专利名称：：哮喘的治疗或预防的制作方法
技术领域：
：本发明涉及施用细菌疫苗以治疗或预防哮喘。
背景技术：
：哮喘是以可逆的气道阻塞为特征的气逸隄性炎症，传统上分类为外源性哞喘(因对吸入的变应原如花粉和屋尘螨的变态反应所致)或内源性哮喘(非由经典的变态反应所引起)，其机制尚未知。后一种形式的哮喘已被称为"特发性"哮喘。在最近报道的基于确诊的哮喘受试者的研究中，基于痰中嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞计数的差异对哮喘进行了分类(Simpson等，2006)。该研究中的受试者基于与健康对照受试者相比较的这些细胞类型的存在而被分成不同的哞喘亚型。鉴定了几种哞喘亚型，包括嗜中性粒细胞性哞喘(>61%嗜中性粒细胞)和嗜酸性粒细胞性哞喘(>1.01%嗜酸性粒细胞)。嗜中性粒细胞性哞喘^占哮喘总数的大约20%。该研究还才艮道了在短期(4周)和长期(平均5.3年)的两次取样间隔过程中，在大多数这些受试者中持久的嗜中性粒细胞增多，尽管在评估前的当月没有受试者^l道气道感染。虽然发现哮喘受试者比健康对照具有更高水平的胞内细菌和巨噬细胞，但是在嗜中性粒细胞性哞喘和其他哞喘群体之间未发现显著差异。实际上，该才艮道指出所见到的细菌水平低于与急性细菌感染相符的细菌水平，该报道的结论是没有细菌感染迹象来解释嗜中性粒细胞性哮喘的炎性过程。不可分型流感嗜血杆菌(Non画typablezVfy"e"z"e，NTHi)是最常见的与慢性支气管炎(CB)相关的致病菌(Sethi，2001)。NTHi可见于健康个体和CB患者的上气道(例如鼻子、中耳、咽喉和窦)(Sethi，2001)，以及呼吸道的若干场所，包括腔，附着于粘膜下层间质组织中的粘膜上皮细胞(MolIer，1998)。有关非阻塞性和阻塞性CB的研究观察到很大比例的患者具有持续存在^NTHi感染(Murphy,2004)。以前已经证明NTHi和金黄色葡萄球菌0S似/7卸/ococc附两者均可以诱导获自CB患者气道的支气管肺泡灌洗液的肥大细胞发生非IgE介导的和增强的IgE介导的组胺释放。在NTHi的情况下，已经报道外毒素可能负责增强IgE介导的组胺释放(Clementsen，19卯)。已经证明由CB患者急性恶化期分离的免疫细胞既能够被患者自身的细菌致敏，又对其具有高反应性(Norn，1994)。若干研究也已经报道了响应真菌(曲霉C4s/7erg,7/附))、病毒(例如呼吸道合胞病毒、副流感病毒[Welliverl982])及细菌(肺炎链球菌(51./me"附卵/^)[Kjaergard，1996;Tee，1982;Pauwels，1980]、金黄色葡萄球菌[Rhode,2004;Tee，l982、铜绿假单胞菌(i^e"do歸fmsfl^Mg《朋5fl)[Shen,1981和肺炎支原体(聊，/肪卿/wewfm/e)[Seggev，1996)的呼吸道感染产生的特异性IgE抗体。也已经在CB患者(Kjaergard,1996;Tee1982)和嚢性纤维化患者(Tee，1982)的血清中鉴定到特异于NTHi的IgE抗体。在对支气管哮喘患者的研究中，于29%中发现NTHi的IgE抗体。NTHi和/或肺炎链球菌的抗体也存在于22%的没有其他IgE介导的超敏反应的患者中。然而，在具有针对吸入剂抗原的明显IgE抗体(表明变应性表型)的患者中发现较高水平的IgE细菌抗体(Pauwels,1980)。虽然已有假说认为细菌感染可能在哞喘的诱发和恶化方面起作用，但哮喘的恶化一直被i人为主要是由病毒感染触发的。实际上，细菌疫苗在孝喘治疗中的临床效果已遭质疑，导致国际组织(WHO)提议细菌疫苗在现代哞喘治疗中没有用处。尽管有大量研究集中于哮喘的治疗性干预和治疗，但该病症在现代西方社会依然是一个主要的、成本高昂的、日益增长的问题。发明概述从广义上讲，本发明源于发明人的如下认识作为不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)的持久定植和/或反复接触的结果，NTHi能够成为严重哮喘的触发因子。具体而言，本发明人已经发现NTHi的IgE抗体是高度重要的哮喘介质(通常在复杂的多因素情形中)。不受理论的限制，本发明人认为下气道中吸入的/定植的NTHi的减少将降低或实质性避免对触发哮喘的机制的活化。通过减少对哮喘的诱导，用本文所述NTHi疫苗治疗也可以减少津喘治疗需求和相关的津喘药物治疗。因此，本发明一方面提供在个体中治疗或预防哮喘的方法，包括向个体施用有效量的NTHi疫苗。该疫苗可以是任何能够诱导抗该细菌的有效免疫应答的NTHi疫苗。典型地，该疫苗是抗NTHi的口服疫苗，更通常地，是口服死NTHi疫苗。本发明另一方面提供用于预防或治疗哮喘的口服疫苗，该疫苗包含至少一种NTHi抗原以及生理可接受的载体。本发明另一方面提供至少一种用于产生抗NTHi免疫应答的抗原于个体中预防或治疗哮喘的用途。该抗原可以是例如选自如下的抗原死的或灭活的NTHi分离林(isolate)、NTHi级分和NTHi的抗原性外膜成分(例如，表面抗原或其片段)。典型地，在如上所述的用于预防或治疗哮喘的疫苗或方法中可以^使用完整的死NTHi。个体可以患有经确诊的哮喘，或可以是被认为有发生哞喘的风险的个体，例如当前或过往的吸烟者，具有复发性气道感染、慢性咳嗽和咳痰(例如在慢性支气管炎的情况下)和/或内源性哮喘的个体。在至少一个实施方案中，个体具有指示暴露于NTHi的一个或多个参数，例如升高的嗜中性粒细胞水平、NTHi在痰或唾液中的存在、和/或特异于NTHi的抗体。本发明的至少一些实施方案可以特别应用于预防或治疗嗜中性粒细胞性译喘。有利地，根据本发明的一个或多个实施方案施用NTHi疫苗可以导致个体中IgE抗体的减少和/或哮喘(例如，内源性或嗜中性粒细胞性哮喘)的症状或严重性的降低。在整个说明书中，措辞"包含"或其变化形式如"包括"或"含有，，应理解为包括所陈述的要素、整体或步骤或者所陈述的要素、整体或步骤组，但不排除任何其它要素、整体或步骤或任何其它要素、整体或步骤组。本说明书中提及的所有出版物在此并入作为参考。本说明书中包括的对文献、文件、材料、装置、产品等的任何讨论，仅仅是出于提供本发明背景的目的。不应视为承认任何或所有这些内容构成现有技术基础的一部分，或是构成于本申请优先权日之前已经存在的本发明所属才支术领域的/>知常识。本发明的特征和优点将由如下对其实施方案的详细描述而变得更加显而易见。附图简述图l显示在安慰剂研究组的漱口液中分离的NTHi平均数；图2显示安慰剂组和用口服灭活NTHi疫苗免疫的治疗组的血清NTHi特异性IgG水平；和图3显示安慰剂组和用口服灭活NTHi疫苗免疫的治疗组的唾液NTHi特异性IgG水平。本发明实施方案的详细描述哮喘在临床上定义为喘息、可逆性气道阻塞和支气管高反应性。哞喘最常见的原因是IgE介导的对吸入变应原的超敏反应，导致津喘被分为"外源性"或"内源性"。然而，患有长期持续哞喘的个体会发生源于肺损伤和相关的复发性气道感染的咳嗽和咳痰。也存在例如，iUL出喘息的长期持续咳嗽和咳痰的支气管炎个体，和患有复ic性哮喘和气道感染的个体。惯常在哮喘研究中，关注于研究离散的群，通常将具有清楚限定的哮喘(如，经典的外源性哮喘)的受试者与其他群(例如患有吸烟相关气道疾病的那些)分开，使得研究在独立于其他哮喘群体的限定哮喘群体上进行。然而，这是一种人为分类，相反，将哮喘视为如线路图l所示的一系列气道疾病更为现实。经典外源性(变应性)哮喘(高痰液嗜酸性粒细胞计数)线路图l:孝喘疾病谱就哞喘的这些不同的临^^现而言，产生了多种不同的观察结果。简而言之，这些可以归结如下针对吸入抗原(如花粉)的IgE抗体的诱导引起经典变应性哮喘，其中变应原特异性IgE与肥大细胞结合，导致所^巴大细胞脱粒和释放介质如组胺，引起过敏症状。受损气道的建群和间歇性病毒感染能够导致嗜中性粒细胞流入支气管(急性支气管炎)(通常伴有喘息——^认为因支气管"炎症"而起)。吸烟导致肺损伤，能够使受试者易受气道感染。然而，许多患有临床诊断的哮喘的哮喘受试者就这些要素而言是"混合型的"，有人提议这种哮喘疾病谱可以通过如下认识来调和不同的致病途径能够引起哮喘且这些途径能够共存。特别是，不受限于理论，本发明人认为在许多没有明显经典变应原超敏反应(例如屋尘、花粉等的IgE抗体测试阴性，和/或个体具有升高的嗜酸性粒细胞计数)的哮喘病中，喘息的主要原因在于IgE抗体介导的对NTHi定植和/或反复接触的反应、以及NTHi诱导和激活嗜中性粒细胞的能力。特别地，NTHi疫苗能够减少小气道的NTHi载量，并为所谓的"内源性哮喘"提供有效治疗。更广义地说，那些呈现一种或多种指示NTHi接触的^lt(例如升高的嗜中性粒细胞水平(有或没有升高的嗜酸性粒细胞水平)、由例如痰或唾液中的NTHi所指示的当前NTHi感染和/或NTHi特异性抗体)的个体，以及那些例如具有由吸烟(慢性阻塞性肺病(COPD))或慢性支气管炎(特别是那些患有喘息的个体)引起的气道受损的个体，可以得到NTHi疫苗的益处。例如，公认气道受损的个体高度易为NTHi及其他细菌病原体感染/定植。虽然气道损伤经典地因吸烟而起，但外源性哮喘也可以损伤气道(因此，随后发作与NTHi感染相关的咳嗽和咳痰)。在具有混合机制的哮喘病个体(例如具有NTHi的IgE抗体的特应性(atopic)受试者)中也可以产生益处，且津喘和哮喘症状的治疗一般而言是降低或避免因接触NTHi而导致的IgE生产诱导的结果。可以使用任何适宜的常规已知试验，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)或其它免疫试验，在血液、血清、血浆、痰或唾液样品中测量抗体水平。特异于NTHi的抗体可以选自IgA、IgM、IgG和IgE及其亚型，例如IgGl和/或IgG3中的一种或多种。通常在痰或唾液样品中测量总IgE和/或NTHi特异性IgE抗体。也可以利用任何适宜的常规已知试验，包括细胞染色后的显孩t镜检评估，在唾液或痰中测量嗜中性粒细胞水平。与此类似，可以采用本领域公知的任何合适的方法来确定NTHi计数/NTHi感染水平。抗体水平、嗜中性粒细胞水平、NTHi计数可以与来自经典外源性哮喘(例如呈现嗜酸性粒细胞增多和/或气道高反应性)或例如非孝喘对照或其它适宜的参照组的相应参照水平进行比较。区分哞喘群体的统计学方法描述在例如Simpson等，2006中。本发明方法中使用的疫苗一般含有完整的死或灭活的(例如减毒的)NTHi分离林(例如福尔马林灭活的)。不过，还可以利用包含或由细胞外膜和/或表面抗原組成的可溶性或颗粒性NTHi抗原，或用其代替完整的灭活生物体。在一个或多个实施方案中，利用所选NTHi分离林的细胞外膜级分或膜蛋白。例如，NTHiOMPP6为高度保守的16kDa脂蛋白(Nelson,1988)，是人杀细菌抗体的靶标，在人体和动物模型中均诱发保护作用。在慢性阻塞性肺病(CPOD)中，已表明OMPP6激起淋巴细胞增殖反应，该反应与防止NTHi感染的相对保护作用相关(Abe，2002)。因此，OMPP6或任何其他合适的外膜NTHi蛋白质/多肽(例如P2、P4和P26)或此类蛋白可溶性和/或颗粒性抗原可以通过破坏灭活的或者活的所选NTHi分离林来制备。然后可以通过离心、过滤和/或本领域公知的其他合适技术来制备用于疫苗的级分。可以采用能够实现所需细胞破坏水平的任何方法，包括超声或利用适当的表面活性剂和搅动来溶解，以及此类技术的组合。当采用超声破碎时，可对分离林进行多个超声步骤，以便获得所需程度的细胞>皮坏或产生特定大小或粒度范围的可溶性和/或颗粒性物质。不可分型流感嗜jfi^f菌分离林HI-164(HunterImmunologyLimited,FrenchsForest,NSW2086，澳大利亚)尤其适宜在本文所述的用于预防或治疗哮喘的疫苗中使用。疫苗典型地包含含量占疫苗组合物大约0.1%至100%w/w的所选细菌分离林(一种或多种)和/或抗原。疫苗的有效剂量将考虑提议的递送模式和疫苗的性质(例如，粉末、液体、气雾剂递送等)。对于完整的灭活疫苗，所施用的细菌分离抹的剂量或者所施用的细菌分离林之每一种的剂量典型地在大约109至大约1012死细菌的范围内，更优选地为大约10"至大约10"个死细菌。疫苗的最佳剂量可以通过如下方式确定向不同的受试哺乳动物组施用不同的剂量，随后用NTHi感染每组的动物，和确定实现满意的该病原体清除所需的剂量水平。疫苗可以根据任何适用于产生抗NTHi感染的有效免疫应答的方案进行施用。例如，可以每年一次在冬季之前施用单剂疫苗。也可以以数周或数月为间隔施用一个或多个"加强"剂量的疫苗。或者，可以历经数周施用数个剂量的疫苗，以产生抗NTHi感染和/或定植的有效免疫应答。疫苗本身可以是冷冻干燥的或冻干的疫苗，利用生理学上可接受的緩冲液或流体进行重构。疫苗也可以含有一种或多种抗结块剂(anti-cakingagent)，防腐剂如石克柳汞或以其他方式适用于推荐的施用方式的防腐剂，稳定剂如氨基酸和糖部分，甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精，表面活性剂，pH緩沖剂和pH调节剂如氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠，可药用载体如生理盐水、溶剂和^t介质及等渗制品。疫苗也可以包含一种或多种佐剂。合适的佐剂包括例如霍乱毒素B亚基和传统公知的明巩佐剂。通常，虽然不是排他性的，疫苗是无佐剂的。此类成分和介质在疫苗中的应用是本领域熟知的。除非在任何传统介质或试剂与NTHi分离林或抗原或者推荐的施用方式不相容的情况下，否则明确涵盖它们在可用于本发明方法中的疫苗中的应用。加强免疫应答的增补活性剂包括例如益生微生物，其级分和生物产品，和适当的细胞因子，也可以纳入到疫苗之中。可用于本发明疫苗组合物的可药用载体和成分组合可例如参见技术人员众所周知的手册和教科书，例如"Remington"TheScienceandPracticeofPharmacy(MackPublishingCo.,1995),其内容在此全文并入作为参考。佐剂的具体实例包括霍乱毒素B亚基和传统公知的明巩佐剂。口服灭活细菌疫苗可以作为干燥的散剂或以液体形式施用。施用可以例如通过注射(例如皮下或静乐>内)、口月良如通过剂量单位形式(例如片剂、胶嚢或定量液体形式)滴注或作为喷雾剂而实现。根据本发明的一个或多个实施方案可以施用的特别合适的NTHi疫苗形式包括肠衣片、胶嚢和糖衣丸。根据本发明接受疫苗施用的个体通常是人类，不过所述疫苗也可以施用^M壬何合适的哺乳动物哞喘模型。下文通过非限制性实施例进一步描述本发明。实施例1患有慢性气道疾病的受试者具有高水平的抗NTHi的IgE抗体进行了研究，其中评估了患有慢性阻塞性肺病(COPD)的受试者和年龄匹配的对照组的唾液、血清和痰中总IgE和NTHi特异性IgE的水平。完成了体检和包括有关性别、年龄、吸烟习惯和呼吸道症状的数据的综合问巻。记录所有受试者的皮质类固醇和抗生素使用情况。通过肺活量测定来评估肺功能。没有一个健康对照为现行吸烟者或具有曾经吸烟的历史。COPD组中除了一个受试者之外都呈现出喘息。喘息定义为任何时候胸腔中的哮鸣音或哨音。在前一个月中所研究的受试者中没有一个具有呼吸道感染。所有患者在临床上稳定。收集唾液和血液样品。1.1方法1.1.1唾液通过温和吸取将所有石蜡刺激的唾液收集在冰冷却的管中，为时10分钟，通过在4。C以20，000xg离心20分钟使之澄清，将清亮的上清液冷冻M在-70'C，直到进行分析。1.1.2血清通过常规的静脉穿刺收集10亳升血液，使之在室温凝块，在4。C以5,000xg离心10分钟，并将血清储存在-70。C,直到进行分析。1.1.3痰溶液(sputurasol.)一般而言，指导受试者在有痰时咳出，并冷藏保持样品。根据Courcol等(1985)所述的标准，通过显微镜检就口咽污染来评估痰样品。由可接受的样品通过在4°C以30,000xg离心60分钟来制备痰溶液，并储存在-70。C，直到进行分析。1.1.4NTHi抗原的制备如Murphy等(1988)所述制备了NTHiOMP的两性洗涤剂(zwmergent)提取物。通过Kyd等(1994)所述的十二烷基琉酸钠(SDS)法，利用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),纯化了NTHi高度保守的16kDa脂蛋白P6。用于纯化P6的制备性SDS-PAGE利用Bio-Rad491Cell(BioRad，Hercules,CA)实施。利用PHASTSystem(PharmaciaPiscataway，NJ)进行SDS-PAGE,以用10-15。/。梯度凝胶分析OMP两性洗涤剂和P6级分。在每块凝胶上跑样低分子量标准(Pharmacia)。凝胶用考马斯亮蓝和硝酸银染色。1.1.5IgE酶联免疫吸附试验(ELISA)浓度为2.0吗/ml的山羊抗人IgE(Tago，Inc.CA)用于样品中总IgE的测量。通过ELISA测量IgE抗体。简言之，在4。C用100|il处于碳酸氢钠緩冲液(pH9.6)中的适当浓度的抗原或单独用碳酸氢钠緩冲液过夜包被平底96孑LELISA板(lmiminoplateI;Polysorp，Nunc,Roskilde，Denmark)。用含0.05%(v/v)Tween20的PBSpH7.2(PBS/Tween)洗涤孔三次，然后添加100W处于PBS/T中的1%(w/v)BSA(放射免疫测定级别；Sigma，StLois，MO)，在37°C留置60分钟。用PBS/T洗涤孔，然后向各孔添加100jnl于1%BSA/PBS/T中稀释的样品。板在37。C另外孵育60分钟，之后洗涤，添加100|J于1%BSA/PBS/T中1:1000稀释的生物素化山羊抗人IgE(Tago，Inc.California,USA)，并在37。C再醉育60分钟。洗涤后，向各孔添加100pl于1%BSA/PBS/T中1:40,000稀释的过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(Tago)，并在37。C孵育45分钟。洗涤后，向各孔添加100nl处于底物緩冲液之中的酶底物3，3，，5，5，-四甲基-联苯胺(Sigma)，并在室温孵育15-30分钟。用100疏酸(l.OM)终止反应，并在ELISA板读数器上读出4卯nm处的吸光值。通过山羊抗人IgE(2.0jug/ml)(BiocIone，Australia)的五个二倍稀释物，生成用于测量样品中的总IgE的标准曲线，通过来自10个慢性支气管炎受试者的汇集血清，生成用于测量样品中的OMPIgE和P6IgE的标准曲线。标准曲线和样品一式两份进行测试。从各抗体包被孔中减去碳酸盐緩冲液孔中的样品吸光值，以给出最终结果。总IgE的灵敏度范围为0.15-2.43ng/ml。进行棋盘滴定以针对蛋白质标准的浓度和样品的稀释来优化所有抗体浓度和有用范围。1.2对照及治疗组的血清和痰IgE水平如实施例1.1.5中所述通过ELISA试验测量了总IgE和NTHiIgE抗体。患者概括示于表la。所获得的数值示于表lb(所示数值表示均值+/-SEM)。表la:受试者概括<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>ND=不可检测EU=ELISA单位1.3IgE水平和变应性气道疾病评价了受试者的IgE水平和变应性呼吸道疾病之间的关系。患者概况示于表2a。简言之，发现患有复发性急性支气管炎伴支气管痉挛的受试者(他们大多吸烟且具有早期慢性气道疾病)不论是否存在变应性疾病，均具有高水平的IgE抗体。总IgE和NTHi特异性IgE水平示于表2b(所示数值表示均值+/-SEM)。表2a:受试者概括<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2b:总IgE和特异于NTHi抗原(OMP&P6)的IgE<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>ND=不可检测EU=ELISA单位1.4讨论实施例1.2和1.3中所示的结果表明对照和COPD組的血清和唾液中的总IgE水平没有显著差异。然而，发现相比对照组，COPD组中IgEOMP抗体显著增加(PO.Ol)，且在痰中既检测到IgEOMP抗体又检测到IgEP6抗体。所述结果表明NTHi特异性IgE抗体在患有慢性气道疾病和哮喘(喘息)的个体的血清和分泌物中普遍存在。发现在积极治疗组中患有轻度到重度COPD且用所述口服疫苗治疗的受试者在支气管扩张药治疗的^f吏用上减少50。/。。而且，在施用三疗程的口服NTHi疫苗治疗之后，发现仅积极治疗组的嗜酸性粒细胞计数显著减少。总之，口服NTHi治疗减少急性事件中支气管扩张药治疗的使用，并且也减少与特异于NTHi的变态反应相关的嗜酸性粒细胞计数。实施例2进行了安慰剂对照的双盲临床研究，其中募集了64个受试者，基准是在过去两年每天曾吸烟至少10支，并分配到双盲研究的口服NTHi治疗组或安慰剂治疗组。受试者随机分配到安慰剂和积极治疗组，并以每隔一个月的方式给予三疗程的研究性药物治疗。每个疗程为每天两个片剂，服用三天。活性片每一个都含有45mg福尔马林杀死的NTHi(相当于每个活性片10"个杀死的细菌)。在7个每两周一次的访问中收集血液、唾液、漱口液、咽喉拭子和鼻拭子(用于微生物学评估)。2.1NTHi的检测和NTHi特异性IgG的测量令人惊讶地，冬季时期在安慰剂治疗组和疫苗治疗组中的测量在两组中均检测到NTHi,表明了与该细菌的随机接触。图l显示了每次访问时安慰剂组漱口液中NTHi的平均水平。通过ELISA试验测量了血清和唾液中的NTHi特异性IgG。简言之，用流感嗜血杆菌164超声抗原制品包被96孔NuncMaxisorp板的孔。在2-8。C过夜孵育之后，洗涤板，并添加多个稀释度的血清或唾液样品。继室温孵育60分钟之后，洗涤板，并添加辣根过氧化物酶缀合的抗人IgG抗体(Chemicon目录号AP112P)。在室温再孵育60分钟之后，洗涤板，添加TMB底物(Biomediq目录号50-76-00)，之后在室温另外孵育10分钟，并通过添加1M磷酸终止反应。在BioRad耀教读数器上以双重波长模式读取吸光值，其中基色滤色器为450nm，标准滤色器为655nm。利用标准曲线确定各样品的ELISA单位。安慰剂组血清和唾液中的NTHi特异性IgG水平比疫苗治疗组中的7jC平更高，且更加多变(参见图2和图3)。本发明人认为这是因为在安慰剂组中NTHi到达下气道，导致系统产生IgG，而在疫苗治疗组中，基本上阻止了NTHi到达下气道。为检验之，对在漱口液中检测到NTHi的访问次数和1-6次访问期间血清IgG的对数变化之间的关系进行了制图。按照是有0-1次访问还是有2-4次访问在漱口液中发现了NTHi，来对安慰剂和积极治疗受试者进行分组。在安慰剂组中，血清IgG的阳性增加与检测到NTHi的次数的增加有关。这在积极治疗组中未发现。安慰剂和积极治疗的IgG变化间的差异具有统计学意义(p-0.0186)，il^明安慰剂组的血清IgG确实是由于NTHi到达下气道而由该细菌引起的。而且，安慰剂洗液中存在的NTHi越多，IgG抗体水平越高。相信这也适用于安慰剂组唾液NTHi特异性IgG的情形。2.2讨论测量了血清IgG抗体作为疫苗功效的标志。发现疫苗治疗组中明显缺乏IgG应答，而安慰剂治疗组的患者表现出血清IgG增加。不受限于理论，本发明人认为在安慰剂组中观察到的IgG增加反映了对到达下气道的感染细菌的免疫反应，在这里抗原提呈细胞摄入细菌、运输到引流淋巴结，诱导了抗菌性IgG应答。相反，疫苗治疗组中缺乏这样的应答表明基本上阻止了(通过疫苗特异性粘膜免疫反应)所述细菌到达下气道。在有0-1次或2-4次访问在上气道检测到NTHi的受试者中比较IgG应答，结果也表明安慰剂组的IgG增加而积极(疫苗)治疗组的IgG不增加。这提示在用NTHi口服疫苗接种后测量血清IgG可以反映对感染的暴露以及通过粘膜免疫防止此暴露的程度。唾液IgG应答反映了在血清中所看到的情况。总的来说，此研究证实在治疗组和安慰剂组受试者的上呼吸道中均检测到NTHi，且用口服灭活NTHi疫苗疗法治疗导致治疗组血清和唾液中NTHi特异性IgG减少，表明所述疫苗成功地限制或防止了NTHi进入下气道(即，更少的变应原引发哮喘)。因而，如由IgG抗体的刺激所反映的那样，仅在安慰剂组中NTHi进入了下气道，而用NTHi疫苗口服"免疫"减少了气道中的NTHi变应原。实施例3对患有轻度、中度或重度气道疾病的受试者口月Mfe用灭活NTHi疫苗减少抗哞喘治疗的使用在双盲安慰剂对照研究中募集了140名患有轻到中度或中到重度气道疾病的人类受试者，以评估口服灭活不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)疫苗对以下方面的影响喘息性可逆气道阻塞的次数和严重性、合用药物的使用、以及气道中NTHi及其他细菌的存在。发现与对照组相比，治疗组中抗哞喘型药物(支气管扩张药，类固醇等)的使用减少，NTHi感染减轻。特别是，实现了具有NTHi的高IgE抗体水平(血清和分泌物)的受试者的气道中NTHi的特异性减少，以及哞喘症状的减轻以及随之对哮喘药物的需求的减少。虽然已参照具体实施例对本发明进行了说明，本领域技术人员将会理解，可以进行众多变更和/或改变而不偏离本发明。因此，本发明的实施方案应从一切角度理解为是举例说明性的而非限制性的。参考文献1.AbeY，MurphyTF，SethiS，FadenHS，DmochowskiJ，Ha醒chiY，ThanavalaYM.针对流感嗜血杆菌P6的淋巴细胞增殖反应与防止慢性阻塞性肺病恶化的相对保护作用相关(LymphocyteproliferativeresponsetoP6of/^"柳0/7///"5/"y/wewzfleisassociatedwithrelativeprotectionfromexacerbationsofchronicobstructivepulmonarydisease).^4附/ies/;,>C>/《Owe3/^2002;165:967-71.2.ClementsenP，MilmanN，KilianM.等.来自流感嗜血杆菌的外毒素增强IgE介导的和非免疫的组胺释放(Endotoxinfrom//"ewo/^//"*,ViyZ"ewzaeenhancesIgE-mediatedandnon-immunologicalhistaminerelease).19卯；45:10-17.3.CourcolRJ，DamienJM,RamonP,CVoisinC,MartinGR.肺泡巨噬细胞的存在可以用作确定痰样本是否适用于细菌培养的标准(Presenceofalveolarmacrophagesasacriterionfordeterminingthesuitabilityofsputumspecimensforbacterialculture)./C7/"M/cro6/o/1985;3:122-25.4.KjaergardLL，LarsenFO，NornS，ClementsenP，StahlSkovP，PerminH.在慢性支气管炎患者的急性恶化期中针对流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的嗜碱性粒细胞结合的IgE和血清IgE(Basophil-boundIgEandserumIgEdirectedagainst/柳0/7/7"51/w/7"e"z恥and5W/tococc附戸ew附ow/aeinpatientswithchronicbronchitisduringacuteexacerbations).爿尸AW51996;104:61-67.5.KydJM，TaylorD，CrippsAW.保存对通过制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离自不可分型流感嗜血杆菌外膜的蛋白质的免疫应答(Conservationofimmuneresponsestoproteinsisolatedbypreparativepolyacrylamidegelelectrophoresisfromtheoutermembraneofnontypable/^附</^//附/"/"e"z"e).T/i/e"/附/Mww1994;62:5652-58.6.MollerLVM，TimensW，vanderBijW等.终末期肺病患者的肺夕卜植体中的流感嗜血杆菌(^ae/m//^7"siVi/wewzaeinlungexplantsofpatientswithend-stagepulmonarydisease).爿附//es/;/rCWYCVweA/ed1998;157:950-56.7.MurphyTF，BartosLC.用不可分型流感嗜血杆菌的主要外膜蛋白P2的单克隆抗体进行纯化和分析(PurificationandanalysiswithmonoclonalantibodiesofP2，themajoroutermembraneproteinofnontypable￡/必附0/;/75iVfyZ"ewzae)./"/e"7i/w1988;56:1084-89.8.MurphyTF，BrauerAL，SchiffmacherAT,SethiS.流感嗜血杆菌在慢性阻塞性肺病中的持久定植(Persistentcolonizationby好《^附0/>/7附inchronicobstructivepulmonarydisease),y4附//esp/rO//Oi"M^/2004;170:266-72.9.Nelson,M.B.，M.A.Apicelli"Murphy,T.F"Vankeulen，H"Spotila，L.D.，Rekosh，D.流感嗜血杆菌外膜蛋白P6的克隆和测序(CloningandsequencingofHaemophilusinfluenzaoutermembraneproteinP6)./"/e"1988;56:128-134.10.NornS,JensenL，KjaergardLL,PerminH，StahlSkovP，EspersenF.细菌诱导的IgE介导的组胺释放:检查处于慢性支气管炎的急性恶化期的患者(Bacteria-inducedIgE画mediatedhistaminerelease:Examinationofpatientswithchronicbronchitis(CB)duringacuteexacerbations).々e"&J"/o"s1仏SpecialConferenceIssue1994:C22-C23.11.PauwelsR，VerschraegenG，VanDerStraitenM.抗细菌IgE抗体与支气管哞喘(IgEantibodiestobacteriawithbronchialasthma),^4//ergy1980;157:665-9.12.RohdeG,GevaertP，HoltappelsG等.在COPD患者中针对金黄色葡萄球菌肠毒素的增加的IgE抗体(IncreasedIgE-antibodiesto)S"鄉/r卢cwc"5"tfwe"5"enterotoxinsinpatientswithCOPD),AM2004;98:858-64.13.SeggevJS，SedmakGV，KurupVP.对急性肺炎支原体感染的同种型特异性抗体应答(Isotype-specificantibodyresponsestoacuteAfj;co//as附fl/meM附卵/fleinfection).j/fe/^A幼附fl/附附w朋/1996;77:67-73.14.SethiS，MurphyTF.2000年慢性阻塞性肺病中的细菌感染现状回顾(Bacterialinfectioninchronicobstructivepulmonarydiseasein2000:astate-of-the-artreview).C/iViM,m)6,W及ev2001;14:336-363.15.ShenJ，B度kettR,FischerT，HolderA，KelloggF，MichaelJGL嚢性纤维化患者血清中特异性假单胞菌免疫球蛋白E抗体(Specific尸s^wfifo附卵"51immunoglobulinEantibodiesinseraofpatientswithcysticfibrosis).维c"画""1981;32:967-68.16.Simpson,J.L"Scott,R"Boyle,M.J"Gibson,P.G哮喘中的炎性亚型4吏用诱导的痰进行的评价和鉴定(Inflammatorysubtypesinasthma:Assessmentandiden朋cationusinginducedsputum).J邵/"。/ogy2006;11，54-61.17.TeeRD，PepysJ.在变应性肺病中针对细菌抗原的特异性IgE血清抗体(SpecificIgEserumantibodiestobacterialantigensinallergiclungdisease),a/w爿/ferg);1982;12:439-50.18.WelliverRC，WongDT,MiddletonEJr，SunM,McCarthyN，OgraPL.副流感病毒特异性IgE在继感染后的哞吼和喘息发病机理中的作用(Roleofparainfluenzavirus-specificIgEinpathogenesisofcroupandwheezingsubsequenttoinfection),J"iW/"加.cy1982;101:889-96,权利要求1.用于在个体中预防或治疗哮喘的方法，包括向个体施用有效量的不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)疫苗。2.根据权利要求l的方法，其中哮喘为内源性哮喘。3.根据权利要求1或2的方法，其中哞喘为嗜中性粒细胞性哞喘。4.根据权利要求2的方法，其中哞喘的特征在于痰或唾液中升高的嗜中性粒细胞7jC平。5.根据权利要求1-4之任一项的方法，其中个体表现出指示暴露于NTHi的一个或多个桐改。6.根据权利要求5的方法，其中个体表现出NTHi特异性抗体。7.根据权利要求6的方法，其中抗体是IgE抗体。8.根据权利要求l-7之任一项的方法，其中疫苗是口服疫苗。9.根据权利要求8的方法，其中疫苗是口服灭活疫苗。10.根据权利要求9的方法，其中疫苗包含一种或多种完整的灭活NTHi分离林。11.用于预防或治疗哞喘的口服疫苗，该疫苗包含至少一种用于产生抗不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)免疫应答的抗原以及生理可接受的载体。12.根据权利要求ll的疫苗，其是口服灭活疫苗。13.根据权利要求ll的疫苗，其中所述至少一种抗原选自死的或灭活的不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)分离林、NTHi级分和抗原性外膜成分。14.根据权利要求12或13的疫苗，其中疫苗包含一种或多种完整的死NTHi分离林。15.至少一种用于产生抗NTHi免疫应答的抗原用于个体中预防或治疗哞喘的用途。16.根据权利要求15的用途，其中所述至少一种抗原选自死的或灭活的不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)分离林、NTHi级分和抗原性外膜成分。17.根据权利要求15的用途，其中疫苗包含一种或多种完整的死NTHi分离抹。全文摘要本发明提供了在个体中治疗或预防哮喘的方法。该方法包括向个体施用有效量的不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)疫苗。一个或多个实施方案尤其适用于预防或治疗内源性哮喘。疫苗典型地是口服完整灭活NTHi疫苗。文档编号A61K39/102GK101657214SQ200880007664公开日2010年2月24日申请日期2008年3月14日优先权日2007年3月15日发明者A·W·西里普斯,D·C·奥茨克,M·邓克利,R·克兰西申请人:亨特免疫有限公司