包含ecm的网片的制作方法

专利名称：：包含ecm的网片的制作方法包含ECM的网片
背景技术：
：腹壁损伤可由外伤、肿块切除或先前腹部手术的并发症诸如疝气和网片感染引起。腹壁包括若干肌肉和正面结构，其允许腹壁起到保护腹内器官的作用并允许腹壁弯曲和伸展躯干并支撑背面。疝气是组织、结构或一部分器官经过其被正常包含的肌肉组织或膜的突出。大多数疝气在腹部内由于腹壁能力变弱导致缺损，被腹膜覆盖的脂肪组织或器官经该缺损突出而发展。当构建人造口时，诱导腹壁的能力变差，并且产生人造口周围疝气的风险增加。在与回肠造口术和尿道造口术相比的结肠造口术中，所有人造口中有30。/。具有增加的发病率(Efron2003)。向后推(Pushingback)或降低患疝气的组织可以手术方式修复大多数腹疝。现代的增强技术包括合成材料(网片假体)，其避免了己经变弱的、将机械载荷散布在更大面积内的组织的过度伸展。将网片放置在缺损上方，并且有时用网栓进行固定。使用几种假体移植物用于腹部筋膜修复，诸如由聚丙烯(Prolene,EthiconInc.)、聚乙烯(Dacron)、腈纶布(Orion)、聚乙烯海绵(Ivalon)、聚四氟乙烯(PTFE,特氟隆网片和布)、膨胀PTFE(Gore-tex)、聚酯(Mersilene)和聚乙烯布(Vinyon-N)制成的不能被吸收的网片。可吸收的网片包括聚乳酸羟基乙酸(Vicryl,Dexon)和聚羟基乙酸(Dexon)。聚丙烯网片是被用于腹部修复的最常用的合成假体网片。女性骨盆区域内组织的变弱导致其中器官下落或从原位滑出的病况。人类的下垂有阴道下垂或直肠下垂。在阴道下垂中，一部分阴道腔从阴道开口伸出，因为膀胱、小肠、直肠、尿道、子宫或阴道顶突出进入阴道。在直肠下垂中，直肠壁伸出经肛门并因此在体外变得可见。在压力性尿失禁中，由妊娠、分娩和绝经引起的物理变化导致骨盆底肌肉能力变弱。当咳嗽、大笑、打喷嚏、锻炼或者当其它运动增加腹内压力从而增加对膀胱的压力时，这一能力变弱导致尿道向下移动。用于压力性尿失禁的普通手术包括通过提升膀胱并用附着于肌肉、韧带或骨的线将膀胱固定而将膀胱向上拉动到更正常的部位。另一个可能性是用宽的悬吊索固定膀胱。这提起膀胱而且还压縮膀胱底部和尿道上部，进一步防止渗漏。在一面上而非在对面上附着细胞的植入用网片是已知的。这通过用特氟龙薄膜层压网片或通过用生物吸收性材料诸如胶原蛋白或胶质涂覆网片来进行。ECM产品或涂覆ECM的网片的使用是已知的。这些产品是料片形式或者是被ECM组分涂覆的网片形式。包括冻干猪ECM料片的ECM料片的实例是SurgisisHerniaMatrix(Surgisis痛气基质)，SurgisisHerniaRepairGraft(Surgisis痛气修复移植物)禾卩StratasisUrethralSling(Stratasis尿道悬吊索)，全部得自Cook。网片的涂层的实例是Parietex复合网片(具有胶原蛋白涂层的聚酯网片)和Sepramesh(Genzyme)(具有由透明质酸钠(HA)、羧甲纤维素(CMC)和聚乙二醇(PEG)组成的水凝胶涂层的聚丙烯网片)。发明概述本文公开了细胞外基质蛋白(ECM)的非连续区域在促进细胞生长中的应用。当所述支架(scaffolds)被施用于惰性材料上面时，促进细胞向内生长并且适当地固定网片的附着。发明详述本发明的一个方面涉及包含生物相容性惰性材料的网片，所述生物相容性惰性材料至少部分地被包含ECM的非连续区域的连续材料所覆盖。在一个实施方案中，网片是针织结构，优选是针织织物。在另一个实施方案中，网片是非织造物。在又一个实施方案中，网片是薄的多孔膜。通过对网片材料的涂层附加ECM的非连续区域，有可能将网片的可以提供的一定范围的物理性质(例如强度、柔软度、灵活性、耐用性)与ECM的重构性质相组合。另外，这种涂层的价格比其它涂层的价格低，因为所述粉末是得自生产非细胞ECM料片的废产物，而且还因为可以确定离散的ECM材料对于每种应用而言在涂层中的最佳量和等同分布，从而避免使用不必要的高浓度的ECM。除了ECM的效果之外，基体材料的多孔结构为系统提供了向内生长的结构。在一个实施方案中，非连续的ECM区域通过添加离散的ECM材料诸如粒子、薄片、纤维或粉末被获得。用于植入的网片被充分地描述并且是本领域技术人员己知的。这些网片典型地是生物相容性的惰性材料。生物相容性是指材料在特定的应用中引起适当的宿主应答的能力，在活组织内不产生有毒的、有害的或免疫学不适当的应答。惰性是指其不被周围的生物流体和酶所降解。在一个方面，生物相容性惰性材料选自PP、PE、由茂金属催化获得的聚合物、硅氧烷、特氟隆(氟烃)和聚氨酯。特别优选的生物相容性的惰性材料是沿用已久被接受用于所述应用的丙烯。惰性材料可进行等离子体处理，以便增加在表面上的粗糙度和/或获得在表面上的官能化，并由此增加细胞和/或生物可降解材料的粘附。典型地，网片是扁平的，为约0.5-1.5毫米厚。根据用途的不同，其可为圆形或细长形的。与形状无关，网片具有两个面。如果网片是细长形的(例如用作悬吊索)，其将具有两个末端和在两个末端之间的中段。形成用于悬吊、疝气或POP修复的结构的生物相容性的惰性材料(经常被称为网片)可以通过多种不同技术被制造。这类结构包括针织织物，机织织物，非织造织物(包括毡合、纺粘、气流+压光)，流延/吹塑薄膜，和注射成型格网。本发明的一个方面涉及在表面上具有ECM粒子的生物相容性的惰性材料。这种材料将引起表面吸引细胞。在ECM粒子周围的腔和在完成ECM粒子后所见的那些腔将用作与惰性材料的锚固点。因此，描述了锚固惰性材料的方法。在一个方面，所述网片具有减弱的细胞向内生长的面和具有增强的细胞向内生长的面。将惰性材料与细胞吸引性材料诸如ECM的组合可实现这一效果。将细胞吸引性ECM与惰性材料的组合可以不同的方法被获得在主要面之一上用包含ECM粒子的生物可降解的合成/天然聚合物涂覆惰性网片诸如聚丙烯网片。在一个面上毡合具有大体上惰性的稳定纤维的主要纤维材料和在另一个面上毡合包含ECM材料的纤维。以夹层结构纺粘第一层和第二层。第一层含有ECM材料和第二层不含ECM材料。分两步进行薄膜流延包含ECM的第一生物可降解层，和惰性材料的第二层。注射成型格网的部分包覆。包含ECM粉末的泡沫与针织网片、非织造织物或薄膜的复合材料。包含ECM粒子的惰性材料在其它或类似惰性聚合物上的共挤出或涂覆形成在表面上具有离散ECM粒子的惰性聚合物的双组分单丝。该单丝可被用于例如机制或针织。该单丝还可被切割成稳定的纤维并用在非织造方法中。在纤维加工期间，ECM粒子还可与惰性的生物相容性聚合物混合，提供离散的粒子分布，然而，这将导致不能被细胞所获得的ECM粒子的浪费，因为只有在表面上的ECM粒子才可接触到细胞。另外，贯穿单丝被分布的ECM粒子引起纤维能力变弱。在本发明的一个方面，惰性材料在一面上用包含ECM的非连续区域的连续材料涂覆。这对于疝气植入而言特别有利。这里，网片将仅附着于腹壁(在网片的一面上)，而不附着于肠。本发明的有关方面涉及包含在一面上用包含ECM的非连续区域的连续材料涂覆的生物相容性的惰性材料的网片用于制造疝气治疗用的医疗器件的应用。本发明的另一个有关方面涉及治疗疝气的方法，包括以下步骤将包含在一面上用包含ECM的非连续区域的连续材料涂覆的生物相容性的惰性材料的网片以被涂覆面朝向腹壁的方式放置在患者体内覆盖疝气部位。在本发明的一个方面中，惰性材料是细长形的并且在两个末端被涂覆。这对于悬吊索而言特别有利。这里，网片将在悬吊索的末端附着于锚固点，但仍允许由膀胱排空引起的尿道重布置。本发明的有关方面涉及包含在两个末端用包含ECM的非连续区域的连续材料涂覆、中央部分未被涂覆的生物相容性的惰性材料的细长形网片用于制造尿失禁治疗用医疗器件的应用。本发明的另一个有关方面涉及治疗尿的失禁方法，包括以下步骤将包含在两个末端用包含ECM的非连续区域的连续材料涂覆、中央部分未被涂覆的生物相容性的惰性材料的细长形网片放置在尿道周围，从而使得所述中央部分包围尿道并且所述末端能够发挥锚固功能。在一面上或对特定部件的部分涂覆可以通过浸涂技术、喷涂技术或刷涂技术获得。在本发明的一个方面，惰性材料被包含ECM的非连续区域的连续材料完全覆盖。这对于其中需要粘附于两个面的植入物特别有利。这尤其可用于治疗骨盆下垂、膀胱壁重构或阴道壁修复的网片。本发明的有关方面涉及包含用包含ECM的非连续区域的连续材料完全涂覆的生物相容性的惰性材料的网片用于制造骨盆下垂治疗用医疗器件的应用。本发明的另一个有关方面涉及治疗骨盆下垂的方法，包括以下步骤将包含用包含ECM的非连续区域的连续材料完全涂覆的生物相容性的惰性材料的网片放置在下垂部位。包含ECM的非连续区域的连续材料优选是生物可降解的。也就是说，该材料消失；被水解掉，被分解掉，被生物降解/可被生物再吸收/可被生物吸收/可被生物侵蚀，被溶解掉或者以其它方式从生物相容性的惰性材料消失。生物可降解区域被重新合成的宿主组织所代替，从而锚固惰性材料。典型地优选该连续材料在1天到IO周内被分解，根据应用的不同而异。包含ECM的非连续区域的连续材料可被理解为是第一材料是连续的。也就是说，其具有连续相。具有非连续区域的连续材料得到复合材料。如同其它复合材料一样，这是由具有显著不同的物理或化学性质的两种以上的构成材料制成并且在最终结构中仍保持分离和不同的工程化材料。ECM材料的非连续相，其是ECM的非连续区域，是指在形式和密度方面与其被嵌入的周围材料是不同的ECM材料。这可以通过实施例5所示的组织学切片或通过实施例6所示的扫描电子显微镜(SEM)被证明。通过附加ECM的非连续区域，可以控制ECM的浓度。ECM材料优选在形成连续材料之前被加入到涂层中(例如冷冻干燥)。用这种方法，ECM材料被均匀分布在涂层中。也就是说，在涂层固化所需的时间内(例如在冷冻期间)，ECM材料的密度在涂层的一端可能比在另一端稍微高一些。然而，在本发明的背景下，均匀分布涵盖了在整个涂层中的这种密度梯度，条件是在涂层中央部分的密度大于0。因此，优选方案涉及其中ECM的非连续区域被均匀分布的涂层。细胞外基质(ECM)是动物或人组织的非细胞部分。因此ECM是包围细胞的复合材料。因此，优选ECM的非连续区域是无细胞区域。无细胞区域通过采用物理、酶和/或化学方法被获得。可以物理方式例如通过破碎组织而除去细胞层。可使用洗涤剂和酶来使组织内的细胞彼此分离。还可使用水或其它低渗溶液，因为低渗透性将引起组织内的细胞破裂，并因此有利于去细胞过程。另一个获得无细胞区域的方法是向涂覆基质中加入ECM粉末(ECM的非连续区域)。无细胞产品使一旦植入就发生的任何免疫排斥的风险最小化，因为细胞组分可引起免疫原性应答。在广义术语下，在ECM中存在三种主要组分纤维性组分(特别是胶原蛋白、弹性蛋白或网硬蛋白)，连接蛋白(例如粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间填充分子(通常是氨基多糖》ECM已知吸引细胞并通过充当生长因素和细胞因子的储库来促进细胞增殖(Hodde，J.P.，Record,R.D.，Liang,H.A.,&Badylak，S.F.2001，"Vascularendothelialgrowthfactorinporcine-derivedextracellularmatrix",Endothelium2001;8.(1):11-24"vol.8,第11-24页；Voytik-Harbin,S.L.，Brightman,A.O.，Kraine，M.R.,Waisner,B.，&Badylak,S.F.1997,"Identificationofextractablegrowthfactorsfromsmallintestinalsubmucosa"，J.CellBiochem.,vol.67,第478-491页)。包含ECM粒子的涂层将被来自周围组织的细胞和来自循环血液的细胞所集落繁殖。当细胞侵入涂层时，形成新的组织。优选的ECM材料包含来自该材料的组织来源的生物活性ECM组分。例如，它们可包含成纤维细胞生长因子-2(碱性FGF)、转化生长因于-(5(TGF-(3)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)。还优选本发明的ECM基体材料包含另外的生物活性组分，包括例如一种或多种胶原蛋白、氨基多糖、糖蛋白和/或蛋白多糖在内。ECM可包括基底膜，其主要由IV胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白多糖组成。本发明的ECM材料优选从被饲养用于肉品生产的动物中收获的组织制备，包括但不限于猪、牛和羊在内。其它的温血脊椎动物也可用作组织来源，但是从用于肉品生产的动物获得这些组织的更大可用性使得这些组织是优选的。经过遗传工程化以不含半乳糖基，a1，3半乳糖(GAL表位)的猪可用作用于生产ECM材料的组织来源。在优选方案中，ECM得自猪来源。ECM材料可得自任何动物。其可得自但不限于肠组织、膀胱、肝、脾、胃、淋巴结或皮肤。特别优选得自人尸体皮肤、猪膀胱粘膜下层(UBS)、猪膀胱基质(UBM)或猪小肠粘膜下层(SIS)的ECM。人组织优选被避免使用，以使疾病的转移最小化。因此，在优选方案中，ECM的非连续区域得自动物组织。由于物种的类似性，优选使用得自温血哺乳动物的ECM。在特别优选的方案中，ECM的非连续区域是UBM(膀胱基质)粒子。UBM材料包括ECM蛋白的独特混合物(cocktail)，其中一些已经过量化TGF-卩293±8pg/g，b國FGF3862±170pg/g和VEGF475±22pg/g(其是pgVEGF/gUBM)。在平均密度为3mg/cm2时，在EMC料片中，TGF-(3的浓度为0,9pg/cm2，b-FGF的浓度为ll,6pg/cm,VEGF的浓度为l,4pg/cm2。ECM的非连续区域的浓度优选高于15M(w/w)，其高于20%(w/w)，诸如高于30%(w/w)。ECM的非连续区域的浓度优选低于95%(w/w)，其低于90Q/q(w/w)，诸如低于80。/。(w/w)或低于70%(w/w)。在本发明的特别优选的方案中，该浓度为20。/。(w/w)到60%(w/w)，诸如20。/。(w/w)到40%(w/w)。在本发明的一个方面，包含ECM的非连续区域的连续材料由包含诸如以下的物质制成玉米蛋白、胶质、胶原蛋白角蛋白、S-磺化角蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白或其它结构蛋白。在本发明的一个方面，包含ECM的非连续区域的连续材料由包含诸如以下的物质的多糖制成藻酸盐、脱乙酰壳多糖/壳多糖、透明质酸、CMC、HEC、HPC或其它官能化纤维素。在本发明的一个方面，包含ECM的非连续区域的连续材料由包含诸如以下的物质的合成聚合物制成a)以下物质的均聚物或共聚物乙交酯，L-丙交酯，DL-丙交酯，内消旋-丙交酯，s-己内酯，1,4-二噁烷-2-酮，-戊内酯，P-丁内酯，，丁内酯，Y-癸内酯，1,4-二氧杂环庚垸-2-酮，1,5，8，12-四氧杂环十四烷陽7,14隱二酮，1，5-二氧杂环庚烷-2-酮，6,6-二甲基-1,4-二隨垸-2-酮，碳酸三亚甲基酯；b)单官能或二官能的聚乙二醇与a的聚合物的嵌段共聚物；c)单官能或二官能的聚垸撑二醇与a的聚合物的嵌段共聚物；d)上述聚合物的共混物；e)上述聚合物和PEG的共混物；或任何上述组合。MPEG-PLGA聚合物可如下合成在氮保护气氛下，将在甲苯中的MPEG、DL-丙交酯、乙交酯和4。/。(w/v)辛酸亚锡加入到在手套箱中的小瓶中。将小瓶密封，加热和振摇，直到内容物澄清和均匀，然后将其置于120-20(TC的烘箱中达1分钟-24小时。该合成还可以在适当溶剂(例如二隨垸)中的溶液形式进行，以便于随后的纯化。然后在氮保护气氛中将MPEG、DL-丙交酯、乙交酯、4%2-乙基己酸亚锡和二噁垸加入到在手套箱中的小瓶中，并如上进行处理。聚合物可以如下进行纯化将聚合物溶于适当的溶剂(例如二嚼烷、四氢呋喃、氯仿、丙酮)中，并在搅拌下在非溶剂(例如水、甲醇、乙醇、l-丙醇或2-丙醇)中在-4(TC到4(TC的温度沉淀。使聚合物沉降，丢弃溶剂，将聚合物在4(TC-12(TC的真空烘箱中干燥过夜。至少部分地覆盖生物相容性的惰性材料的涂层的一个功能是提供促进细胞生长的基质。促进细胞向内生长进入涂层的一个标准是在室温下为固体的涂层。也就是说，该涂层具有被固定的物理结构，双连续结构。采用这种结构，帮助细胞移动经过涂层并形成新组织。促进细胞生长的另一个标准是具有开放的孔或至少具有允许细胞迁移的多孔性的涂层。多孔性被定义为是P=l-p(V/M)，其中P是涂层的多孔性，p是所用聚合物系统的密度，M是所制涂层的重量，和V是所制涂层的体积。本发明的一个实施方案涉及本文所述的至少部分地覆盖生物相容性的惰性材料、包含ECM的非连续区域的涂层。超过50%的多孔性能够发生细胞生长。因此，在优选方案中，所述涂层包括高于50%、诸如高于80%、甚至高于90%的多孔性或在95%的多孔性的涂层。优选多孔涂层具有开放的连通孔。涂层厚度必须使得在提供细胞的足够的向内生长以锚固网片并同时体积不是很大并且不在体内产生障碍物之间达到平衡。因此，涂层厚度优选是0.05-1毫米。在许多的这些应用中，必要条件是本发明的网片经过杀菌处理。本发明的一个实施方案涉及具有包含ECM的非连续区域的涂层的经过杀菌的网片。这典型地被表现为以不透细菌的方式进行包装的包含至少部分地用包含ECM的非连续区域的连续材料覆盖的生物相容性的惰性材料的网片，在该包装上表明该产品经过杀菌处理。如实施例4所述，通过例如辐射进行杀菌保持了ECM的生物效应，根据涂层类型的不同而异。不透细菌的材料是本领域技术人员公知的。实施例材料MPEG-PLGA支架形成试剂的纯化乙酸乙酯在氮气下从氢化钙蒸馏。二嗯垸在氮气下从钠/二苯甲酮蒸馏。甲苯在氮气下从钠/二苯甲酮蒸馏。DL-丙交酯和乙交酯在无水乙酸乙酯中在氮保护气氛中进行重结晶并进行真空干燥。PEG/MPEG被溶于适当的溶齐U(例如氯仿)中，在冷己垸中沉淀，过滤并干燥过夜。2-乙基己酸亚锡经过真空蒸馏并保存在氮气下。2-30的合成在氮保护气氛下将在甲苯中的0.5gMPEG2000、4.15gDL-丙交酯、3.35g乙交酯和4。/。(w/v)辛酸亚锡加入到在手套箱中的小瓶中。将小瓶密封，加热和振摇，直到内容物澄清和均匀，然后将其置于120-20(TC的烘箱中达1分钟到48小时，例如长达6小时。上述合成还可以在适当溶剂(例如二嚼垸)中的溶液形式进行，以促进随后的纯化。然后，在氮保护气氛下将0.5gMPEG2000、4.15gDL-丙交酯、3.35g乙交酯和101nL4。/。(w/v)的辛酸亚锡和8g二卩恶垸加入到在手套箱中的小瓶中，并如上进行处理。聚合物的纯化将聚合物溶于适当的溶剂(例如二嚼烷、四氢呋喃、氯仿、丙酮)中，并在搅拌下在非溶剂(例如水、甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇)中在-4(TC到4(TC的温度沉淀。使聚合物沉降，丢弃溶剂，将聚合物在4(TC-12(TC的真空烘箱中干燥过夜。使用NMR-光谱学和GPC分析聚合物以确认结构、分子量和纯度。实施例l:构建具有被涂覆表面和未被涂覆的表面的网片将25gMPEG-PLGA(如上所述)转移到100ml容量瓶中。将容量瓶的四分之三填充1，4-二嚼烷。将MPEG-PLGA在50。C下溶解过夜。将2.5g的PEG400加入到容量瓶中并将烧瓶填充达到100ml的水平标记。将MPEG-PLGA溶液转移到250ml烧杯中并使用磁性搅拌器将5gUBM粉末(例如ACell)悬浮在该溶液中。将UBM悬浮液轻轻刷涂到约1.5mm厚的用氧等离子体处理的聚丙烯网片的主要表面之一上。将丙烯网片保持在低于l(TC的温度以冷冻MPEG-PLGA溶液并避免对聚丙烯网片的另一面造成滑痕。通过冷冻干燥除去1，4-二嗨烷，留下包含ECM粒子的多孔性MPEG-PLGA涂层。实施例2:构建被完全涂覆的复合材料。将4gMPEG-PLGA(如上所述)转移到100ml容量瓶中，将容量瓶的四分之三填充1，4-二隨垸。将MPEG-PLGA在5(TC溶解过夜。将0.4g的PEG400加入到容量瓶中并将烧瓶填充达到100ml的水平标记。可使用PEG700来代替PEG400。将MPEG-PLGA溶液转移到250ml烧杯中并使用磁性搅拌器将2gUBM粉末(例如ACell)悬浮在该溶液中。将7.5ml的悬浮液倾入到10X10cm的铝模具中，得到高度为0.75mm的悬浮液。将具有1.5mm的近似高度的10X10cm聚丙烯网片放置在模具中。将模具淬火并置于冷冻干燥仪中过夜。实施例3:在有和没有ECM粒子的合成支架中的原代人成纤维细胞的向内生长将由包含40。/。(w/w)的UBM(ACell)粒子(平均直径为约150微米)的生物可降解聚酯制成的支架与不含ECM粒子的支架在细胞形态和3D生长试验中进行比较。将甲氧基-聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(Mn2.000-30.000,LG1:1)溶于1,4-二嗨垸得到1.5%的溶液。对于包含UBM的支架，将0.03gUBM加入到3ml聚合物溶液(40。/。w/w干物质)，高速混合并倾入到3X3cm的模具中。将溶液在-5。C冷冻并在-2(TC冻干5小时，在2(TC保持约60小时。随后将样品放置于干燥器中抽吸(液压泵)5小时。评价了在两个支架的表面上被接种的原代成纤维细胞的生长和形态学试验。从第l、3和7天得到的结果被分成l-5级，l级代表最坏情况，5级代表最好情况。在混有ECM粒子的支架中，细胞的分布和生长在所有天数内被给出5级并且优于对照支架(其在所有天数被给出2^级)。结论粉状ECM基质的生物活性在被并入合成支架中后仍保持活性，当与单独的支架相比时，引起在支架上的显著更好的生长。实施例4:支架中ECM+/-并入的杀菌对原代成纤维细胞的细胞形态和3D生长的影响将甲氧基-聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(Mn2.000-30.000，LG1:1)溶于1,4-二噁烷得到1.5%的溶液。对于包含UBM的样品，将0.045g的未经杀菌的UBM加入到10ml聚合物溶液(23。/。w/w干物质)中，高速混合并倾入到7X7cm模具中。将溶液在-5'C冷冻并在-2(TC冻干5小时和在2(TC保持约18小时。随后将样品置于干燥器中抽吸(液压泵)15小时。使有和没有UBM的样品经历0、1X25kGy和2X25kGy的(3辐射。以同样方式制备另一个样品(0.045g/5ml溶液)，但是使用预先经过杀菌的UBM(2X25kGy的(3辐射并且在制备后不对样品进行杀菌处理。将得自猪皮肤的A型明胶175bloom(Sigma)溶于Milli-Q水和叔丁醇(95:5)中得到1%的溶液。在搅拌下将0.015g的未经杀菌的UBM加入到5ml溶液(23。/。w/w干物质)中并顷入到模具(D:5cm)中。将含溶液的模具置于+5X:下持续2小时，然后在-2(TC冷冻并在-20'C冻干5小时和在20'C保持20小时。随后将样品在12(TC的真空烘箱中交联15小时。使有和没有UBM的样品经历0禾B1X25kGy禾Q2X25kGy的(3辐射。以同样方式制备了不含UBM的另一个样品。在制备后使样品经历0、1X25kGy禾卩2X25kGy的杀菌处理。将得自猪皮肤的A型明胶175bloom(Sigma)溶于Milli-Q水和叔丁醇(95:5)中得到1%的溶液。在搅拌下将0.015g的预先经过杀菌的UBM(1X25kGy)加入到5ml溶液(23。/。w/w干物质)中并顷入到模具(D二5cm)中。将含溶液的模具置于+5t:下保持1小时，然后在-2(TC冷冻并在-2(TC冻干5小时和在20'C保持50小时。随后将样品在13(TC的真空烘箱中交联15小时。细胞形态和3D生长研究表明，UBM料片的增加的辐射降低了在UBM料片上的细胞的数目，但不影响细胞的形态学。在胶质支架和含30%(w/w)UBM的胶质中，在胶质支架中观察到细胞数降低以及形态学从典型的成纤维细胞向更圆形态的改变效果最大。在被并入胶质支架之前进行UBM粒子的杀菌，比在支架杀菌之前并入UBM粒子，提供了更好的细胞形态和3D生长。在MPEG-PLGA中，增加的辐射由于支架增湿而导致细胞数增加以及成纤维细胞形态学。包含30%(w/w)UBM的MPEG-PLGA的支架的辐射，与其中UBM粒子在被并入支架之前经过辐射的支架相比，引起成纤维细胞的细胞数甚至更高和更具3D形态学。该研究显示了在未经辐射的胶质支架中实现最高的生物活性并且该辐射使活性降低。相比之下，当UBM粒子被并入MPEG-PLGA支架并随后进行杀菌时发现了最高的生物活性。据信辐射降低UBM的生物活性。辐射根据与生物活性有关的材料的不同而异可以消极或积极的方式影响支架材料。有迹象表明支架材料(例如MPEG-PLGA)在杀菌期间具有保护UBM的效果。实施例5:在MPEG-PLGA中的离散的ECM粒子对包含41。/。(w/w)的UBM粒子的MPEG-PLGA支架接种原代成纤维细胞在支架的表面上以2.5Xl(^个细胞/cm2的密度在小体积的生长培养基(在DMEM中的10%的FCS，包含抗生素青霉素、和两性霉素B)中进行。该支架在37t:和5。/。C02中进行培养，然后加入另外的生长培养基。在7天后，将支架置于Lillys定色剂中3天，然后将其包埋在石蜡中，被切割成8|im的切片并用Meyer苏木精侵蚀(HE)进行染色。使用装有EvolutionMP冷却彩色摄影机(MediaCybernetics)的BX-60Olympus显微镜收集数字图象(4倍和20倍放大率)，并使用ImageProPlus5.1软件获得数字图象。在MPEG-PLGA支架中ECM粒子分布的数字图象显示被HE染色并与支架材料相区别的离散的UBM粒子。在支架中生长的成纤维细胞被染成蓝色(图1)。实施例6:通过SEM显示的在MPEG-PLGA中的离散的UBM粒子。如实施例1所述制备支架。SEM照片显示了含UBM粒子的MPEG-PLGA支架(图3)和不含UBM粒子的MPEG-PLGA支架(图2)。照片在250倍放大率下在支架的上表面获得。在Danishtechnologicalinstitute(2005-160)获得SEM照片。实施例7:在包含ECM粒子的支架中的三维内皮生长和分化。将甲氧基-聚乙二醇-聚(丙交酯-乙交酯)(Mn2.000-30.000，LG1:1)溶于1，4-二嗯垸得到1.5%的溶液。对于包含UBM的样品，将0.045g的未经杀菌的UBM加入到10ml聚合物溶液(23y。w/w干物质)中，高速混合并倾入到7X7cm模具中。将溶液在-5'C冷冻并在-2(TC冻干5小时和在2(TC保持约16小时。随后将样品置于干燥器中抽吸(液压泵)15小时。将得自脐带的原代人内皮细胞与原代人皮肤成纤维细胞在MPEG-PLGA支架上和在包含23%(w/w)UBM的支架上共同培养。将构成物浸没在规定的内皮生长培养基中培养6-10天，然后将其悬空并培养另外9天。在最后一天，将培养构成物用4%福尔马林缓冲液固定，二等分并用石蜡包埋。通过CD31/PECAM(血小板内皮细胞粘着分子)的免疫组织化学古德帕斯彻氏染色，在5pm切片上可见内皮细胞。鉴定成纤维细胞，平行切片用与苏木精复染组合的PECAM过氧化物酶染色。因为内皮生长和分化受到成纤维细胞性能的影响时，因此所有的支架材料采用2个不同的成纤维细胞群进行试验，但不引起不同的结果。所有的MPEG-PLGA支架支持成纤维细胞和内皮生长。成纤维细胞被发现贯穿于所有MPEG-PLGA支架的整个体积内。UBM粒子均匀分布并且支架在培养期间完整无损。然而，在MPEG-PLGA支架上培养内皮细胞和成纤维细胞只引起内皮表面生长，即在通过与支架上面的相邻的成纤维细胞产生的基质内进行内皮细胞增殖。加入UBM粒子促进在支架更深层内的成纤维细胞和内皮生长，并且内皮细胞采取毛细管样形态学。内皮细胞沿着UBM粒子的表面被引导，而非移动进入UBM粒子内。因此，本发明人发现在支架中包含UBM粒子导致内皮生长和分化的非常明显的改善。不同的成纤维细胞群不产生不同的结果。MPEG-PLGA支架(图4)和在MPEG-PLGA中含23%(w/w)UBM(图5)显示了在MPEG-PLGA支架的表面内的内皮细胞的生长，其中生长向内达到容纳UBM粒子的深度(内皮被染成红色(以黑色显示)-成纤维细胞不可见)。内皮细胞的毛细管样形态学在容纳23%(w/w)UBM的MPEG-PLGA支架的更深层中被发现(图6)。这些结构在MPEG-PLGA支架中不可见。实施例8:在双组分生物相容性的惰性纤维中的离散的ECM粒子。使用在15(TC-18(TC下操作的Dr.CoIMn挤出机将20gECM配合到得自Noveon的180gTecoflex⑧(EG-80A)中。使用串联造粒机对该配合物进行造粒，提供包含约10。/。的ECM粒子的200克氨基甲酸酯小球。将配合的Tecoflex⑧小球进料到经改进的FET实验室纤维共挤出机中。将0.2mm直径的用氧等离子体处理的PP纤维进料到中心，将经配合的Tecoflex⑧在PP纤维上进行共挤出，得到0.3mm直径的单丝。然后将双组分单丝拉伸，以便降低单丝的最终直径。该双组分单丝包含在Tecoflex⑧表面上可触及的ECM粒子。图1:在MPEG-PLGA支架中ECM粒子的分布的数字图象。图2:MPEG-PLGA支架的SEM照片(放大率250倍)。图3:包括40%的ECM粒子的MPEG-PLGA的SEM照片(放大率250倍)。图4:在MPEG-PLGA支架中的内皮生长的数字图象。图5:在包括23。/。ECM粒子的MPEG-PLGA中的内皮生长的数字图象。图6:在包含23y。ECM粒子的MPEG-PLGA中的内皮生长的数字图象，显示在支架的更深层中毛细管样形态学的放大图。2权利要求1.包含至少部分地被包含ECM的非连续区域的连续材料覆盖的生物相容性的惰性材料的网片。2.权利要求1的网片，其中生物相容性的惰性材料选自PP，PE，通过茂金属催化获得的聚合物，硅氧烷，特氟隆(氟烃)和聚氨酯。3.前述权利要求中任一项的网片，其中生物相容性的惰性材料是聚丙烯。4.前述权利要求中任一项的网片，其中惰性材料在一面上用包含ECM的非连续区域的临时性的连续材料涂覆。5.前述权利要求中任一项的网片，其中惰性材料完全被包含ECM的非连续区域的连续材料覆盖。6.前述权利要求中任一项的网片，其中连续材料是生物可降解的。7.前述权利要求中任一项的网片，其中ECM的非连续区域均匀分布。8.前述权利要求中任一项的网片，其中连续材料具有开放的连通孔。9.前述权利要求中任一项的网片，其中连续材料具有0.05-1毫米的厚度。10.前述权利要求中任一项的网片，其中网片以不透细菌的方式被包装，在包装上具有该产品经过杀菌的标记。11.包含在表面上具有ECM粒子的非连续区域的生物相容性的惰性材料的网片。12.治疗疝气的方法，包括以下步骤将包含在一面上用包含ECM的非连续区域的连续材料涂覆的生物相容性的惰性材料的网片以被涂覆面朝向腹壁的方式放置在患者体内覆盖疝气部位。13.治疗尿失禁的方法，包括以下步骤将包含在两个末端用包含ECM的非连续区域的连续材料涂覆、中央部分未被涂覆的生物相容性的惰性材料的细长形网片放置在尿道周围，从而所述中央部分包围尿道并且所述末端能够进行锚固。14.治疗骨盆下垂的方法，包括以下步骤将包含用包含ECM的非连续区域的连续材料完全涂覆的生物相容性的惰性材料的网片放置在下垂部位。全文摘要本文公开了胞外基质蛋白(ECM)的非连续区域在促进网片中的细胞生长中的应用。当所述支架被施用于惰性材料上面时，促进细胞向内生长并且适当地固定网片的附着。在一个方面，所述网片具有减弱的细胞向内生长的面和具有增强的细胞向内生长的面。将惰性材料与细胞吸引性材料诸如ECM的组合可实现这一效果。这对于疝气植入而言特别有利。这里，网片将仅附着于腹壁(在网片的一面上)，而不附着于肠。在本发明的一个方面中，惰性材料是细长形的并且在两个末端被涂覆。这对于悬吊索而言特别有利。这里，网片将在悬吊索的末端附着于锚固点，当仍允许由膀胱排空引起的尿道重分布。文档编号A61L27/36GK101626791SQ200880007469公开日2010年1月13日申请日期2008年3月7日优先权日2007年3月7日发明者延斯·赫格·特鲁尔森,汉内·埃韦尔兰德,莱内·费尔德斯科夫·尼尔森申请人:科洛普拉斯特公司