骨关节炎中， 关节软骨的磨损、软骨组织的变性、滑膜的炎症、伴随炎症的疼痛等病态复合性发生。而肩 周炎中，滑膜或关节囊的炎症以及伴随该炎症的疼痛为主流，有未见软骨的磨损或变性的 情形。尽管风湿性关节炎的发病基理尚未清楚，但可以认为由于自身免疫反应产生的炎症 性细胞因子破坏了滑膜组织或软骨组织。如上所述，软骨疾病是呈现复合性病态的疾病，其 治疗药物要求兼具在磨损中保护软骨的效果、抑制磨损或炎症导致的软骨退行性改变的效 果、修复软骨损伤部位的效果、抑制炎症或疼痛的效果等复合性的效果。本发明的“含有低 内毒素褐藻酸的1价金属盐的组合物”兼具通过机械刺激保护软骨的效果、抑制磨损或炎症 导致的软骨退行性改变的效果、修复软骨损伤部位的效果、以及抑制关节组织的炎症或疼 痛的效果。由此可抑制软骨疾病的进展，缓解、改善和/或治愈症状。特别是对于骨关节炎 的治疗、肩周炎的治疗、风湿性关节炎的关节痛的缓解有效。“关节内注入给药”是指将具有流动性的液状组合物注入到关节腔内、滑膜囊内、 腱鞘内等。在用于治疗骨关节炎时，优选将组合物注入关节腔内。另外，骨关节炎可在膝、 肩、髋、腰、踝、腕、指等身体各关节处发生，本发明的组合物对任何关节均适用。2.褐藻酸的1价金属盐本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物中所含的“褐藻酸的1价金 属盐”是通过将褐藻酸的6位羧酸的氢原子与Na+或K+等1价金属离子进行离子交换而形 成的水溶性盐。褐藻酸的1价金属盐具体例子有褐藻酸钠、褐藻酸钾等，特别优选可由市 售商品获得的褐藻酸钠。褐藻酸的1价金属盐的溶液在与交联剂混合时形成凝胶。本发明中使用的“褐藻酸”是生物降解性的高分子多糖类，是D-甘露糖醛酸(M)和 L-葡萄糖醛酸(G) (L-gluronic acid)两种糖醛酸聚合成直链状所得的聚合物。更具体地 说，是D-甘露糖醛酸的均聚物组分(MM组分)、L-葡萄糖醛酸的均聚物组分(GG组分)、以 及D-甘露糖醛酸和L-葡萄糖醛酸无规排列而成的组分(MG组分)任意结合而成的嵌段共 聚物。褐藻酸的D-甘露糖醛酸和L-葡萄糖醛酸的构成比(M/G比)主要根据海藻等的来 源生物的种类而不同，还受该生物生长发育场所或季节的影响，M/G比在约0. 4的高G型至 M/G比为约5的高M型的高范围内。
褐藻酸的1价金属盐是高分子多糖类，较难准确确定分子量，通常重均分子量为 1万 1000万、优选为5万 300万的范围。若分子量低，则软骨损伤部位的软骨再生效 果、特别是透明软骨再生效果差，因此，本发明中使用的褐藻酸的1价金属盐优选重均分子 量为50万以上。特别是重均分子量为50万以上的高分子量褐藻酸钠在没有包埋细胞的状 态下也具有可以再生透明软骨这样另人惊讶的效果，适合用作用于软骨再生的组合物。另 外，该软骨再生效果对于软骨疾病中软骨损伤的修复也有利，因此适合作为用于治疗软骨 疾病的组合物使用。实际上，在兔OA模型中，相比低分子量的褐藻酸，高分子量的褐藻酸可 见优异的治疗效果。凝胶过滤色谱测得的重均分子量为100万和170万的褐藻酸钠与分子 量41万的褐藻酸钠相比，其抑制软骨退行性改变的效果、保护软骨的效果和修复软骨的效 果优异。通常，通过凝胶过滤色谱计算高分子多糖类的分子量时可能产生10 20%的测 定误差。例如，如果是40万则可能在32 48万，如果是50万则可能在40 60万，如果 是100万则可能在80 120万左右的范围内发生值的变动。因此，对于褐藻酸的1价金属 盐，对软骨的效果特别优异的、最佳的重均分子量范围至少为50万以上，更优选65万以上， 进一步优选80万以上。分子量过高则制备困难，同时，制成水溶液时产生粘度过高、溶解性 降低的问题，因此优选重均分子量为500万以下，更优选300万以下。通常来自天然产物的高分子物质并不具有单一的分子量，而是具有各种分子量的 分子集合体，因此，以具有一定幅度的分子量分布的形式测定。代表性的测定方法是凝胶过 滤色谱法。作为通过凝胶过滤色谱测得的分子量分布的代表性的信息例如有重均分子量 (Mw)、数均分子量(Mn)、分散比(Mw/Mn)。如果关注分子量大的高分子对平均分子量的贡献，则以重均分子量表示，用下式 表不。Mw = Σ (WiMi)/W = Σ (HiMi)/ Σ (Hi)数均分子量是高分子的总重量除以高分子的总数计算得出的。Mn = W/Σ Ni= Σ (MiNi)/ Σ Ni = Σ (I Ii)/ Σ (I li/Mi)其中，W为高分子的总重量，Wi为第i个高分子的重量，Mi为第i个洗脱时间下的 分子量，Ni为分子量Mi的个数，Hi为第i个洗脱时间下的高度。可以认为软骨损伤部位的软骨再生效果(特别是透明软骨再生效果)、软骨疾病 治疗中的修复软骨的效果、抑制软骨退行性改变的效果和/或保护软骨的效果是分子量大 的分子种类的贡献大，因此分子量的指标可使用重均分子量。已知在来自天然产物的高分子物质的分子量测定中，测定方法产生值的差异(透 明质酸的例子Chikako Yomota 等人.，Bull. Natl. HealthSci.，117 卷，135 139 页 (1999)，Chikako Yomota 等人.，Bull. Natl. Health Sci.，121 卷，30 33 页(2003))。 关于褐藻酸盐的分子量测定，有记载了由特性粘度计算的方法、通过SEC-MALLS(尺寸排 阻层析与多角度激光散射检测联用)计算的方法的文献(ASTM F2064-00 (2006)，ASTM International发行)。该文献中，在通过尺寸排阻层析(=凝胶过滤色谱)测定分子量时， 只凭使用普鲁兰作为标准物质的校正曲线计算是不足够的，推荐结合使用多角度激光散射 检测器(MALLS) ( = SEC-MALLS测定)。还有将通过SEC-MALLS测得的分子量作为褐藻酸盐 的产品目录上的规格值使用的例子(FMC Biopolymer公司、PR0N0VA 褐藻酸钠规格目录)。本发明人等发现对于分子量不同的褐藻酸钠，在OA模型等中的治疗效果有差
13异，对这些褐藻酸进行了凝胶过滤色谱的分子量测定和SEC-MALLS的分子量测定。结果得 知，凝胶过滤色谱测得的分子量与褐藻酸盐的粘度或治疗效果的相关性高。即，我们最新发 现作为用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物中使用的褐藻酸盐的确定最佳分子量 范围的参数，与通常推荐的SEC-MALLS测定相比，凝胶过滤色谱测得的分子量更为适合。因 此，本说明书中，在确定褐藻酸盐的分子量时，如没有特别说明，是指通过凝胶过滤色谱计 算得出的重均分子量。 凝胶过滤色谱的优选条件如实施例。代表性的条件是使用以普鲁兰作为标准物质 的校正曲线。作为标准物质使用的普鲁兰的分子量优选至少使用160万、78. 8万、40. 4万、 21. 2万和11. 2万的作为标准物质。除此之外，还可以确定洗脱液(200mM硝酸钠溶液)、柱 条件等。柱条件优选使用聚甲基丙烯酸酯树脂系填充剂，使用至少一根排除极限分子量为 1000万以上的柱。代表性的柱是TSK gel GMPWxl (直径7. 8mmX 300mm) (Tosoh株式会社制褐藻酸的1价金属盐尽管在从褐藻类中提取的初期时，分子量大，粘度高，但在热 干燥、冷冻干燥、纯化等过程中，分子量变小，粘度降低。因此，通过在制备的各步骤中进行 适当的温度管理，可以制备分子量不同的褐藻酸的1价金属盐。通过使制备的各步骤中的 温度低，可获得分子量大的褐藻酸的1价金属盐，温度越高则可获得分子量越小的褐藻酸 的1价金属盐。另外，通过适当选择作为原料的褐藻类、或在制备步骤中根据分子量进行分 组等方法，可制备分子量不同的褐藻酸的1价金属盐。并且，对于以各种方法制备的褐藻酸 的1价金属盐，在测定分子量或粘度之后通过与具有不同分子量或粘度的其它批次的褐藻 酸的1价金属盐混合，可以制成具有目标分子量的褐藻酸的1价金属盐。本发明中使用的褐藻酸可以来自天然也可以是合成物，优选来自天然的褐藻 酸。来自天然的褐藻酸例如有由褐藻类提取的褐藻酸。含有褐藻酸的褐藻类在世界沿 海区域繁茂生长，但实际上可作为褐藻酸原料使用的海藻是有限定的，其代表性的例子 有南美的褐藻属(Lessonia species)、北美的巨藻属(Macrocystis species)、欧洲 的海带属(Laminaria species)或泡叶藻属(Ascophyllum species)、澳大利亚的南极 冰河海藻属(Durvillea)等。作为褐藻酸原料的褐藻类例如有褐藻(Lessonia)属、 巨藻(Macrocystis)属、海带(Laminaria)属、泡叶藻(Ascophyllum)属、南极冰河海藻 (Durvillea)属、羽叶藻(Eisenia)属、昆布(Ecklonia)属等。3.低内毒素处理本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物中所含的褐藻酸的1价金 属盐是低内毒素褐藻酸的1价金属盐。低内毒素是指内毒素水平降低至实质上不会引发炎 症或发热的程度。即，供给进行低内毒素处理。另人惊异的是，通过低内毒素处理，将组合 物应用于软骨损伤部位时，可更加提高软骨再生作用，并且促进软骨下骨的再生，可提高患 部的机械强度。即，本发明的组合物中，通过使用低内毒素褐藻酸，可以制成周围软骨的变 性或炎症反应少、机体亲和性高的组合物。低内毒素处理可按照公知的方法或与其近似的方法进行。例如可通过菅等人的纯 化透明质酸钠的方法(例如参照日本特开平9-324001号公报等)；吉田等人的纯化β-1， 3_葡聚糖的方法(例如参照日本特开平8-269102号公报等)；William等人的纯化褐藻酸 盐、胞外多糖胶(gellangum)等生物体高分子盐的方法(例如参照日本特表2002-530440号公报等)James等人的纯化多糖的方法(例如参照国际公开第93/13136号小册子等)； Lewis等人的方法(例如参照美国专利第5589591号说明书等)；Hermanfranck等人的纯 化褐藻酸盐的方法(例如参照ApplMicrobiol Biotechnol (1994)40 638 643等)或与 其近似的方法来实施。本发明的低内毒素处理并不限于此，可通过洗涤、滤器(除去内毒素 的滤器或带电的滤器等)过滤、超滤、使用柱(吸附内毒素的亲和柱、凝胶过滤柱、离子交换 树脂柱等)的纯化、与疏水性物质、树脂或活性碳等的吸附、有机溶剂处理(有机溶剂萃取、 添加有机溶剂进行的析出、沉淀等)；表面活性剂处理(例如参照日本特开2005-036036号 公报等)等公知的方法或者将它们组合来实施。这些处理步骤中可以适当组合离心等公知 的方法。优选结合褐藻酸的种类进行适当选择。内毒素水平可按照公知的方法确认，例如可通过鲎试剂(LAL)的方法、使用 Endospecy (注册商标)ES-24S试剂盒(生化学工业株式会社)的方法等进行测定。对 本发明的组合物中所含有的褐藻酸的内毒素处理方法没有特别限定，作为其结果，褐藻酸 的1价金属盐的内毒素含量在通过鲎试剂(LAL)进行的内毒素测定时，优选为500内毒素 单位(EU)/g以下，进一步优选100EU/g以下，尤其优选50EU/g以下，特别优选30EU/g以 下。经低内毒素处理过的褐藻酸钠例如可通过SeaMatrix(灭菌)((株)Kimica(株)持田 International)、PR0N0VA UPLVG(FMC)等市售品获得。4.制备褐藻酸的1价金属盐的溶液本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物可以使用褐藻酸的1价金 属盐的溶液来制备。褐藻酸的1价金属盐的溶液可按照公知方法或与其近似的方法制备。 即，本发明中使用的褐藻酸的1价金属盐可使用上述褐藻类，通过酸法、钙法等公知的方法 来制备。具体来说，例如可使用碳酸钠水溶液等碱水溶液，由这些褐藻类中提取，然后添加 酸(例如盐酸、硫酸等)，以获得褐藻酸，可通过褐藻酸的离子交换获得褐藻酸的盐。如上 所述，进行低内毒素处理。褐藻酸的盐的溶剂只要是可应用于生物体的溶剂即可，没有特别 限定，例如有纯净水、蒸馏水、离子交换水、Milli-Q水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS) 等。优选将它们进行灭菌，优选经低内毒素处理。例如，可以将Milli-Q水过滤灭菌后使用。 本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物无需将褐藻酸的1价金属盐溶解于 上述溶剂中，例如可通过在含有细胞的培养基中混合褐藻酸的1价金属盐等来获得。另外， 为获得本发明的组合物而进行的操作优选完全在低内毒素水平、以及细菌水平低的环境下 进行。例如，优选操作是在洁净工作台上、使用灭菌器具进行，可以将要使用的器具用市售 的内毒素清除剂进行处理。使用纯化至显示优选的内毒素水平的褐藻酸的1价盐制备上述组合物时，组合物 的内毒素含量通常为500EU/g以下，进一步优选为300EU/g以下，尤其优选为150EU/g以 下。5.用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物的粘度本发明的用于软骨再生的组合物的粘度只要可获得本发明的效果即可，没有特别 限定，优选为400mPa · s 20000mPa · s。例如使用上述溶剂等可制备成适当的粘度。如 果是在上述粘度范围内，则与软骨损伤部位的附着性良好，还可通过注射器等注入到关节 腔内或软骨损伤部位。另外，本发明的用于软骨再生的组合物的粘度如果为约2000mPa · s 以上，则与软骨缺损部位的附着性进一步提高，特别是如果粘度为约5000mPa · s以上，则
15例如在关节镜下对人的股骨关节面的软骨损伤进行操作时等，即使软骨缺损部位的开口部 是朝向下方的状态，通过对缺损部位注入本发明的组合物，也可以使本发明的组合物与软 骨损伤面接触，在没有固定的状态下也可以至少附着1分钟以上。在附着期间，可根据需 要使组合物的表面固定。与损伤部位的附着性随着粘度的升高而进一步提高，例如粘度为 IOOOOmPa-S时，与粘度为5000mPa ·s相比，可以以不固定的状态在患部附着更长时间。因 此，本发明的组合物在应用于软骨缺损部位的开口部、或者在软骨损伤部位或软骨缺损部 位形成的孔的开口部倾斜时或朝向下方的状态的软骨损伤部位时，在不施加固定手段的状 态下优选在损伤部位至少附着5秒以上，还优选10秒以上，更优选30秒以上，尤其优选附 着1分钟以上。本发明的组合物通过调节粘度，可以确保在组合物的表面上实施固定手段 所需的时间。其中，“附着在损伤部位”是指本发明的组合物不会从损伤部位上脱落，可停留 在损伤部位上。这样，本发明的组合物通过调节粘度，即使是手术时患部朝向下方这样的对 于手术人员来说难以治疗的体位，也可以通过注入这样简便的方法进行治疗。另一方面，粘度为约20000mPa 以下时，通过注射器等的注入更加容易。例如粘 度为20000mPa · s左右时也可以通过注射器等注入，但是粘度高、注入困难时，还可使用其 它手段将本发明的组合物应用于软骨损伤面。从注射器操作的容易程度的角度考虑，本发 明的组合物的粘度优选为20000mPa · s以下，更优选为15000mPa · s以下。因此，从附着性 的角度考虑，适合应用于软骨缺损部位的开口部、或者在软骨损伤部位或软骨缺损部位上 形成的孔的开口部倾斜时或者朝向下方的状态的软骨损伤部位的本发明的组合物的粘度 优选为2000mPa · s左右以上；从组合物的使用容易程度的角度考虑，优选为20000mPa · s 左右以下，还优选为3000mPa · s 15000mPa · s，更优选为4000mPa · s IOOOOmPa · s，尤 其优选为 5000mPa · s 6000mPa · s。如果本发明的组合物的粘度为400mPa*s左右以上，则应用于软骨损伤部位，可充 分发挥本发明的效果。例如，可在软骨缺损部位的开口部一侧朝向上方的状态下实施手术 时，将本发明的组合物注入到缺损部位，使本发明的组合物与软骨损伤面接触，然后使组合 物的表面固定化。组合物的粘度低，因此通过注射器等的注入更为容易进行。例如，在粘度 为5000mPa · s左右的情况下、软骨损伤部位上残留有软骨情况下等，也可以通过在损伤部 位上形成1个以上的极小的孔，而将组合物应用于损伤部位全体。将本发明的用于治疗软骨疾病的组合物注入到关节内时的粘度只要可获得治疗 软骨疾病的效果即可，没有特别限定，优选为IOOmPa 20000mPa .s。优选为200mPa .s 15000mPa · s，更优选为 400mPa · s IOOOOmPa · s，尤其优选为 IOOOmPa · s 6000mPa · s。 通过使用适当的粘度，还可以发挥补充关节液的作为缓冲的功能的效果，可在分散于关节 液中的状态下发挥治疗软骨疾病的效果。用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物的粘度例如可通过控制褐藻酸的1 价金属盐溶液中的褐藻酸浓度、褐藻酸的分子量等来调节。关于褐藻酸的1价金属盐的溶液粘度，溶液中褐藻酸的浓度高时则高，溶液中褐 藻酸的浓度低时则低。褐藻酸的1价金属盐溶液中的优选的褐藻酸浓度受分子量的影响， 因此不能一概而论，大约为w/v 5% w/v左右，进一步优选1. 5% w/v 3% w/v左右， 尤其优选2% w/v 2. 5% w/v0褐藻酸的1价金属盐即使是恒定的浓度，在从褐藻类中提取的最初时，分子量大，
16粘度高，但是在热干燥、冷冻干燥、纯化等过程中，分子量变小，浓度降低。同样是由褐藻类 提取的褐藻酸，其粘度也常有变动。粘度的测定值根据测定仪器、测定条件而变动。因此， 与损伤部的附着性优异、内毒素水平降低的褐藻酸的1价金属盐溶液均包含在本发明的范 围内。为了通过低浓度的褐藻酸的1价金属盐溶液获得与患部的附着性优异、高粘度的 组合物，可以选择分子量高的褐藻酸的1价金属盐。褐藻酸的1价金属盐的溶液的粘度受M/G比的影响，因此，例如可根据溶液的粘度 等适当选择具有更为优选的M/G比的褐藻酸。本发明中使用的褐藻酸的M/G比约为0. 4 4. 0，优选约为0. 8 3. 0，更优选约为1. 0 1. 6。如上所述，M/G比主要由海藻的种类决定，因此，作为原料使用的褐藻类的种类对 褐藻酸的1价金属盐溶液的粘度有影响。本发明使用的褐藻酸优选来自褐藻属、巨藻属、海 带属、泡叶藻属、南极冰河海藻属的褐藻，更优选来自褐藻属的褐藻，特别优选来自褐海藻 (Lessonia nigrescens)0组合物的粘度还可根据褐藻酸的1价金属盐溶液中的包埋细胞(参照下述)的量 等进行调节。本发明的组合物在包埋细胞时，本发明的组合物的粘度优选基于包埋细胞后 的粘度进行调节。但是，在实际临床中，使用包埋细胞的组合物时，包埋细胞之后难以进行 调节粘度的步骤。因此，本发明的组合物在包埋细胞时，可以将包埋细胞之前的组合物的粘 度作为本发明的组合物的粘度。本发明的组合物的方式之一是在含有使内毒素水平降低至实质上不会引发炎症 或发热的程度的褐藻酸的1价金属盐、粘度为400mPa · s 20000mPa · s的具有流动性的 组合物中包埋骨髓间充质干细胞和/或骨髓间叶系间质细胞的、应用于软骨损伤部位的用 于软骨再生的组合物。6.包埋细胞本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物可以制成在含有褐藻酸的1 价金属盐的组合物中包埋用于软骨组织再生的细胞所得的组合物，优选制成在褐藻酸的1 价金属盐的溶液中包埋用于软骨组织再生的细胞所得的组合物。本发明中的“包埋”是指 将用于软骨组织再生的细胞悬浮于含有褐藻酸的1价金属盐的组合物、优选悬浮于褐藻酸 的1价金属盐的溶液中。由此，可以更加有效地促进软骨的再生，还可以更提高应用了本发 明的组合物的软骨的强度。优选细胞分散存在于本发明的组合物中。上述细胞例如有干 细胞、间质细胞等，对其来源没有特别限定，可以是骨髓、脂肪细胞、脐带血等。优选为骨髓 间充质干细胞或骨髓间叶系间质细胞。除此之外还有软骨前体细胞、软骨细胞、滑膜细胞、 红细胞系干细胞、ES细胞等细胞。可以包埋这些细胞的一种以上。其中，“干细胞”是具有 自我再生能力和多向分化能力的细胞，将干细胞应用于软骨再生，由此可以再生机械强度 或组织学上优异的软骨。干细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞等，特别是骨髓间充质干 细胞可以使用来自成人的自身组织的细胞，因此容易获得，适合用于软骨再生。此外，骨髓 间充质干细胞可分化成骨，也可分化成软骨，因此，例如损伤除软骨之外还涉及骨时，可以 在骨的部位再生骨、在软骨部位再生软骨。将骨髓间充质干细胞悬浮于褐藻酸的1价金属 盐的溶液中，通过关节内注入给药，可以用于治疗软骨疾病。因此，本发明中使用的细胞优 选骨髓间充质干细胞的比例高，但难以完全分离，因此优选骨髓间充质干细胞在本发明的用于软骨组织再生的细胞中含有30%以上，更优选含有50%以上，进一步优选含有70%以 上，尤其优选含有90%以上。本发明的组合物的方式之一是将骨髓间充质干细胞和/或骨 髓间叶系间质细胞用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物。要包埋的细胞可以使用自体的或异种的，特别是从可预防排斥反应的角度考虑， 优选采集自体细胞使用。采集的细胞优选通过细胞培养使其增殖后使用。此时，可以预先 将细胞包埋在褐藻酸的1价金属盐的溶液中，在该状态下培养，也可以用培养基培养细胞， 然后包埋在褐藻酸的1价金属盐的溶液中。培养细胞的方法可按照常规方法进行，可以在将细胞包埋在褐藻酸的1价金属盐 的溶液中的状态下进行，或者也可以在不包埋在褐藻酸的1价金属盐的溶液中的状态下进 行。培养基优选可以高效地进行包埋在褐藻酸的1价金属盐溶液中的细胞或未包埋的细胞 的培养的培养基，可以从本领域所公知的培养基中适当选择。例如，培养基可使用DMEM培养基(Virology，8卷，396 (1959))、MEM培养基 (Science，122 卷，501 (1952))、RPMI1640 培养基(TheJournal of the American Medical Association, 199卷，519 (1967))、F12等培养基，根据需要可以添加血清、氨基酸、葡萄糖、 抗生素等。pH值优选约为6 8。培养通常在约30°C 40°C下进行5 120小时、优选 5 100小时左右。还可根据需要进行培养基的更换、通气、搅拌。本发明的一个方式中，组合物是将用于软骨组织再生的细胞特别是骨髓间充质干 细胞、或者骨髓间叶系间质细胞与褐藻酸的1价金属盐的溶液混合所得的组合物，不含有 TGF-β等生长因子。另外，也不一定必须在体外诱导这些细胞的分化。这种情况下，例如从 具有软骨损伤的患者的髂骨前缘等采集骨髓液，立即由骨髓液中提取骨髓间充质干细胞， 获得一定数量以上的细胞数之后，则可以作为本发明的组合物立即应用于患者。无需将采 集的细胞进行体外培养、分化等处理的麻烦，对于手术人员来说是很大的优点，也可以降低 成本，还可以减轻对患者的负担。为骨髓间充质干细胞时，由于免疫原性低，因此可以毫无问题地应用异种细胞，因 此实用性优异。另一方面，上述包埋有细胞的褐藻酸的1价金属盐溶液在应用于软骨损伤部位之 前可以制成包埋有体外培养至选自下述任意状态的细胞的组合物，所述状态有a)细胞数 为1 X IO6个/mL以上的状态、b)通过番红0染色或H-E染色检测出透明软骨组织的状态、 c)通过抗胶原II型抗体或基因分析检测出II型胶原的状态、d)通过抗糖苷配基抗体或基 因分析检测出糖苷配基的状态、e)分泌胞外基质(胶原、透明质酸、蛋白聚糖)的状态。可 结合损伤部位的状态、患者的状态而进行适当选择。对要包埋的细胞的量没有特别限定，例如可以是1. 0 X IO6 3. 0 X IO7个细胞/mL， 优选为2. OX IO7 3. OX IO7个细胞/mL。通过使细胞数为该程度的数目，可以更加促进软 骨的再生。另一方面，为了手术方法的简便，以及不会对机体施加软骨细胞、骨膜采集、骨髓 采集等过度的负担，减轻来自机体的或来自培养步骤的病毒等的感染的危险，优选制成不 含有细胞的组合物。上述组合物的优选例子是以含有凝胶过滤色谱测得的重均分子量为 50万以上的低内毒素褐藻酸钠、不含有细胞为特征的、粘度 为400mPa · s 20000mPa · s、 具有流动性、可应用于软骨损伤部位并在患部固化的用于软骨再生的组合物。另外，本发明的用于治疗软骨疾病的组合物是以低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分的组合物， 发现了褐藻酸本身具有治疗软骨疾病的效果。优选的用于治疗的组合物的例子是以含有 凝胶过滤色谱测得的重均分子量为50万以上的低内毒素褐藻酸钠作为有效成分、不含有 细胞为特征的、关节内注入给药的用于治疗软骨疾病的组合物，该组合物可发挥比以往所 使用的透明质酸制剂更为优异的治疗效果。7.组合物表面的凝胶化本发明中，可以将含有褐藻酸的1价金属盐的溶液的组合物应用于软骨损伤部 位，并在该组合物的表面应用交联剂。使组合物表面进行凝胶化，以使表面凝固，由此可有 效地防止组合物由软骨损伤部位漏出。上述交联剂只要可通过将褐藻酸的1价金属盐溶液交联，使其表面固定即可， 没有特别限定，例如可例举Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+等2价以上的金属离子化合物、分子内具 有2 4个氨基的交联性试剂等。更具体地说，2价以上的金属离子化合物包含CaCl2、 MgCl2, CaSO4, MaCl2等分子内具有2 4个氨基的交联性试剂包含在氮原子上具有赖氨酰 基(-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2)的二氨基链烷烃，即二氨基链烷烃及其氨基被赖氨酰基取代、 形成赖氨酰基氨基的衍生物，具体有二氨基乙烷、二氨基丙烷、N-(赖氨酰基)-二氨基乙 烷等，从容易获得和凝胶强度等角度考虑，特别优选制成CaCl2溶液。对组合物的表面加入2价以上金属离子的方法没有特别限定，例如可通过注射 器、喷射器(喷雾器)等，在组合物的表面施加2价以上金属离子的溶液的方法等。在本发 明的组合物的表面应用交联剂的时间可以是在缺损部位应用了本发明的组合物之后，也可 以同时。交联剂的使用量优选结合应用了本发明组合物的缺损部位的大小适当调节。交联 剂是由所应用的组合物的表面缓慢渗透到内部，进行交联。为了不使交联剂对本发明的组 合物与损伤面的接触部分有较大影响，可调节交联剂的使用量、不要过量使用。2价以上金 属离子的使用量只要是可以使含有褐藻酸的1价金属盐的组合物表面凝固的量即可，没有 特别限定。不过，例如加入IOOmM的CaCl2溶液时，当为直径5mm、深度2mm左右的缺损时， 所加入的量优选为0. 3 0. 6mL左右，可以与患部的表面积成比例地确定给药量。例如，如 宽窄(IOmmX 20mm)、深度5mm左右的缺损时，优选为1 12mL左右、更优选为2 IOmL左 右。可一边观察损伤部位的状态一边适当增减。其应用例如可以是缓慢地、持续数秒 数 十秒加到含有褐藻酸的1价金属盐的组合物的表面。通过在本发明的组合物中含有其凝胶化随时间差、温度差或与机体内钙离子的接 触等环境的变化而进展的交联剂，可以得到在给药前保持液体状态、在给予机体后形成自 身凝胶化的组合物。这样的交联剂例如有葡糖酸钙、CaSO4、褐藻酸钙等。其中，已知交联剂中含有钙时，钙离子的浓度高则凝胶化快，可以形成更硬的凝 胶。但是，钙具有细胞毒性，因此浓度过高则可能对本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨 疾病的组合物的软骨再生作用产生不良影响。因此，为了使含有褐藻酸的1价金属盐的组 合物表面凝固，例如使用CaCl2溶液时，优选为25mM 200mM、更优选为50mM IOOmM的浓 度。其中，褐藻酸微球如下形成例如将褐藻酸钠溶液滴加到CaCl2溶液中从而形成凝 胶。已知在该褐藻酸微球中包埋细胞，将其用于软骨再生(例如参照文献2、3)。但是，褐藻
19酸微球必须通过按压应用到软骨缺损部位，因为必须制成符合缺损部位的大小，在实际临 床中使用时有技术性困难。另外，使用CaCl2溶液作为交联剂时，微球表面的Ca离子与软 骨损伤面接触，因此还有钙的细胞毒性问题。与此相对，本发明的组合物是溶液状，因此可 以容易地应用于各种形状的缺损部位，还可以用本组合物覆盖损伤部位的全体，与软骨缺 损部位的贴合性良好。本组合物与软骨损伤面接触的部分可以保持较低的钙浓度，钙的细 胞毒性的问题也少。本发明的组合物与软骨损伤部位接触的面上，受到交联剂的影响小，因 此本发明的组合物可以容易地与机体的损伤部位的细胞或组织接触。本发明的组合物应用 于损伤部位之后，经过约4周即可以在应用部位与机体组织融合至无法识别的状态，与机 体的亲和性高。将本发明的组合物应用于软骨损伤部位时，若通过交联剂使表面凝胶化，或者预 先与交联剂混合、实现全体的凝胶化，则本发明的组合物在患部固化，可以以与应用的软骨 损伤部位紧密贴合的状态局部存在。由此，在包埋细胞等时，可以使细胞等成分局部存在于 患部。除此之外，本发明的组合物与软骨损伤部位紧密贴合，由此可以更强烈地发挥本发明 的组合物的软骨再生效果、特别是透明软骨再生效果。8.含褐藻酸的1价金属盐的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物的制剂 化和应用本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物通过应用于人或人以外的 生物例如牛、猴、鸡、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猪、狗、兔、绵羊、马等非人哺乳动物的软骨 损伤部位，以用于促进软骨再生，或者通过注入到关节内、以用于进行软骨疾病的治疗。本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物的形态优选具有流动性的 液体状，即溶液状。本发明中，“具有流动性”是指具有使其形态无定形变化的性质，例如如 溶液，无需总是具有流动的性质。优选具有例如将组合物封入注射器等中、可注入到患部的 流动性。为溶液状的本发明的组合物可通过注射器、凝胶用移液管、专用注射器等容易地应 用于软骨损伤部位或关节内。另外，还适合于各种形状的损伤部位或缺损部位的形状，可以 填充或接触缺损部位全体。本发明的用于软骨再生的组合物、例如在作为透明软骨的关节软骨的软骨缺损部 位显示优异的软骨再生作用。另外，本发明的用于治疗软骨疾病的组合物在骨关节炎等软 骨疾病中具有修复软骨的效果、抑制软骨退行性改变的效果、保护软骨的效果、抑制关节组 织的炎症的效果和/或抑制关节组织炎症产生的疼痛的效果，而发挥治疗软骨疾病的效果。本发明的用于软骨再生的组合物的方式之一是用于透明软骨再生的组合物。透明 软骨再生是指以再生透明软骨的比例高于纤维软骨比例的软骨为目的，实现富含II型胶 原或蛋白聚糖的软骨组织的再生。本发明的治疗软骨疾病的组合物的方式之一是用于治疗骨关节炎的组合物。如骨 关节炎，当软骨损伤涉及关节软骨的广泛范围时，或者要对虽然没有产生明显的软骨缺损 但软骨表面的平滑性变得混乱、开始退行性改变等的较初期的骨关节炎中常见类型的软骨 损伤进行治疗时，优选将本发明的组合物注入到关节腔内，使其遍及关节液内。通过将褐藻 酸的1价金属盐与软骨损伤部位接触，可以促进软骨损伤部位的关节的修复、抑制炎症或 磨损导致的软骨退行性改变、以保护软骨。另外，作为有效成分的褐藻酸的1价金属盐遍及关节液内，由此可以抑制包含滑膜组织的周边组织的炎症反应，以发挥抑制疼痛的效果。同 时，通过在关节液内存在褐藻酸的1价金属盐，可以发挥补充作为缓冲和润滑油的关节液 的功能的作用。本发明的治疗软骨疾病的组合物的另一方式之一是用于治疗肩周炎的组合物。肩 周炎中，以滑膜或关节囊的炎症以及伴随该炎症的疼痛为主，有未见软骨的磨损或变性的 情形。褐藻酸的1价金属盐通过抑制包含滑膜组织的周边组织的炎症反应而发挥抑制疼痛 的效果，因此，通过将本发明的组合物给予肩关节腔内、肩峰下滑液囊内、或肱二头肌长头 腱腱鞘内等，可以治疗肩周炎。本发明的治疗软骨疾病的组合物的又一方式之一是抑制关节疼痛的组合物。关节 疼痛除上述的骨关节炎、肩周炎等之外，在风湿性关节炎中也常成为问题。本发明的优选方 式之一是用于治疗风湿性关节炎的关节痛的组合物，特别优选用于抑制慢性风湿性关节炎 的膝关节痛的组合物。风湿性关节炎的发病机理尚未阐明，可能是由于自身免疫反应产生 的炎症性细胞因子破坏了滑膜组织或软骨组织。褐藻酸的1价金属盐通过抑制包含滑膜组 织的周边组织的炎症反应，而发挥抑制疼痛的效果，因此通过将本发明的组合物给予罹患 了风湿性关节炎的关节内，可以抑制炎症反应及其伴随该炎症反应的疼痛。另一方面，为了 根本性地治疗类风湿性关节炎，必须抑制自身免疫反应，褐藻酸的1价金属盐在风湿性关 节炎的患部中是否具有免疫抑制性作用，这目前尚未阐明。本发明的治疗软骨疾病的组合物的又一方式之一是缓解、改善和/或治愈伴随软 骨疾病的各种病态的组合物。软骨疾病中，软骨、软骨组织和/或关节组织(滑膜、关节囊、 软骨下骨等)由于机械刺激或炎症反应而受到伤害，关节软骨的磨损、机械刺激或炎症反 应导致的软骨组织的退行性改变、滑膜等关节组织的炎症、伴随炎症的关节疼痛等的病态 复合性发生。本发明的组合物含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分，兼具通过 机械刺激保护软骨的效果、抑制磨损或炎症导致的软骨退行性改变的效果、修复软骨损伤 部位的效果、以及抑制关节组织的炎症或疼痛的效果。由此，可抑制软骨疾病的进展，缓解、 改善和/或治愈症状。另外，本发明的治疗软骨疾病的组合物经过对这些病态的缓解、改善 和/或治愈而具有改善关节机能的效果。关节机能的改善意味着关节可活动区域的改善、 曰常生活动作的改善等。将本发明的用于软骨再生的组合物以填充到软骨缺损部位的形式应用时，如果粘 度高则难以使用注射器，因此可使用加压型或电动型等注射器。即使不使用注射器等，例如 也可将板、棒等应用于软骨损伤部位。用注射器注入时，例如优选使用16 18G的针。将 本发明的用于治疗软骨疾病的组合物注入到关节内进行应用时，优选使用18G 27G的针。本发明的用于软骨再生的组合物的应用量可根据所应用的软骨缺损部位、在损伤 部位制作的孔的大小来决定，没有特别限定，直接注入到软骨缺损部位时，例如为0. 05 10mL，更优选为0. 1 2mL。应用于软骨损伤部位时，优选将患部的空洞容积充分注满。将 本发明的用于治疗软骨疾病的组合物应用于关节内时，给药量可根据作为给药对象的关节 的关节液等的量来适当决定，没有特别限定，给予人膝关节或肩关节时，通常为1 5mL，更 优选为2 3mL。给予例如可每周连续给药5次，然后在2 4周内继续给予一次的方法。 并不限于这些方法，可根据症状和效果适当增减。例如，可采取将2周一次或每月一次的给 药适当持续的方法。褐藻酸是动物体内原本不存在的物质，因此动物不具有特异性分解褐藻酸的酶。褐藻酸在动物体内通常通过水解被缓慢地分解，但与透明质酸等聚合物相比，体 内的分解缓慢，给予关节内时可期待长时间的持续效果。本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物的特征在于含有低内毒素 褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。本发明人等首次发现在将褐藻酸给予机体的关节内 时，褐藻酸本身发挥了对软骨组织和关节组织的再生、治疗效果。作为有效成分含有，是指 将褐藻酸应用于患部时，以可发挥对软骨组织和关节组织的再生、治疗效果的量含有，至少 优选为占组合物全体的0. 1% w/v以上。更优选为0. 5% w/v以上，特别优选为1 3% W/
Vo本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物中可以根据需要含有其它 药物活性成分、或常用的稳定剂、乳化剂、渗透压调节剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、止痛剂、 着色剂等通常药物中使用的成分。本发明的一个方式中，本发明的组合物除低内毒素褐藻酸的1价金属盐之外，不 含有对软骨或关节组织发挥药理作用的成分。只含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有 效成分的组合物也可发挥充分的软骨再生或治疗软骨疾病的效果。另外，本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物可含有促进细胞生长 的因子。上述因子例如有BMP、FGF、VEGF、HGF、TGF-β、IGF-1、PDGF、CDMP、CSF、ΕΡ0、IL 和 IF等。这些因子可通过重组法进行制备，或由蛋白组合物中纯化而获得。本发明的一个方式中，本发明的组合物不含有这些生长因子。不含有生长因子时 软骨的再生也十分良好，并且与主动地促进细胞生长的情形相比安全性也高。9.治疗方法本发明进一步提供使用上述本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合 物的软骨损伤部位的治疗方法和软骨疾病的治疗方法。“软骨损伤部位的治疗”或“软骨疾病的治疗”如“ 1.概要”项目中所述。对在软骨损伤部位应用本发明的用于软骨再生的组合物的方法没有特别限定，例 如可在关节镜下、内窥镜下，通过注射器、凝胶用移液管、专用填充器等直接注入到软骨缺 损部位。或者，例如通过髌旁内侧入路等关节切开术等公知的外科方法使患部暴露，然后用 注射器、凝胶用移液管、专用填充器等直接注入到软骨缺损部位。另外，将本发明的组合物应用于软骨损伤部位 前或同时或之后，可以给予链霉 素、青霉素、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、新霉素和两性霉素B等抗生素，阿司匹林、非类 固醇性解热镇痛剂(NSAIDs)、乙酰氨基酚等抗炎症药物等的联合用药。这些药物可以通过 混入在本发明的组合物中的方式来使用。还可以在软骨损伤部位形成一个以上的孔，将本发明的组合物注入到形成的孔 中。并且软骨缺损部位也可以形成一个以上的孔，以同样的方式进行使用。例如，通过外科方法使患部暴露的方法中，在注入本发明的组合物之前可以使用 电钻、钢线等，例如以直径1. 5mm左右的较小的直径在具有残留软骨的软骨缺损部位上制 作多个深达软骨下骨的缺损(全层缺损)，向其中注入组合物。通过形成全层缺损，骨髓出 血，骨髓中的软骨前体细胞游离到软骨缺损部位。通过游离的软骨前体细胞和本发明的组 合物的效果，促进软骨再生，可改善软骨全体的功能。或者，可以在残留软骨的软骨缺损部位，以例如直径1. 5mm左右的较小的直径制作未达软骨下骨的部分缺损，对其应用组合物。制作部分缺损时，缺损部位没有来自骨髓的 出血，没有骨髓中的软骨前体细胞的渗出。即使在这种情况下，通过在小直径的孔中应用组 合物，也可发挥本发明的组合物的效果，软骨的再生良好，可改善软骨全体的功能。这些方 法是对于软骨损伤部位、残留有损伤的软骨的情形为有效的方法。10.用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的试剂盒本发明进一步提供用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的试剂盒。试剂盒中可含 有上述本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物、交联剂、注射器、凝胶用移液 管、专用填充器、使用说明书等。试剂盒的优选的具体例子是具备以下构成的试剂盒在一 体成型、含有通过间隔区分的两个空间的注射器的一个空间中密封褐藻酸的1价金属盐、 另一空间中密封作为溶解液的生理盐水或作为交联剂的CaCl2等含有钙离子的溶液，可以 在使用时将两个空间的间隔容易地连通；使用时将两者混合、溶解。作为另外一个例子，是 可以将褐藻酸的1价金属盐溶液封入预灌封注射器中、在使用时无需制备操作可直接给药 的试剂盒。作为另外一个例子，是将褐藻酸溶液与交联剂分别封入不同的注射器、装入一个 包装内的试剂盒。关于“用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物”、“交联剂”、“注射器” 如上所述。而且，在含有褐藻酸的1价金属盐的组合物中可以如上所述包埋细胞。并且试 剂盒中还可以含有链霉素、青霉素、妥布霉素、阿米卡星、庆大霉素、新霉素和两性霉素B等 抗生素，阿司匹林、非类固醇性解热镇痛剂(NSAIDs)、乙酰氨基酚等抗炎症药物等的联合用 药。通过使用本试剂盒，可以顺利地进行软骨再生治疗、软骨疾病治疗。需要说明的是，对于本说明书中引用的所有的公开发行物、例如现有技术文献和 公开公报、专利公报等其它专利文献，其全体内容均在本说明书中作为参照引用。而且本说 明书包含作为本申请优先权主张基础的日本国特许出愿-日本特愿2007-41520号说明书 和日本特愿2007-277005号说明书的内容。以下，通过实施例具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。实施例1褐藻酸钠溶液的制备本实施例中，使用纯化褐藻酸钠((株)Kimica、(株)持田International, Sea Matrix (灭菌)，生产型号B5Y01)、和未纯化的食品级褐藻酸钠(也称为商品级褐藻酸钠) (和光纯药工业(株)，褐藻酸钠500，199-09961)两种。纯化褐藻酸钠是灭菌的冷冻干燥 品。食品级的褐藻酸钠通过孔径0. 22 μ m的滤器过滤灭菌。当利用市售的LAL测定试剂盒(Limulus Color KY Test Wako, Wako日本)测定 内毒素水平时，纯化褐藻酸钠的内毒素水平为5. 76EU(内毒素单位)/g，食品级褐藻酸钠的 内毒素水平为75950 EU/g，纯化褐藻酸钠的内毒素水平与食品级褐藻酸钠的内毒素水平相 比极低。即，纯化褐藻酸钠是经过了低内毒素处理的褐藻酸钠。另外，纯化褐藻酸钠的重金 属含量为20ppm以下，硫酸铅为0. 98%以下，砷为2ppm以下。另外，将各褐藻酸钠用过滤灭菌的Mi 11 i-Q水制备成1、2 % w/v的各浓度的褐藻酸 钠溶液。利用旋转粘度测定仪(小型)(TVE-20LT, TOKI SANGYO CO.，LTD.日本)，在20°C 下测定各浓度的褐藻酸钠溶液的粘度。关于转数，测定褐藻酸钠溶液时为lrpm，测定 2%褐藻酸钠溶液时为0. 5rpm ；关于测定范围，测定褐藻酸钠溶液时为MjBUS 2%褐藻
23酸钠溶液时为5M。结果如下述表1所示。(表 1)
褐藻酸粘度mPa-s取度(％)第1次第2次第3次平均标准偏差食品级1533.5537.0531.5534.02.27食品级25377.05336.05325.05346.022.38纯化1435.4434.1429.3432.92.62纯化25359.05496.05488.05447.762.78如表1所示，纯化褐藻酸钠在w/v下约为430mPa *s，在2%下约为5400mPa .S。 食品级中，在w/v下约为530mPa · s，在2%下约为5300mPa · s。由两组的结果可知，本 实施例中使用的纯化褐藻酸钠和食品级褐藻酸钠的各溶液的粘度在 Λ下约为400 600mPa · s、在2%下约为5000 6000mPa · s左右的粘度。对于1、2、3% w/v的各浓度的纯化和食品级的褐藻酸钠溶液进行性状确认。将各 浓度的褐藻酸钠溶液自下向翻转的塑料盘中滴加数滴，此时， Λ褐藻酸钠溶液(粘度 约400 600mPa 的大部分不堪重力而在数秒内从盘中滴下，但盘底部会粘有一些褐藻 酸钠。由此显示，含有褐藻酸的1价金属盐的组合物如果粘度约为400 600mPa · s左右 以上，则可得到具有附着性、可停留在患部的性质，显示得到了本发明的效果。与此相对，对 于2% w/v的褐藻酸钠溶液(粘度约5000 6000mPa ，不会滴下，至少可在盘上附着约 1分钟以上。从盘上滴下后仍有较多的褐藻酸钠附着在盘的底部。浓度为3% w/v的褐藻 酸钠溶液在上述盘的试验中，比2% w/v的褐藻酸钠溶液附着于盘上的时间更长。另一方面，关于组合物的操作的容易程度，对于3% w/v的褐藻酸钠溶液，溶解于 Milli-Q水需要稍长时间，填充到移液管或注射器时操作稍有难处，但是是可以进行移液管 和注射器的操作的。对于上述的1、2% w/v的褐藻酸钠溶液则容易操作。其中，可以认为此时所使用的褐藻酸钠与实施例10中使用的浓度的粘度为 570mPa-s的褐藻酸钠接近，由此可知3% w/v的褐藻酸钠溶液的粘度大约为20000mPa ·8。 因此，从移液管或注射器等的操作容易的角度考虑，含有褐藻酸的1价金属盐的组合物优 选使粘度约为20000mPa · s以下。由以上结果显示，将褐藻酸钠溶液的粘度制成5000mPa · s 6000mPa · s时，制备 和手术最为容易，适合作为用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物。在临床上，例如 在关节镜下操作股骨关节面的软骨缺损的情形等，损伤部位大多朝向下方或侧方。本发明 的组合物显示即使对于上述手术困难的损伤部位，通过调节组合物的粘度，也可以对各种 形态的软骨损伤部位广泛应用。另外，为本实施例中使用的纯化褐藻酸钠时，为了使粘度为 5000mPa · s 6000mPa · s，可使用Milli-Q水等将浓度制备成2% w/v左右。实施例2移棺细胞的制备为了制备移植细胞，分离骨髓间叶系间质细胞(BMSC)并培养。BMSC中除了骨 髓间充质干细胞之外，还含有红细胞系细胞等。由4月龄的日本白兔的胫骨采集IOmL骨
24髓，用无Ca-Mg的PBS (GibcoBRL Lab.)清洗2次，然后悬浮于DMEM-高葡萄糖(DMED-HG， SigmaChemical，圣路易斯，密苏里州)。用孔径70 μ m的细胞过滤网(FalconCo. Ltd)除 去血液凝块。将细胞在 DMEM-HG、10 % 胎牛血清(FBS, Gibco, Life Technology, Grand Island，纽约)、1%抗生素(青霉素-链霉素-两性霉素IOOX浓缩，Cambrex Biosciences, ffalkersville, MD)的培养基中、在IOOmm的培养皿中、在37°C、5% CO2、加湿下进行温育。 每隔3天更换1次培养基，除去未粘附的细胞。将具有粘附性的细胞进行10 14天的单 层培养，然后用胰蛋白酶-EDTA(IOmM) (Sigma, UK)剥离，计数，每隔3天继代1次。实施例3褐藻酸微球的制备将实施例2所得的细胞用过滤灭菌的Milli-Q水悬浮于调节为2% w/v的褐藻酸 钠溶液中，使细胞浓度为2. 5 X IO7个细胞/mL。将悬浮液用移液管滴加到CaCl2溶液中，形 成凝胶，10分钟后，将形成的微胶囊用无Ca-Mg的PBS清洗2次，然后用DMED-HG清洗1次。 每个微球40 μ L，制成含有1 X IO6个细胞的微球。从褐藻酸微球中收集细胞是用PBS清洗3次，在50mM的EDTA (Gidco BRL laboratories)中、在37°C、5% CO2下温育。10分钟后以1500g离心5分钟，收集细胞。实施例4对褐藻酸微球中的细胞的钙毒件(方法)通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8，Dojindo Laboratories，东京，日本)测定通过滴 加CaCl2溶液形成褐藻酸胶囊的细胞的存活率。按照实施例3的顺序，将实施例2所得的 细胞悬浮于2% w/v纯化褐藻酸钠溶液中，使细胞浓度为2. 5 X IO7个细胞/mL，滴加到50、 100、200、400mM的各浓度的CaCl2溶液中，浸泡15分钟，每个微球40 μ L，制成含有1 X IO6 个细胞的微球。将褐藻酸微球用PBS清洗2次，然后按照实施例3所述的方法收集微球中 的细胞，悬浮于DMED-HG中。将各组的细胞铺于96孔板，进行1小时温育，然后将20 μ L CCK-8溶液加入到各孔 中，进一步温育4小时。细胞的存活率是使用微量板读数仪(Bio-Rad Japan Life Science Research,东京，日本)、在吸光度450nm下测定而获得的。(结果)各CaCl2溶液浓度下的细胞存活率如图1所示。褐藻酸微球中的活细胞数与钙浓度相关性地减少，自200mM起显著降低。由此显 示了 CaCl2的细胞毒性。还发现，为了将其对细胞的影响抑制到最低限度、且使褐藻酸钠尽 可能快地形成硬的凝胶，使与褐藻酸钠接触的氯化钙溶液的浓度为IOOmM左右较为适当。实施例5(方法)用经低内毒素处理的纯化褐藻酸钠和未经低内毒素处理的食品级褐藻酸钠，比较 褐藻酸微球中的细胞存活率。各褐藻酸微球如下制备按照实施例3的顺序，将由实施例2 得到的细胞悬浮于2% w/v褐藻酸钠溶液中，滴加到IOOmM的CaCl2溶液中。各微球是每个 微球40 μ L，制成含有IX IO6个细胞的微球。将两种褐藻酸胶囊在加入了 10%FBS、1%抗生素的DMED-HG中培养0、1、2、3、7、14天。按照实施例3所述的方法从各胶囊中收集细胞， 通过CCK-8计算活细胞数。(结果)结果如图2所示。在第1、3、7天中，使用经低内毒素处理的纯化褐藻酸钠溶液与 使用未经低内毒素处理的食品级褐藻酸钠溶液的情形相比，前者中的活细胞显著残留。经 低内毒素处理的纯化褐藻酸钠溶液与未经低内毒素处理的食品级褐藻酸钠溶液相比，特别 是在早期(7天以内)，可见前者对细胞的毒性小等有利之处。实施例6体外褐藻酸微球中的培养Tffe(培养)分别将纯化褐藻酸钠和食品级褐藻酸钠按照实施例3、与实施例5同样地制备 每个微球40 μ L、含有IX IO6个细胞的微球。在24孔培养皿中，每孔中一个微球，在下面 的ImL标准培养基中培养。即，所使用的标准培养基是将包含100yg/mL丙酮酸钠(ICN Biomedicals, Aurora,俄亥俄州)>40 μ g/mL 脯氨酸(ICN Biomedicals, Aurora,俄亥俄 州)、50μ g/mL抗坏血酸2-磷酸(Wako，大阪，日本)、1 X ICT7M地塞米松(ICN Biomedicals, Aurora，俄亥俄州)、1% ITS plus mix (Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州)、1 %抗生素、 以及lOng/mL重组人转基因生长因子β 3 (R&D System,明尼阿波利斯，明尼苏达州)的 DMEM-HG用lmg/mL含牛血清白蛋白的4mM HCl溶解而形成。培养皿在37°C下温育，每隔3 天更换1次培养基。(RNA 的实时 RT-PCR 分析)培养14天后，由勻浆后的细胞中提取总RNA，分析I、II、X型胶原、聚集蛋白聚糖、 Sox 9的基因表达。试验全部按照常规方法进行。S卩，RNA是通过以吸光度260nm、280nm测定求出收量。接着，通过mProm-II 反 转录系统(Promega，麦迪逊，威斯康星州)，按照手册，由0.05μβ的RNA合成cDNA。此 时，将总RNA和随机引物的结合物在70°C下变性5分钟，立即在冰水中冷却5分钟，然后 用ImProm-II 反转录酶，在42 °C下反转录60分钟。接着将所得cDNA用PCR-Grade水 (Roche Diagnostics,印第安纳波利斯，印第安纳州)稀释，浓度调整为低于40ng/yLo以 20 μ L的反应容量进行PCR，使用DNA Engine Opt icon 2连续荧光检测系统(Bio-Rad laboratories, Hercules，加利福尼亚州)进行监测。使用通过 DNASIS (HitachiSoftware Engineering，东京，日本)设计的基因特异性引物，使用SYBRgreen qPCR试剂盒(Finzyme， Espoo，芬兰)检测信号。具体来说，使用下面的引物兔I 型胶原(5，-3，) TAAGAGCTCCAAGGCCAAGA (SEQ ID NO. 1)禾口(3，-5，) TGTACCTACTCCTTTGACCG (SEQ ID N0. 2)兔II 型胶原(5，-3，)AGAGACCTGAACTGGGCAGA(SEQ ID N0. 3)禾口(3，-5，)ACCACGATATGAGGCACAGTTT(SEQ ID N0. 4)兔X 型胶原(5，-3，) GCCAGGACCTCCAGGACTAT (SEQ ID N0. 5)禾口(3，-5，) CTTTGGACCTGTTGTCCCT (SEQ ID N0. 6)
兔聚集蛋白聚糖(5，-3，)GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT (SEQ ID NO. 7)禾口(3，-5，)TGACAGTCCATGGGGTAGGT(SEQ ID NO. 8)兔Sox9 (5，-3，) AAGGGCTACGACTGGACGCT (SEQ ID NO. 9)禾口(3，-5，)GTGCAGTTCGCCGGGT(SEQ ID NO. 10)在95 °C、10分钟的初期变性步骤后，将cDNA产物以40个PCR循环进行扩增。各循 环包含如下步骤94°C、10秒的变性步骤；58°C、20秒的退火步骤；以及72°C、30秒的链延 伸步骤。使用 OpticonMonitor 软件(Bio-Rad Laboratories，Hercules，加利福尼亚州) 进行数据分析。当荧光强度达到0.03时以Ct(循环阈值)值的形式求出各样品的值。该 值通过在该范围内确认所有的曲线处于指数扩增期进行选择。使用改良比较Ct法，由该目 标基因和比较基因(GAPDH)的Ct值计算各基因的相对表达水平。(染色)将培养21天、28天后的微球用PBS清洗，用10%磷酸缓冲液-低聚甲醛固定24 小时，然后包埋到石蜡中，由微球的中央切取5μ m的部分，按照常规方法进行H-E染色、番 红-0染色。另外，通过抗I型、抗II型(Fuji Pharm. Lab.，富山，日本)、抗X型(Sigma，圣 路易斯，密苏里州)的抗胶原抗体确认I、II、X型胶原的生成。MMRNA的实时RT-PCR分析的结果如图3所示。染色结果如图4所示。图4㈧和⑶ 显示使用纯化褐藻酸钠的结果，图4(C)和(D)显示使用食品级褐藻酸钠的结果。图4(A) 和(C)为培养21天，图4(B)和⑶为培养28天。另外，在图4(A) ⑶的各照片中，由 左依次表示Η-Ε、番红-0、抗I型、抗II型、抗X型的抗胶原抗体的染色结果。参照RT-PCR的结果(图3)，在使用纯化褐藻酸钠和食品级褐藻酸钠的任意情形 下，均可见显示细胞的软骨分化的II型胶原、聚集蛋白聚糖、SOX9的增加。将两种进行比 较，则以纯化褐藻酸钠培养的显示聚集蛋白聚糖、sox9的水平显著高。另外，参照染色的结果(图4)，可见两种褐藻酸微球均产生了被番红0染色或显示 软骨分化的II型胶原免疫染色所染色的胞外基质，可见软骨分化。实施例7兔软骨修复模型^fe(手术)将40只雌性日本白兔(体重2. 6 2. 9kg)用异氟烷· O2气和戊巴比妥静注 (0. 05mg/kg)进行麻醉，肌肉注射抗生素(青霉素G，Meiji-Seika,日本)，然后腿部剃毛。 将前侧中央部切开2cm，通过髌旁内侧入路到达髁间部位。使用电钻(Rexon，日本)，制作股 骨滑车的骨软骨缺损(直径5mm，深度2mm)。将膝部用生理盐水浸润，确认缺损部位没有出 血，使缺损部位干燥。本实施例中，分成以下5组进行试验。A)对照组(空白)B)食品级褐藻酸组(无细胞)C)食品级褐藻酸+有细胞(2. 5 X IO7个/mL)组D)纯化褐藻酸组(无细胞)
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E)纯化褐藻酸+有细胞(2. 5 X IO7个/mL)组A)的对照组是对缺损部位未进行任何处置的组。B)的食品级褐藻酸组(无细胞) 是将2% w/v的食品级褐藻酸钠溶液应用于缺损部位的组，D)的纯化褐藻酸组(无细胞) 是将2% w/v的纯化褐藻酸钠溶液应用于缺损部位的组。并且，C)食品级褐藻酸+有细胞 组、E)纯化褐藻酸+有细胞组是将实施例2所得的细胞悬浮于2% w/v的食品级褐藻酸钠 溶液或2% w/v的纯化褐藻酸钠溶液中，应用于关节软骨的缺损部位。此时，细胞使用了按 照实施例2的方法制备的兔自体细胞。使褐藻酸钠溶液的浓度为2 % w/v，这是由于由实施例1的结果可知，这样可以使 粘度为适合手术的5000mPa · s 6000mPa · s。以缺损部位朝向上方的姿势固定兔，使用凝胶用移液管将本发明的组合物应用于 缺损部位。B) E)的各组中，褐藻酸钠浓度的粘度均适度，因此，即使由于关节液而形成容 易流动的条件，褐藻酸钠溶液也不会从缺损部位流出。然后，用27G针的注射器将约0.5mL IOOmM的CaCl2溶液用10秒的时间缓慢持续地加到移植片的表面。移植片的表面层立即形 成凝胶，移植细胞不会从患部脱离。用生理盐水清洗CaCl2溶液。无需进一步固定，手术后 缝合患部。兔可自由活动。在手术4周后或12周后，对受试体的兔静脉注射过量戊巴比妥，使其安乐死。然 后将其腿部的末端部用电锯切除。图5是手术时的照片。(全体观察)用肉眼观察全体外观，进行评分。评分是参考Gabriele G.等人的方法 (Biomaterial，21 (2000)，2561 2574)，按照图 6 的基准打分。(染色)之后将受试体用低聚甲醛固定，脱钙，用石蜡固定。将自缺损部位中央向外5μπι 的部分实施番红-0、Η-Ε染色、抗I型胶原、抗II型胶原免疫染色。为了评价新形成的软骨 组织，采用图7所示的评分系统，通过显微镜进行评价。评分由独立的、盲试人员进行。(机械强度测定)通过压痕试验仪测定患部的机械强度。将股骨膝关节朝向上方，牢固地进行夹板 固定，试验在室温下进行。压头运动自动的朝向再生软骨的中心，记录相对于负荷(N)的移 动(mm)。新生组织的厚度由组织切片来测量。由负荷-变形曲线的直线部分得出杨氏模量。MM染色结果如图8 11所示。H-E染色、番红0染色、抗II型胶原免疫染色的结果如下E)的纯化褐藻酸+有细 胞组(图11)中，与其它组比较，自4周后这样较早的阶段即可见形成最优异的透明软骨、 II型胶原。12周时可见约80%的软骨再生。从H-E染色结果可知，软骨下骨的形成也极为 良好。番红0染色中可见蛋白聚糖的形成，也可见胞外基质的形成。另一方面，通过H-E染 色、抗I型胶原免疫染色，几乎未见纤维软骨的生成。D)的纯化褐藻酸组(无细胞)(图10)与C)的食品级褐藻酸+有细胞组(图9) 比较，透明软骨、II型胶原、软骨下骨的形成均良好，在未包埋细胞的D)组中，得到了通过透明软骨细胞引发的软骨再生，这是另人惊讶的结果。另外，未包埋细胞的D)组与包埋了 细胞的C)组相比，软骨损伤的再生能力优异，这是预想以外的结果。另一方面，缺损部位未经任何处理的A)对照组(图8)中几乎未见软骨细胞、II型 胶原的新生。肉眼观察外观全体并评分得到的评价结果(肉眼)、以及对上述染色观察进行评 分的评价结果(组织学)如图12所示。12周中，结合肉眼和组织学的结果进行综合评分(总分)，E)纯化褐藻酸+有细 胞组为22. 71分，D)纯化褐藻酸组(无细胞)为19. 57分，C)食品级褐藻酸+有细胞组为 14. 75分，B)食品级褐藻酸组(无细胞)为10. 25分，A)对照组(空白)为8. 43分，E)纯 化褐藻酸+有细胞组最为优异，其次是D)纯化褐藻酸组(无细胞)、C)食品级褐藻酸+有 细胞组的顺序。未包埋细胞的D)组与包埋了细胞的C)组比较，综合评分(总分)优异，软 骨损伤的再生能力优异，这是完全未预想到的结果。肉眼的外观全体的评价(肉眼-全体)、染色评价(组织学-全体)的评分结果均 与上述同样，E)纯化褐藻酸+有细胞组最优，其次是D)纯化褐藻酸组(无细胞)。肉眼的评价项目中，使用纯化褐藻酸的D)组和E)组与使用食品级褐藻酸的B) 组、C)组比较，端部融合(新生细胞相对于原有的软骨(new tissue relative to native cartilage))、软骨表面的光滑程度(smoothness of cartilage surface)、软骨表面、±真充 度(cartilage surface, degree of filling)、软骨颜色、新生软骨的不透明程度、透明性 (color ofcartilage, opacity or translucency of the neocartilage) ^PJfW^M Ιξ|i-^iJt
已在组织学的评价项目中，使用纯化褐藻酸的D)组和E)组特别是在优势组织的性 M (nature of predominant tissue)(surfaceregularity)
禾口均勾性(structural integrity andhomogeneity)、厚度(thickness)、与周围软骨的结 (bonding to adjacentcartilage) ^ΜΗΙ ^'Μ' ' Μ τ ιβ^^ (degenerative changes in adjacentcartilage)、炎症反应(inflammatory response)项目中比使用食品级褐藻酸的 B)组、C)组的评分高。由以上可知，作为本发明组合物的D)组、E)组中，透明软骨、II型胶原、软骨下骨 的形成等的软骨损伤中的软骨细胞、软骨组织的形成极为良好，几乎未见纤维软骨的形成。可知新生组织与宿主组织的融合性好，周围软骨的变性或炎症反应少，机体亲和性高。可以确认本发明的组合物有效地促进了软骨损伤部位的软骨再生。纯化褐藻酸组D)组、E)组的机械强度测定结果如图13所示。纯化褐藻酸组的机械强度测定的结果是相对于正常软骨组织的杨氏模量10，E) 纯化褐藻酸+有细胞组为8，可见强度恢复至几乎没有损伤的正常状态。由此证明，包埋了 细胞的本发明的组合物机械强度优异，可再生具有强度的透明软骨，也可良好地形成软骨 下骨。实施例8经适性处理的男性尸体(Cadaver)模型(方法)
对经适性处理的男性尸体进行福尔马林固定，在室温下膝部没有变形部位或不稳 定的性质。通过髌旁内侧入路使股骨侧面关节丘暴露。关节软骨光滑，且未见变性或退化 等。使用多种类的打孔机，在内侧关节面负荷最重的部位制备幅宽(IOmmX20mm)、深度5mm 的软骨全层缺损并缝合。由前外侧插入倾斜30°的关节镜。手术器具全部由前内侧插入。 将生理盐水应用于患部，然后排出残留在关节部位的液体，用干棉球擦拭。用18G针的注射 器将台盼蓝着色的2% w/v纯化褐藻酸钠溶液(无细胞)、粘度5000 6000mPa 缓慢注 入软骨缺损部位。手术时，患部朝向下方，但本发明的组合物未从损伤部位脱落，停留在损 伤部位。将约IOmL IOOmM的CaCl2溶液应用于患部，使表面形成凝胶。通过生理盐水回流， 充分清洗膝关节，为防止干燥，用20mL生理盐水充满患部。手术后，每隔6小时手动将膝盖进行弯曲和伸展200次，在0°C 120°C的范围内 运动。手术24小时后评价患部。(结果)表示本实验的情形的照片如图14所示。图14(A)是表示制作软骨缺损部位的情形 的照片。图14(B)是表示将着色的褐藻酸钠移植到软骨缺损部位的情形的照片。图14(C) 是在褐藻酸钠的表面施加CaCl2溶液，使其凝胶化(固化)时的照片。并且，图14(D)是手 术后活动关节、24小时后进行观察的情形的照片。本试验不仅是对兔，也是对在人的尸体上制作较大的缺损部位时确认是否可移植 而进行的试验。如图14B的照片所示，将褐藻酸钠溶液注入到缺损部位，即使表面不形成凝胶，褐 藻酸钠溶液也不会从患部流出。另外，对于使褐藻酸钠溶液的表面凝胶化，在术后活动关 节，即使是在24小时后观察时缺损部位仍停留有褐藻酸钠溶液。这样，在施加负荷、活动剧 烈的较严酷的条件的部位中，上述形态的组合物也可以停留，这是另人惊讶的。由此可知， 本发明的用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物对于各种形态的软骨损伤部位、对于 各种应用条件均可以广泛地临床应用。实施例9在软骨损伤部位制作1个 多个小孔的方法(1) M 1软骨损伤部位或软骨缺损部位残留有软骨时，按照实施例7、8的方法，使用电钻， 在软骨损伤部位或残留软骨上以直径1. 5mm、深度5 IOmm左右的较小的直径制作1个 多个深达软骨下骨的全层缺损。用18G针向其中缓慢注入3000 4000mPa 的纯化褐藻 酸钠溶液(无细胞)，然后将l.OmL IOOmM的CaCl2溶液应用于在缺损部位注入有褐藻酸钠 溶液的表面，使表面形成凝胶。由于制作了全层缺损，来自患者的骨髓出血使骨髓中的软骨 前体细胞游离到软骨缺损部位。通过游离的软骨前体细胞和本发明的组合物的效果促进软 骨的再生，可以改善软骨全体的功能。(2)例 2与例1同样，在软骨损伤部位或残留有软骨的软骨缺损部位制作未达软骨下骨的 部分缺损。与例1同样，对其应用2000 3000mPa · s的纯化褐藻酸钠溶液(无细胞)、 IOOmM的CaCl2溶液。由于缺损部位没有来自患者的骨髓出血，受试者没有骨髓中的软骨前 体细胞的浸润。但是，即使在这种情况下，通过在小直径的孔中应用组合物，也可发挥本发明的组合物的效果，软骨再生良好，可改善软骨全体的功能。这些方法对于软骨损伤部位范 围较广时、残留有损伤的软骨时均是有效的方法。
实施例10使用褐藻酸钠((株)Kimica)水溶液，对本发明的组合物的粘度和附着性的关系 进行研究。(方法)使用褐藻酸钠水溶液的粘度因分子量不同而显示110、360、570mPa · s的三种 褐藻酸钠水溶液，制备各种褐藻酸钠水溶液(下述表2)，将一定量注入到离心用的微量管 (内径9mm、高39mm)中，注意不要有气泡混入，在迅速地倾斜135度的角度时测定至各水溶 液开始由微量管中流出所用的时间。此时，褐藻酸钠水溶液的粘度通过东机产业制造的B型粘度计、在20°C的条件下 进行测定。(表 2)样品
褐藻酸納水溶液浓度(％)IlOmPa-S0.51.01.52.02.53.01%粘度360 mPa.s0.51.01.52.02.53.0570 mPa-s0.51.01.52.02.53.0(结果)各种褐藻酸钠的浓度与附着时间的关系如图15所示。可知三种褐藻酸钠水溶液 中的任意一种，随着褐藻酸钠水溶液浓度的升高，附着时间延长，附着性升高。另外，将3种 褐藻酸钠水溶液进行比较，可知如果选择1 %浓度下粘度高的褐藻酸钠水溶液，则显示高附 着性，可获得更长的附着时间。各种褐藻酸钠水溶液的粘度与附着时间的关系如图16所示。随着褐藻酸钠水溶 液粘度的升高，附着时间延长，显示高附着性。以上显示，含有褐藻酸的1价金属盐的组合 物的粘度与附着性之间可得到一定的相关性。基于以上发现，当将本发明的组合物应用于倾斜的或朝向下方状态的软骨损伤部 位时，以及除去所应用的患部的水分或血液等、以符合本试验条件时，可以参照该结果，调 节本发明的组合物的粘度。例如，为了获得约5秒左右的附着时间，可将本发明的组合物的 粘度调节至约2000mPa 左右以上；为获得大约10秒左右的附着时间，可将本发明的组合 物的粘度调节至约3000 4000mPa · s左右以上；为获得大约20秒左右的附着时间，可将 粘度调节至约7000 8000mPa · s左右以上；为获得大约30秒左右的附着时间，可将粘度 调节至约8000 9000mPa · s左右以上。但是，实际应用于患部时，由于组合物的注入量、注入部位的形状等，附着时间发 生变化。特别是组合物的注入量少时，除粘性之外，表面张力等因素也有影响，因此，即使是 低粘性也可长时间附着。
除此之外，可以适当考虑测定中使用的粘度计的特性、室温、包埋的细胞量、本发 明的组合物的状态，结合手术的方法获得目标附着时间。实施例11纯化褐藻酸钠的分子量分布测定(1)方法按照以下条件，通过凝胶过滤色谱进行纯化褐藻酸钠的分子量分布测定。柱=TSKgelGMPffxl 2 根 +TSKgel G2500Pffxl 1 根(Tosoh 株式会社制备)(直径 7. 8mmX300mmX3 根)柱温40°C洗脱液200mM硝酸钠水溶液试样浓度0.05%流速LOmL/分钟注入量200μ L检测器RI (差示折射仪)标准物质普鲁兰、葡萄糖(分子量160万、78. 8万、40. 4万、21. 2万、11. 2万、4. 73 万、2. 28 万、1. 18 万、5900、180)(2)结果(表 3)
权利要求
用于治疗软骨疾病的组合物，该组合物是关节内注入给药，其特征在于含有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。
2.权利要求1所述的组合物，其特征在于上述低内毒素褐藻酸的1价金属盐通过凝 胶过滤色谱测得的重均分子量为50万以上。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中，上述软骨疾病是骨关节炎。
4.权利要求1或2所述的组合物，其中，上述软骨疾病是肩周炎。
5.权利要求1或2所述的组合物，其中，上述软骨疾病是风湿性关节炎的关节疼痛。
6.用于抑制软骨退行性改变的组合物，该组合物是关节内注入给药，其特征在于含 有低内毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。
7.用于保护软骨的组合物，该组合物是关节内注入给药，其特征在于含有低内毒素 褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。
8.用于修复软骨的组合物，该组合物是关节内注入给药，其特征在于含有低内毒素 褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。
9.用于抑制关节疼痛的组合物，该组合物是关节内注入给药，其特征在于含有低内 毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。
10.用于抑制关节炎的组合物，该组合物是关节内注入给药，其特征在于含有低内毒 素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。
11.用于改善关节机能的组合物，该组合物是关节内注入给药，其特征在于含有低内 毒素褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。
12.用于软骨再生的组合物，该组合物通过应用于软骨损伤部位而在患部固化，该组合 物含有凝胶过滤色谱测得的重均分子量为50万以上的低内毒素褐藻酸的1价金属盐，粘度 为400mPa · s 20000mPa · s，具有流动性。
13.权利要求12所述的组合物，该组合物包埋有骨髓间充质干细胞。
14.用于透明软骨再生的组合物，该组合物通过应用于软骨损伤部位而在患部固化，该 组合物含有凝胶过滤色谱测得的重均分子量为50万以上的低内毒素褐藻酸的1价金属盐， 不含有用于软骨组织再生的细胞，粘度为400mPa · s 20000mPa · s，具有流动性。
15.权利要求12 14中任一项所述的组合物，其中，上述组合物应用于软骨损伤部位， 通过在该组合物的表面应用CaCl2溶液来进行固化。
全文摘要
本发明提供用于软骨再生或用于治疗软骨疾病的组合物，其特征在于该组合物含有使内毒素水平降低至实质上不会引发炎症或发热程度的褐藻酸的1价金属盐作为有效成分。由此，可以提供使软骨再生作用和应用于软骨损伤部位的容易程度更为改善的用于软骨再生的组合物，以及同时具有通过机械刺激保护软骨的效果、抑制因磨损或炎症而导致的软骨退行性改变的效果、修复软骨损伤部位的效果以及抑制关节组织的炎症或疼痛的效果的用于治疗软骨疾病的组合物。
文档编号A61K9/06GK101951969SQ20088000492
公开日2011年1月19日 申请日期2008年2月21日 优先权日2007年2月21日
发明者三浪明男, 五十岚达弥, 今井真理子, 大泽伸雄, 宫岛千寻, 岩崎伦政, 河村太介, 笠原文善, 笠原靖彦 申请人:持田制药株式会社;国立大学法人北海道大学