专利名称：作为治疗剂的色酮的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及色酮和新型色酮组合物的分离和鉴定，其可
有效增强脂肪细胞的脂连蛋白生产，并且调控参与脂肪酸生物合成、脂肪
酸的线粒体P-氧化、类固醇生物合成、糖异生作用、脂肪转运、PPARo/RXRa 肝信号转导和异生素(xenobiotic)代谢的基因。本发明包括用于预防和治疗 胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、血脂异常和高甘 油三酯血症的方法。
背景技术：
肥胖症、糖尿病和代谢综合征已迅速地成为全球性流行病。 根据世界卫生组织(WHO)的公布，在2005年约有4亿成年人肥胖，而预 期到2015年将有7亿以上的成年人肥胖。肥胖症是很多慢性疾病，包括心 血管疾病和糖尿病的主要致病因素。在 Third National Health and Nutrition ExaminationSurvey (1988-1994)中，对由年龄为20岁或以上的8814名男女获得的数据
进行的分析表明未调整的代谢综合征发病率和按年龄调整的代谢综合征发 病率分别为21.8%和23.7%。使用2000年的人口普査数据，约有4700万美 国居民可能患有代谢综合征(Ford等(2002) JAMA 16:359)。在肥胖的儿童 和青少年中，代谢综合征的发病率非常高，其随着肥胖症的严重程度而提 高并且在重度肥胖的年轻人中的比例达到50% (Weiss等(2004) "Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents." N Eng J Med 350:2362-2374)。在这些年轻人中已经出现表明不良心血管事件风险提高 的生物标记。发现代谢综合征及其单个症状不仅存在于肥胖人群中，也存 在于体重正常和略重的个体中。 已有令人信服的证据指出胰岛素抵抗是代谢疾病问题的根源 (Reaven GM.(1998) Diabetes 37:1595-1607)。在根据民族或种族以及肥胖度 进行调整后，代谢综合征的发病率随着胰岛素抵抗的增大而显著提高(按趋 势计，P<0.001)， (Weiss等(2004) "Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents." N Eng J Med 350:2362—2374)。胰岛素抵抗是对正 常循环系统胰岛素浓度的响应下降的状态(Saltiel AR (2000) J Clin. Invest. 106:163-164)，并且是II型糖尿病的主要病因。胰岛素抵抗与肥胖、生活 方式以及遗传因素相关(KadowakiT(2000)JClin. Invest 106:459-465; Stem M (2000) J Clin. Invest. 106:323-327)。动物实验清楚地表明胰岛素受体和胰 岛素信号转导途径的遗传缺陷与n型糖尿病中胰岛素抵抗的发病机理有 关。例如，在胰岛素受体敲除小鼠的肌肉、肝和脂肪组织中有明显的胰岛 素作用缺陷。这些小鼠还显示出高胰岛素血症和严重的糖尿病。PI3激酶 (PI3K，胰岛素信号转导级联中的关键信号转导酶)活性提高的小鼠由于骨 骼肌和脂肪细胞中的葡萄糖转运提高而显示出胰岛素敏感性升高和低血糖 症(KadowakiT (2000) J Clin. Invest. 106:459-465)。类似地，Akt2(PI3K下 游的激酶)缺陷小鼠显示出胰岛素抵抗降低以及肌肉葡萄糖转运提高(Cho 等2001 Science 292:1728)。对于人类，最近的研究集中于胰岛素抵抗和糖尿病的遗传基础和生理学。在PPARy2-特异性B外显子中带有部分"失去功能"的Prol2Ala 突变的对象具有较低BMI、较高胰岛素敏感性和改进的脂谱(lipid profile) 的组合(Deeb等(1998) Nat Genet 20:284-287; Alhuler等(2000) Nat Genet 26:76-80)。 Prol2Ala多态性的生理结果在很大程度上取决于混同的遗传和 环境因素。带有Proll5Gln功能获得性(gain-of-fUnction)突变的对象特别肥 胖并对胰岛素敏感(Ristow等(1998) N Engl J Med 339:953-959)，这与 PPARY在刺激脂肪细胞分化中的作用相符。另一方面，显性负突变例如 Pro495Leu、 Val318Met、 Phe388Leu禾Q Arg425Cys与部分脂肪营养不良、 严重胰岛素抵抗糖尿病以及高血压相关(Savage等(2003) Diabetes 52:910-917; Agawal和Garg (2002) J Clin Endocrinol Metab 87:408-411)。 人类遗传疾病——青少年发病的成年型糖尿病(MODY)的特 征为在25岁前糖尿病的临床发病、常染色体显性模式遗传以及胰腺卩细胞 功能的原发性缺陷。现已鉴定出6个MODY基因MODYl，肝细胞核因 子-4a (HNF-4a); MODY2，葡糖激酶；MODY3， HNF-la; MODY4，胰岛 素促进因子-1 (IPF-1); MODY5， HNF-ip;和MODY6， P-细胞E盒反式激 活因子或NeuroDl(Fajans等(2001) N Engl J Med 345:971) 。 MODY基因 参与胰腺J3-细胞中的异常基因表达和葡萄糖代谢，从而导致(3-细胞功能紊 乱。 II型糖尿病是复杂且异源性的多成因疾病。虽然能够对糖尿 病病理生理学提供一些知识，但MODY的罕见单基因形式并不能捕获人类 糖尿病的病因谱。很多基因组学研究组曾利用人基因组范围扫描以在多个 易感种族中使用遗传性多态性来搜索糖尿病和胰岛素抵抗位点(McIntyre 和Walker (2002) Clin Endocrinol 57:303) 。 15号染色体上的1^蛋白酶-10基 因是对墨西哥-美洲裔种族的252个同胞对(sib-pairs)使用基因组范围扫描 而鉴定出的首个基因，其随后使用对其他种族的研究而得到确认。临床研 究表明钙蛋白酶-10是影响胰岛素对肌肉组织的作用以及胰腺卩细胞分泌胰 岛素的因素之一。对钙蛋白酶-10缺失小鼠的研究表明钙蛋白酶-10在分泌 胰岛素的胰腺P细胞中介导脂肪酸诱导的凋亡(Horikawa等(2000) NatGenet 26:163; Weedon等(2003) Am J Hum Genet 73:1208)。对人类糖尿病 基因的搜索远未结束，在16号染色体上的FTO就是近期的发现。功能未 知的FTO与BMI相关，并在人数总计39,000人的多个糖尿病研究中得到 证实(Kaiser (2007) Science 316:185)。此外，通过对候选基因的相关研究， 还发现KCNJ11 (p细胞ATP-敏感性钾通道的内向整流亚基(inward-rectifier subunit))和HNF-4a基因为NIDDM基因(Taylor (2007) Diabetes 56:2844)。
游离脂肪酸(FFA)或许是胰岛素抵抗的病理生理学中最重要 的因素。耶鲁大学的Shulman研究小组现己在临床研究中使用同位素13C、 "P和^通过非侵入性磁共振波谱追踪肌肉糖原合成、葡萄糖摄取以及葡 萄糖-6-磷酸浓度。在高胰岛素-正常葡萄糖钳夹下的健康人类对象中，使用 脂质输注以维持高血FFA水平，胰岛素抵抗逐步发展，在脂质输注4-6小 时后，受胰岛素剌激的肌肉葡萄糖摄取下降达50%且肌肉糖原合成和葡萄 糖氧化下降达50%，同时胰岛素刺激的IRS-l-相关PI3K活性下降>90% (Roden等(1996) J Clin Invest 97:2859; Dresner等(1999) J Clin Invest 103:253)。 过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR)是核受体超家族的亚类。 PPAR是配体依赖性转录因子，其作为与维甲类X受体的异源二聚体与特 异的DNA响应元件结合。该配体结合导致对染色质凝縮共活化复合物的优 选募集并有利于共抑制复合物的解体(Glass (2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi: 10.1172/JCI129713)。此外，PPAR可通过与其他转录因子 竞争而间接影响基因表达，其通常为负影响(Gervois等(2001). J. Biol. Chem. 276:33471-33477) 。PPAR家族有3个成员PPARa、PPARS(或PPAR|3) 和PPARY。大量实验证据将3个核受体与脂质和糖类代谢的调控及协调相 关连。很好地确立了这3种蛋白与多种疾病(包括糖尿病、肥胖症、血脂异 常和炎症)的关联。这3种PPAR在不同组织中的表达不同(Semple等. (2006)。 PPARa在肝、肾和心脏中的表达最高。PPARy优选在脂肪组织和 巨噬细胞中表达。PPAR5的表达广泛存在，但在脂肪组织、皮肤和脑中的 表达最高。这3种核受体参与多个细胞过程。PPARa或PPAR5的活化导致脂肪酸卩氧化提高。PPARa参与脂蛋白合成和氨基酸分解代谢。PPARy在 脂肪细胞的分化中至关重要。这些蛋白具有不同的生理功能。PPARa协调 组织对禁食的代谢响应，其中PPARy的表达在餐后增加，且其活化导致在 脂肪组织中介导脂肪酸摄取的基因上调。PPARY是协调脂肪细胞分化的关 键转录因子。PPARS的生理功能尚未被彻底了解。然而，最近的证据表明 其可能是肌纤维型的调控因子，而该蛋白的活化导致对肥胖症的抗性以及 改进的代谢谱(Wang等(2004). PloS Biology 2:e294)。 可能有多个途径与胰岛素抵抗相关。脂肪组织中的PPARy活 化上调了参与脂肪酸捕获的基因的转录(Semple等(2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi:10.1172/JCI128003) 。 PPARy活化内皮月旨蛋白月旨肪酶(LPL) 和脂肪酸转运蛋白(FATP和CD36)，其分别促进脂蛋白甘油三酯的水解和 脂肪细胞对FFA的摄取。该过程通过减少循环系统中的脂质并引导脂质进 入对胰岛素敏感的组织(例如肌肉和肝脏)来提高胰岛素敏感性(Semple等 (2006) J. Clin. Invest. 116:556-560 doi:l0,1172/JCI 128003) 。 PPARy现已被充 分表征。PPARY的重要作用通过纯合PPARy缺陷型小鼠的胚胎致死性得到 证明(Tsuchida等(2005) J Pharmacol. Sci. 97:164-170)。在野生型小鼠中， 也可通过高脂肪饮食诱导肥胖症和胰岛素抵抗。然而，高脂肪饮食诱导的 肥胖症或胰岛素抵抗在杂合PPARy缺陷型小鼠中被阻止(Tsuchida等 (2005) J Pharmacol. Sci. 97:164-170)。例如，向杂合PPARy (+/-)小鼠饲喂高 脂肪饮食后，此类小鼠的胰岛素抵抗低于野生型小鼠，且具有较少的脂肪 细胞。此类小鼠还具有较低的脂肪酸水平和提高的血浆瘦蛋白水平(Kubota 等(1999) Mol Cell 4:597-609; Tsuchida等(2005) J Pharmacol. Sci. 97:164-170)。然而，通过使用PPARy激动剂处理小鼠降低了杂合PPAR 缺陷的保护作用。噻唑烷二酮(TZD)类胰岛素敏感化药(Lehmann等 (1995). J. Biol. Chem. 270:12953-12956)反而降低了 PPARy (+/-)小鼠的胰岛 素敏感性。这些结果表明PPARY介导了高脂肪饮食诱导的肥胖症和胰岛素 抵抗，且抑制PPARY可使动物或人对胰岛素抵抗的内源和外源诱因的易感 性减小。另一方面，TZD在饲喂高脂肪饮食的野生型小鼠中对PPARY的超生理活化同样改进了胰岛素敏感性，但同时也诱导了脂肪细胞分化。实验
证据表明PPARy活性的下调和上调均改善了胰岛素敏感性。 PPARa是内源脂肪酸及其衍生物的分子传感器。其在肝脏和 骨骼肌的葡萄糖平衡和脂质代谢中发挥关键作用。已证明PPARa激动剂(例 如纤维酸盐(fibrate))可有效减少脂质(Lefebvre等(2006). J. Clin. Invest. 116:571-580. doi:10.1172/JCI27989)。在啮齿动物中，PPARa激动剂Wyl4643 改善了 KKAy小鼠的胰岛素敏感性并增强了 PPARY激动剂罗格列酮的抗糖 尿病作用(Tsuchida等(2005) Diabetes 54:3358-3370) 。 Wyl4643可预防脂 肪细胞肥大(Tsuchida等(2005) Diabetes. 54:3358-3370)。 最近发现PPAR5作为代谢调节因子存在于多种组织中，包括 脂肪、骨骼肌和心脏(Barish等(2006) J. Clin. Invest. 116:590-597)。其增 强脂肪酸分解和能量的解偶联，从而导致甘油三酯贮存减少以及耐力提高。 在小鼠骨骼肌中靶向表达活化形式的PPARS使其具有肥胖症抗性及改进的 代谢谱(Wang等(2004). PloS Biology 2:1532-1539)。体内PPAR活性的调控对维持正常的胰岛素敏感性从而响应 饮食和其他环境影响至关重要。小鼠遗传研究为理解核受体与环境因素的 复杂相互作用提供了极好的机会。PPAR活性可被不同的调节剂调控。 PPARs与不同的配体相互作用，导致不同靶基因集的活化。结果，由于不 同的亲和力以及调控剂对PPARs的作用而产生了不同的转录活性和药理作 用。PPARs的调节剂可被分成多个组，包括完全激动剂、部分激动剂、拮 抗剂和共激动剂(Knouff和Auwerx (2004) Endocrine Review 25:899-918)。 现已研发出多种PPAR完全激动剂。罗格列酮和吡格列酮是 在临床上用于治疗II型糖尿病的两类TZD(Lehmann等(1995) J Biol. Chem 270:12953-12956)。尽管这些PPARy激动剂减少胰岛素抵抗并降低血 浆葡萄糖水平，但完全激动剂具有严重的副作用，包括由于脂肪量增加而 使体重增加和水肿、体液潴留、血液稀释，并在多达15%的患者中导致心 衰(Mudaliar等(2003). Endocr. Pract. 9:406-416)。 一些TZD还与显著的肝 毒性相关。尽管已积极地追踪到新的分子药物靶，但是用于预防或治疗代谢综合征多个方面的药物疗法在选择和成功率上仍受到限制。 其他胰岛素敏感化途径包括脂肪细胞产生的改变的脂肪因子 谱，包括TNFcu IL-6、 CRP、 PAI-1、血管紧张素原、抵抗素、瘦蛋白和脂 连蛋白(Lau 等 (2004). Am. J. Physiol Heart Cir. Physiol 288:H2031-H2041)。这些脂肪因子对胰岛素抵抗和血管内平衡有重要的作 用。在这些蛋白中，脂连蛋白是来自脂肪细胞的介导胰岛素敏感化激素中 被表征最好的一个。TZD在肥胖小鼠和具有胰岛素抵抗的肥胖人体内刺激 脂连蛋白基因表达并提高循环系统中的脂连蛋白浓度(Maeda等(2001) Diabetes 50:2094-2099)。由于脂连蛋白通过提高胰岛素敏感性而改进葡萄 糖耐受，因此TZD对脂连蛋白分泌的影响可至少部分地解释TZD在患有 II型糖尿病的患者体内的降血糖作用。 还有其他途径参与人体内的胰岛素敏感化。例如，瘦蛋白也 在啮齿动物中显示出改善胰岛素敏感性。在脂肪缺乏性小鼠(lipoatmpic mice)中，施用生理剂量的脂连蛋白和瘦蛋白的组合导致胰岛素敏感性的完 全恢复，但在单独使用脂连蛋白或瘦蛋白处理个体时，仅观察到部分的胰 岛素敏感化(Yamauchi等(2001)。瘦蛋白降低脂肪生成酶的表达并由此活 化肝脏、褐色脂肪组织和骨骼肌中的PPARa途径，从而导致UCP-2以及参 与P-氧化的酶表达增加。在人体中，体重下降并未使胰岛素敏感性改善的 个体中的血浆脂连蛋白浓度发生变化(Abbasi等(2004) Metabolism 53:280-283)。在另一研究中，证明通过运动训练而使胰岛素敏感性改善并 不是人体内脂连蛋白水平变化的结果(Marcell等(2005), Metabolism 54:533-41)。该数据表明存在用于胰岛素敏感化的其他途径，并且有不同的 机制参与了体重降低后以及用TZD化合物治疗后胰岛素敏感性的改善。 色酮是如下通式结构所示的以苯并吡喃-4-酮作为其主要骨架 结构的一类特定的芳香族化合物<formula>formula see original document page 21</formula>Ri\
其中
R卜R2、 R3、 R4、 R5和R6独立地选自由以下组成的组-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羟基垸基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、-OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X_，选自由没食子酸酯、乙 酸酯、肉桂酰基酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯组 成的组的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧 与色酮相连，且其中所述己糖或戊糖选自由戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、 已酮醣及其化学衍生物组成的组；包括二聚体、三聚体及其他聚合的色酮；
其中所述烷基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链， 并在不同的位置具有禾B/或不具有双键和选自由-OH、 =0和-OR组成的组的 取代基团；
X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括但不限于羟基、氯离子、 碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等；和 R为具有1-20个碳原子的烷基基团。
迄今为止，仅有183种由天然源分离的色酮(The Combined Chemical Dictionary, Chapman & Hall/CRC， Version 5:1 June 2001)。 据报道，色酮具有单胺氧化酶抑制活性(Fujimoto等(2002) Chem. Pharm. Bull. 50:330-336)、酪氨酸酶抑制活性(Oiao等(2002) Chem. Pharm. Bull. 50:309-311)、抗血小板作用(Leoncini等(1991) Pharmacol. Res. 23:139-148)、对经口病原的生长抑制活性(Cai (1996) J. Nat. Prod. 59:987-990)、前列腺素H合成酶抑制活性(Jurenka等(1989) Comp. Biochem. 93:253-255)。色酮还具有抗大鼠体内II型胶原诱导的关节炎的治 疗效果(Inaba等(2000) Chem. Pharm. Bull. 48:131-139)以及降血脂活性 (Witiak等(1975) J. Med. Chem. 18:935-942; Tetko等(1995) Bioorg Khim.21:809-815)。已报道色酮能够起选择性ci受体配体的作用(Erickson等 (1992) J. Med. Chem. 35:1526-1535)。基于动物研究，色酮易于被吸收和代 谢(Crew等(1976) Xenobiotica 6:89-100)，并且可通过人肠道细菌切割芦 荟苦素(aloesin)的c-葡糖基键。 芦荟是包含多种生物活性物质的复杂的植物(Dagne等 (2000) Current Org. Chem. 4:1055-1078; Cohen 等 in Wound Healing/Biochemical and Clinical Aspects, 1st ed. WB Saunders, Philadelphia (1992))。已知的芦荟品种超过300种，其中大部分产自非洲。研究发现生 物活性物质位于芦荟叶的隔离部分(位于叶中部的澄清凝胶片(gel fillet)) 中、叶外皮(leafrind)或叶皮层中，以及叶外皮和内部凝胶片之间的维管束 中柱鞘细胞中包含的被称为芦荟胶的黄色流体中(Dagne等(2000) Current Org. Chem. 4:1055-1078)。位于叶中部的澄清凝胶片包含水溶性多糖、有机 酸、氨基酸和无机盐。库拉索芦荟胶(Aloe vera gel)由该戸荟植物的部分产 生。叶外皮或叶皮层以及维管束中柱鞘细胞中包含的黄色流体包含芳香族 化合物，例如蒽醌、色酮、有机酸、酶、维生素、盐和其他多种化合物。 全叶芦荟胶通过研磨整棵芦荟植物产生，其包含所有水溶性组分的内含物， 包括蒽醌、色酮、多糖和其他化合物。由于蒽醌的颜色和光毒性、GI刺激 性、细胞毒性和其他副作用，因此要将全叶芦荟胶进行加工以除去所有的 芳香族组分，包括蒽醌和色酮(International J. Toxicology (2007)， 26 (suppl,2):l-50)。历史上，芦荟产物已在用于治疗烧伤、疼痛和其他创伤的皮 肤敷用物中使用。这些应用已激励人们进行了大量研究以从芦荟植物中鉴 定具有临床活性，特别是抗炎活性的化合物。(参见，例如Grindlay和 Reynolds (1986) J. of Ethnopharmacology 16:117-151; Hart等(1988) J. of Ethnopharmacology23:61-71)。作为这些研究的结果，现已有很多关于具有 不同生物活性的芦荟化合物的报道，包括抗癌活性、抗胃溃疡活性、抗糖 尿病活性、抗酪氨酸酶活性和抗氧化剂活性(International J. Toxicology (2007), 26 (suppl,2):l陽50)。
已报道从各种芦荟品种分离的色酮具有不同的生物活性。据 报道芦荟苦素抑制酪氨酸酶活性(Jones等Journal of Pigment Cell Research, Acceptance, Feb. 10th. 2002)并上调依赖细胞周期调节蛋白E的激酶活性 (Lee等(1997) Biochem.Mol. Biol. Int. 41:285-292)。从巴巴多斯戸荟U/oe 6GA^/ms/s)分离的c-糖基色酮显示出抗炎活性(Hutter等(1996) J. Nat Prod. 59:541-543)，并且基于大鼠脑匀浆模型显示出与a-生育酚相似的抗氧 化剂活性(Lee等Free Radic Biol. Med. 28:261-265)。 巴巴多斯芦荟叶及其苦味成分显示出对正常和阿脲糖尿病小 鼠血糖水平的作用(Ajabnoor (19卯)J. Ethnopharmacol. 28:215-220)，而且多 个芦荟品种的干汁液在临床研究中显示出抗糖尿病活性(Ghannam, (1986) Horm Res. 24:288-294)。芦荟胶或提取物的抗糖尿病作用已经在低剂量链脲 霉素诱导的糖尿病动物模型中得到证实(Beppu (2006) J Ethnopharmacol. 103(3):468謹77; Rajasekaran (2006) Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(3):232陽7)。 此类抗糖尿病作用被报道为通过酚类和其他分子量低于10KDa的化合物保 护胰岛B细胞免于受到链脲霉素诱导的选择性毒性(Rajasekaran (2006) Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(3):232-7)。据报道来自库拉索芦荟胶的其他成分， 例如无机物(Rajasekaran (2005) Biol. Trace Elem. Res. 108(1-3):185-195)和 抗氧化剂(Rajasekaran (2005) Pharmacol. Rep. 57(l):90-96)也与抗糖尿病作 用相关。最近，获自芦荟凝胶的5种植物甾醇被鉴定为抗糖尿病组分 (Tanaka (2006) Biol. Pharm. Bull. 29(7): 1418-1422)。在2007年，对好望角 芦荟U/oe/woc)叶凝胶的化学成分进行了彻底分析，并推测了其潜在的抗 氧化性质以及在缓解症状和/或预防糖尿病中的潜在应用(Loots (2007) J Agric. Food Chem. 55(17):6891-6896)。 美国专利第6,780,440号公开了用于糖尿病和体重控制的包含 芦荟的草药组合物。然而并未鉴定出主要的活性成分及作用机理。在美国 专利第5,88,984号中，要求保护将获自芦荟的复杂糖类作为用于糖尿病治 疗的组合物之一。在美国专利第4，598，069号中，也要求保护将芦荟多糖用于治疗低血糖症。在美国专利第5,627,204号中公开了可以作为醛糖还原酶 抑制剂而用于预防和治疗糖尿病的具有不同取代模式的合成色酮衍生物。 美国专利第6,133,305号要求保护用于治疗蛋白激酶相关疾病(包括糖尿病) 的具有色酮骨架的合成化合物。 Yagi等人公开了从戸荟分离的一类化合物，特别是芦荟苦素 及其衍生物之一——2"-0-阿魏酰戸荟苦素，其是酪氨酸酶的有效抑制剂 (Yagi等(1987) Plant Medica 515-517)。戸荟苦素是C-糖基化的5-甲基色 酮(Holdsworth (1972) Chromones in Aloe Species, Part I-Aloesin PM 19(4):322-325)。在体外，芦荟苦素是酪氨酸酶活性的强抑制剂(Yagi等 (1987) Planta Medica 515-517)。标题为"Aqueous Composition Comprising Active Ingredients for the De-Pigmentation of the Skin "的美国专利第 6,123,959号描述了包含磷脂脂质体和用于黑色素合成的酶的至少一种竞争 性抑制剂以及与用于黑色素合成的酶的至少一种非竞争性抑制剂的组合的 水性组合物。美国专利第6,884,783号公开了 7-羟基色酮(包括芦荟苦素和 aloesinol)作为强效抗氧化剂用于预防和治疗与活性氧类别(ROS)损伤及其 他氧化应激相关的疾病和病症。迄今为止，用于纯化芦荟苦素以及其他色酮的已知方法包括 使用色谱法。(参见，例如Ra廳ld和Beil (1993) J. of Chromatography 639:359-362;Rauwald和Beil (1993) Z. Naturforsch 48c:l-4; Conner等(1990) Phytochemistry 29:941; Holdsworth (1972) Chromones in Aloe Species, Part I画Aloesin PM 19(4):322-325; Mebe (1987) Phytochemistry 26:2646; Haynes 等(1970) J. Chem. Soc. (C) 2581; McCarthy和Haynes (1967) The Distribution of Aloesin in Some South African Aloe Species; Heft 3 342》这些 方法是为化学分析而研发的，并不适合应用于芦荟苦素的制备级生产。在 标题为"Method of Purification of Aloesin "的美国专利第6,451,357号中公 开了使用结晶作用纯化芦荟苦素的方法。
发明内容
本发明描述了来自植物来源的色酮和新型色酮组合物的鉴定 和分离，所述色酮和新型色酮组合物上调脂肪细胞的脂连蛋白生产并使与 葡萄糖和脂肪酸代谢及信号转导相关的上百个基因正常化。色酮组合物可 有效增强脂肪细胞的脂连蛋白生产并调控参与脂肪酸生物合成、脂肪酸的 线粒体p-氧化、类固醇生物合成、糖异生作用、脂肪转运、PPARa/RXRa 肝信号转导和异生素代谢的基因。色酮组合物可被用于提高哺乳动物中的 胰岛素敏感性、改善葡萄糖耐受、降低甘油三酯水平以及平衡葡萄糖水平。 本发明还包括用于预防和治疗多种疾病和病症的方法，所述疾病和病症包 括但不限于胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、血脂 异常和高甘油三酯血症。 本发明包括用于预防和治疗代谢综合征以及由哺乳动物中的 胰岛素抵抗介导的疾病和病症的方法。该方法包括向有此需要的对象给药 有效量的包含一种或多种色酮的药物组合物或营养组合物。色酮或色酮混 合物可分离自单个或多个来源，包括但不限于通过合成获得、天然存在或 其任意组合。 在一个实 施方案中，本发明描述了用于提高脂肪细胞的脂连蛋白生产的方法，其包
括向有此需要的对象给药有效量的色酮或色酮的混合物；其中所述色酮或 色酮的混合物。在另一个实施方案中，本发明描述了用于使高脂肪饮食诱 导的有关脂肪酸生物合成、脂肪酸的线粒体P-氧化、类固醇生物合成、糖
异生作用、脂肪转运、PPARa/RXRa肝信号转导和异生素代谢的基因表达 变化正常化的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的包含色 酮或色酮混合物的组合物。在另一个实施方案中，本发明包括用于预防和 治疗胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、血脂异常和 高甘油三酯血症的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的包 含色酮或色酮混合物的组合物。可按照下文所述使用的色酮包括如以下通式结构所示的化合
25物:<formula>formula see original document page 26</formula>
其中
RM R2、 R3、 R4、 R5和R6独立地选自由以下组成的组-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羟基烷基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、-OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X'，选自包括但不限于没食 子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖 啡酰基酯的组的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、 硫或氧与色酮相连，且其中所述己糖或戊糖选自包括但不限于戊醛糖、甲 基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化学衍生物的组；包括二聚体、三聚体及 其他聚合的色酮；
其中所述垸基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链并 在不同的位置具有和/或不具有双键和选自由-OHrO和-OR组成的组的取 代基团；
X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括但不限于羟基、氯离子、 碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根等；和 R为具有1-20个碳原子的垸基基团和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，色酮为选自具有以下通式结构的化合物 组的苯并吡喃-4-酮(7-羟基色酮)
<formula>formula see original document page 26</formula>
其中R,、 R2和R3的定义如上所述。
在本发明的另一个实施方案中，色酮选自芦荟苦素和/或 aloesinol，其结构如下所示。
戸荟苦素 Aloesinol本发明的色酮可以通过合成方法获得或可以分离自众多的植 物科属，包括但不限于金合欢属C4cac7'a)、水团花属G4&"力、芦荟属(j/oe)、 链格孢属G4/fer"an'a)、崖摩属(Jwoora)、五月茶属04""ofeswfl)、蒿属 (j/"tow'w'a)、岗松属(5aech'a)、决明属(Cosw'a)、书带木属(C/w"a)、蛇床属 (O Wm附)、方龙花属(Co"vo/vw/iw)、 淫羊藿属(￡/ z>wWww)、 鸡头暮属 (￡n'owma)、艾里奥斯特门属(五n'o^ewo")、番樱桃属(EMgew/a)、藤黄属
(G"rc/"/")、金丝桃属CftTj;;^r/CMW)、钟萼草属(丄/"fife"Z)^g/a)、全能花属
(户awcra^wm)、青霉菌属(尸ew/c/〃/wm)、蓼属(户o/ygowwm)、 i^aero;qy/ow、大黄 属(及/^ww)、槐属(5b; /K ra)、冠网蝽属(5^/7/^"/&)、蒲桃属(^^^'MW)、篮 状菌属(ra/aramyce"和Zom^z'a。在优选的实施方案中，植物选自包括但不 限于儿茶(^c"c/" c她c/m)、 金合欢(y4ca"'a 、 木立戸荟(J/oe
ar6omsce—、 巴巴多斯戸荟(J/oe 6ar6acfe腦》、爿/oe cre腦o/ Ma、好望角 戸荟(」/oe/erax)、皂质戶荟(^/oe sapowan'a)、库拉索戸荟G4/oe vera)、中华 戸签(J/oe vera var. c/w'ne"57's)、/wew6/-flwaceww、茵P东嵩(J/^^w/w'a cap/〃an'as)、 岗丰公(5aecA:/a^Mfesce"s)、箭卩十 垂羊藿(_￡尸// ￡(^'1/附sagz'"a w附)、 爪卩圭凤果(Garcz'w/a c w/c&)、 土也耳草(/^;/ eWcwmyapow/cwm)、虎杖(尸o(ygowwm CM^spz,ctowm)、毛苦参(5bp/zora tomewtosa)禾口 iS e/ /zam'他r/zO(iocfe"(ir/的组。在 一个实施方案中，色酮分离自好望角芦荟G4/oe/era;c)、库拉索芦荟G4/oe vera) 或巴巴多斯芦荟C4/oe 6arkKfe"&)的全叶。
色酮可以在植物的各个部位中找到，包括但不限于茎、茎皮、 干、干皮、嫩枝、块茎、根、根皮、幼芽、种子、根茎、花和其它生殖器 官、叶和其它气生部分。 本发明描述了从包含这些化合物的植物中分离和纯化色酮。 本发明的方法包括a)提取包含色酮(特别是选自芦荟苦素或aloesinol的色 酮)的植物的地上生物量(groundbiomass); b)中和并浓縮所述提取物；和c)
使用色谱法纯化所述经中和及浓縮的提取物，所述色谱法包括但不限于聚 酰胺、LH-20、 XAD树脂、CG-161树脂、硅胶或反相色谱。在本发明的一 个实施方案中，使用选自由重结晶、沉淀、溶剂分配和/或色谱分离组成的 组的方法纯化提取物。本发明提供了用于分离和纯化具有期望的生理活性 的色酮的商业可行方法。用于在药物制剂中给药的产物可通过本领域技术人员熟知的 多种方法进行制备。色酮可以以如下形式配制其天然存在形式的草药粉 末；不同浓度的溶剂和/或超临界流体提取物；通过重结晶、柱分离、溶剂 分配、沉淀和其他方式富集和纯化的化合物；通过合成方法制备的纯色酮 和/或包含基本纯的色酮的混合物。本发明人已使用可接受的动物模型证明给药色酮或其混合物 例如芦荟苦素和/或aloesinol或分离自多种植物来源如好望角芦荟叶渗出物 的包含色酮混合物的提取物；以及库拉索芦荟胶或库拉索芦荟全叶胶粉和 提取物可以降低胰岛素抵抗，同时降低胰岛素水平、维持低空腹血糖水平 并显著降低甘油三酯水平，同时不影响食物摄取和体重。分离自含色酮的 植物例如库拉索戸荟和好望角芦荟以及其他植物品种的一种或多种色酮和 /或色酮标准化提取物在改善胰岛素抵抗及降低空腹血糖水平中的新用途 在此前尚未被描述过。所公开的色酮可被用作胰岛素敏感化剂和预防剂以 预防和治疗哺乳动物(包括但不限于人)的代谢紊乱，包括但不限于胰岛素抵 抗、葡萄糖耐受不良、代谢综合征、血脂异常、高甘油三酯血症和高甘油 三酉旨血症。可通过本领域普通技术人员已知的任何方法给药本发明的组
28合物。给药模式包括但不限于经肠(口)给药、胃肠外(静脉内、皮下和肌肉
内)给药和局部给药。本发明的治疗方法包括向有此需要的患者中给药或局 部给药药学上有效量的单独的色酮和/或色酮混合物，其分离自单个来源或
多个来源，包括但不限于通过合成获得、天然存在或其任意组合。单独的
色酮和/或色酮混合物的纯度在0.01%-100%的范围内，这取决于用于获得
该化合物的方法。在口服给药、注射给药、局部给药、气雾剂、栓剂、皮
内给药中色酮组合物的浓度可以为适合的制剂的总重量的0.001重量 %-99.99重量％。可通过选自由口服给药、局部给药、气雾剂、栓剂、皮内 给药、肌内给药和静脉内给药组成的组的任何给药途径使用色酮，其每日 剂量在0.01 mg/kg-500 mg/kg哺乳动物(特别是人)体重的范围。
图1是使用早先公布的方案(图1A)和改进的方案(图1B)时， 吲哚美辛对分泌到培养基中的脂连蛋白水平的作用的示意图。图1A:将 3T3-L1细胞诱导分化7天并用吲哚美辛处理24小时。使用1 pM刚哚美辛 得到的脂连蛋白水平的最大平均提高倍数为1.6倍。图1B:将3T3-L1细胞 诱导分化2天并用吲哚美辛处理2天。使用100 吲哚美辛得到的脂连蛋 白水平的最大平均提高倍数为52倍，而使用10 吲哚美辛得到的最低提 高倍数为7倍。 图2是好望角芦荟植物提取物(P0017-OE)对分泌到分化 3T3-L1细胞培养基中的脂连蛋白水平的作用的示意图。简而言之，诱导 3T3-L1细胞分化，随后使用浓度为0.5、 0.166和0.055 mg/mL的粗有机提 取物P0017-OE处理48小时。将最初的粗提取物先后按1: 3和1: 9进行 稀释，以检测剂量响应。 图3描述了 P0017-OE的HTP-UV谱和馏份组合。将全部96 个馏份组成8个细分馏份。在脂连蛋白试验中，P0017-OE-NP-F3是这8个 细分馏份中活性最高的细分馏分。图4是说明P0017-OE-NP-F3的Cw柱分级的图示。P0017-ACl和P0017-AC2在脂连蛋白试验中显示出活性，并且分别被鉴定为芦荟苦素 禾口 aloesinol。 图5描述了通过与可靠标准物的UV谱解析和HPLC保留时 间进行比较来鉴定芦荟苦素(UP394)。 图6描述了通过与可靠标准物的UV谱解析和HPLC保留时 间进行比较来鉴定aloesinol (UP396)。 图7是UP394(卢荟苦素)和UP396 (aloesinol)对分泌到分化 3T3-L1细胞培养基中脂连蛋白水平的作用的示意图。简而言之，诱导 3T3-L1细胞分化，随后使用浓度为30 pM的UP394(芦荟苦素)和 UP396 (aloesinol)处理48小时。使用脂连蛋白ELISA试剂盒测定培养基中 脂连蛋白的浓度。 图8A是在处理后18天以2 g/kg的剂量在C57BL/6J小鼠上 进行腹膜内葡萄糖耐受试验的结果的示意图。简而言之，在给药葡萄糖前 使动物禁食3小时。在腹膜内使用GW1929 (5 mg/kg) ("、UP394 (100 mg/kg) (▲)、 UP396(100mg/kg)(x)和运载体("处理小鼠。在0、 30、 60、 90和120 分钟时测量血糖水平。向动物提供高脂肪饮食，持续12周。在第8周开始 进行处理。所述数据为平均值士 SD，n- 6。与运载体相比，GW1929和UP396 在60、 90和120分钟时观察到显著的葡萄糖利用，p<0.05(*)。与运载体 相比，GW1929、 UP394和UP396在T0的P值分别为0.00、 0.87禾Q 0.43; 在T30分别为0.07、 0.16禾卩0.23。与运载体相比，UP394在T60的P值为 0.15，在T90为0.10，在T120为0,17。 图8B是在活性处理第24天以0.5单位/kg的剂量在C57BL/6J 小鼠上进行的腹膜内胰岛素耐受试验的结果的示意图。简而言之，在注射 胰岛素前使动物禁食3小时。使用GW1929(—、 UP394(iO、 UP396 (x)和 运载体0)处理小鼠24天。在0、 30、 60、 90和120分钟时测量血糖水平。 向动物提供高脂肪饮食，持续12周。在第8周开始进行处理。所述数据为 平均值士SD， n = 6。与运载体相比，UP394和UP396及GW192在时间点 T30、 T60和T90观察到显著的葡萄糖清除，p<0.05(*)。与运载体相比，GW1929、 UP394和UP396在TO的P值分别为0.00、 0.14和0.67;在T120 分别为0.08、 0.00和0.04。图9是说明使用高脂肪饮食诱导的糖尿病模型时UP394和 UP396对胰岛素水平的作用的示意图。在使用高脂肪饮食诱导代谢疾病8 周后，在腹膜内用GW1929 (5 mg/kg)、UP394 (100 mg/kg)、UP396 (100 mg/kg) 和运载体处理动物2周。通过尾静脉收集血液并离心收集血浆。使用胰岛 素ELISA试剂盒(Ciystal Chem - Chicago, IL)测量血浆胰岛素水平。 图10是用GW1929 (■)、 N931 (A)和运载体(令)处理的雄性 db/db小鼠在IO周内每周的空腹血糖水平示意图。除禁食期外，向动物提 供T2018鼠粮，供其任意取食。在进行测量前使动物禁食过夜。将数值表 示为平均值士SD， n = 8。与运载体相比，GW1929和N-931在第6、 7、 9 和IO周使空腹血糖水平显著下降，P<0.05(*)。 图11A是在处理10周后以3g/kg的剂量在db/db小鼠上进行 口服葡萄糖耐受试验的结果的示意图。在加入葡萄糖负荷前使动物禁食过 夜。使用GW1929 (睡)、N931 (A)和运载体("处理小鼠10周。在0、 30、 60、卯和120分钟时测量血糖水平。除禁食期外，向动物提供T2018鼠粮， 供其任意取食。所述数据为平均值士SD， n = 8。与运载体相比，GW1929 和N-931两者在0和120分钟时都观察到显著的葡萄糖利用，尸< 0.05 (*)。 与运载体相比，GW1929和N931在T30的P值分别为0.15和0.05;在T60 的P值分别为0.33和0.02;在T90的P值分别为0.002和0.083。 图11B是在处理6周后以0.5单位/kg的剂量在db/db小鼠上 进行腹膜内胰岛素耐受试验的结果的示意图。在注射胰岛素前使动物禁食 过夜。使用GW1929 0)、 N931(A)和运载体("处理小鼠10周。在0、 30、 60、 90和120分钟时测量血糖水平。除禁食期外，向动物提供T2018鼠粮， 供其任意取食。所述数据为平均值士SD， n = 8。与运载体相比，GW1929 和N-931两者在0、30和60分钟时都观察到显著的葡萄糖清除，尸〈0.05 (*)。 与运载体相比，GW1929和N931在T90的P值分别为0.00和0.14;在T120 的P值分别为O.OO和0.09。
图12是用GW1929、 N931和运载体处理的雄性db/db小鼠 IO周每周空腹甘油三酯水平的示意图。除禁食期外，向动物提供T2018鼠 粮，供其任意取食。在进行测量前使动物禁食过夜。该数值以运载体的甘 油三酯水平的百分比表示，n = 8。在处理10周后，发现与运载体相比，在 经GW1929和N-931处理的动物中甘油三酯水平显著下降，P<0.05(*)。图13A-13F显示在处理后第3周进行的腹膜内葡萄糖耐受试 验的结果。在试验当天，使动物禁食3小时并接受剂量为2mg/g的腹膜内 葡萄糖给药。在递送葡萄糖后的O(葡萄糖注射前)、30、 60、 90和120分 钟测定血糖水平。从尾静脉取血。该数据为平均值iSD，n:7。 A.运载体 ( )对比400 mg/kg Qmatrix ; B.运载体("对比GW1929 (■); C.运载 体O)对比UP780 (100 mg/kg) (■); D.运载体O)对比UP780 (200 mg/kg) (■); E.运载体O)对比UP780(400mg/kg)—)和F.运载体("对比词喂常规饮食 的动物，户<0.05 (*)。在处理3周时检测UP780的效力。每天口服处理3 周后，在用200 mg/kg UP780和GW1929处理的动物中发现加入腹膜内葡 萄糖负荷后30、 60和90分钟时出现统计学上显著的葡萄糖清除。类似地， 用400 mg/kgUP780处理的动物在30分钟时显示出显著的葡萄糖利用，尸S 0.05 (*)。 图14A-13E显示在处理后第9周进行的腹膜内葡萄糖耐受试 验的结果。在试验当天，使动物禁食3小时并接受剂量为2mg/g的腹膜内 葡萄糖给药。在递送葡萄糖后O(葡萄糖注射前)、30、 60、 90和120分钟 测定血糖水平。从尾静脉取血。该数据为平均值士SD,n-7。 A.运载体( ) 对比GW1929 —); B.运载体("对比Qmatrix (400 mg/kg)(醒);C.运载 体0)对比UP780(100mg/kg)O);D.运载体("对比UP780 (200 mg/kg) (■) 和E.运载体("对比UP780(400mg/kg)(匿)，尸<0,05(*)。每日口服处理 9周后，与运载体对照相比，用400 mg/kg UP780和Qmatrix⑧处理的动物 在经IP葡萄糖给药30、 60、 90和120分钟在葡萄糖利用中显示出统计学 上的显著差别，户S 0.05 (*)。用100 mg/kg UP780处理的动物仅在T30显 示出显著差别。阳性对照GW1929在分析的各个时间点均具有小于0.05的P值。 图15A-15E显示在处理后第3周进行的腹膜内胰岛素耐受试 验的结果。在试验当天，使动物禁食3小时并接受剂量为0.5单位/kg的腹 膜内胰岛素给药。在递送葡萄糖后O(葡萄糖注射前)、30、 60、 90和120 分钟测定血糖水平。从尾静脉取血。该数据为平均值士SD,n-7。 A.运载 体("对比Qmatrix (400 mg/kg) (■); B.运载体("对比UP780 (100 mg/kg) (■); C.运载体0)对比UP780(200mg/kg)O); D.运载体("对比UP780 (400 mg/kg)(麗)和E.运载体("对比GW1929，户< 0.05 (*)。在每日口服 处理10周后的胰岛素耐受试验中验证UP780的胰岛素敏感化作用。对于 用400 mg/kg UP780处理的动物，在所有研究的时间点均观察到统计学上 显著的胰岛素敏感化，尸￡ 0.05 (*)。除胰岛素注射1小时后的GW1929组 之外，其他处理组并未观察到其他的显著差别，尸S0.05。 图16图示说明以200mg/kg的剂量给药UP780的稳定的葡萄 糖降低效果。使用从尾静脉获得的15-20nl血液在基线以及处理后第2、 5 和7周测量空腹血糖水平。使用GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780(100、 200和400mg/kg)和运载体对照处理动物。在处理后2周即发 现空腹血糖水平的统计学上的显著下降，尸<0.05(*)(勺。该数据为平均值士 SD, n = 7。与未处理的运载体相比，用200 mg/kg UP780和GW1929处理 的动物在两周(第5和第7周)中均显示出统计学上显著下降的空腹血糖水 平。用400 mg/kg Qmatrix⑧和UP780处理的小鼠在第5周显示出相似的空 腹血糖下降水平。另一方面，与未处理的运载体相比，在所有的测试周中， 100mg/kgUP780处理组均保持了相对较高的空腹血糖水平，户^0.05 (*)。 图17图示说明在处理后第2、 5和7周测量的空腹血糖水平 与运载体对照相比下降的百分比。使用GW1929(5mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780(100、 200和400 mg/kg)和运载体对照处理动物。在第2周 即可在200 mg/kg UP780处理组发现稳定的低空腹血糖水平。该数据为平 均值土SD,n-7。分别在第2、 5和7周测定用200mg/kgUP780处理的动 物与运载体相比的空腹血糖水平下降百分比，其结果分别为18%、 20%和
3317%。 图18图示说明了 GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100， 200和 400 mg/kg)和运载体对雄性C57BL/6J小鼠空腹甘油三酯水平的作用。在处 理后第2、 5和7周测定运载体对照的空腹甘油三酯的下降百分比。使用 GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780(100、 200和400 mg/kg) 和运载体对照处理动物u在第2周即在200 mg/kg UP780处理组发现稳定 的低空腹甘油三酯水平。该数据为平均值士SD,n-7。在连续7周的每日处 理后，与运载体相比，400 mg/kg Qmatrix , 200、 400和100 mg/kg UP780 及GW1929的空腹甘油三酯水平下降百分比分别为2%、22.1%、22%、21.7% 和22.7%。 图19图示说明了 GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100、 200和 400 mg/kg)和运载体对胆固醇水平的作用。使用从尾静脉获得的15-20 )il 血液在基线以及处理后的第2、 5和7周测量空腹总胆固醇水平。使用 GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780 (100、 200和400 mg/kg) 和运载体对照处理动物。相对于运载体对照，在所有处理组中均未观察到 总胆固醇水平变化。该数据为平均值士SD,n-7。相对于运载体，所有的处 理组均未发现胆固醇水平的显著变化，PS0.05。 图20说明了 GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100、 200和400 mg/kg)和运载体对雄性C57BL/6J小鼠体重的作用。在具有饲料和饮水部分 的鼠笼中圈养3或4只雄性C57BL/6J小鼠。在诱导期和处理周的过程中测 量体重，每周一次。使用GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780 (100、200和400 mg/kg)和运载体对照处理动物。在使用GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100、 200和400 mg/kg)和运载体处理的所有小鼠组之间均未观察到 在统计学上显著的体重增量差异。该数据为平均值士SD,n-7。如图20所 示，在整个研究期内，各处理组(包括运载体和常规鼠粮组)的动物体重均持 续增加。在组I(Qmatrix 400 mg/kg和200 mg/kg UP780)和组H(GW1929、 运载体、100、 400mg/kgUP780)之间观察到的体重增量差异在统计学上并 不显著，尸￡0.05。
图21说明了 GW1929、 Qmatrix 、 UP780 (100， 200和400 mg/kg)和运载体对雄性C57BL/6J小鼠饲料消耗的作用。在具有词料和饮水 部分的鼠笼中圈养3或4只雄性C57BL/6J小鼠。在诱导期和处理周的过程 中测量词料摄入量，每周一次。已显示处理周中的词料消耗数据。使用 GW1929 (5 mg/kg)、 Qmatrix (400 mg/kg)、 UP780 (100、 200和400 mg/kg) 和运载体对照处理动物。各组之间的饲料摄入量在统计学上没有显著差异。 该数据为平均值士SD，n-7。在所有组中均记录了相似的饲料消耗方式，这 与体重数据一致。 图22A和22B描述了测量雄性(图22A)和雌性(图22B)平均 体重的急性毒性研究的结果。对照组和处理组间的体重增加率在整个试验 中保持恒定。使用2 g/kg UP780和运载体对照处理小鼠14天。对UP780 处理动物和运载体对照在尸检当天和基线之间的体重增量差异的统计分析 显示雄性和雌性在体重增量上没有显著差异。类似地，在所比较的各数据 点处UP780处理动物和运载体对照动物中雄性和雌性的平均体重增量均没 有统计学上的显著性。该数据为平均值土SD，n-5。 图23从视觉角度上图示说明LV对比LC基因表达的普遍上 调(图23A)和LUP对比LC基因表达的下调(图23B)。该图由SigmaPlot 软件生成。在标准化微阵列数据上使用ANOVA检测处理组之间基因的差 异表达(LV对比LC和LUP对比LC)。为了进行各比较，从ANOVA模型 和多个比较修正的结果获得显著差异地表达的基因。图中总结了用于通过 Holm的连续Bonferroni校正法进行比较的统计上显著的探针组的数量，LV 对比LC (图23A)和LUP对比LC (图23B)。 图24描述了检测ACC2转录物水平的微阵列分析的QPCR确 认结果。图24A为来自微阵列数据的量化结果。图24B为根据GAPDH表 达水平绘制的作为标准化表达水平的QPCR量化结果。将三份瘦型对照 (lean control)RNA样品混合作为QPCR中的LC将高脂肪饮食(LV)和高脂 肪饮食+ UP780(LUP)处理组的RNA样品单独用于QPCR。在微阵列和 中均使用相同的RNA制备物。由于在微阵列数据分析中各自独立地使用PM+MM和仅PM强度值(参见实施例20)，因此将二者分别绘图以进 行比较，并且在可行时用于动物与动物变种之间的比较。 图25A和25B描述了用于FASN转录物水平的微阵列分析的 QPCR确认结果，其与图24中所述的形式相同。 图26A和26B描述了用于PEPCK1转录物水平的微阵列分析 的QPCR确认结果，其与图24中所述的形式相同。 图27A和27B描述了用于FABP5转录物水平的微阵列分析 的QPCR确认结果，其与图24中所述的形式相同。 图28A和28B描述了用于AMPKa2转录物水平的微阵列分 析的QPCR确认结果，其与图24中所述的形式相同。
具体实施例方式
本发明描述了来自植物来源的色酮和新型色酮组合物的鉴定 和分离，所述色酮和新型色酮组合物上调脂肪细胞的脂连蛋白生产并使与 葡萄糖和脂肪酸代谢及信号转导相关的上百个基因正常化。所述色酮组合 物可有效增强脂肪细胞的脂连蛋白生产，并且调控参与脂肪酸生物合成、 脂肪酸的线粒体(3-氧化、类固醇生物合成、糖异生作用、脂肪运输、 PPARa/RXRa肝信号转导和异生素代谢的基因。可将该色酮组合物用于提 高哺乳动物中的胰岛素敏感性、改善葡萄糖耐受、降低甘油三酯水平以及 平衡葡萄糖水平。本发明还包括用于预防和治疗多种疾病和病症的方法， 所述疾病和病症包括但不限于胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、 代谢综合征、血脂异常和高甘油三酯血症。 本发明还包括包含一种或多种色酮和芦荟胶粉或芦荟全叶胶 粉的混合物的新型组合物。这些新型组合物对于降低葡萄糖水平及增强胰 岛素敏感性特别有效。该组合物通过将芦荟胶粉或芦荟全叶胶粉与一种或 多种色酮的基本纯的混合物混合而制备，其中所述一种或多种色酮的混合 物基本不含蒽醌(通常为戸荟素A和B)。所述"基本纯"是指色酮混合物 的纯度为至少70%，优选至少80%，且最优选90%或以上。所述"基本不
36含蒽醌"是指色酮混合物中的蒽醌总量小于或等于100 ppm，更优选小于 或等于50ppm。可通过用于制备这些组合物的任何已知标准方法制备芦荟 胶粉或全叶胶粉(本文统称为"芦荟胶")。在一个实施方案中，从巴巴多 斯芦荟或库拉索芦荟制备芦荟胶。这些组合物中芦荟胶与总色酮的比例可 以在0.1-99.9%的范围内。在一些实施方案中，所述组合物包含90%-99%(以 重量计)的芦荟胶和1-10%(以重量计)的总色酮。在其他实施方案中，所述 组合物包含95%-99%(以重量计)的芦荟胶和1-5%(以重量计)的总色酮。在 另外的实施方案中，所述组合物包含98%-99%(以重量计)的芦荟胶和 1-2%(以重量计)的总色酮。按照以下的详述分离色酮。在一些实施方案中， 所述一种或多种色酮选自由以下组成的组芦荟苦素、abesinol、芦荟树脂 (aloeresin)A、芦荟树脂C、芦荟树脂D、芦荟树脂E、芦荟树脂F和芦荟 苦素衍生物。本发明的色酮可通过通过化学方法改变天然色酮的结构而半 合成获得，或者可以从小的芳香族起始材料完全合成获得。 本文所用多种术语涉及到本发明的各个方面。为了有助于说 明对本发明组分的描述，提供以下定义。除非另有限定，否则本文所用的所有科技术语均具有本发明 所述技术领域普通技术人员通常所理解的含义。 应注意本文所用术语"一 (个)"("a"或"an")实体是指一个或 多个该实体，例如， 一种色酮是指一种或多种色酮。因此，术语"一(个)"、 "一(个)或多(个)"和"至少一(个)"在本文中可相互置换。"色酮"是如下通式结构所示的以苯并吡喃-4-酮作为其主要 结构骨架的一类特定的天然产物<formula>formula see original document page 37</formula>其中R,、 R2、 R3、 R4、 Rs和R6独立地选自以下组中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、 烷基、烯基、氧代垸基、氧代烯基、羟基烷基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NRsI',选自包括但不限于没食子酸酯、 乙酸酯、肉桂酰基酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯 的组的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧与 色酮相连，且其中所述己糖或戊糖选自包括但不限于戊醛糖、甲基戊酸糖、 己醛醣、已酮醣及其化学衍生物的组；包括二聚体、三聚体及其他聚合的 色酮；
其中所述烷基和减烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和域支链， 并在不同的位置具有和/或不具有双键和选自由-OH、 =0和-OR组成的组的 取代基团；
X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括但不限于羟基、氯离子、 碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根；和
R为具有l-20个碳原子的烷基基团，和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，色酮为选自具有以下通式结构的化合物 的组的苯并吡喃-4-酮(7-羟基色酮)
其中，R^、 R2和R3的定义如上所述。在本发明的另一个实施方案中， 色酮选自芦荟苦素或aloesinol。 本发明的色酮可以通过合成方法获得或可以分离自众多的植 物科属，包括但不限于金合欢属、水团花属、芦荟属、链格孢属、崖摩属、 五月茶属、蒿属、岗松属、决明属、书带木属、蛇床属、旋花属、淫羊藿 属、鸡头薯属、艾里奥斯特门属、番樱桃属、藤黄属、金丝桃属、钟萼草 属、全能花属、青霉菌属、蓼属、Ptoera;^/o"、大黄属、槐属、冠网蝽属、蒲桃属、篮状菌属和ZomWfl。在优选的实施方案中，植物选自包括但不限 于儿茶、金合欢、木立芦荟、巴巴多斯芦荟、」/oe crew朋p/w7"、好望角芦 荼、阜质卢荼、库拉索戸荼、中华戸荼、^w"cfesma mem6na"accMm、茵P东 蒿、岗松、箭叶淫羊藿、爪哇凤果、地耳草、虎杖、毛苦参和^ep/zam'to A^fo&W^7'的组。在一个实施方案中，色酮分离自好望角芦荟、库拉索芦 荟或巴巴多斯芦荟的全叶。 色酮可以在植物的各个部位中找到，包括但不限于茎、茎皮、 干、干皮、嫩枝、块茎、根、根皮、幼芽、种子、根茎、花和其它生殖器 官、叶和其它气生部分。术语"芦荟"是指百合科植物的南非植物的属，其中库拉索 戸荟C4/oe vera) /巴巴多斯声荟U/oe to6acfem7's)(注意爿/oe Z)arZjafifm^是 ^fee vera种的拉丁名)或好望角芦荟是其种名。卢荟色酮主要存在于多种不 同芦荟种的叶外皮中。术语"芦荟提取物"被定义为多种芦荟植物全叶的干燥汁液。 本发明实施例中使用的"芦荟提取物"包括但不限于新鲜和浓缩的戸荟胶、 全叶胶、叶渗出物和提取物，其通过多种芦荟全叶的"全叶加工"而制备。 在一个实施例中，将来自巴巴多斯芦荟植物的全叶研磨、过滤、用纤维素 酶(任选)和活性炭处理并冻干。在使用前，用色谱溶剂复溶冻干粉末。在 另一个实施例中，将来自好望角芦荟叶的渗出物悬浮在水中，随后在使用 前与适合的色谱溶剂相接触。 本文所用"治疗"包括治疗和/或预防。在使用时，治疗是指 人以及其他哺乳动物。"药学上或治疗上有效的剂量或量"是指足以诱导所需生物 学结果的剂量水平。其结果可以为迹象、症状或病因的缓解，或生物系统 的任何其他所需变化。准确剂量将随多种因素而改变，包括但不限于对象 的年龄和大小、所患疾病和接受的治疗。"主体"或"患者"或"对象"是期望治疗的活体哺乳动物、 人或动物。"主体"或"患者"或"对象"通常是指将按照本发明的方法接受治疗的受者。应注意本文所述的发明可用于兽医以及人类应用，且术语 "主体"不应以受限的方式进行解释。在兽医应用的情况下，可考虑动物 的体重而按下述方式确定剂量范围。 本文所用的"药学上可接受的载体"是指不影响活性成分的 生物活性的效力，并且对被给药该载体的主体没有毒性的任何载体。"药学 上可接受的载体"的实例包括但不限于任何标准药物载体，例如盐水溶液 (即林格氏溶液)、缓冲盐水溶液、水、右旋糖溶液、血清白蛋白和用于压 片和胶囊化制剂的其他赋形剂和防腐剂。注意本申请中提供了多个引用引文。各引文均通过引用以其 全文具体地并入本文中。 本发明包括用于预防和治疗哺乳动物中的代谢综合征和由胰 岛素抵抗介导的疾病和病症的方法。该方法包括向有此需要的对象给药有 效量的包含一种或多种色酮的药物或营养组合物。可从单个或多个来源分 离色酮或色酮混合物，包括但不限于通过合成获得、天然存在或其任意组合。本发明的一个实施方案描述了用于提高脂肪细胞的脂连蛋白 生产的方法，其包括向有此需要的对象给药有效量的色酮或色酮混合物； 其中所述色酮或色酮混合物。在另一个实施方案中，本发明描述了用于使 高脂肪饮食诱导的有关脂肪酸生物合成、脂肪酸的线粒体|3-氧化、类固醇 生物合成、糖异生作用、脂肪转运、PPARa/RXRa肝信号转导和异生素代 谢的基因表达变化正常化的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有 效量的包含色酮或色酮混合物的组合物。本发明的另一个实施方案包括用 于预防和治疗胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、血 脂异常和高甘油三酯血症的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有 效量的包含色酮或色酮混合物的组合物。 可按照下文使用的色酮包括以下通式结构所示的化合物
40其中
R,、 R2、 R3、 R4、 Rs和R6独立地选自以下组中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、 烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羟基垸基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X'，选自包括但不限于没食子酸酯、 乙酸酯、肉桂酰基酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯 的组的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧与 色酮相连，且其中所述己糖或戊糖选自包括但不限于戊醛糖、甲基戊醛糖、 己醛醣、已酮醣及其化学衍生物的组；包括二聚体、三聚体及其他聚合的 色酮；
其中所述烷基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链并 在不同的位置具有和/或不具有双键和选自由-OH、 =0和-OR组成的组的取 代基团；
X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括但不限于羟基、氯离子、 碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根；和
R为具有1-20个碳原子的烷基基团，和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，色酮为选自具有以下通式结构的一组化 合物的苯并吡喃-4-酮(7-羟基色酮)
其中，R,、 R2和R3的定义如上所述。在本发明的另一个实施方案中， 色酮选自具有如下所示结构的芦荟苦素和/或aloesinol。
41戸荟苦素 Aloesinol 本发明的色酮可以通过合成方法获得或可以分离自众多的植 物科属，包括但不限于金合欢属、水团花属、芦荟属、链格孢属Ute/77^Z'a)、 崖摩属、五月茶属、蒿属、岗松属、决明属、书带木属、蛇床属、旋花属、 淫羊藿属、鸡头薯属、艾里奥斯特门属、番樱桃属、藤黄属、金丝桃属、 钟萼草属、全能花属、青霉菌属、蓼属、/^wo";/o"、大黄属、槐属、冠 网蝽属、蒲桃属、篮状菌属和Zo加n'"。在优选的实施方案中，植物选自包 括但不限于儿茶、金合欢、木立声荟、巴巴多斯戸荟、X/oe cwm"o; /zz7a、 好望角声荟、阜质戸荟、库拉索戶荟、中华声荟、爿""Gfeswa wem6ra"aceww、 茵陈蒿、岗松、箭叶淫羊藿、爪哇凤果、地耳草、虎杖、毛苦参和Ste; /zam'fe ;^^fo^w^7'的组。在一个实施方案中，色酮分离自好望角芦荟、库拉索芦 荟或巴巴多斯芦荟的全叶。 色酮可以在植物的各个部位中找到，包括但不限于茎、茎皮、 干、干皮、嫩枝、块茎、根、根皮、幼芽、种子、根茎、花和其它生殖器 官、叶和其它气生部分。 本发明的色酮化合物和组合物以及其生化和生物活性是通过 对下述2059种植物提取物的随机筛选而鉴定的。基于植物提取物或化合物 增强所培养脂肪细胞的脂连蛋白生产的能力来设计初步筛选。脂肪细胞从 小鼠纤维原细胞(3T3 Ll)分化而来。人们认为测量脂肪细胞培养基中的关 键脂肪因子(adipokin)标记蛋白——脂连蛋白的水平能够鉴定出可充当 PPAR泛调控剂(pan regulator)的天然存在的化合物，或调节葡萄糖和脂肪 酸的其他关键代谢途径以用于预防和治疗代谢疾病，包括但不限于哺乳动物(特别是人)的胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、 血脂异常和高甘油三酯血症。 为了创建植物提取物文库，将干燥的植物材料研磨成细粉并 按照实施例1的描述使用ASE 300自动提取器用甲醇二氯甲烷(l: l)进 行提取。通过旋转蒸发和真空离心干燥提取物。将各植物提取物(约75 mg) 溶解于1.5ml DMSO (1.5 ml)从而制备浓度为50mg/ml的溶液。 已发现3T3-L1细胞响应PPARy活化剂产生脂连蛋白并将其 分泌到培养基中。然而，在文献中响应PPARy活化剂治疗仅使脂连蛋白分 泌提高2倍。在重复此试验时，在所公开的试验条件下使用浓度为0.1-300 ^M吲哚美辛所达到最好的试验信号背景比为1.6。如实施例2和3所示， 通过改变诱导和培养条件使信噪比得到了极大的改进。将3T3-L1细胞诱导 分化2天，随后用吲哚美辛处理2天。使用100pM吲哚美辛，脂连蛋白的 最大平均提高倍数为52倍(图1B)。使用该试验系统筛选2059种有机提取 物。 初次筛选使用与参考化合物10 nM n引哚美辛的脂连蛋白诱导 效果等价的截止阈值获得了 139种阳性物。根据随后验证试验和二次筛选 的结果，来自好望角戸荟叶渗出物的一个活性提取物(记为P0017)显示出对 培养基中脂连蛋白水平的稳定上调(图2)。 随后，对该活性植物提取物(P0017-OE)进行以活性为导向的 HTP分级和化合物纯化。如实施例5所示，使用正向快速柱对P0017的有 机提取物进行分级。将具有相似UV吸收和保留时间的馏份组合成细分馏 份，并在低真空下干燥并离心，将其命名为P0017-OE-HTPFl-8(图3)。使 用DMSO溶解各细分馏份(50 !ig^l)并将其部分(2 pl)用于脂连蛋白分析。 在生物分析中，在8个细分馏份中P0017-OE-HTPF3显示出最高的活性。 实施例7和图4中说明了活性馏分和化合物的重复的大规模提取以及分离。 具有生物活性的馏分被鉴定为P0017-AC1和P0017-AC2。 使用LC-MS/PDA进行活性细分馏分的去冗余(de-replication) 。 经鉴定，独特的化合物峰与最强的脂连蛋白增强活性相对应。如实施例8所述，P0017-OE-HTPF3和P0017AC1/2中活性最高的化合物 aloesinol (mv^396)和芦荟苦素(m^394)被分别鉴定为编号为UP394(芦荟 苦素，图5)和UP396(aloesino1，图6)的色酮类化合物。特别地，芦荟苦素 和aloesinol被分离并鉴定为增强脂肪细胞的脂连蛋白分泌的活性色酮化合 物。按照实施例10的描述试验纯化的UP394和UP396，并且如图7所示， 这两种色酮化合物在体外分析中均具有增强脂肪细胞的脂连蛋白生产的活 性。 实施例9描述了通过制备性柱色谱分离和重结晶从粗芦荟渗 出物中纯化色酮，从而除去蒽醌污染物(特别是芦荟素A和B)的方法。蒽 醌的缺点在于其导致显著的不良副反应例如引起腹泻和遗传毒性，因此防 碍了直接使用粗色酮提取物。按照本方法纯化分离的色酮的纯度高达70重 量％,优选80重量％，且最优选90重量％或以上，且通过HPLC定量分析， 其"基本不含蒽醌"。所述的基本不含蒽醌，是指纯化组合物中的蒽醌总 量小于100 ppm，优选小于50 ppm(芦荟素A和B)。在好望角芦荟的粗渗 出物中，芦荟苦素(UP394)的量为约25重量Q/。，而蒽醌的量为约22。/。(Zahn, (2007) Phytochem. Anal. H0):: 1002-1024)。因此，好望角卢荟是用于分离色 酮组合物的优秀且优选的植物来源。如实施例9所述，分离自好望角戸荟 叶渗出物的经分离和纯化的戸荟苦素(UP39)(Lot弁A-2705和Lot#I1506AW) 的纯度分别为93%和100.6°/。，且总蒽醌小于50 ppm。如实施例11和18 所述，使用不含蒽醌(总蒽醌<50 ppm)的芦荟苦素(UP394)生产富含色酮的组 合物N931和UP780。然而，据报道在其他芦荟品种如巴巴多斯芦荟(其为戸荟胶的 优选来源)中，色酮的量要少得多(0.32mg/g; 0.032%，总色酮为0.10%)， 而蒽醌(芦荟素A和B)的量几乎高四倍(1.14 mg/g或0.114%) (Park (1998) Phytochem. Anal. 2:186-191)。此外，色酮仅贮存在芦荟植物叶的外皮或外 层中。在获得芦荟胶产物的标准方法中，通常从芦荟植物如库拉索芦荟/巴 巴多斯芦荟除去芦荟叶的外皮，并仅过滤并浓縮澄清的凝胶。即便是在戸 荟全叶胶粉的生产中(其中将芦荟植物的全叶粉碎且收集凝胶并过滤)，使用活性炭的脱色加工和其他加工步骤也会除去几乎所有的色酮以及蒽醌。
因此，通过HPLC验证，在标准芦荟胶产物中没有发现显著量的色酮或蒽 醌(Dell'Agli (2007) J. Agric. Food Che. 55(9):3363-3367: Zonta (7卯" /owma/ o/C7zro附fltograp/;y ^ 718(1): 99-106)。本发明人设想在标准植物提取物中富集色酮可使组合物在增
强胰岛素敏感性、改善葡萄糖耐受和降低甘油三酯水平方面具有改善的且 更持久的活性。为了试验上述假设，如实施例ll所示，通过将分离自好望
角芦荟叶渗出物的色酮芦荟苦素(UP394)与由库拉索芦荟制备的全叶胶粉 组合，从而生产出独特的色酮组合物。来自这两种芦荟的标准色酮组合物 包含小于1.4%的色酮——即芦荟苦素(UP394)，且未受蒽醌污染(芦荟素A 禾口B〈50ppm)。按照标题为"Method of Purification of Aloesin"的美国专利 第6,451,357号的描述，通过制备性色谱柱，其后通过重结晶进一步纯化， 从而从好望角芦荟叶渗出物提取分离出芦荟苦素(UP394)，该文献通过引用 全文并入本文。将此独特的标准色酮组合物编号为N931，并在不同的胰岛 素抵抗模型db/db小鼠模型中试验其对血糖水平、胰岛素抵抗和脂肪代谢 的作用。由于据报道脂连蛋白可改善胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗被认 为是代谢综合征的根本原因，因此设想通过色酮UP394和UP396降低胰岛 素抵抗应该导致多种代谢疾病的改善。如实施例12所示，为了验证这一理 论，通过连续8周向C57BL/6J小鼠饲喂高脂肪饮食，在其中诱导胰岛素敏 感性受损、葡萄糖耐受和代谢疾病(Surwit等(1988) Diabetes 22:1163-1167; Laakso等(2004). Diabetes Care互:2253-2259; Kahn等(2004) Diabetes 11:3274-3285; Scheurink等(1998) European J Endo. 139:461-467)。随后， 使用色酮UP394、 UP396和参考化合物GW1929(N-(2-苯甲酰基苯 基)-0-[2-(甲基-2-吡啶基氨基)乙基]-L-酪氨酸)处理(注射或口月艮)小鼠4周。使用以下两个实验证明本文公开的色酮对高脂肪饮食小鼠中 胰岛素抵抗的治疗作用葡萄糖耐受试验(实施例13)和胰岛素耐受试验(实 施例14)。在使用本文公开的色酮芦荟苦素(UP394)和aloesinol(UP396)处
45理的第18天进行腹膜内葡萄糖耐受试验。在给药葡萄糖(2 g/kg)前使动物 禁食3小时。在给药葡萄糖后的0、 30、 60、 90和120分钟测量血糖水平。 如实施例13和图8A所示，与运载体处理的动物相比，用UP396处理的动 物显示出对自循环系统中的葡萄糖清除的显著改善。与运载体处理的动物 相比，UP394处理的动物显示出明显的改善趋势(图8A)。如实施例14所示，在处理第24天进行腹膜内胰岛素耐受试 验。在胰岛素注射前使动物禁食3小时。在给药胰岛素(0.5单位/kg)后的0、 30、 60、 90和120分钟测量血糖水平。如图8B和实施例14所示，与运载 体处理的动物相比，在用UP394和UP396两者处理的动物中观察到显著的 葡萄糖清除，p〈0.05(图8B)。通过该化合物降低所处理动物血浆胰岛素水平的能力进一步 证明了所公开色酮的胰岛素敏感化活性。使用ELISA试剂盒测定小鼠中的 血浆胰岛素水平(图9)。参照化合物GW1929(选择性PPARy激动剂)如期 地使胰岛素水平显著下降。与此类似，相对于运载体处理的小鼠，UP394 和UP396也使胰岛素水平显著下降(图9)，说明本发明公开的色酮化合物 提高了高脂肪饮食诱导的代谢疾病小鼠的胰岛素敏感性。自发糖尿病突变(丄^/"纯系小鼠在大约3-4周龄时明显变肥 胖。血浆胰岛素在10-14天时开始升高，而血糖在4-8周开始升高。纯合突 变小鼠多食、多饮且多尿。该疾病的病因明显受遗传背景影响。在db/db 小鼠中观察到多种特征，包括血糖不受限制地升高、胰岛中产生胰岛素的卩-细胞的严重损耗，及在10月龄死亡。如实施例15所示，用GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和运载体处理(注射或口服)雄性必/必小鼠(每组 8只)IO周，并且每周测量小鼠的空腹葡萄糖水平。结果，N931对于降低 ^v^6小鼠的血糖水平非常有效。如图10所示，在10周的处理期内，运载 体处理小鼠的葡萄糖水平随时间而增加。参考化合物GW1929能够如期地 将葡萄糖保持在基线水平。与GW1929相似，N931从处理第5周开始使葡 萄糖水平充分降低。与运载体处理组相比，在第6、 7、 9和10周时N931 处理组的空腹血糖水平显著下降，P<0.05。处理10周后，用N931处理的动物的葡萄糖水平为用运载体处理的动物的54%。如实施例16所述，N931对胰岛素抵抗的作用在口服葡萄糖 耐受试验中得到证实。用GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和运载体处 理必/必小鼠(每组8只)10周。在加入葡萄糖负荷前使动物禁食过夜。在 给药葡萄糖后的O、 30、 60、 90和120分钟测量血糖水平。与运载体组相 比，用GW1929或N-931处理的组在0和120分钟时观察到自循环系统中 的显著的葡萄糖清除，户<0.05(图IIA)。该结果证明N931具有提高葡萄 糖耐受的能力，由此改善了"6A^小鼠的胰岛素敏感性。在腹膜内胰岛素耐受试验中进一步证明了 N931对胰岛素抵 抗的作用。用GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和运载体处理必/必小 鼠(每组8只)6周。在注射胰岛素后的O、 30、 60、 90和120分钟测量血糖 水平。同样，在用GW1929和N931处理的小鼠中胰岛素敏感性的改善十 分明显。与运载体相比，GW1929和N931两者在O、 30和60分钟时均观 察到显著的葡萄糖清除，P〈0.05(图IIB)。此外，与运载体组相比，处理10周后，N931使甘油三酯水 平显著降低(P0.05)。如实施例17所示，每周测量GW1929、 N931和运载 体处理的雄性必/W小鼠的空腹甘油三酯水平。除禁食期间之外，向动物 提供T2018鼠粮，供其随意取食。在处理10周后，在用N931处理的动物 中观察到甘油三酯下降34%(P < 0.05);而在参照化合物组中观察到下降 430碌<0.05)(图12)。为了证明富含色酮的组合物的优异且出人意料的功效，通过 将分离自好望角芦荟叶渗出物的色酮芦荟苦素(UP394)与从库拉索芦荟制 备的叶胶粉(编号为QM400的Qmatrix)组合生产另一种独特的组合物。通 过HPLC定量分析，来自这两种芦荟的标准化的色酮组合物(UP780)包含 不小于2%的色酮——即芦荟苦素(UP394)，且总蒽醌不大于50ppm。按照 实施例9的描述，以及标题为"Method of Purification of Aloesin"的美国专 利第6,451,357号的进一步描述，通过制备性色谱柱，其后通过重结晶进一 步纯化，从而从好望角芦荟叶渗出物提取分离出芦荟苦素(UP394)，上述文献通过引用全文并入本文。将该新型标准化的色酮组合物编号为UP7S0， 并在剂量范围选择研究中口服给药至高脂肪饮食饲喂的C57BL/6J小鼠。在 此研究中，将UP780的胰岛素敏感化活性与药物GW1929及原库拉索芦荟 胶粉(Qmatrix QM400)进行比较，其中如实施例9中的HPLC定量分析所示， 所述Qmatrix QM400不包含显著量的色酮。在实施例19中，每天口服处理3周后，在用200 mg/kg UF780 (图13D)和GW1929 (图13B)处理的动物中发现加入腹膜内葡萄糖负 荷后30、 60和90分钟时出现在统计学上显著的葡萄糖清除。类似地，用 400 mg/kg UP780处理的动物在30分钟时显示出显著的葡萄糖利用，P ^ 0.05(*)(图13E)。同样，每日口服处理9周后，与运载体对照相比，用400 mg/kg UP780处理的动物在经IP葡萄糖给药30、 60、 90和120分钟后在葡 萄糖利用上显示出统计学上显著的差别，户^0.05(*)(图14E)。 100mg/kg UP780处理的动物在T30显示出显著差别(图14C)。阳性对照GW1929在 所分析的各个时间点均具有小于0.05的P值。而不含显著量色酮的原戸荟 胶粉(QmatrixQM400)在口服3周后没有显示出功效(图13A)。该试验清楚 地显示出与不含色酮的组合物相比，富含色酮的组合物的出人意料的优异 的胰岛素敏感化功效。此外，在每日口服处理10周后的胰岛素耐受试验中验证了 UP780的胰岛素敏感化作用(图15A-15E)。对于用400 mg/kg UP780处理 的动物，在所述的所有时间点均观察到在统计学上显著的胰岛素敏感化，/> (*)(图15D)，这与葡萄糖耐受的数据相符。与之相比，不含色酮的 库拉索芦荟胶粉(Qmatrix QM400)在口服10周后仅显示出中等程度的改 善，且仅在单个点具有显著性(图15A)。富含芦荟苦素的库拉索芦荟胶粉同样稳定地保持了低水平的 空腹血糖水平。在处理的第2、 5和7周分别监测空腹葡萄糖水平。如图16 所示，与未处理的运载体相比，用200 mg/kg UP780和GW1929处理的动 物在两周中(第5和第7周)均显示出空腹血糖水平在统计上的显著下降。 用Qmatrix⑧和400 mg/kg UP780处理的小鼠在第5周显示出相似的空腹血糖下降水平。另一方面，在所有的测试周中，100mg/kgUP780处理组保持 了比未处理的运载体更高的空腹血糖水平，尸S0.05 (*)。类似的数据分析 显示，与运载体相比，在用200 mg/kg UP780处理的动物中空腹葡萄糖水 平下降的百分比在第2、 5、 7周分别为18%、 20%和17%(图17)。在实施例19的剂量范围研究试验中，在用UP780和GW1929 处理的动物中观察到空腹甘油三酯水平的相继下降。在每日口服处理7周 后，200、 400和100mg/kgUP780及GW1929相对运载体的空腹甘油三酯 水平下降百分比分别为22.1%、 22%、 21.7%禾卩22.7%(图18)。然而，不含 显著量色酮的库拉索芦荟胶粉(Qmatrix QM400)在处理2周后仅显示出2% 的甘油三酯水平改善，此外，该作用在随后的两次测量中消失。通过这一 试验清楚地证明了富含色酮的植物提取物在降低甘油三酯水平中的出人意 料的优异功效。如图19所示，相对于运载体，对所有的处理组均未发现胆固 醇水平的显著变化，户^0.05。此夕卜，在用GW1929、 Qmatrix 、UP780(100、 200和400 mg/kg)和运载体处理的所有小鼠组间均未观察到在统计学上显 著的体重增量差异或饲料消耗差异。尽管各处理组(包括运载体组和正常鼠 粮组)中的动物在整个研究期间体重持续增加，但在处理组之间观察到的体 重增量差异在统计学上不显著，尸S0.05(图20)。在所有组中都记录到相似 的饲料消耗方式，这与体重数据相符(图21)。根据定义，基因组研究是指基因组范围内的研究，通常使用 包含覆盖所有表达基因的探针组的DNA微阵列芯片。对于哺乳动物系统， 普遍认为具有功能且被表达的基因有25,000个。在使微阵列芯片与cRNA/ 由mRNA制备的cDNA杂交后，从该微阵列芯片检测到的数据应该反映出 mRNA的组织/细胞源的基因表达谱。通过基因组数据库分析通常为几千个 的具有表达差异的基因对生物途径的参与活动。如实施例20所述，对UP780进行了微阵列研究。所使用的 微阵列芯片为来自Affymetrix的小鼠基因组430 2.0，包含45,000个探针组。 通过ANOVA的强效统计法分析基因表达差异的微阵列数据，以验证基因表达差异的有效性。如实施例21所述，通过定量逆转录PCR(QPCR)进一 步验证具有表达差异的关键基因。通过影响代谢和信号转导途径的基因表 达差异检测处理的作用，并通过智能途径分析软件和数据库(IPA5)对其进行 分析。在高血糖水平下，胰腺P细胞分泌胰岛素，其导致肝脏和肌 肉中的葡萄糖转运体转移到质膜，以进行葡萄糖摄取并将葡萄糖以糖原的 形式贮存。胰岛素还提高肝脏和脂肪细胞中的脂肪酸和甘油三酯合成及脂 肪在脂肪组织中的贮存。由胰岛素受体信号级联缺陷引起的胰岛素抵抗导 致葡萄糖转运体向质膜的转移减少、脂肪贮存减少以及血糖和游离脂肪酸 增加。血中游离脂肪酸高使胰岛素受体底物(IRS)失活，并且是诱导胰岛素 抵抗的因素。用于UP780功效试验的C57BL6前期糖尿病小鼠模型是用于 微阵列的小鼠组织的来源。从瘦型对照、高脂肪饮食(也称为运载体)以及 高脂肪饮食+ 200 mg/Kg UP780处理的小鼠获取小鼠组织以用于RNA提 取，各样品都为一式三份。对于能量摄取、代谢、胰岛素抵抗、肥胖症和 糖尿病而言重要的组织为肝脏、肌肉和脂肪。完成了肝脏微阵列的一套数 据。大体而言，相对于瘦型对照(LC)，高脂肪饮食(LV)使基因表达提高， 但高脂肪饮食+ UP780(LUP，图23)使很多基因的表达水平下降。如实施例20和21所示，微阵列和QPCR研究中最显著的发 现是UP780使脂肪酸生物合成减少。与高脂肪饮食相比，UP780使限速酶 乙酰-CoA羧激酶(ACC2)和脂肪酸合酶(FASN)的转录物分别减少了 3倍和 3.5倍(表1和图24和25)。在高脂肪饮食中，来自葡萄糖的过量能量被转 化成脂肪，其必然后果是使血浆游离脂肪酸增加，从而导致肌肉中的胰岛 素抵抗。根据对动物模型的观察，UP780使脂肪酸生物合成减少的直接后 果应该是使胰岛素敏感性和葡萄糖耐受提高。此外，硬脂酰-CoA去饱和酶(SCDl，多不饱和脂肪酸合成的 限速酶)缺陷型小鼠在高脂肪饮食下仍保持消瘦。与高脂肪饮食相比， UP780使SCD1转录物减少4.44倍。
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微阵列分析还显示出与瘦型对照和高脂肪饮食相比，UP780 使参与线粒体脂肪酸P-氧化的酶的转录物水平降低(表1) 。p-氧化下降可使 高能量摄取下的线粒体氧化总水平正常化，并且可能获得使线粒体游离氧 自由基的产生正常化的结果。已知高类固醇水平可反馈并降低类固醇生物合成，这在高脂 肪饮食和UP780处理中均可观察到，特别是对于限速酶HMG-CoA还原酶 而言(表l)。与高脂肪饮食相比，UP780使CYP7A1升高，并且可能获得 使胆酸生物合成提高的有益结果。糖酵解/葡糖异生途径中的全局性基因表达差异表明几乎没 有全局性变化，因为所涉及的大部分酶是双向的。肝脏糖异生的限速酶是 丙酮酸代谢途径中的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)(表1)。微阵列和 QPCR显示了 UP780使PEPCK转录物相比瘦型对照增加的趋势，但其与高 脂肪饮食相等(图26)。这会使血糖增加，因此在抗肥胖抗糖尿病治疗中应 避免。然而，如果UP780使肌肉显示出葡萄糖摄取和利用提高，如上述动 物研究所示，其净作用可处于总体平衡状态。根据微阵列和QPCR的观察，与高脂肪饮食相比，UP780使 肝脏中脂肪酸结合蛋白FABP5的转录物提高了 1.74倍(表1和图27)。 FABP5增加有利于脂肪转转运并使导致胰岛素抵抗的血浆游离脂肪酸减 少。UP780使质膜LDL受体减少，其可减少从血中摄取的LDL，并降低肝 脏中的甘油三酯含量。此外，与高脂肪饮食相比，UP780还降低了用于质 膜HDL、氧化态LDL和脂肪酸摄取的CD36，其可进一步减少肝脏脂肪含 量(表l)。高脂肪饮食使参与PPARa/RXRa肝信号转导途径的基因转录 物增加，而UP780则可使其下降，特别是对于PPARa、 CD36和c-Jun而 言。肝脏中的PPARa活化通过增加HDL并减少LDL使血浆脂肪谱正常化。 然而，高脂肪饮食或UP780均未使HDL脂蛋白ApoAl和ApoA2的转录物 水平产生可观的变化。UP780对PPARa的作用值得进一步关注。 UP780使很多参与药物代谢和解毒的酶的转录减少，所述酶包括CYP7B1、 CYP2B9、 CYP2C18、谷胱甘肽-S-转移酶和SOD3，该作用 也值得进一步研究(表l)。 AMPK被视为是能量平衡的细胞传感器。健康细胞在所有时 间内均维持高ATP浓度。AMPK在细胞AMP/ATP比例增大(能量应激标志) 时被激活(Hardie (2004) J Cell Sci i/Z:5479) 。 AMPK的活化抑制葡萄糖和 脂肪酸合成、提高葡萄糖和脂肪摄取、提高醣酵解和脂肪酸P-氧化、并减 少蛋白质合成和细胞生长(Hardie (2004) Rev Endocrine & Metabolic Disorders ^ 119) 。 UP780逆转了高脂肪饮食造成的AMPK转录物水平下降 (图28)。在CD-I小鼠中进行了富含色酮的植物提取物UP780的药物 安全性试验，经检测，该组合物具有良好的耐受性。如实施例22所示，对 CD-1小鼠连续14天每天给药2.0 g/kg UP780，在整个研究过程中没有发病 或致死的迹象。小鼠身体状况和保持良好状态的每日系统检查显示在整个 研究过程中没有表明测试化合物相关毒性或异常的标志。在该急性毒性研 究中，所有小鼠的体重均在研究过程中持续增加(图22A和B)。除了观察 到电解质的读数与参考范围略有偏差之外，在该14天毒性研究中所有的主 要血液生物化学读数均在正常的范围内。与运载体对照相比，经UP780处 理的雌性的天门冬氨酸转氨酶(AST)、钠、钾和平均红细胞血红蛋白浓度 (MCHC)以及雄性的总蛋白和血尿氮在统计学上有显著差异，户S0.05(数据 未显示)。MCHC、总蛋白和BUN的观测平均值仍在正常参考范围内；然 而，AST、钠和钾的平均值在正常范围之外。在运载体对照和UP780处理动物中，所有小鼠尸检的一般检 査结果都基本正常(数据未显示)。对给药UP780 14天的小鼠，没有在其用 于微观检查的任何组织中观察到与测试物相关的微观变化。在所检查的器 官和组织中观察到少量的各种微观变化是在该年龄和应激下的实验小鼠中 常观察到的自发变化类型。所观察到的电解质失衡可由很多条件引起，包 括肾和肾上腺病变以及导致呕吐和/或腹泻的任何疾病。低AST值没有临 床显著性。因为缺少相应的临床观察、血液学数值和组织病理学结果证据，
52我们认为这些与正常值之间的偏差可能是由于饲养和实验室条件造成的。 因此，因心理压力产生的溶血和脾收縮而造成的影响如细胞流失等可能导 致分析物读数的假提高或降低。因此，基于临床发现以及血液学、血液化 学和组织病理学的试验报告，推断没有证据表明此剂量对任何研究的小鼠 产生任何系统毒性。运载体或试验物对这些偶发事件的类型、发生或严重 性没有影响。本发明的化合物以及包含该化合物的植物可作为饮食添加剂 递送，其可被配制成片剂、胶囊剂、软凝胶剂，也可用于基本饮食和/或功 能性食品、能量条、果汁饮料和碳酸或常规饮料中，以用于预防和治疗哺 乳动物(包括但不限于人)中由胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高甘油三酯 水平和葡萄糖水平失衡介导的疾病和病症。可通过本领域技术人员熟知的多种方法制备用于在药物组合 物中给药的化合物。色酮可以以如下形式配制其天然存在形式的草药粉 末；不同浓度的溶剂和/或超临界流体提取物；通过重结晶、柱分离、溶剂 分配、沉淀和其他方式富集和纯化的化合物；通过合成方法制备的纯色酮 和/或包含基本纯的色酮的混合物。多种给药系统是本领域已知的，且可用于给药本发明的治疗 组合物，包括粉剂、胶囊、片剂、酊剂、舌下给药系统、食物条和多种溶 液剂包括水、果汁和碳酸软饮料、软膏剂和用于口服的乳剂。可将该组合 物以水溶液剂的形式，包装于脂质体、微粒和微胶囊中而进行递送。尽管 其他的有效的给药形式例如关节内注射、吸入喷雾、口服和局部活性的制 剂、透皮离子电渗疗法或栓剂也是预期的，但本发明的治疗组合物可通过 注射经肠胃外给药。 一种优选的载体是生理盐水溶液，但预期也可以使用 其他药学上可接受的载体。在一个实施方案中，预期载体和色酮构成生理 相容的缓释制剂。此种载体中的主要溶剂的性质可以是水性或非水性的。 此外，该载体可包含其他药理上可接受的用于改变或维持制剂的pH、渗透 压、粘度、澄清度、色泽、无菌性、稳定性、溶解速率或气味的赋形剂。 类似地，该载体仍可包含其他药理上可接受的用于改变或维持配体的稳定性、溶解速率、释放或吸收的赋形剂。此类赋形剂为通常且常规用于配制 以单剂量或多剂量的形式用于胃肠外给药的剂型的那些物质。
—旦配制治疗组合物，就可将其以溶液剂、混悬剂、软膏剂、 凝胶剂、固体或脱水或冻干粉的形式贮存在无菌瓶中。此类制剂可以即用 型或需要在给药前进行复溶的形式贮存。将包含该组合物的制剂用于系统 给药的给药方式可通过口服给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、 局部给药、鼻内给药或通过阴道或直肠栓剂给药。对具体疾病或病症而言对治疗有效的组合物的量将取决于疾 病或症状的性质，其可通过标准的临床技术确定。此外，可任选地采用体 内或体外试验以有助于确定最佳的剂量范围。制剂中所采用的准确剂量还 将取决于给药途径，以及疾病或病症的严重性或进展，并且应根据医生和 各个患者的状况决定。可根据体外或动物模型试验系统获得的剂量-响应曲 线外推出有效的剂量。例如，可通过给药梯度剂量的组合物并观察所需的 作用从而简单地确定本发明组合物的有效量。本发明的治疗方法包括向有此需要的哺乳动物(包括但不限 于人)体内或局部给药治疗有效量的来自一个或多个来源的一种或多种色 酮。色酮或其混合物的纯度可在0.01%-100%的范围内，这取决于用于获得 该化合物的方法。口服给药、注射给药、局部给药、气雾剂、栓剂、皮内 给药的色酮组合物的浓度可占适当制剂的总量的0.001重量％-99.99重量 %。可通过标准给药途径使用色酮，所述给药途径选自由口服给药、局部 给药、气雾剂、栓剂、皮内给药、肌肉内给药和静脉内给药组成的组，其 每日剂量在0.01 mg/kg-500 mg/kg哺乳动物(特别是人)体重的范围内。
实施例以下提供的实施例仅用于说明的目的，而非用于限制本发明 的范围。
实施例1.从干植物制备有机和水性提取物将干燥的植物材料研磨至粒径不大于2 mm，使用ASE 300实施例2.小鼠3T3-L1细胞系和培养条件 胚鼠细胞系3T3-LI (American Type Culture Collection, Manassas, VA)是可由前脂肪细胞分化成脂肪细胞态的瑞士白化细胞系 3T3 (3T3 swiss albino line)的亚株。将这些前脂肪细胞在包含10%胎牛血清 (FBS)的Dulbecco's改良的Eagle培养基(DMEM， Mediatech， Inc., Herndon, VA)中培养。
实施例3.脂连蛋白ELISA分析为了建立分化程序，将3T3-L1细胞平铺到96孔板中并培养 过夜至汇合。在汇合后2天诱导汇合细胞分化。向培养基中补充0.5mM异 丁基甲基黄嘌呤、1.0 pM地塞米松和1.7 jiM胰岛素(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)进行诱导。在第7天，使用对照化合物或植物提取物处理脂肪 细胞24小时。所有对照和植物提取物均溶于DMSO，并以总体积的1%加 入到培养基中。收集细胞培养基以测量脂连蛋白水平，并根据制造商的方 法(R&D Systems, Minneapolis, MN)通过酶联免疫分析(ELISA)进行分析。 该分析的敏感度范围为31.25-2000 pg/mL。阳性对照的检测范围为0.01-300 pM(图1)。吲哚美辛和曲格列酮均在l pM观察到脂连蛋白水平的最大增 长倍数，其脂连蛋白水平的增长分别为1.6和1.7倍。由于该分析的信 号背景比差(小于2)，因此需要对上述方法进 行改进。如上所述平铺脂肪细胞并使其分化。使细胞在添加或不添加胰岛 素的分化培养基中分化48小时。随后，使用对照化合物或植物提取物在分 化后处理细胞仅48小时。所有其他参数都与上述的参数相同。分别在10-100 ^M和3-30nM检测吲哚美辛(图l)和曲格列酮(数据未显示)对照。脂连蛋白水平的最大增加为高于基线信号52倍，其通过用100 mM吲哚美辛处理 而达到，而最小增加为用10pM吲哚美辛时的增加7倍(图1B)。通过曲格 列酮处理而达到的脂连蛋白最大增加为30 pM时的增加49倍，而3 pM时 观察到脂连蛋白水平的最小增加倍数，为24倍(数据未显示)。这两种化合 物显示的脂连蛋白水平增加均显著高于公开的数据。
实施例4.筛选增强脂肪细胞中脂连蛋白生产的植物提取物使用实施例3中描述的脂连蛋白ELISA分析筛选植物提取物 库。使用吲哚美辛和曲格列酮作为对照，筛选按实施例1的描述分离的有 机提取物， 一式三份。在2059种粗提取物中，有14.9%(139种提取物)诱 导了高于对照水平的脂连蛋白生产。在这些阳性提取物中，37种提取物(总 数的1.8%)的活性高于最低浓度(3 MM)的曲格列酮对照。通过连续稀释对 这37种提取物再次进行试验。来自好望角戸荟叶渗出物的有机提取物 P0017-OE显示出对脂连蛋白诱导的良好的剂量效应曲线(图2)，并选择其 用于进一步的评价。
实施例5.获自好望角芦荟的活性有机提取物的高通量纯化(HTP)选择P0017-OE用于生物分析引导的活性化合物分级。将 P0017-OE (400 mg)装载到预装填的正向快速柱(2 cm ID x 8.2 cm， 10g硅胶) 上。使用Hitachi高通量纯化(HTP)系统，以(A) 50:50 EtOAc:己烷和(B)甲 醇为梯度流动相(由100% A到100% B)在30分钟内以5 mL/分钟的流速对 柱进行洗脱。使用宽带波长UV检测器监测分离，并使用Gilson馏分收集 器将馏分以1.9 mL/孔收集到96深孔板中。将具有相似UV吸收和保留时 间的馏份组合成8个细分馏份，并在低真空下干燥并离心，将其命名为 P0017-OE-HTPF1-F1、 F2、 F3、 F4、 F6、 F6、 F7禾口F8(图3)。使用画SO 溶解各个细分馏份(50 pg&l)并将其部分(2 pl)用于脂连蛋白分析。 P0017-OE-NP-F3是8个细分馏份中活性最高的一个。实施例6. P0017-OE-NP细分馏分的LC-MS/PDA去冗余因为在脂连蛋白分析中证明P0017-OE-NP-F3是活性最高的 细分馏分，因此利用LC-MS/PDA分析从HTP分级获得的各个P0017-OE-NP 细分馏分，并相互比较以发现P0017-OE-NP-F3中的独特化合物峰。基于分 子量和文献检索，认为P0017-OE-NP-F3中最可能的活性活化物的分子量为 394 (芦荟苦素)和396 (aloesinol)。
实施例7.从好望角芦荟中提取并纯化芦荟苦素和Aloesinol用甲醇(3x)提取好望角芦荟叶渗出物(P0017)(200g)。在低真空 下蒸发组合的甲醇溶液，从而获得甲醇提取物。使用实施例6 P0017-OE-NP-F3中描述的方法从P0017分出甲醇提取物(5 g)。将活性馏分 (等价于实施例6的P0017-OE-NP-F3馏分)装载到Phenomenex Luna 。18柱 (250 x 30 mm 10 p)上，并在Hitachi高通量纯化(HTP)系统上使用水(A)和甲 醇(B)的梯度流动相(从90% A到100% B)以5 mL/分钟的流速进行洗脱，随 后用100%甲醇清洗10分钟。使用宽带波长UV检测器监测分离，并使用 Gilson馏分收集器将馏分收集到管中。从4个ds柱洗脱中手工收集10个 主要的化合物峰。将10个馏分干燥并通过重结晶纯化，并命名为 P0017國AC 1 、 P0017-AC2 、 P0017-AC3 、 P0017-AC4 、 P0017垂AC5 、 P0017-AC6 、 P0017-AC7、 P0017-AC8、 P0017-AC9和P0017隱AC10(图4)。 P0017-AC1和 P0017-AC2在脂连蛋白分析中显示出活性并且分别被鉴定为芦荟苦素和 aloesinol。其他8个化合物无活性或活性较小。
实施例8.芦荟苦素和Aloesinol的详细鉴定声荟苦素(UP394):产量由P0017-OE-NP-F3的产量为 2.4% (纯度> 98%， HPLC); UV(Max): 248.4和295.9 nm; MS(ESI，负离 子检测)m/z 393 (M-1,100%)。该样品的峰与戸荟苦素标准品相同，其在 HPLC色谱图上的保留时间相同(图5)。
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Aloesinol(UP396):产量由P0017-OE-NP-F3的产量为 1.4%(纯度> 97%， HPLC); UV(Max): 248.4禾卩295.9 nm; MS(ESI,负离 子检测)m/z 395 (M - 1， 100%)。该样品峰与aloesinol标准品相同，其在 HPLC色谱图上的保留时间相同(图6)。
实施例9.从好望角芦荟提取物制备和定量芦荟苦素按照标题为"Method of Purification of Aloesin"的美国专利第 6,451,357号的描述，通过制备性色谱柱，其后通过重结晶进一步纯化，从 好望角芦荟全叶提取物分离提取出芦荟苦素(UP394)，该文献通过引用全 文并入本文。简而言之，得自于好望角芦荟全叶的干提取物曾溶于热水并 过滤以除去不溶性颗粒。随后，将提取物装载到装填有CG-161树脂的反相 柱上，并在用DI水清洗柱后，用20-30。/。甲醇将戶荟苦素(UP394)从柱中洗 脱。将20-30%甲醇洗脱液组合并蒸发。使固体在醇/水溶剂中重结晶直到 根据以下HPLC法测定的其纯度〉90。/。，且没有蒽醌污染物(芦荟素A & B 的含量不超过100 ppm)为止。使用公开的HPLC法(Zahn (2007) Phytochem. Anally: 1002-1024) ， 对色酮例如卢荟苦素(UP394)， aloesinol (UP396)和戸荟树 脂A进行相对于蒽醌污染物(即芦荟素A& B)的定量。在带有L-7100泵、 L國7200自动取样器和L7300柱式加热炉的Hitachi L-7000 HPLC系统上进行 分析。该方法使用与C18保护柱偶联的Phenomenex IB SIL C18柱(250 mm x 4.6 mm， 5 p粒径)。在最初的5分钟内，流动相由起始比例为66%:34%的 水/甲醇梯度组成。该比例在15分钟内变为24体积％水76体积％甲醇， 随后在此比例下再保持2分钟。在下次的样品注射前，用66%水和34%甲 醇使柱平衡5分钟。流速为1.0ml/分钟。使用L-7400UV检测器在297nm 波长下检测色酮和蒽醌。基于HPLC保留时间鉴定色酮和蒽醌，并基于相 对于单独的色酮和蒽醌标准物的峰面积进行定量。据报道，在好望角戸荟的粗提取物中戸荟苦素(UP394)的含 量为24.8重量％，而蒽醌为22重量。/o(Zahn, (2007) Phytochem. Anal.1^:1002-1024)。据报道，在不同的巴巴多斯芦荟叶中，芦荟苦素的含为0.32 mg/g(即0.032%)，而总色酮含量为0.1037%。另一方面，蒽醌(芦荟素八& B)的含量比芦荟苦素的含量高几乎4倍(1.14 mg/g或0.114%) (Park (1998) Phytochem. Anal. 2:186-191)。使用脱色法和其他生产方法，从库拉索芦荟全叶喷雾干燥胶 粉(Lo说RM040805-02 & RM040805-05)和库拉索戸荟胶粉——Qmatrix脱 水物(Lo说RM120806-01)中完全除去芦荟苦素和蒽醌(根据HPLC分析，两 者均低于50 ppm)。分离自好望角芦荟叶提取物的经分离和纯化的芦荟苦 素(UP39)(Lot弁A-2705和Lot弁I1506AW)的纯度分别为93。/o和100.6%,且总 蒽醌小于50ppm。如以下实施例所述，使用不含蒽醌(总蒽醌——戸荟素A & B<50 ppm)的戸荟苦素(UP394)生产富含色酮的组合物N931和UP780。
实施例10.通过芦荟素(UP394)和Aloesinol(UP396)增强脂连蛋白生产如实施例3所述，检测两种纯色酮UP394(芦荟苦素)和 UP396(aloesinol)在30 pM时使脂肪细胞的脂连蛋白生产的提高。芦荟苦素 和aloesinol分别使脂肪细胞的脂连蛋白生产提高2倍和3.2倍(图7)。
实施例11.N93KLo说D1205-01)的详细制备通过将分离自好望角芦荟叶渗出物的纯色酮芦荟苦素 (UP394)与由库拉索芦荟制备的全叶胶粉组合来生产该独特的组合物 (N931)。来自两种芦荟的标准色酮组合物包含不少于1.4%的色酮——即戸 荟苦素(UP394)。按照实施例9所示，以及标题为"Method of Purification of Aloesin"的美国专利第6,451,357号的进一步描述，通过制备性色谱柱分离， 其后通过重结晶进一步纯化，从好望角芦荟全叶渗出物分离提取出芦荟苦 素(UP394)，所述文献通过引用全文并入本文。将该独特的标准色酮组合 物确定为N931。随后，将0.811 kg芦荟苦素(纯度93%，含水量5%的Lot# A-2705)加入到50 kg的库拉索芦荟全叶喷雾干燥胶粉(Aloecorp分装号5020; LotttRM-040805-02和RM-040805-05)，并使用V-搅拌机将混合物混 和。启动加强棒(intensifierbar)并同时运行加强棒和壳(shell),混合时间不 少于5分钟且不多于7分钟。仅关闭加强棒，并继续混合不少于5分钟且 不多于10分钟。再次启动加强棒，并混合不少于5分钟且不多于7分钟。 停止混合，收集混合的物质，并通过HPLC法将UP780中的芦荟苦素含量 定量，为1.5%，并通过如实施例9所述的HPLC法将总蒽醌含量定量，为 小于50 ppm。
实施例12.高脂肪饮食诱导的前糖尿病模型开发出高脂肪饮食诱导的动物模型并将其用于评价色酮提取 物的潜在治疗作用。C57BL/6J是可用于研究代谢疾病、葡萄糖耐量受损的 病理生理学以及开发新型治疗剂的临床上相关的动物模型(Ahren等(2004) Diabetes 53 (Supplement 3):S215-S219: Laakso等(2004) Diabetes Care 22:2253-2259; Kahn等(2004) Diabetes 2:3274-3285; Scheurink等(1998) European J Endo. ，:461-467; Yuan等(2002) Diabetes il:1851-1858; Reitman等 (2005) Endocrinology递:3258-3264; Vlassara等(2005) Diabetes M:2314-2319 ; Cawthome等 (2002) Molecular and Cellular Proteomics j_:509-516)。 Surwit等人在1988年首先解释了模型的诱导方法 (Diabetes, 22:1163-1167)。简而言之，饲喂高脂肪饮食8周时，在C57BL/6J 小鼠中成功造成了葡萄糖耐量受损以及代谢疾病样的症状。6周龄的雄性 C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)。在适应期后1周， 将动物分组(11=5或6)，并提供高脂肪(45% kcal)鼠粮(Research diets, Inc., New Brunswick, NJ)和水，供其随意取食12周，但在葡萄糖和胰岛素耐受 试验时禁食3小时。以12小时的光照一黑暗循环将动物饲养在温度受控的 空间(22,2T:沖。如上文所述，每周监测血糖、胆固醇和甘油三酯，持续12 周。每周测量一次体重，持续12周。 —旦代谢疾病的诱导通过所选参数(葡萄糖、甘油三酯和胆固 醇)的每周监测而得到确认，例如在第8周确认，则开始进行每日腹膜内治
60疗，并持续4周。在研究中每天将测试化合物和阳性对照GW1929(Tocris Bioscience, Ellisville MO，批次弁2A/58705)溶于0.5。/。甲基纤维素(Sigma， St. Louise MO， Lot# 116H0857)并分别以100和5 mg/kg的腹膜内剂量递送。由 于GW1929不能在甲基纤维素中完全溶解，因此首先将其溶于 DMSO(Sigma, St Louise MO，批号# 064K0067)中。随后，在给药前将各化 合物(包括运载体)的终浓度调节至包含5% DMSO。运载体处理的动物仅接 受0.5%的甲基纤维素。在给药各化合物或运载体后没有观察到可检测的刺 激标记。所使用的阳性对照gw1929——n-(2-苯甲酰苯基)-0-[2-(甲基 墨2-吡啶基氨基)乙基]-L-酪氨酸——是批分子量为504.59的黄色固体粉末 (Tocris Bioscience, Ellisville MO,批号# 2A/58705)。该化合物是具有口服活
性的选择性PPARy激动剂。其在口服给药后降低糖尿病动物模型中的葡萄 糖、脂肪酸和甘油三酯水平(Brown等(1999) Diabetes趄:1415; Way等 (2001) J. Biol. Chem. 22^:25651-25653)。向动物提供高脂肪饮食，持续12 周。在第8周开始进行治疗并持续4周。
实施例13. UP394和UP396对胰岛素抵抗的作用如实施例12所述，在通过腹膜内给药GW1929 (5 mg/kg)、 UP394(100mg/kg)、 UP396 (100 mg/kg)和运载体进行处理的第18天，以2 g/kg的剂量使用C57BL/6J小鼠进行腹膜内葡萄糖耐受试验。在给药葡萄糖 前使动物禁食3小时。在0、 30、 60、 90和120分钟时测量血糖水平。所 述数据为平均值土SD， n = 6。与运载体相比，GW1929和UP396在60、 90 和120分钟时观察到显著的葡萄糖利用，p〈0.05。与运载体相比，GW1929、 UP394和UP396在T0的P值分别为0.00、0.87和0.43;在T30分别为0.07、 0.16和0.23。与运载体相比，UP394在T60的P值为0.15，在T90为0.10， 在T120为0.17(图8A)。在胰岛素耐受试验中UP394和UP396均显示出胰岛素敏感化 的作用。如实施例13所述，在通过口服给药GW1929 (5 mg/kg)、UP394 (100mg/kg)、 UP396 (100 mg/kg)和运载体进行处理的第24天，以0.5单位/kg 的剂量使用C57BL/6J小鼠进行腹膜内胰岛素耐受试验。在注射胰岛素前使 动物禁食3小时。在0、 30、 60、 90和120分钟时测量血糖水平。所述数 据为平均值士SD， n=6。与运载体相比，UP394和UP396及GW192在时 间点T30、 T60和T90观察到显著的葡萄糖清除，p<0.05。与运载体相比， GW1929、 UP394和UP396在TO的P值分别为0.00、 0,14和0.67;在T120 分别为0.08、 0.00和0.04(图8B)。
实施例14. UP394和UP396在高脂肪饮食诱导的胰岛素抵抗模型中对胰岛 素敏感性的作用在用化合物UP394和UP396处理的动物中进一步证明了 口服 给药UP394 (100 mg/kg)和UP396 (100 mg/kg)对胰岛素抵抗的作用。这些动 物中的胰岛素水平显著降低。使用胰岛素ELISA试剂盒(Crystal Chem -Chicago, IL)测量血浆胰岛素水平。在词喂高脂肪饮食8周后，用GW1929、 UP394和UP396及运载体处理动物2周(图9)。通过尾静脉收集血液并离心 收集血浆。与运载体组相比，第14天在GW1929、 UP394和UP396处理组 观察到血浆胰岛素水平显著下降，尸<0.05。
实施例15.N931对db/db小鼠中空腹葡萄糖水平的作用每周测量GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和运载体处理 的雄性必AZ6小鼠(每组8只)的空腹葡萄糖水平。除禁食期外，向动物提供 T2018鼠粮，供其任意取食。在进行测量前使动物禁食过夜。如图IO所示， 在10周的处理期内，运载体处理小鼠的葡萄糖水平随时间增加。参考化合 物GW1929能够如预期地将葡萄糖水平保持在基线水平。与GW1929相似， N931从处理第5周开始使葡萄糖水平充分降低。与运载体相比，N-931在 第6、 7、 9和IO周使空腹血糖水平显著降低，P<0.05。在处理的第10周， 在N931处理组中观察到葡萄糖水平下降46%。实施例16.N931对db/db小鼠模型中胰岛素抵抗的作用在处理10周后，以3g/kg的剂量在db/db小鼠上进行口服葡 萄糖耐受试验。除禁食期外，向动物提供T2018鼠粮，供其任意取食。在 给药葡萄糖负荷前使动物禁食过夜。用GW1929 (5 mg/kg)、N931 (375 mg/kg) 和运载体处理小鼠(每组8只)10周。在给药葡萄糖负荷后的O、 30、 60、 90 和120分钟测量血糖水平。与运载体相比，用GW1929或N-931处理的小 鼠中在0和120分钟时观察到葡萄糖从循环系统的显著清除，P < 0.05(图 IIA)。该结果证明N931具有提高葡萄糖耐受的能力，由此改善必/必小鼠 的胰岛素敏感性。在处理6周后，以0.5单位/kg的剂量在db/db小鼠上进行腹 膜内胰岛素耐受试验。在注射胰岛素前使动物禁食过夜。用GW1929 (5 mg/kg)、 N931 (375 mg/kg)和运载体处理必/必小鼠(每组8只)6周。在注 射胰岛素后的O、 30、 60、 90和120分钟时测量血糖水平。在用GW1929 和N931处理的小鼠中同样证实了胰岛素敏感性的改善。与运载体相比， GW1929和N-931在0、 30和60分钟时均观察到显著的葡萄糖清除，P< 0.05(图IIB)。
实施例17.N931对db/db小鼠模型中甘油三酯的影响每周检测GW1929 (5 mg/kg)、 N-931 (375 mg/kg)和运载体处 理的雄性db/db小鼠的空腹甘油三酯水平，持续10周。除禁食期外，向动 物提供T2018鼠粮，供其任意取食。在进行测量前使动物禁食过夜。该数 值以运载体的甘油三酯水平的百分比表示，n = 8。在处理10周后，与运载 体相比，在经GW1929和N-931处理的动物中发现甘油三酯水平显著下降， P〈0.05(图12)。
实施例18.富含色酮的组合物(UP780)的制备和给药通过将分离自好望角芦荟叶渗出物的纯色酮芦荟苦素 (UP394)与由库拉索芦荟制备的叶胶粉组合来生产该独特的组合物(UP780)。来自两种戸荟的标准化的色酮组合物包含不少于2%的色酮—— 即芦荟苦素(UP394)以及小于50 ppm的总蒽醌。按照实施例9的描述，以 及标题为"Method of Purification of Aloesin"的美国专利第6,451,357号的 描述，通过制备性色谱柱分离，其后通过重结晶进一步纯化，从好望角芦 荟全叶渗出物提取分离出色酮芦荟苦素(UP394)，上述文献通过引用全文 并入本文。将该独特的标准化的色酮组合物确定为UP780。下述方法用于制备一批5 kg的富含芦荟色酮的库拉索芦荟胶 粉UP780。这是包含不少于2%的库拉索芦荟胶粉中的芦荟苦素的标准芦荟 胶组合物。将从好望角芦荟全叶渗出物纯化的0.11 g芦荟苦素(Lo说 11506AW，纯度100.6%)添加到4.90 kg库拉索芦荟胶(Qmatrix⑧脱水)粉 (Aloecorp分装号AA8010XQ80， Lot# RM-120806-01)中。将该混合物混合 以获得芦荟色酮标准化组合物UP780(Lot弁L1806QMAW-01)。通过HPLC 确认该组合物(UP780)中芦荟苦素(UP394)的含量为2.2%，没有蒽醌污染 物。在动物接受8周高脂肪饮食后， 一旦代谢疾病的诱导通过对 所选参数的每周监测得到确认，则开始进行每日口服处理。每天将测试物 和阳性对照GW1929 (Tocris Bioscience, Ellisville MO，批号弁2A/58705)溶于 0.5。/o甲基纤维素(Sigma， St. Louise MO, Lot# 116H0857)并分别以100、 200 和400 mg/kg的口服剂量递送UP780 (Lot # L1806QMAW-01); 400mg/kg Qmatrix⑧库拉索戸荟胶粉(QM400， Lot# G6319103-L3)以及5 mg/kg GW1929。由于GW1929不能在甲基纤维素中完全溶解，因此首先将其溶 于DMSO (Sigma, St. Louise MO，批号# 064K0067)中。随后，在给药前将 测试化合物(包括运载体)的终浓度调节至包含5% DMSO。载体运载体处理 的动物仅接受0.5%的甲基纤维素。在给药药物或运载体后没有观察到可检 测的刺激标记。实施例19. UP780对高脂肪饮食诱导的C57BL/6J小鼠的效力和剂量范围研 究 如实施例12所述，由Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 购得6周龄的雄性C57BL/6J小鼠。在适应期后1周，将动物分成6组(n-7)，并提供高脂肪(45% kcal)鼠粮(Research Diets, Inc.， New Brunswick, NJ) 和水，供其随意取食12周，但在葡萄糖和胰岛素耐受试验时禁食3小时。 以12小时的光照一黑暗循环将动物饲养在温度受控的空间(22.2°C)中。在具有饲料和饮水部分的鼠笼中圈养3或4只雄性C57BL/6J 小鼠。通过测量预称重的高脂肪粒数值与当天剩余量间的差别确定每日的 饲料摄取量。在整个研究过程中每周测量体重一次。使用得自于尾静脉的15-20 pl血液测量空腹血糖、总胆固醇 和甘油三酯水平。使用带有Prestige试纸带(Walgreen, Home Diagnostics, Incv Ft. Lauderdale, FL)的IQ血糖监测系统测定血糖，用带有PTS Panels试纸带 (Polymer Technology System, Inc, Indianapolis, IN)的CardioChek分丰斤仪观!l 定胆固醇和甘油三酯，从而测定胆固醇和甘油三酯的全血值。在处理开始后的第0天(基线)、第3周和第9周进行腹膜内葡 萄糖耐受试验。在试验当天，使动物禁食3小时并接受剂量为2 mg/g的腹 膜内给药。在递送葡萄糖后O(葡萄糖注射前)、30、 60、 90和120分钟测定 血糖水平。从尾静脉取血。在第10周进行腹膜内胰岛素耐受试验。使动物 禁食3小时，接受剂量为0.5IU/kg的腹膜内胰岛素给药(酵母中表达的人重 组蛋白，Sigma，St,Louis，MO， Lot# 055K1321)。在给药胰岛素后O分钟(胰 岛素注射前)、30、 60、 90和120分钟测定血糖水平。从尾静脉取血。
实施例20. DNA微阵列的材料和方法将小鼠分成7个处理组，每组选择3只动物用于组织收集。 在处理10周后，用C02气体麻醉小鼠，在安乐死后5分钟内收集肝脏、体 壁肌肉和脂肪。将组织切成小于5 mm的块，并在组织收集期间浸入RNALater溶液(Ambion)中贮存，随后转移到-8(TC冰箱中长期贮存。在分 离RNA时，将小鼠组织解冻并从RNALater贮存溶液中取出。使用RNEasy 总RNA分离试剂盒进行肝脏总RNA提取，并使用RNEasy纤维组织试剂 盒(Qiagen)进行肌肉总RNA提取。在RNEasy试剂盒中附带的含异硫氰酸 胍和P-巯基乙醇的RLT溶液中用Dunce玻璃均质器将组织均质化。通过 260/280 nm波长下的UV吸收定量所提取的RNA。使用变性乙二醛琼脂糖 凝胶(1%)电泳，根据28S和18S rRNA带的完整性以及基因组DNA的缺 乏确定RNA的质量。当从凝胶中观察到基因组DNA时，使用RNEasy试 剂盒对具体的RNA样品进行第二轮提取。选择Affymetrix小鼠基因组430 2.0阵列用于DNA微阵列研 究。每个阵列包含34，000个小鼠基因的45,000个探针组，以及用于杂交的 对照序列、poly-A、 100个标准化探针组和管家基因。从12家Affymetrix 授权的服务提供商列表中选择CoGenics进行cRNA合成、杂交/清洗、扫 描程序，并使用Affymetrix GCOS软件进行数据分析。CoGenics使用 NanoDrop分光光度计和Agilent 2100生物分析仪对所接收的RNA样品进 行其本身的内部RNA质量控制。在微阵列加工期间，Cogenics还对cRNA 以及微阵列数据集进行质量控制。对于小鼠肝脏，选择瘦型对照(LC)、高 脂肪饮食(LV)和高脂肪饮食+ 200 mg/Kg UP780 (LUP)进行微阵列分析试 验，共计9个阵列。所有的RNA、 cRNA和最后的微阵列数据集均通过了 质量控制。 Affymetrix小鼠基因组430 2.0阵列按标准Affymetrix阵列设 计每个探针组11对探针，每对探针包含一个完全匹配(PM)和一个错配 (MM)的25-mer寡核苷酸。通过GCOS的数据分析使用了经背景扣除的PM 和MM 二者的强度值。对于每个探针组，将所有的11个PM值和11个 MM值相加成一个强度值。随后，基于平均强度值以及用于阵列间比较的 目标强度值对阵列数据集进行全面扫描。还使用Affymetrix软件"Expression Console"进行独立的微阵列数据分析。除了将GOCS中的MAS5算法用于 强度加和之外，还将Expression Console中使用的RMA和PLIER算法用于
66强度加和。 MM探针的实用性现已成为争论的对象。因此，我们用 Bioconductor软件进行了仅使用PM值、校正背景的额外微阵列数据分析。 每个处理组有3个阵列。使用MA绘图判断处理组内的阵列一致性。使用 R编程语言中的Bioconductor微阵列包的Loess函数对不一致性进行标准 化。对于处理组的每个探针组，将33个PM值集合成一个强度值，进行log2 转化。此外，在处理组之间，使用33对比33 PM值对每个探针组进行 ANOVA的统计试验。在LUP对比LV、 LUP对比LC和LV对比LC处理 组之间共进行了 3 x 45,000个ANOVA试验。通过假阳性率(FDR)和Holm 的连续Boriferroni校正法检测基因表达差异的显著性，显著性水平a = 0.05。微阵列数据集通常为数千个表达差异的基因，需要来自路径 分析软件的协助以理解生物显著性的意义。使用Ingenuity Pathway Analysis 软件IPA5和相关的基因组数据库分析从PM值总结得到的LC、 LV和LUP 阵列每组3份的小鼠肝脏数据集。应用了 ANOVAp￡0.0001， log2强度2 2.5，以及log2比2 0.9三个截止标准。IPA5产生出40种规范途径和70种 功能，每种至少在三个数据集中有一个具有超过0.05的P阈值。(规范途 径来自常见的信号转导和代谢途径数据库，例如Science STKE和KEGG。 功能以Gene Ontology (GO)数据库为基础)。对成熟的规范途径进行详细分 析，特别是显示出UP780对营养代谢的清楚影响的上层代谢途径(t叩 metabolic pathway) 。 IPA5产生的途径分析数据列于表1中。
实施例21. UP780调控的基因表达的OPCR分析从小鼠组织中提取的总RNA通常超出微阵列试验的需要。因 此，将用于微阵列的相同的总RNA样品保藏，以用于对微阵列结果的QPCR 确认，其通常在数月后进行。通常将总RNA贮存在-8(TC的冰箱中，且在 长期贮存后未发现降解。为了使用总RNA进行cDNA合成的逆转录反应， 使用了改进的逆转录酶SuperscriptIII，以及缓冲液、核苷酸、寡(dT》引物 以及无RNAse的DNAseI，以上为Invitrogen为Superscript III提供的试剂。对于每个反应，在50 的反应体积中使用5吗的总RNA。用水将第一链 cDNA稀释至2.5倍体积，且每50^il的QPCR反应使用2W的cDNA。在 使用前通过DNA测序分析确认用于各个基因的TagMan Gene Expression Assay的ABI引物和探针组。所有的探针均为FAM染料标记的MGB探针。 在QPCR反应中使用来自ABI的2X TagMan Universal PCR Master Mix。使 用ABI 7700测序检测器进行热循环和检测，且通过ABI SDS软件进行设 备控制并获取QPCR数据。使用AADt的相对定量法，且每个QPCR96孔 板包含对照cDNA(LC)和对照引物，以及管家基因GAPDH的探针组。
实施例22. UP780的安全性评价从USDA授权的实验室动物供应商Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA)购买专门培养的CD-I小鼠。在收到动物后使其适应 环境1周，并在8周龄时用于研究。以12小时的光照一黑暗循环将动物饲 养在温度受控的空间(22.2'0中，并提供饲料和水，供其随意取食。在处理第1天，在给药前测量基线体重，此后至尸检日前每 周测量体重两次。使用注射器和18号球顶喂食针，连续14天向处理组 (n=10， 5雄5雌)中的所有小鼠口服给药含2.0g/kg UP780(Lo估 L1806QMAW-01)剂量的200 pl水运载体。对照组(11=10， 5雄5雌)仅接受 200 jal7乂。在试验前以及试验期间的每一天进行系统性的临床观察。监 测动物的毒性体征，包括被毛、皮毛、眼睛、粘膜、运动力、呼吸、体态 的变化以及其他的异常体征。对所有药物毒性体征进行临床观察，例如颤 抖、痉挛、腹泻、嗜睡、发病、肌束抽搐、脱毛、流涎、出脓和脱水。在 试验的最后一天，以2 L/分钟的氧气流速通过2%的异氟烷麻醉所有动物， 收集血液并送至Antech Diagnostics, Inc (Portland, OR)进行全面的哺乳动物 检测。将全血样品(淡紫色盖的Microtainer中)用于血液学评价，将血浆(带 分离凝胶的绿色盖Microtainer中)用于临床化学评估。给所有动物抽血，并 检查大体病理情况。打开体腔后，立即对器官进行大体检查，并收集食道、
68胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、肝脏、直肠、脑(多个切片)、
垂体、末梢神经和肌肉(髋部)、脊髓(3个水平)、眼睛、肾上腺、甲状腺/ 副甲状腺、胰腺、肺和气管、喉、大动脉(胸部)、心脏、淋巴结(颈&肠系 膜)、脾、胸腺、肾脏、膀胱、睾丸、附睾、精囊、前列腺、子宫颈、卵巢、 子宫、胆囊、腿骨关节、皮肤、唾腺和舌的组织样品，用10%的中性缓冲 福尔马林固定，并送往Research Pathology Services Inc (New Britain, PA)以 进行用于显微评估的组织病理制备。来自临床化学、血液学、体重和食物消耗的所有非离散数据 均以平均值和标准差的形式列出。基于所发现的病理学、异常体征和数据 的统计评估对结果进行解释。将pO.OOOl的肝脏基因表达差异标记为上调(T)和下调U)_
基因描述 -肝脏(基因表达差异倍数) LUP/LVLUP/LC LV/LC脂肪酸生物合成
ACC2Acetyl-CoA羧化酶2丄3.01丄2.54
FASN脂肪酸合成酶丄3.50丄2.33".5
ASCL3Acyl-CoA合成酶，长链3丄2.07丄1.49T 1.39
ACSS2Acyl-CoA合成酶，短链2i 1.63丄2.63i 1.62
SCD1硬脂酰-CoA去饱和酶丄4.44丄3.94
FADS2脂肪酸去饱和酶2丄3.24丄1.39".34
ME1苹果酸酶1丄2.27丄2.03
ACYLATP拧檬酸裂解酶丄1.85丄1.57
脂肪酸的线粒体B-氧化
ALDH1B1醛脱氢酶1B1丄2.82丄1.75T 1.61
CPT1A肉毒碱棕榈酰转移酶1A丄1,86T 1.98
LCHAD用于P-氧化的三功能蛋白质，a丄1.57T 1.49
亚基
ACOT1ACYL-COA硫酯酶1丄5.87丄3.04卞1.93
类固醇生物和成
SREBF1固醇调节元件结合转录因子1丄2.38丄1.60T 1.49
画GCR3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原丄1.54i2.37丄1.54
MVD甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶丄2.36丄2.06
CYP26A1细胞色素P450，、视黄酸，药物代丄2.88丄6.53丄2.27
CYP7B1细胞色素P450，胆汁合成"T 1.94T 1.91
糖异生作用
PEPCK1磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1T 1.89" 06
脂肪转运
CD36凝血栓蛋白受体，长链脂肪酸转丄2.67i 1.25".14
运体
FABP5脂肪酸结合蛋白5丫 1.74丄1.67丄2.89
FABP4脂肪酸结合蛋白4个2.19卞2.43
LDLRLDL受体丄2.89i 1.60T 1.80
PPARa过氧化物酶体增殖物激活受体-a丄2.48".11
异生素的代谢
CYP2B9细胞色素P450丄20.83丄1.68T 11.88
CYP2C18细胞色素P450丄2.98丄2.60
GSTA5谷胱甘肽-S-转移酶A5]_ 1.67丄4.08丄2.10
SOD3超氧化物歧化酶3，细胞外丄2.05丄1.37T 1.50
权利要求
1.用于提高脂肪细胞的脂连蛋白生产的方法，其包括向有此需要的对象给药有效量的色酮或色酮的混合物；其中所述色酮或色酮的混合物选自具有以下结构的化合物组其中R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自以下组中-H、-OH、-CH3、-SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羟基烷基、羟基烯基、-OCH3、-SCH3、-OR、-SR、-NH2、-NRH、-NR2、-NR3+X-，选自没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯中的酯；以及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧与色酮相连，且其中所述己糖或戊糖选自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、己酮醣及其化学衍生物；包括二聚体、三聚体及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链，并在不同的位置具有和/或不具有双键和选自-OH、＝O和-OR的取代基；X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根；和R为具有1-20个碳原子的烷基基团，和药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述色酮或所述色酮的混合物选自具有以下通式结构的化合物组<formula>formula see original document page 3</formula>其中，R。 R2和R3的定义如上所述。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述色酮选自芦荟苦素或aloesinol。
4. 如权利要求1所述的方法，其中所述色酮从植物部分分离或通过合 成方法获得。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述植物选自由以下属组成的组 金合欢属、水团花属、芦荟属、链格孢属、崖摩属、五月茶属、蒿属、岗 松属、决明属、书带木属、蛇床属、旋花属、淫羊藿属、鸡头薯属、艾里 奥斯特门属、番樱桃属、藤黄属、金丝桃属、钟萼草属、全能花属、青霉 菌属、蓼属、尸toera矽/o"、大黄属、槐属、冠网蝽属、蒲桃属、篮状菌属 禾口 Zo"an'a。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述植物选自以下组中儿茶、金 合欢、木立芦荟、巴巴多斯芦荟、J/oe C,^W2印/H7fl、好望角戸荟、皂质戸荟、库拉索声荟、中华声荟、JW/cfesma mew6ra"acew附、茵陈蒿、岗松、 箭叶淫羊藿、爪哇凤果、地耳草、虎杖、毛苦参和5^p/wm'他Ao^^ew^/。
7. 如权利要求4所述的方法，其中所述植物部分选自由以下组成的组 茎、茎皮、干、干皮、嫩枝、块茎、根、根皮、幼芽、种子、根茎、花和 其它生殖器官、叶和其它气生部分。
8. 如权利要求1所述的方法，其中所述色酮组合物包含0.01%至100% 的色酮。
9. 如权利要求1所述的方法，其中所述组合物以选自0.01-500 mg/kg 体重的剂量给药。
10. 如权利要求1所述的方法，其中给药途径选自以下组中在适合 的药物制剂中口服给药、局部给药、栓剂、静脉内给药、皮内给药、胃内 给药、肌肉内给药、腹膜内给药和静脉内给药。
11. 使高脂肪饮食诱导的有关脂肪酸生物合成、脂肪酸的线粒体卩-氧化、类固醇生物合成、糖异生作用、脂肪转运、PPARa/RXRa肝信号转 导和异生素代谢的基因表达变化正常化的方法，所述方法包括向有此需要 的对象给药有效量的包含色酮或色酮混合物的组合物。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所述色酮或色酮的混合选自具 有以下结构的化合物组R" R2、 R3、 R4、 R5和Re独立地选自以下组中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、烯基、氧代烷基、氧代烯基、羟基烷基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X-，选自没食子酸酯、乙酸酯、肉 桂酰基酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯中的酯；以 及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧与色酮相连，且 其中所述己糖或戊糖选自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化学 衍生物；包括二聚体、三聚体及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链， 并在不同的位置具有和/或不具有双键和选自-OH、 K)和-OR中的取代基；X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括羟基、氯离子、碘离子、 硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根；和R为具有l-20个碳原子的烷基基团，和药学上可接受的载体。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述色酮或所述色酮的混合选 自具有以下通式结构的化合物组<formula>formula see original document page 5</formula>其中，Rp R2和R3的定义如上所述。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述色酮选自芦荟苦素或 aloesinol。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述色酮从植物部分分离或通 过合成方法获得。
16. 如权利要求15所述的方法，其中所述植物选自由以下属组成的组金合欢属、水团花属、芦荟属、链格孢属、崖摩属、五月茶属、蒿属、 岗松属、决明属、书带木属、蛇床属、旋花属、淫羊藿属、鸡头薯属、艾 里奥斯特门属、番樱桃属、藤黄属、金丝桃属、钟萼草属、全能花属、青 霉菌属、蓼属、Ptoera:^/o"、大黄属、槐属、冠网蝽属、蒲桃属、篮状菌 属和Zo""n》。
17. 如权利要求15所述的方法，其中所述植物选自以下组中儿茶、 金合欢、木立卢荟、巴巴多斯卢荟、X/oe crem"o; /H7a、好望角戸荟、皂质 卢荟、库拉索戸荟、中华卢荟、爿w"cferma we/w6rawacew/w、茵陈蒿、岗松、 箭叶淫羊藿、爪哇凤果、地耳草、虎杖、毛苦参和5^p/za"zto Aodoafew士/。
18. 如权利要求15所述的方法，其中所述植物部分选自以下组中 茎、茎皮、干、干皮、嫩枝、块茎、根、根皮、幼芽、种子、根茎、花和 其它生殖器官、叶和其它气生部分。
19. 如权利要求11所述的方法，其中所述色酮组合物包含0.01%至 100%的色酮。
20. 如权利要求11所述的方法，其中所述组合物以选自0.01-500 mg/kg体重的剂量给药。
21. 如权利要求11所述的方法，其中给药途径选自以下组中在适 合的药物制剂中口服给药、局部给药、栓剂、静脉内给药、皮内给药、胃 内给药、肌肉内给药、腹膜内给药和静脉内给药。
22. 用于预防和治疗胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢 综合征、血脂异常和高甘油三酯血症的方法，所述方法包括向有此需要的 对象给药有效量的包含色酮或色酮混合物的组合物。
23. 如权利要求22所述的方法，其中所述色酮或色酮的混合物选自 具有以下结构的化合物组<formula>formula see original document page 7</formula>Ri、 R2、 R3、 R4、 Rs和R6独立地选自以下组中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、 烷基、烯基、氧代垸基、氧代烯基、羟基垸基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X'，选自没食子酸酯、乙酸酯、肉 桂酰基酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯中的酯；以 及己糖或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧与色酮相连，且 其中所述己糖或戊糖选自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化学 衍生物；包括二聚体、三聚体及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链， 并在不同的位置具有和/或不具有双键和选自-OH、 =0和-OR中的取代基；X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括羟基、氯离子、碘离子、 硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根；和R为具有l-20个碳原子的烷基基团，和药学上可接受的载体。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述色酮或所述色酮的混合物 选自具有以下通式结构的化合物组<formula>formula see original document page 8</formula>其中，Rp R2和R3的定义如上所述,
25.如权利要求22所述的方法，其中所述色酮选自芦荟苦素或 aloesinol。
26. 如权利要求22所述的方法，其中所述色酮从植物部分分离，或 通过合成方法获得。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述植物选自由以下属组成的 组金合欢属、水团花属、芦荟属、链格孢属、崖摩属、五月茶属、蒿属、 岗松属、决明属、书带木属、蛇床属、旋花属、淫羊藿属、鸡头薯属、艾 里奥斯特门属、番樱桃属、藤黄属、金丝桃属、钟萼草属、全能花属、青 霉菌属、蓼属、户&erax;;/o"、大黄属、槐属、冠网蝽属、蒲桃属、篮状菌 属禾卩Zowor/ao
28. 如权利要求26所述的方法，其中所述植物选自以下组中儿茶、 金合欢、木立戸荟、巴巴多斯戸荟、J/oe cwmm^Ma、好望角芦荟、皂质 戸蔡、库拉索卢签、中华声荼、Jw^5fes附a附e附6rawacew附、茵P东嵩、岗松、 箭叶淫羊藿、爪哇凤果、地耳草、虎杖、毛苦参和5fep/2a"/to T^ocfocfe^H。
29. 如权利要求26所述的方法，其中所述植物部分选自由以下组成 的组茎、茎皮、干、干皮、嫩枝、块茎、根、根皮、幼芽、种子、根茎、 花和其它生殖器官、叶和其它气生部分。
30. 如权利要求22所述的方法，其中所述色酮组合物包含0.01%至 100%的色酮。
31. 如权利要求22所述的方法，其中所述组合物以选自0.01-500 mg/kg体重的剂量给药。
32. 如权利要求22所述的方法，其中给药途径选自以下组中在适 合的药物制剂中口服给药、局部给药、栓剂、静脉内给药、皮内给药、胃 内给药、肌肉内给药、腹膜内给药和静脉内给药。
33. 通过混合以下成分形成的组合物a) 90-99重量％的芦荟胶粉或芦荟全叶胶粉；和b) l-10重量％的一种或多种色酮的混合物；其中所述色酮的混合物为 基本上纯的，且所述色酮的混合物基本不含蒽醌。
34 如权利要求33所述的组合物，其中所述芦荟胶粉或芦荟全叶胶 粉分离自巴巴多斯芦荟或库拉索芦荟，且所述色酮的混合物分离自好望角 芦荟。
35. 如权利要求33所述的组合物，其中所述色酮或所述色酮的混合 物选自具有以下通式结构的化合物组<formula>formula see original document page 10</formula>其中R!、 R2和R3独立地选自以下组中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、垸基、 烯基、氧代垸基、氧代烯基、羟基垸基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、-OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X-，选自没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基 酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯中的酯；以及己糖 或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧与色酮相连，且其中所 述己糖或戊糖选自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化学衍生物； 包括二聚体、三聚体及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链， 并在不同的位置具有和/或不具有双键和选自"OH、 K)和-OR中的取代基；X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括羟基、氯离子、碘离子、 硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根；和R为具有l-20个碳原子的垸基基团，和药学上可接受的载体。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述色酮选自芦荟苦素或 aloesinol 。
37.通过混合以下成分形成的组合物a) 95-99重量％的芦荟胶粉或芦荟全叶胶粉；和b) l-5重量％的一种或多种色酮的混合物；其中所述色酮的混合物为基 本上纯的，且所述色酮的混合物基本不含蒽醌。
38. 如权利要求37所述的组合物，其中所述芦荟胶粉或芦荟全叶胶 粉分离自巴巴多斯戸荟或库拉索芦荟，且所述色酮的混合物分离自好望角 芦荟。
39. 如权利要求37所述的组合物，其中所述色酮或所述色酮的混合 物选自具有以下通式结构的化合物组<formula>formula see original document page 11</formula>其中R。 R2和R3独立地选自以下组中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、 烯基、氧代烷基、氧代烯基、羟基垸基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、-OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -N^l—,选自没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基 酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯中的酯；以及己糖 或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧与色酮相连，且其中所 述己糖或戊糖选自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化学衍生物； 包括二聚体、三聚体及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链， 并在不同的位置具有和/或不具有双键和选自-OH、 =0和-011中的取代基；X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括羟基、氯离子、碘离子、 硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根；和R为具有l-20个碳原子的烷基基团，和药学上可接受的载体。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述色酮选自芦荟苦素或 aloesinol 。
41.通过混合以下成分形成的组合物<formula>formula see original document page 12</formula>a) 98-99重量。/。的芦荟胶粉或芦荟全叶胶粉；和b) 1-2重量％的一种或多种色酮的混合物；其中所述色酮的混合物为基 本上纯的，且所述色酮的混合物基本不含蒽醌。
42 如权利要求41所述的组合物，其中所述芦荟胶粉或芦荟全叶胶 粉分离自巴巴多斯芦荟或库拉索芦荟，且所述色酮的混合物分离自好望角 芦荟。
43.如权利要求41所述的组合物，其中所述色酮或所述色酮的混合 物选自具有以下通式结构的化合物组其中Ri、 R2和R3独立地选自以下组中-H、 -OH、 -CH3、 -SH、烷基、 烯基、氧代烷基、氧代烯基、羟基烷基、羟基烯基、-OCH3、 -SCH3、 -OR、 -SR、 -NH2、 -NRH、 -NR2、 -NR3+X-，选自没食子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基 酯和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯中的酯；以及己糖 或戊糖，其中所述己糖或戊糖通过碳、氮、硫或氧与色酮相连，且其中所 述己糖或戊糖选自戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮醣及其化学衍生物; 包括二聚体、三聚体及其他聚合的色酮；其中所述烷基和/或烯基基团为具有1-20个碳原子的直链和/或支链， 并在不同的位置具有和/或不具有双键和选自-OH、 =0和-OR中的取代基；X选自药学上可接受的一组反荷阴离子，包括羟基、氯离子、碘离子、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟离子、碳酸根；和R为具有l-20个碳原子的烷基基团，和药学上可接受的载体。
44. 如权利要求43所述的组合物，其中所述色酮选自戸荟苦素或 alocsinol o
45. 包含芦荟胶粉或芦荟全叶胶粉和1-10重量％的一种或多种色酮 的组合物；其中所述组合物基本不含蒽醌，且其中所述芦荟胶分离自选自 巴巴多斯芦荟或库拉索芦荟的植物；且其中所述一种或多种色酮分离自好 望角芦荟。
46. 包含芦荟胶粉或芦荟全叶胶粉和一种或多种色酮的混合物的组 合物的制备方法，所述方法包括a. 制备包含一种或多种色酮的混合物的组合物；其中所述一种或多种 色酮的组合物为基本上纯的，且基本不含蒽醌；和b. 将步骤a)所述的组合物与芦荟胶粉或芦荟全叶胶粉以1-10重量％的 所述色酮混合物和90-99重量％的芦荟胶粉或芦荟全叶胶粉的比例组合。
全文摘要
本发明描述了来自植物来源的色酮和新型色酮组合物的鉴定和分离，所述色酮和新型色酮组合物上调脂肪细胞的脂连蛋白生产，并使与葡萄糖和脂肪酸代谢及信号转导相关的上百个基因正常化。所述色酮组合物可有效增强脂肪细胞的脂连蛋白生产，并且调控参与脂肪酸生物合成、脂肪酸的线粒体β-氧化、类固醇生物合成、糖异生作用、脂肪运输、PPARα/RXRα肝信号转导和异生素代谢的基因。该色酮组合物可用于提高哺乳动物中的胰岛素敏感性、改善葡萄糖耐受、降低甘油三酯水平以及平衡葡萄糖水平。本发明还包括用于预防和治疗多种疾病和病症的方法，所述疾病和病症包括但不限于胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、血脂异常和高甘油三酯血症。
文档编号A61K31/35GK101631544SQ200880007809
公开日2010年1月20日 申请日期2008年1月9日 优先权日2007年1月9日
发明者J·郑-克兰克, M·伊玛姆, 琦 贾, 赵吉福 申请人:尤尼根制药公司