lgE分子的结合成员的制作方法

专利名称：：lgE分子的结合成员的制作方法
技术领域：
：本发明涉及IgE的结合成员，特别是抗体分子。结合成员尤其可用于治疗IgE介导的疾病，包括过敏碎和津喘。IgE是免疫球蛋白家族的成员，能介导变态反应如哮喘、食物过敏、I型超敏反应和鼻窦炎。IgE由B细胞分泌和表达在其表面上。简言之，IgE通过跨膜结构域锚定在B细胞膜中，^争膜结构域通过短的膜结合区域与成熟IgE分子链接。IgE还可通过其Fc区，经由低亲和力IgE受体(FcsRII，也称CD23)，与B细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和血小板结合。在暴露于过^:原时，能产生过壽t原特异性IgE的B细胞被克隆扩增。过敏原特异性IgE然后被B细胞释放到循环中，它在循环中又通过FceRII被B细胞结合，和通过高亲和力受体(FcsRI)被肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合。这些肥大细胞和嗜碱性粒细胞因此变得对过敏原敏感。随后暴露于过敏原就会交联肥大细胞和嗜^喊性粒细胞上的FcsRI,从而激活这些细胞释放出造成临床超敏反应和过敏性反应的组胺和其他因子。能抑制与/^E^/的结合和通过R必W发生的功能活性、并且有或没有同时抑制FcERII的作用的结合成员，可用于抑制IgE介导的疾病状况，如过敏症和哮喘。通常认为，FceRI和FcsRII结合IgE恒定(Fc)结构域中的识别位点。已进行了各种鉴定这些识别位点的研究。例如，对应于IgE分子的特异性部分的肽已被用作IgE-受体结合的竟争性抑制剂(Burt等人,Eur.J.Immun,17:437-440[1987];Helm等人，Nature,331:180-183[1988];Helm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,86:9465-9469[1989〗；6Vercelli等人,Nature,338:649-651[1989];Nio等人，PeptideChemistry:203-208[1990]),或者用来引发可阻断IgE-受体相互作用的抗IgE抗体(Burt等人，Molec.Immun.24:379-389[1987];Robertson等人，Molec.Immun.,25:103-113[1988];Baniyash等人，Molec.Immun.25:705-711[1988])。最近，Xolair⑧(奥马佐单抗)已生产并上市，用来治疗哮喘患者。Xolair⑧是人源化IgGlk单克隆抗体，它能选择性结合人IgE,从而降低IgE与至少肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的FceRI的结合。通过降低带有FcsRI的细胞上的表面结合IgE，Xolair⑧能一定程度地降低变态反应介导物的释放程度。Xolair⑧在国际专利申请公开号WO93/04173和WO97/04807中公开。但是，还需要其他的IgE结合成员，例如那些亲和力和/或效价(potency)比Xolair⑧高的结合成员，来推进这个有前途的治疗策略。发明简述通过采用适当设计的选择技术和测定法，我们开发了能抑制与Fc五^/(肥大细胞上存在的高亲和力IgE受体)的结合和通过Fc五^/发生的功能活性、并且有或没有同时抑制FcERII的作用的结合成员。本发明的结合成员能抑制与/^Ei/的结合和通过Fc5^/发生的功能活性、并且有或没有同时抑制FcERII的作用。对结合的抑制可以是通过直接抑制进行，例如通过中和IgE进行。由例如RBL-ER51钙信号转导测定法测出，本发明的结合成员通常以小于约10nM的IC50中和人IgE。在某些实施方案中，由RBL-ER51钙信号转导测定法测出，本发明的结合成员以小于约lnM、或者小于约0.5nM、或者小于约0.2nM的IC50中和人IgE。本发明的结合成员还可结合和中和非人IgE,即在人类以外的物种中天然存在的IgE直向同源物(ortholog)。本发明的结合成员对IgE的特异性通常高于对其他免疫球蛋白的特异性，因此能选择性结合IgE。这种选择性可例如在标准的竟争测定中测出或显示出。结合成员可用于治疗和/或预防IgE介导的疾病，特别是过敏症和哮喘。和用于抑制过敏原引起的肥大细胞脱粒。结合成员进一步可在体内或体外用于抑制与尸C五W结合的IgE所介导的生物反应，并且有或没有同时抑制与FcERII结合的IgE所介导的生物反应的作用。本发明的结合成员还具有诊断用途，如用于检测目的样品如哞喘或过敏症患者样品中IgE的存在与否或数量，或者过敏原特异性IgE的存在与否或数量。可用任何合适的方法测定被结合成员结合的残基的序列。例如，可使用肽结合扫描法，如本文别处详细描述的基于PEPSCAN的酶联免疫测定法(ELISA)。在肽结合扫描如PEPSCANSystems所提供的那种肽结合扫描中，对衍自抗原的短重叠肽进行系统筛选，确定是否能与结合成员结合。可将肽共价偶联到载体表面以形成肽阵列。肽可以处于线性构象或约束构象(constrainedconformation)。约束构象可用在肽序列的每一端具有末端Cys残基的肽产生。可将Cys残基直接或间接地共价偶联到载体表面，使得肽保持处于成环构象(loopedconformation)。因此，该方法中使用的肽可在对应于抗原的片断的肽序列的每一端加上Cys残基。还可使用双环肽，其中另外有一个Cys残基位于肽序列中部或中部附近。可将Cys残基直接或间接地共价偶联到载体表面，使得肽形成双环构象，中央Cys残基的每一侧各有一个环。肽可以合成产生，因此可将Cys残基工程设计在期望的位置，尽管这在IgE序列中不天然出现。任选地，可在肽结合测定中同时筛选线性肽和约束肽。肽结合扫描可涉及到鉴定(例如使用ELISA)结合成员所结合的一组肽，其中这些肽具有对应于IgE的各片断的氨基酸序歹'K例如IgE的约5、10或15个连续残基的肽)，和将各肽进行比对以确定被结合成员结合的残基的足迹(footprint),其中该足迹包含各重叠肽共有的残基。抑或或者另外，肽结合扫描方法可涉及鉴定结合成员以至少给定信噪比所结合的肽。用于测定结合情况的合适的肽结合扫描方法的细节是本领域知道的。其他本领域公知和可用来测定被抗体结合的残基和/或确认肽结合扫描结果的方法，包括定点诱变、氲氖交换、质谱、NMR和X射线结晶学。本发明的结合成员可以或可不结合和/或中和IgE变体。因此，或没有同时抑制FcERII的作用。可采用IgE的线性表位序列，例如是包含它们的分离肽片断或多肽，来鉴定、产生、分离和/或试验本发明的结合成员。如下文更详细地描述，已证实本发明的结合成员能以高效价中和IgE。中和是指IgE的生物活性的抑制。本发明的结合成员可中和IgE的一种或多种生物活性，但通常抑制IgE与Fc五^/的结合，且有或没有同时抑制与FcERII的结合的作用。对IgE与FcERI的结合的中和作用并且有或没有对FcERII的同时抑制作用，可任选作为受体的生物活性如过敏原引起的肥大细胞脱粒的函数进行测量。用于测量本发明结合成员对IgE的中和作用的合适测定法，包括例如配体受体生化测定法和表面等离振子共振(SPR)(例如BIACORE)。生物活性的抑制可以是部分抑制或全部抑制。对于IgE生物活性如受体结合或肥大细胞脱粒，相比于结合成员不存在下的该活性，结合成员可抑制该活性达100%，或者达至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。结合成员的中和效价通常用ICso值(单位nM)表示，除非另有规9定。在功能测定中，ICso是能使生物反应减少达其最大值的50°/。的结合成员浓度。在配体结合研究中，ICso是能使受体结合减少达其最大特异性结合水平的50%的浓度。ICso可如下计算将°/。最大生物反应作为结合成员浓度对数的函数进行作图，使用诸如Prism(GraphPad)的软件程序将sigmoidal函数与数据拟合，以得到ICso值。效价可用技术人员知道的和/或本文描述或提到的一种或多种测定法进行测定或测量。结合成员的中和效价可用几何平均值(geomean，也称geometricmean)表示。本文所用的几何平均值是指数据集的对数值的平均值，换算回底数10数字。这要求有至少两个测量值，例如至少2次、优选至少5次、更优选至少10次重复。本领域技术人员会认识到，重复次数越多，几何平均值值将越可靠。重复次数的选择可由本领域技术人员决定。在本文描述的测定中结合成员对IgE活性的中和作用，表示结合成员能结合和中和IgE。其他可用来测定结合成员与IgE的结合的方法，包括ELISA、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、亲和层析法和生化测定法。本发明的另一个实施方案提供对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，该结合成员结合血清中免疫球蛋白E的IC50比Xolair低至少10倍，或者低至少20倍、低至少50倍、低至少75倍、低至少100倍、低至少125倍、低至少150倍、低至少200倍、低至少300倍、低至少400倍或者低至少500倍。可将使用来自第一物种(例如人类)的IgE在某测定中计算出的结合成员中和效价，与使用来自第二物种(例如食蟹猴)的IgE在相似测定中在相似条件下得出的结合成员中和效价进行比较，以评估结合成员对两种物种的IgE的交叉反应性程度。或者，如本文别处更详细描述的，可在竟争性结合测定中评估交叉反应性。本发明的结合成员在人IgE结合或生物测定中的中和效价，可大于在使用来自人类以外的物种的IgE进行的相似测定中的中和效价。因此，结合成员在某测定中与人IgE的中和效价，可大于在相似测定中与人类以外的物种的IgE的中和效价。在人IgE结合或生物测定中的效价，可例如比采用食蟹猴IgE的相似测定中的效价高约5倍，或者在另一个实施方案中，可高约15或20倍。更具体的说，对于25ng/ml的人IgE的浓度，可测定在人RBL-ER51钙信号转导测定中的效价，并与用100ng/ml食蟹猴IgE在其他方面相似的条件下所得的效价进行比较。表2b显示了用人IgE和食蟹猴IgE在相似的RBL-ER51钙信号转导测定中获得的数据的实例。本发明的结合成员对人IgE的亲和力可比对其他物种IgE的亲和力强。结合成员对人IgE的亲和力可例如比对食蟹猴IgE的亲和力强约5或10倍，或者在另一个实施方案中，可强约100倍。表2a和b显示了人和食蟹猴IgE所获得的数据的实例。本发明的结合成员在例如RBL-ER51钙信号转导测定中，在25ng/ml的人IgE浓度下，可具有约10nM或以下的IgE中和效价或IC5o。或者，IC5o小于约3nM。在其他实施方案中，IC5o小于约1nM,或者小于约0.5nM,或者小于约0.2nM。本发明的另一个实施方案提供对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，该结合成员对RBL-ER51细胞中25ng/mlIgE所诱导的钙信号转导的抑制的IC50几何平均值小于lnM，或者小于0.6nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于O.lnM。人IgE的IgE结合成员的结合动力学和亲和力(以平衡解离常数KD表示)，可利用表面等离振子共振(BIACORE)进行测定。本发明的结合成员对人IgE的亲和力(KD)通常小于约10nM,在一些实施方案中KD小于约5nM,在其他实施方案中KD小于2nM。对食蟹猴IgE的亲和力通常小于约20nM,在一些实施方案中KD小于约10nM。有多种方法可供用来测量抗体与其抗原的结合亲和力，其中一种方法是KinExA。动力学排除测定(KineticExclusionAssay,KinExA)是一种通用的免疫测定平台(基本上是流式分光荧光计)，它能够测量抗原/抗体相互作用的平衡解离常数及締合和解离速率常数。由于KinExA是在达到平衡后进行的，它是用来测量多价抗原/mAb相互作用的KD的有利技术。抗体与IgE分子的结合是与多价抗原的结合的一个实例。当多价抗原意味着形成包含超过一个抗体和超过一个抗原的抗体和抗原多聚体时，使用KinExA特别适宜。在这种复杂相互作用模型中，准确估计Ko可能很困难。KinExA方法可按Drake等人，(2004)AnalyticalBiochemistry328,35-43中所述进行。由KinExA方法测出，抗体11的K。为6.3pM,比Xolair丁M的353pM的K。低得多。本发明的另一个实施方案提供对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其Kd用KinExA方法测出为300pM或更低。或者，KD为200pM或以下、100pM或以下、50pM或以下、20pM或以下或者10pM或以下。体内的内源IgE可被糖基化，因此糖基化人IgE是人类治疗的治疗耙标。虽然重组人IgE——其可能由细菌所衍生和没有糖基化——可用于本文描述的测定中，但本发明的结合成员可结合糖基化人IgE,例如由骨髓瘤细胞系如U266.B1产生的IgE。这代表着本发明结合成员的显著优点，因为对于人体内应用而言糖基化人IgE是靶标抗原。本发明的结合成员可包含抗体分子，优选人抗体分子或人源化抗体分子。在本发明的一个方面，抗体分子是单克隆抗体。抗原结合位点通常由可变重链(VH)和可变轻链(VL)免疫球蛋白结构域形成，其中抗原结合界面由六个称为互补决定区(CDR)的表面多肽环形成。每个VH和每个VL都有三个CDR,分别为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3,还有构架区(FR)。本发明的结合成员通常包含抗体VH和/或VL结构域。本发明的VH结构域包含一组HCDR,VL结构域包含一组LCDR。抗体分子可包含抗体VH结构域和构架，其中VH结构域包含VHCDR1、CDR2和CDR3。抑或或者另外，它可包^^抗体VL结构域和构架，其中VL结构域包含VLCDRl、CDR2和CDR3。本发明的抗体VH结构域(SEQIDNO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、288、300和306)和抗体VL结构域(SEQIDNO:318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378和380)以及CDR(SEQIDNO:3-5、8-10、13-15、18-20、23-25、28-30、33-35、38-40、43-45、48-50、53-55、58-60、63-65、68-70、73-75、78-80、83-85、88-90、93-95、98-100、103-105、108-110、113-115、118-120、123-125、128-130、133-135、138-140、143-145、148-150、153-155、158-160、163-165、168-170、173-175、178-180、183-185、188-190、193-195、198-200、203-205、208-210、213-215、218-220、223-225、228-230、233-235、238-240、243-245、248-250、253-255、258-260、263-265、268-270、273-275、278-280、283-285、296-298、289-291、296-298、301-303、307-309和314-316)的实例，在构成本公开内容的一部分的所附序列表中列出(另见表3a)。更多的CDR在下文和表1中公开。所有本文公开的VH和VL序列、CDR序列、各组CDR和各组HCDR和各组LCDR，代表了本发明的各个方面和各个实施方案。如本文所述，"一组CDR，，包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，一组LCDR是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除另有规定外，"一组CDR，，包括HCDR和LCDR。或者，本发明的结合成员可包含非抗体分子当中的抗原结合位点，通常由非抗体蛋白质支架(scaffold)中的一个或多个CDR例如一组CDR提供，这在下文进一步讨论。13如本文所述，分离了具有表l所示的那组CDR序列的亲本抗体分子(见抗体l)。通过优化方法，我们产生了编号2-28的一批抗体克隆，其中CDR序列衍自亲本CDR序列，且在表l指出的位置处具有修饰。因此例如可从表1看出，抗体2具有亲本HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，和具有这样的亲本HCDR3序列其中Kabat残基96被S置换，Kabat残基97被L置换，Kabat残基99被S置换，和Kabat残基100被A置换。本文描述了包含表1所示的那组亲本CDR的结合成员(抗体1),其中HCDR1是SEQIDNO:3(Kabat残基31-35),HCDR2是SEQIDNO:4(Kabat残基50-65),HCDR3是SEQIDNO:5(Kabat残基95-102),LCDR1是SEQIDNO:8(Kabat残基24-34)，LCDR2是SEQIDNO:9(Kabat残基50-56)和LCDR3是SEQIDNO:10(Kabat残基89-97)。本发明的结合成员还可以是表l所示的亲本结合成员，其中一个或多个CDR具有一个或多个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入。在一些实施方案中，结合成员包含相对于抗体ll的亲本序列而言具有1-10个添加、置换、缺失和/或插入的一组CDR。在另一个实施方案中，相对于抗体11而言具有l-10个置换。在另一个实施方案中，相对于抗体1的亲本序列而言具有1-11个添加、置换、缺失和/或插入。在另一个实施方案中，相对于抗体1而言具有l-10个置换。在某些实施方案中，本发明的结合成员包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3;其中HCDR3具有SEQIDNO:5的氨基酸序列，该序列任选具有1-5个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入；LCDR3具有SEQIDNO:10的氨基酸序列，该序列任选具有l-6个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入。在这些实施方案中，HCDR1可具有SEQIDNO:3的氨基酸序列；HCDR2可具有SEQIDNO:4的氨基酸序列；LCDR1可具有SEQIDNO:8的氨基酸序列；和LCDR2可具有SEQIDNO:9的氨基酸序列。或者，、HCDR2、LCDR1和LCDR2相对于亲本序列(抗体l)而言还可共同具有一个或多个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入，如1-10个置换。本发明的结合成员可包含本文所述的一个CDR或CDR的组合。例如，本发明的结合成员可包含具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HCDR1;具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的HCDR2;具有选自SEQIDNO:5、15、25、65、75、85、95、145、155、175和255的氨基酸序列的HCDR3;具有SEQIDNO:8的氨基酸序列的LCDR1;具有SEQIDNO:9的氨基S吏序列的LCDR2;具有选自SEQIDNO:10、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、l卯、200、210、220、230、240、250、260、270和280的氨基酸序列的LCDR3。在某些实施方案中，本发明的结合成员或VH结构域包含具有一个或多个以下置换的亲本HCDR3(SEQIDNO:5):Kabat残基96被S、M或T置换；Kabat残基97被L或G置换；Kabat残基98被K置换；Kabat残基99被S、W、A、T或E置换；Kabat残基100被A或I置换。在一些实施方案中，结合成员或其VL结构域可包含其中Kabat残基94被T、R、D、P、E、N、H、Q或A置换的亲本LCDR3(SEQIDNO10)。在某些实施方案中，本发明的结合成员或VL结构域包含具有一个或多个以下置换的亲本LCDR3(SEQIDNO:10):Kabat残基94被T、R、D、P、E、N、H、Q或A置换；Kabat残基95被T、K、S、I、G、H、M、F、R、N、K或Q置换；Kabat残基95A被L、H、D、G、R、N、Q、K或E置换；Kabat残基95B被T、H、S、Y、L或N置换；Kabat残基96一皮G或A置换；Kabat残基97被P、S或G置换。在一个实施方案中，本发明是这样的结合成员，其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:103,HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:104，HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:105,LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:108，LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:109,和LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:110。例如参见表1的抗体11。本发明的还其他的实施方案，是能够与本发明的抗体如表1的抗体11竟争与人IgE的结合的结合成员如抗体分子，所述结合成员在本文描述的测定中以小于约1riM的IC50中和人IgE,或者以小于约0.5nM的IC50中和人IgE。在一些实施方案中，IC50小于约0.2nM。本发明提供包含抗体1-28中任一个抗体的HCDR1和/或HCDR2和/或HCDR3和/或抗体1-28中任一个抗体的LCDR1和/或LCDR2和/或LCDR3,例如表1所示抗体1-28中任一个抗体的一组CDR的结合成员。结合成员可包含这些抗体中的一个抗体的一组VHCDR。任选地，它还可包含这些抗体中的一个抗体的一组VLCDR，所述VLCDR可来自与VHCDR相同或不同的抗体。本发明还提供包含抗体1-28中任一个抗体的一组HCDR的VH结构域，和/或包含抗体1-28中任一个抗体的一组LCDR的VL结构域。通常，将VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合位点，不过如下文所进一步讨论，也可单独使用VH或VL结构域来结合抗原。可将抗体1VH结构域(见表l)与抗体1VL结构域配对，使得形成包含抗体1VH和VL结构域的抗体抗原结合位点。对于本文公开的其他VH和VL结构域，提供了类似的实施方案。在其他实施方案中，将抗体1VH与抗体1VL以外的VL结构域配对。轻链杂交(promiscuity)在本领域中已确立。同样，对于本文公开的其他VH和VL结构域，本发明提供了类似的实施方案。因此，可将亲本或抗体2-28中任一个抗体的VH与亲本或抗体2-28中任一个抗体的VL闺己对。结合成员可包含亲本抗体或抗体2-28中任一个抗体的一组H和/或LCDR,其中在所公开的该组H和/或LCDR当中具有多达20、16、10、9个或更少个例如1、2、3、4或5个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入。或者，结合成员可包含亲本抗体或抗体2-28中任一个抗体的一组H和/或LCDR，其中在所7>开的该组H和/或LCDR当中具有多达20、16、10、9个或更少个例如1、2、3、4或5个氨基酸置换。这种ff饰可潜在地在该组CDR当中的任何残基处作出。例如，如表l所示，可在抗体2-28中的任一个抗体中被修饰的位置处作出修饰。因此，所述一个或多个修饰可包含在以下残基处的一个或多个置换HCDR中的Kabat残基96、97、98、99和100;和LCDR中的Kabat残基94、95、95A、95B、96和97。结合成员可包含在抗体构架当中具有一个或多个CDR例如一组CDR的抗体分子。例如，可将抗体的一个或多个CDR或者一组CDR移植到构架(例如人构架)中，以提供抗体分子。构架区可以源于人种系基因序列，或者是非种系化的(non-germlined)。因此，构架可以是种系化的(germlined)，其中构架当中的一个或多个残基被改变，以匹配大多数相似的人种系构架中的对等位置处的残基。因此，本发明的结合成员可以是具有包含人种系构架例如人种系IgGVH构架中的一组HCDR的VH结构域的分离人抗体分子。结合成员还具有包含例如人种系IgGVL构架中的一组LCDR的VL结构域。VH和/或VL构架残基可如本文所讨^仑和例示进行修饰，例如用定点诱变进行修饰。本发明的VH或VL结构域，或者包含这种VL结构域的结合成员，优选具有表3的抗体的VH和/或VL结构域序列。非种系化的抗体分子与种系化的抗体分子相比，具有相同的CDR，但具有不同的构架。种系化的抗体可通过对本文所示的这些抗体的VH和VL结构域序列的构架区进行种系化来产生。本发明的结合成员，可以是与任何既能结合IgE又包含结合成员如本文7>开的VH和/或VL结构域、CDR例如HCDR3和/或一组CDR的结合成员竟争与IgE的结合的结合成员。结合成员之间的竟争可容易地在体外测定，例如用ELISA和/或通过将特异性报道分子标记(tagging)到一个结合成员来测定，所述一个结合成员能在一个或多个其他未标记的(untagged)结合成员的存在下被纟企测，以使得可以鉴定能结合相同表位或重叠表位的各个结合成员。这些方法是本领域普通技术人员容易知道的，在本文中有更详细的描述。因此，本发明的一个进一步的方面提供包含这样的人抗体抗原结合位点的结合成员，该人抗体抗原结合位点能与抗体分子例如特别是包含亲本抗体或抗体1-28中任一个抗体的VH和/或VL结构域、CDR如HCDR3或者一组CDR的抗体分子竟争与人IgE的结合。在一个实施方案中，本发明的结合成员与表l的抗体11竟争。本发明的另一个实施方案提供能结合IgE的特定区域的结合成员。结合情况可例如通过检测或者观察结合成员与IgE的残基之间的特异性相互作用来测定，所述相互作用例如在可例如用X射线晶体学方法测定的结合成员:IgE复合物的结构中。用X射线晶体学方法测定的与人IgECs3-Cs4结构域结合的抗体11的结构，给研究晶体当中抗体11Fab与IgE的两个相互作用提供了机会。IgE是二价抗原，因为存在着两条轻链和两条重链。X射线晶体学研究证实，与表位结合的Fab跨越两条IgE重链。第一个相互作用表明，抗体11的相互作用位点包含一条IgE重链的残基Glu390至Asn394包括端点在内和糖部分(sugarmoiety)GlcNAcl和Man6，和另一条IgE重链的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Glu472和糖部分Man5。本发明的一个实施方案提供对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所述结合成员能结合免疫球蛋白E中的包含以下残基的表位第一IgE重链中的残基Glu390至Asn394包括端点在内，和第二IgE重链中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Glu472;18在又一个实施方案中，所述表位进一步包含第一IgE重链的糖部分GlcNAcl和Man6和第二IgE重链的糖部分Man5。第二个相互作用表明，抗体11的相互作用位点包含第一IgE重链的残基Glu390、Gln392至Asn394包括端点在内和糖部分GlcNAcl和Man6,和第二IgE重链的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Glu472。本发明的又一个实施方案提供对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所迷结合成员能结合免疫球蛋白E中的包含以下残基的表位第一IgE重链中的残基Glu390、Gln392至Asn394包括端点在内，和第二IgE重链中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Glu472;在又一个实施方案中，所述表位进一步包含第一IgE重链中的糖部分GlcNAcl和Man6。本发明的又一个实施方案提供对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所述结合成员能结合免疫球蛋白E中的包含以下残基的表位第一IgE重链中的残基Glu390、Gln392至Asn393包括端点在内，和第二IgE重链中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Gu472;在又一个实施方案中，所述表位进一步包含第一IgE重链中的糖部分GlcNAcl和Man6。本发明的又一个实施方案提供对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，所述结合成员能结合包含来自第一IgE重链的元件和来自第二IgE重链的元件的表位。在进一步的方面，本发明提供包含与抗体抗原结合位点竟争与人IgE的结合的人抗体抗原结合位点的结合成员，其中所述抗体抗原结合位点由VH结构域和VL结构域组成，且其中所述VH和VL结构i或包含本文所公开的亲本抗体(抗体l)或者抗体2-28中任一个抗体的一组CDR。在进一步的方面，本发明提供包含编码本发明的结合成员、VH结构域和/或VL结构域的序列的分离核酸。例如，SEQIDNO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、287、299和305编码本发明的示例性VH结构域，SEQIDNO:317,319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377和379编码本发明的示例性VL结构域。本发明还包括制备本发明的结合成员、VH结构域和/或VL结构域的方法，所述方法包括在能导致产生所述结合成员、VH结构域和/或VL结构域的条件下表达所述核酸，和通过分离或纯化该结合成员进行回收。本发明的另一个方面提供编码本文所公开的VHCDR或VLCDR序列的核酸，通常是分离核酸。又一个方面提供含有或转化有本发明的核酸的宿主细胞。本发明的进一步的方面提供含有本发明的结合成员的组合物，和它们在抑制和/或中和IgE的方法中的用途，所述方法包括通过疗法治疗人或动物身体的方法。例如，本发明的结合成员可用于人或动物身体中(例如人患者中)或者体外的生物反应、疾病、病患或病症的治疗和/或预防的方法中，或者用于所述生物反应、疾病、病患或病症的诊断方法中。治疗和/或预防的方法可包括将本发明的结合成员以足以可测量地中和IgE的量给予所述患者。可按本发明进行治疗的病症包括任何其中IgE起作用的病症，如过敏症和哮喘。本发明的这些和其他的方面在下文中作更详细的描述。在这里要顺便指出的是，本文所使用的"和/或"要认为是明确公开两个指定的特征(feature)或成分(component)中的每一个加上或不加上另一个。例如"A和/或B，，要认为是明确公开(i)A、(ii)B及(iii)A和B中的每一个，犹如每一个都在本文中单独提出。IgE是免疫球蛋白E。人IgE恒定区的氨基酸序列是可公开获得的。在一些实施方案中，IgE可以是人或食蟹猴IgE。如本文别处所述，IgE可以是重组的，和/或可以是糖基化的或非糖基化的。IgE在体内天然以糖基化形式表达，例如在U266.B1细胞中。糖基化IgE还可在重组系统中表达。结合成员通常指能互相结合的一对分子中的一个成员。结合对的各成员可以是天然衍生的，或者完全或部分合成产生的。该对分子的一个成员在其表面上具有能结合从而互补于该对分子的另一个成员的特定空间和极性构造(spatialandpolarorganization)的区域，或者说空穴(cavity)。结合对的类型的实例有抗原-抗体、生物素-亲和素、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明主要涉及抗原-抗体类型的反应。结合成员通常包含具有抗原结合位点的分子。例如，结合成员可以是包含抗原结合位点的抗体分子或非抗体蛋白质。抗原结合位点可通过将CDR安排在非抗体蛋白质支架如纤连蛋白或细胞色素B等之上来提供[参考文献1，2,3]，或者通过将蛋白质支架当中的环的氨基酸残基随机化或突变以赋予对期望靶标的结合特异性来提供。Nygren等人[参考文献3]已详细综述了用于将新的结合位点工程掺入(engineer)到蛋白质中的支架。用于抗体模拟物的蛋白质支架在WO/0034784中7>开(该专利通过引用全文并入本文)，在该专利中发明人描述了包括具有至少一个随机化环的纤连蛋白III型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。其中移植一个或多个CDR例如一组HCDR的合适支架，可由免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供。支架可以是人或非人蛋白质。非抗体蛋白质支架的优点是，它可在比至少一些抗体分子更小和/或更容易制造的支架分子中提供抗原结合位点。结合成员的小尺寸可赋予有用的生理特性，如能够进入细胞、深入渗透到组织中或到达其他结构当中的靶标，或者在靶标抗原的蛋白质空穴当中结合。Wess,2004[参考文献4]综述了抗原结合位点在非抗体蛋白质支架中的应用。典型的是具有稳定骨架和一个或多个可变环的蛋白质，其中该(一个或多个)环的氨基酸序列专门地或随机地进行突变，以产生能结合靶标抗原的抗原结合位点。这种蛋白质包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)A蛋白的IgG结合结构域、转铁蛋白、四连蛋白、纤连蛋白(例如第IO个纤连蛋白III型结构域)、脂笼蛋白以及Y-晶体蛋白和其他AffilinTM支架(ScilProteins)。其他方法的实例包括基于环肽(cyclotide)(具有分子内二硫键的小蛋白质)的合成"微体"、微蛋白质(Versabodies,Amunix)和锚蛋白重复蛋白(DARPins,MolecularPartners)。这些蛋白质还包括小的工程改造的蛋白质结构域，例如免疫结构域(参见例如美国专利公开号2003082630和2003157561)。免疫结构域含有抗体的至少一个互补决定区(CDR)。除了抗体序列和/或抗原结合位点外，本发明的结合成员还可包含其他的氨基酸，例如形成肽或多肽如折叠结构域的氨基酸，或者赋予该分子除结合抗原的能力之外的另一功能特性的氨基酸。本发明的结合成员可带有可检测标记，或者可与毒素或靶向作用部分(targetingmoiety)或酶(例如通过肽键或接头)缀合。例如，结合成员可包含催化位点(例如在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中抗原结合位点能结合抗原从而将催化位点耙向抗原。催化位点可例如通过切割作用抑制抗原的生物功能。虽然如所述，CDR可由非抗体支架携带，但携带本发明CDR或一组CDR的结构通常会是抗体重链或轻链序列或它们的实质部分(substantialportion),其中该CDR或该组CDR位于与由重排免疫球CDR对应的位置处。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可参考Kabat等人，1987[参考文献5](以及可用任何互联网搜索引擎以"Kabat"找到的更新内容)进行测定。所谓CDR区域或CDR是指由Kabat等人，1991[参考文献6]和之后的各版本所定义的免疫球蛋白重链和轻链超可变区。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。本文中使用术语CDR,目的是视情况而定表示这些区域中的一个或者这些区域中的几个乃至全部，所述这些区域含有负责结合的氨基酸残基的大部分，所述结合是通过抗体对其识别的抗原或表位的亲和力进行。在六个短的CDR序列当中，重链的第三个CDR(HCDR3)具有较大的尺寸可变性(较大的多样性，基本上由产生它的基因的重排机制所致)。它可短至2个氨基酸，不过已知的最长尺寸为26个氨基酸。CDR长度还可根据可由特定的基础构架(underlyingframework)容纳的长度而变。在功能上，HCDR3在决定抗体的特异性方面起到部分作用[见参考文献7，8,9，10,11,12,13,14]。本发明的另一个实施方案提供包含选自表3a的HCDR3序列的分离结合成员。抗体分子指免疫球蛋白，不管是天然的还是部分或全部合成产生的。该术语还涵盖任何包含抗体抗原结合位点的多肽或蛋白质。这里必须理解的是，本发明不涉及天然形式的抗体，也就是说抗体不处在它们的天然环境中，而是已通过纯化从天然来源分离或获得，要不然就是通过遗传重组或通过化学合成获得，包括用非天然氨基酸修饰在内。包含抗体抗原结合位点的抗体片断，包括但不限于诸如Fab、Fab，、Fab，-SH、scFv、Fv、dAb和Fd的分子。已工程构建出各种其他的包含一个或多个抗体抗原结合位点的抗体分子，包括例如Fab2、Fab3、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。抗体分子及它们的构建和使用方法在[参考文献15]中描述。有可能采取单克隆抗体和其他抗体，使用重组DNA技术的方法，来产生其他能结合靶标抗原的抗体或嵌合分子。这种方法可涉及到将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA导入到另一免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400以及众多后续文献。可使产生抗体的杂交瘤或其他细胞经历遗传突变或其他变化，这可能改变或不改变所产生的抗体的结23合特异性。由于抗体可用多种方式进行修饰，术语"抗体分子"应被解释为涵盖任何具有带有所需的抗原特异性和/或结合力的抗体抗原结合位点的结合成员或物质。因此，这个术语涵盖包含抗体抗原结合位点的抗体片断和衍生物，包括任何多肽在内，不管是天然的还是完全或部分合成的。因此，本发明包括包含与另一多肽(例如衍自另一物种或者属于另一抗体种类或亚类)融合的抗体抗原结合位点或等价物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及众多后续文献中描述。抗体工程领域中更多的可利用的技术使得有可能分离人抗体和人源化抗体。例如，可按Kontermann&Dubel[参考文献16]所述制备人杂交瘤。噬菌体展示——另一种确立的用以产生结合成员的技术，在许多出版物中有详细描述，如Kontermann&Dubel[参考文献16]和WO92/01047(下文进一步讨论)，以及美国专利US5,969,108、US,5,565,332、US5,733,743、US5,858,657、US5,871,907、US5,872,215、US5,885,793、US5,962,255、US6,140,471、US6,172,197、US6,225,447、US6,291,650、US6,492,160和US6,521,404。其中小鼠抗体基因被失活而功能替换上人抗体基因、同时小鼠免疫系统的其他成分保持完整的转基因小鼠，可用于分离人抗体[参考文献17]。人源化抗体可用本领域熟知的技术产生，如在例如WO91/09967、US5,585,089、EP592106、US5,565,332和WO93/17105中公开的那些技术。此外，WO2004/006955描述了基于/AA抗体基因选择可变区构架序列将抗体人源化的方法，所述选择是通过将非人抗体的可变区的CDR序列的规范CDR结构类型，与一文库的(alibraryof)人抗体序列例如种系抗体基因区段的相应CDR的规范CDR结构类型进行比较来选择。与非人CDR具有相似的规范CDR结构类型的人抗体可变区，构成了可从中选择人构架序列的人抗体序列成员亚组。亚组各成员可通过人和非人CDR序列之间的氨基酸相似性进行进一步的分等级(ranked)。在WO2004/006955的方法中，选择高等级的人序列来提供构架序列，用以构建采用选定的亚组成员人构架、以非人CDR对等序列功能性替换人CDR序列的嵌合抗体，从而提供高亲和力和低免疫原性的人源化抗体，而不需要比较非人抗体和人抗体之间的构架序列。还公开了按该方法制备的嵌合抗体。合成的抗体分子可例如按Knappik等人[参考文献18]或Krebs等人[参考文献19]所述，由通过在合适表达载体当中合成和装配的寡核芬酸所产生的基因表达生产。已证实完整抗体的片断能执行结合抗原的功能。结合片断的实例有(i)由VL结构域、VH结构域、恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)组成的Fab片断；(ii)由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片断；(iii)由单一抗体的VL结构域和VH结构域组成的Fv片断；(iv)由VH结构域和VL结构域组成的dAb片断[参考文献20,21,22];(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片断，由两个连才妻的Fab片断组成的二价片断；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，该接头能让这两个结构域发生締合而形成抗原结合位点[参考文献23,24];(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)"双抗体，，，通过基因融合构建的多价或多特异性片断(WO94/13804;[参考文献25])。Fv分子、scFv分子或双抗体分子可通过掺入将VH结构域和VL结构域连接在一起的二硫键来稳定化[参考文献26]。还可制备出包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体[参考文献27]。结合片断的其他实例有Fab，和Fab，-SH,前者与Fab片断差别在于重链CH1结构域的羧基末端处添加有几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，后者是其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的Fab，片断。个分子出发，通过诸如以下的方法来获得酶消化如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，和/或通过化学还原进行的二硫#:切割。按另一种方式，传重组的技术获得，要不然就是通过借助例如自动肽合成仪(如AppliedBiosystems等公司提供的合成仪)进行的肽合成来获得，或者通过核酸合成和表达来获得。本发明的功能抗体片断包括任何其半寿期通过化学^f饰(特别是通过PEG化)或者通过掺入脂质体来延长的功能片断。dAb(结构域抗体)是抗体的小单聚抗原结合片断，即抗体重链或轻链的可变区[参考文献22]。VHdAb天然出现在駱駝科动物(camelid)(例如骆驼(camel)、美洲驼(llama)),可通过用靶标抗原免疫骆驼科动物、分离抗原特异性B细胞和从B细胞个体直接克隆dAb基因来产生。dAb也可在细胞培养中产生。它们的小尺寸、良好溶解性和温度稳定性使得它们特别在生理上有用和适合于选择和亲和力成熟。骆驼科动物VHdAb正以"nanobodies"的商品名开发用于治疗用途。本发明的结合成员可以是包含基本上如本文所给出的VH结构域和VL结构域的dAb,或者是包含基本上如本文所给出的一组CDR的VH结构i或或VL结构i或。双特异性抗体或双功能抗体构成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区结合在同一分子中[参考文献28]。它们的用途已在诊断领域和在治疗领域中，由它们募集新的效应子功能或者靶向肿瘤细胞表面上的几种分子的能力得到证明。在要使用双特异性抗体的情形中，这些抗体可以是通过多种方式制造[参考文献29]，例如化学法制备或从杂合杂交瘤制备的常规双特异性抗体，或者可以是任何上文提到的双特异性抗体片断。这些抗体可通过化学方法[参考文献30,31]或者体细胞方法(somaticmethod)[参考文献32,33]获得，但同样地和优先地通过能让异型二聚化(heterodimerization)被迫进行从而有助于所要的抗体的纯化过程的遗传工程技术获得[参考文献34]。双特异性抗体的实例包括BiTETM技术获得的那些双特异性抗体，其中两个具有不同特异性的抗体的结合结构域可被使用并通过短的柔性肽直接连接在一起。这将两个抗体组合在一条短的单一多肽链上。可仅使用可变结构域构建出没有Fc区的双抗体和scFv,这能潜在地减少抗独特型反应的作用。双特异性抗体可构建成完整IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双抗体或者双特异性scFv。此外，两个双特异性抗体可用本领域知道的常规方法连接在一起形成四价抗体。与双特异性的完整抗体不同，双特异性的双抗体还可因为它们能容易地在大肠杆菌(E.coli)中构建和表达而特别有用。具有适宜的结合特异性的双抗体(和许多其他多肽，如抗体片断)可容易地用噬菌体展示法(WO94/13804)从文库选择。如果双抗体的一个臂(arm)要保持恒定，例如对IgE的特异性，则可制备出其中另一个臂有变化的文库，并选出具有适宜特异性的抗体。双特异性的完整抗体可通过Ridgeway等人，1996[参考文献35]中所述的替代工程方法(altemativeengineeringmethod)来制备。本领域有多种方法可用来获得抗IgE抗体。抗体可以是单克隆抗体，尤其是人来源、鼠来源、嵌合来源或人源化来源的单克隆抗体，它们可按照本领域技术人员熟知的标准方法获得。一般来说，为制备单克隆抗体或者它们的功能片断，尤其是鼠来源的，可以参考在《抗体》手册[参考文献36]中具体描述的技术，或者参考K6hler和Milstein所描述的从杂交瘤的制备技术[参考文献37〗。单克隆抗体可例如从针对IgE或其含有被所述单克隆抗体识别的表位的片断之一进行了免疫的动物细胞获得。合适的片断和包含它们的肽或多肽可用来免疫动物以产生抗IgE抗体。所述IgE或其片断之一尤其可按照通常的工作方法，通过从含在编码IgE或其片断的cDNA序列中的核酸序列开始进行的遗传重组，通过从包含在IgE和/或其片断的肽序列中的氨基酸的序列开始进行的肽合成，来产生。单克隆抗体可例如在之前已固定化了含有#:所述单克隆抗体识别的表位的IgE或其片断之一的亲和柱上纯化。更具体的说，单克隆抗体可这样纯化在A蛋白和/或G蛋白上进行层析，接着进行或不进行旨在消除残余蛋白质污染物及DNA和LPS本身的离子交换层析，再接着进行或不进行旨在消除因二聚体或其他多聚体的存在所致的潜在聚集体的琼脂糖凝胶排阻层析。在一个实施方案中，全部这些技术可同时使用或者相续使用。抗原结合位点是分子中的能结合和互补于靶标抗原的全部或部分的那部分。在抗体分子中，它被称为抗体抗原结合位点，包含抗体中的能结合和互补于靶标抗原的全部或部分的那部分。抗原较大时，抗体可能只结合抗原的特定部分，该部分被称为表位。抗体抗原结合位点可由一个或多个抗原可变结构域提供。抗体抗原结合位点可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。"分离的"是指本发明的结合成员或者编码这些结合成员的核酸一般会符合本发明的这么一种状态。因此,本发明的结合成员、VH结构域和/或VL结构域及编码核酸分子和载体，可以例如从它们的天然环境分离和/或纯化而以基本上纯的或同质的(homogeneous)形式提供，或者在核酸的情形中，不含或基本上不含其来源不同于编码具有所需功能的多肽的序列的核酸或基因。分离的成员和分离的核酸将不含或基本上不含它们天然相伴的物质，如在它们的天然环境中或者制备它们的环境(例如细胞培养物)(当这种制备是通过体外或体内实施的重组DNA技术进行时)中与它们一起存在的其他多肽或核酸。成员和核酸可用稀释剂或佐剂配制，且出于实用目的仍是分离的，例如所述成员如果用来包被用于免疫测定的微量滴定板的话，通常会用明胶或其他载体混合,或者当用于诊断或治疗时，将与药物可接受的载体或稀释剂混合。结合成员可以天然糖基化或通过异源真核细胞(例如CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)的系统糖基化，或者它们可以是(例如如果在原核细胞中表达产生的话)未糖基化的。包含抗IgE抗体分子的异质制品(heterogeneouspreparation)也构成本发明的一部分。例如，这种制品可以是具有全长重链和缺乏C末端赖氨酸的重链、具有不同程度的糖基化和/或具有衍生化氨基酸(如N末端谷氨酸环化形成焦谷氨酸残基)的抗体的混合物。本文所用的词语"基本上如...所给出"是指本文所述结合成员的VH结构域或VL结构域的相关CDR的特性，将是相同于或高度类似于其序列在本文中给出的指定区域。本文针对一个或多个可变结构域的指定区域所述的词语"高度类似"，是设想到可在CDR和/或VH结构域或VL结构域中作出1至约6个，例如l-5个，包括l-3个或者1或2个或者3或4个氨基酸置换。发明详述如上所述，本发明的结合成员能调节和可中和IgE的生物活性。如本文所述，可对本发明的IgE结合成员优化中和效价。一般来说，效价优化涉及到将选定的结合成员的序列(通常是抗体的可变结构域序列)突变，以产生一文库的结合成员，然后测定它们的效价，选出效价更高的结合成员。这样选出的"效价优化的"结合成员趋向于具有比产生该文库的结合成员更高的效价。不过不进行优化也可获得高效价结合成员，例如可直接从初始筛选如生化中和测定直接获得高效价结合成员。"效价优化的"结合成员指具有经优化的对特定活性或下游功能的中和效价的结合成员。本文别处对测定法和效价有更详细的描述。本发明提供效价优化的结合成员和非效价优化的结合成员，以及用以从选定的结合成员进行效价优化的方法。本发明因此使得技术人员能产生具有高效价的结合成员。尽管可采用效价优化从给定的结合成员产生更高效价的结合成员，但还要指出的是甚至不用进行效价优化，也可获得高效价结合成口贝。在又一个方面，本发明提供获得一个或多个能够结合抗原的结合成员的方法，所述方法包括使本发明的一文库结合成员与所述抗原接触，和选择该文库的一个或多个能够结合所述抗原的结合成员。可将文库展示在颗粒或分子复合物上，例如可复制的遗传组件(geneticpackage),如酵母、细菌或噬菌体(例如T7)颗粒、病毒、细胞或者共价的、核糖体的或其他的体外展示系统，每个颗粒或分子复合构域(如果存在的话)的核酸。噬菌体展示描述于WO92/01047和例如美国专利US5,969,108、US5,565,332、US5,733,743、US5,858，657、US5,871,907、US5,872,215、US5,885,793、US5,962,255、US6,140,471、US6,172,197、US6,225,447、US6,291,650、US6,492,160和US6，521，404(每个专利都通过引用全文并入本文)。选择了能够结合抗原且^^L示在噬菌体或其他文库颗粒或分子复合物上的结合成员后，可从展示选定的结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物获取核酸。这种核酸可用于随后产生结合成员或抗体VH或VL可变结构域，产生的方式是用获自展示所述选定结合成员的噬菌体或其他颗粒或分子复合物的核酸的序列进行核酸表达。具有所述选定结合成员的抗体VH可变结构域的氨基酸序列的抗体VH可变结构域，如包含这种VH结构域的结合成员一样，可以以分离形式提供。可进一步试验IgE结合能力，还有与例如亲本抗体分子或抗体分子2-28(例如为scFv形式和/或IgG形式，例如IgGl)竟争与IgE的结合的能力。可试验IgE中和能力，这在本文别处进一步讨论。本发明的结合成员可以以亲本或其他抗体分子(例如scFv)或者抗体2-28中的一个(例如IgGl)的亲和力，或者以更好的亲和力，来结合IgE。本发明的结合成员可以以亲本或其他抗体分子或者抗体2-28中的一个(例如scFv或IgGl)的效价，或者以更好的效价，来中和IgE的生物活性。可将不同结合成员的结合亲和力和中和效价在适当条件下进行30比较。本发明的VH结构域和VL结构域和CDR的变体，包括本文给出了氨基S吏序列的那些变体和可应用于IgE结合成员的那些变体，可通过序列变化或突变方法及筛选具有期望特性的抗原结合成员的方法来获得。期望特性的实例包括但不限于'相对于对抗原有特异性的已知抗体，对该抗原的结合亲和力提高.如果活性已知的话，相对于对该抗原有特异性的已知抗体，对该抗原活性的中和作用提高.以特定的摩尔比与该抗原的已知抗体或配体的指定竟争能力*使复合物发生免疫沉淀的能力，结合指定表位的能力o线性表位，例如用本文所述的肽结合扫描所鉴定的肽序列，例如^f吏用以线性构象和/或约束构象筛选的肽。由非连续残基形成的构象表位调节IgE或下游分子的新的生物活性的能力。这些方法在本文中也提供。可产生本文公开的抗体分子的变体并在本发明中使用。可效法计算化学将多元数据分析技术应用到结构/性质-活性相互关系[参考文献38]，采用公知的数学技术如统计回归、模式识别和分类，来得出抗体的定量活性—性质相互关系[参考文献39,40,41,42,43，44]。抗体的性质可从抗体序列、功能结构和三维结构的经验和理^仑;漠型(例如，可能接触残基的分析或者计算的理化性质)得出，且这些性质可单独考虑或组合考虑。由VH结构域和VL结构域组成的抗体抗原结合位点，通常由以下六个多肽环形成三个来自轻链可变结构域(VL)，三个来自重链可变结构域(VH)。对已知原子结构的抗体的分析，已揭示了抗体结合位点的序列和三维结构之间的关系[参考文献45,46]。这些关系暗示，除了VH结构域的三个区域(环)之外，结合位点环具有少数的主链构象之一规范结构(canonicalstructure)。已证实，在特定环中形成的规范结构是由其大小和在环和在构架区中关键位点处的某些残基的存在所决定[参考文献45,46]。序列-结构关系的这个研究，可用于预测序列已知但三维结构未知的抗体中，那些在维持其CDR环的三维结构方面重要从而能维持结合特异性的残基。这些预测可通过将预测结果与先导优化实验(leadoptimizationexperiment)的结果进行比较而得到支持。在结构方法中，可用任何自由获取的或商业的软件包如WAM[参考文献48]来产生抗体分子[参考文献47]的模型。接着可用蛋白质可视化和分析软件包如InsightII(Accelrys,Inc.)或DeepView[参考文献49]来评估CDR中每个位置处的可能置换。然后可用这个信息来作出可能对活性具有最低限度的影响或有利影响的置换。在CDR、抗体VH结构域或VL结构域和结合成员的氨基酸序列当中作出置换所需要的技术，一般是本领域可获得的。可作出具有可被或不被预测到对活性有最低限度影响或有利影响的置换的变体序列，并试验其结合和/或中和IgE的能力和/或试验任何其他期望的性质。如所讨论，任何其序列在本文中明确公开的VH结构域和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体，都可按本发明采用。本发明的又一个方面是包含与表3和所附序列表所示的抗体1-28中任一个抗体的VH结构域，或者与表1所示的HCDR(例如HCDR1、HCDR2或HCDR3)有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列同一性的VH结构域的抗体分子。该抗体分子任选还可包含与抗体1-28中任一个抗体的VL结构域或者与表1所示的LCDR(例如LCDR1、LCDR2或LCDR3)有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列同一性的VL结构域。可用来计算两个氨基酸序列的。/。同一性的算法，包括例如BLAST[参考文献50]、FASTA32[参考文献51]或Smith-Waterman算法[参考文献52]，这些算法例如采用默认参数。具体的变体可包括一个或多个氨基酸序列变更(氨基酸残基的添加、缺失、置换和/或插入)。在某些实施方案中，变体具有不到约20个这些变更。-可在一个或多个构架区和/或一个或多个CDR中作出变更。变更通常不导致功能的丧失，因此包含如此变更的氨基酸序列的结合成员可保持结合和/或中和IgE的能力。例如如在本文所述的测定中测出，它可保持与其中没有作出变更的结合成员相同的定量结合和/或中和能力。包含如此变更的氨基酸序列的结合成员可具有改进的结合和/或中和IgE的能力。变更可包括用非天然或非标准氨基酸置换一个或多个氨基酸残基，将一个或多个氨基酸残基修饰成非天然或非标准形式，或者将一个或多个非天然或非标准氨基酸插入到序列中。本发明的序列中的变更的数量和位置的实例，在本文别处描述。天然氨基酸包括20个"标准的"L-氨基酸，它们由其标准的单字母代号表示为G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非标准氨基酸包括任何其他可掺入到多肽骨架中或者可由现有氨基酸残基的修饰产生的残基。非标准氨基酸可以是天然的或非天然的。有几个天然的非标准氨基酸是本领域知道的，如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、3-甲基组氨酸、N-乙酰丝氨酸等[参考文献53]。那些在其N-a位置被衍生化的氨基酸残基，将只位于氨基酸序列的N末端。通常在本发明中，氨基酸是L-氨基酸，但它也可以是D-氨基酸。因此变更包括将L-氨基酸修饰成D-氨基酸，或者用D-氨基酸置换L-氨基酸。曱基化、乙酰化和/或磷酸化形式的氨基酸也是为人所知的，本发明的氨基酸可进行这种修饰。本发明的抗体结构域和结合成员中的氨基酸序列可包含上述的非天然或非标准氨基酸。非标准氨基酸(例如D-氨基酸)可在合成过程中掺入到氨基酸序列中，或者在氨基酸序列合成后通过修饰或置换"原始的"标准氨基酸来掺入。非标准和/或非天然氨基酸的使用能增加结构和功能多样性，因此可提高在本发明的结合成员中实现期望的IgE结合和中和性质的潜在可能性。另外，已证实D-氨基酸和类似物具有比标准的L-氨基酸更好的药代动力学概况，因为具有L-氨基酸的多肽在给予动物如人之后会发生体内降解。携带本发明的CDR衍生序列的新型VH区或VL区，可采耳又对一个或多个选定的VH基因和/或VL基因进行随机诱变以在整个可变结构域当中产生突变来产生。这种技术由Gram等人描述[参考文献54]，他们使用了易错PCR。在一些实施方案中，在整个可变结构域或整组CDR当中作出一个或两个氨基酸置换。另一可使用的方法是将诱变导入VH基因或VL基因的CDR区。这种技术由Barbas等人[参考文献55]和Schier等人[参考文献56]公开。所有上述技术本身在本领域中是为人所知的，技术人员将能够采用本领域的常规方法，应用这些技术来提供本发明的结合成员。本发明的又一个方面提供获得针对IgE的抗体抗原结合位点的方法，所述方法包括通过在本文给出的VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、置换或插入一个或多个氨基酸来提供VH结构域；任选将这样提供的VH结构域与一个或多个VL结构域结合；和对VH结构域或VH/VL组合(一个或多个组合)进行试验，以鉴定针对IgE和任选具有一个或多个期望性质(例如中和IgE活性的能力)的结合成员或抗体抗原结合位点。所述VL结构域可具有基本上如本文所给出的氨基酸序列。有类似的方法可使用，其中将本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域进行组合。如上所述，基本上如本文所给出的CDR氨基酸序列，可在人抗体可变结构域或其实质部分中作为CDR携带。基本上如本文所给出的HCDR3序列是本发明的实施方案的代表，这些序列的每一个都可在人重链可变结构域或其实质部分中作为HCDR3携带。本发明中采用的可变结构域可获自或衍自任何种系或重排的人可变结构域，或者可以是基于已知的人可变结构域的共有序列或实际序列的合成可变结构域。可变结构域可衍自非人抗体。可使用重组DNA技术，将本发明的CDR序列(例如CDR3)导入到一整库(arepertoireof)缺乏CDR(例如CDR3)的可变结构域中。例如，Marks等人[参考文献57]描述了产生成整库的(repertoiresof)抗体可变结构域的方法，其中将定向在或邻近于可变结构域区域的5'末端的共有引物与人VH基因的第三构架区的共有引物联合使用，以提供一整库缺乏CDR3的VH可变结构域。Marks等人进一步描述了这整库如何可与特定抗体的CDR3进行组合。使用类似的技术，本发明的CDR3衍生序列可用成整库的缺乏CDR3的VH结构域或VL结构域进行改组(shuffle)，并将改组的完全VH结构域或VL结构域与同族的(cognate)VL结构域或VH结构域进行组合，以提供本发明的结合成员。该整库然后可在合适的宿主系统，如WO92/01047(通过引用全文并入本文)和后续大量文献中的任何一篇(包括Kay,Winter&McCafferty[58]在内)的噬菌体展示系统中展示，使得可选择出合适的结合成员。一整库可由104个以上的成员个体组成，例如至少105个、至少106个、至少107个、至少108个、至少109个或至少10"个成员或更多。其他合适的宿主系统包括但不限于酵母展示、细菌展示、T7展示、病'毒展示、细胞展示、核糖体展示和共价展示。本发明提供制备IgE抗原的结合成员的方法，所述方法包括(a)提供起始的一整库编码VH结构域的核酸，所述核酸包括要被置换的CDR3或者缺乏CDR3编码区；(b)将所述的整库与编码基本上如本文对VHCDR3所给出的氨基酸序列的供体核酸进行组合，使得所述供体核酸被插入到该整库中的CDR3区中，以j是供编码VH结构域的核酸产物整库(aproductrepertoireofnucleicacids)。(c)表达所述产物整库的核酸；(d)选出针对IgE的结合成员；和(e)回收所述结合成员或编码它的核酸。同样有类似的方法可使用，其中将本发明的VLCDR3与一整库编码VL结构域的核酸进行组合，所述核酸包括要被置换的CDR3或者缺乏CDR3编码区。类似地，可将一个或多个或者所有三个CDR移^i到一整库VH结构域或VL结构域中，然后筛选出IgE的结合成员(一个或多个)。例如，可采用亲本或抗体2-28HCDR1、HCDR2和HCDR3或者亲本或抗体2-28各组HCDR中的一个或多个，和/或采用亲本或抗体2-28LCDR1、LCDR2和LCDR3或者亲本或抗体2-28各组LCDR中的一个或多个。类似地，也可采用本文公开的其他VH结构域和VL结构域、各组CDR和各组HCDR和/或各组LCDR。免疫球蛋白可变结构域的实质部分可包含至少三个CDR区以及它们的间插构架区。该部分还可包括第一和第四构架区之一或两者的至少约50%,所述50%是第一构架区的C末端50%和第四构架区的N末端50%。可变结构域的实质部分的N末端或C末端处的另外残基，可以是通常不与天然可变结构域区域有关的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建本发明的结合成员，可导致被引入来促进克隆或其他操作步骤的接头所编码的N末端或C末端残基的引入。其他操作步骤包括引入接头来将本发明的可变结构域与更多的蛋白质序列连接，所述蛋白质序列包括抗体恒定区、其他可变结构域(例如在双抗体的生产中)或可检测标记/功能标记，这在本文别处作更详细的讨论。在本发明的一些方面，结合成员包含一对VH结构域和VL结构域，不过基于VH结构域序列或VL结构域序列的单一结合结构域构36成本发明的进一步的方面。已知单一免疫球蛋白结构域特别是VH结构域能够以特异性方式结合靶标抗原。例如参见上文对dAb的讨论。对于任一个单一结合结构域，这些结构域可用来筛选能够形成能结合IgE的两结构域结合成员的互补结构域。这可通过采用WO92/01047(通过引用全文并入本文)中公开的所谓的等级二元组合法(hierarchicaldualcombinatorialapproach)的遵菌体展示筛选方法来实现，在该等级二元组合法中，用含有H链克隆或L链克隆的单个菌落来感染一完整文库的(acompletelibraryof)编码另一链(L或H)的克隆，所得的两链结合成员按噬菌体展示技术(如在该专利文献中描述的那些技术)进行选择。这个技术在Marks等人(出处同上)中也有公开。本发明的结合成员可进一步包含抗体恒定区或其部分，例如人抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可在其C末端连接到抗体轻链恒定结构域，包括人CK或CX链。同样，基于VH结构域的结合成员可在其C末端连接到书1"自任何抗体同种型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)及任何同种型亚类(特别是IgGl和IgG2)的免疫球蛋白重链的全部或部分(例如CH1结构域)。IgGl由于其制备容易和稳定性例如半寿期，是有利的。任何具有这些性质和能使可变区稳定化的合成的或其他的恒定区变体，也可用于本发明。本发明的结合成员可用可检测标记或功能标记进行标记。因此，结合成员或抗体分子可以以免疫缀合物的形式存在，以获得可检测信号和/或可定量信号。免疫缀合物可包含与可^f企测标记或功能标记缀合的本发明抗体分子。标记可以是任何能产生或者可被诱导产生信号的分子，包括但不限于荧光剂、放射标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，可通过检测焚光或发光、放射性、酶活性或吸光度来检测和/或测量结合情况。合适的标记包括以下标记，它们是以举例方式给出，并非限制本发明37-酶，例如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氬酶("G6PDH")、a-D-半乳糖香酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸肝酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氲酶和过氧化物酶如辣才艮过氧化物酶；-染料；-荧光标记或焚光剂，如荧光素及其衍生物、荧光染料(fluorochrome)、罗丹明化合物及其衍生物、GFP(GFP是指"绿色荧光蛋白，，)、丹磺酰、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；荧光团如镧系元素穴状化合物和螯合物，例如铕等(PerkinElmer禾口CisBiointernational)，-化学发光标记或化学发光物质(chemiluminescer)，如异鲁米诺、鲁米诺和二氧杂环丁烷；-生物发光标记，如萤光素酶和萤光素；-敏化剂；-辅酶;-酶底物；隱放射性标记，包括但不限于澳77、碳14、钴57、氟8、镓67、镓68、氬3(氖)、铟lll、铟113m、硖123m、碘125、碘126、碘131、硪133、汞107、汞203、磷32、铼99m、铼101、铼105、钌95、钌97、钌103、钌105、钪47、硒75、硫35、锝99、锝99m、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、钇199和本丈提到的其他放射性标记；、-颗粒物，如乳胶或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞，等等，颗粒物可进一步用染料、催化剂或其他可检测基团标记；-分子，如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；-毒素部分，例如选自以下的毒素部分4i单胞杆菌属外毒素(Pseudomonasexotoxin)(PE或其细胞毒性片段或突变体)、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变体、肉毒杆菌毒素A,B,C,D,E或F、蓖麻毒蛋白(ricin)或其细胞毒性片段如蓖麻毒蛋白A、相思豆毒蛋白(abrin)或其细胞毒性片段、肥皂草毒蛋白(saporin)或其细胞毒性片段、美洲商陆(pokeweed)抗病毒毒素或其细胞毒性片段及异抹泻根毒蛋白(bryodin)1或其细胞毒性片段。合适的酶和辅酶公开于Litman,等人，US4，275，149和Boguslaski,等人，US4318980，每个专利通过引用全文并入本文。合适的荧光剂和化学发光物质公开于Litman,等人，US4275149，该专利通过引用全文并入本文。标记还包括化学部分，如可通过与特异性关联(cognate)可才企测部分的结合来^r测的生物素，例如经标记的亲和素或链霉亲和素。可检测标记可用本领域知道的常规化学法连接到本发明的抗体。免疫缀合物或其功能片段可通过本领域技术人员知道的方法来制备。它们可直接地，或者通过间隔基团或连接基团如聚醛(比如戊二醛)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DPTA),或者在偶联剂(如上对治疗性缀合物所迷的那些偶联剂)的存在下，偶联到酶或荧光标记。含有荧光素类型的标记的缀合物可通过与异硫氰酸反应来制备。本领域技术人员所知道的现有的将治疗性放射性同位素直接地或通过螯合剂(如以上提到的EDTA、DTPA)偶联到抗体的方法，可应用在可用于诊断的放射性元素上。同样可以通过氯胺T方法[参考文献59]用钠125进行标记，或者通过Crockford等人的4支术(US4424200，通过引用全文并入本文)用锝99m进行标记，或者按Hnatowich(US4,479,930,通过引用全文并入本文)的描述通过DTPA进行连接。有多种方法可使标记能产生可通过外部手段检测的信号，例如通过肉眼检验、电磁辐射、热和化学试剂来检测。也可使标记结合到另一种能结合本发明抗体的结合成员，或者结合到载体。标记可直接产生信号，因此不需要另外的成分以产生信号。有许多有机分子例如荧光剂能够吸收紫外光和可见光，吸收的光将能量转移到这些分子，从而使它们跃迁到激发能态。这个吸收的能量然后通过以第二波长进行的光发射而散发。这个第二波长发射也可将能量转移到经标记的接纳分子(acceptormolecule),结果接纳分子又通过光发射例如荧光共振能量转移(FRET)散发能量。其他能直接产生信号的标记包括放射性同位素和染料。或者，标记可能需要其他成分以产生信号，这样信号产生系统将包括所有为产生可测量信号所需的成分，这些成分可包括底物、辅酶、增强剂、另外的酶、能与酶制品反应的物质、催化剂、激活剂、辅因子、抑制剂、清除剂(scavenger)、金属离子及信号产生物质的结合所需的特定结合物质。有关合适的信号产生系统的详细讨论可见于Ullman,等人US5,185,243,该专利通过引用全文并入本文。本发明提供这样的方法，它包括引起或允许本文所提供的结合成员与IgE的结合。如所指出，这种结合可在体内发生，例如在将结合成员或编码核酸给予人或动物(例如哺乳动物)后发生，或者可在体外发生，例如在ELISA、蛋白质印迹法、免疫细胞化学、免疫沉淀法、亲和层析和生化测定或基于细胞的测定中发生。一般来说，本发明结合成员与IgE之间的复合物，可通过酶联免疫测定、放射测定、免疫沉淀法、荧光免疫测定、化学发光测定、免疫印迹测定、侧向流测定(lateralflowassay)、凝集测定和基于微粒的测定(particulate-basedassay)等测定法来检测。本发明还提供通过例如在生物传感器系统中采用本发明的结合成员来直接测量抗原的水平。例如，本发明包括检测和/或测量与IgE的结合的方法，所述方法包括(i)将所述结合成员暴露于IgE,和(ii)检测所述结合成员与IgE的结合,其中结合是用本文描述的任何方法或可检测标记来检测。本文描述的这个和任何其他的结合检测方法，可由执行该方法的人员例如通过目测观察可检测标记来直接阐释。或者，本文描述的这个和任何其他的结合检测方法可以如下形式产生报告放射自显影图、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告、图(graph)、图表(chart)、含有结果的试管或容器或孔(well)，或者该方法的结果的任何其他可视或物理表示法。可测定结合成员与IgE的结合的量。可将定量数量与试验样品中可能具有诊断意义的抗原的量关联起来。对IgE结合和/或其定量的筛选，可用于例如筛选患者是否有本文所指的疾病或病恙，和/或任何其他涉及异常IgE产生、表达和/或活性的疾病或病恙。本发明的诊断方法可包括(i)从受试者获得组织或流体样品，(ii)将所述组织或流体样品暴露于本发明的一个或多个结合成员，和(iii)与对照样品相比较检测结合的IgE，其中与对照样品相比较IgE结合的量的增加可表示IgE产生、表达或活性的异常水平。待测的组织或流体样品包括血液、血清、尿液、活组织检查材料、肿瘤或者任何怀疑含有异常IgE水平的组织。经试验发现异常IgE水平或活性阳性的受试者，也可受益于本文后面所公开的治疗方法。的复合物。例如，可将抗原固定化在侧条带分析(lateralstripassay)上，来捕捉目的样品中的抗原特异性IgE。本领域技术人员能够按照本文公开的方法，根据他们的偏好和常识，来选择测定结合成员与抗原的结合的合适方式。免疫测定(RIA)是一种可能的方式。将放射性标记的抗原与未标记的抗原(试验样品)混合，让它们与结合成员结合。采用物理方式将结合的抗原与未结合的抗原分离开来，测定与结合成员结合的方文射性抗原的量。试验样品中抗原越多，与结合成员结合的放射性抗原将越少。竟争性结合测定也可与非放射性抗原一起使用，使用的是与报道分子连接的抗原或类似物。报道分子可以是具有光谱上分离的(spectrallyisolated)吸收或发射特征的荧光染料、磷或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德克萨斯红以及镧系元素螯合物或穴状化合物。合适的发色染料包括二氨基联苯胺。其他的报道分子包括有色的、磁性的或顺磁性的大分子胶体颗粒或微粒材料如胶乳珠(latexbead),和能直接或间接造成可检测信号被目测观察到、以电子方式检测到或以别的方式记录到的生物活性或化学活性物质。这些分子可以是催化反应的酶，这些反应例如能显示颜色或改变颜色，或者引起电学性质的改变。它们可以是在分子上可激发的，使得各能态之间的电子跃迁会导致特征性光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器联用的化学实体(chemicalentity)。可采用生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素和碱性磷酸酶检测系统。各个结合成员-报道分子缀合物所产生的信号，可用来导出样品(正常样品和试验样品)中相关结合成员的可定量绝对或相对数据。作为本发明的一个方面，还提供了包含根据本发明任何方面或实施方案的结合成员的试剂盒。在试剂盒中，可对结合成员进行标记以让其在样品中的反应性得以检测，例如如下文所进一步描述。此外，结合成员可连接或不连接到固相载体。试剂盒的各成分通常是无菌的，装在密闭小瓶或其他容器中。试剂盒可应用在诊断分析或者其他能用得上结合成员的方法中。试剂盒可包括关于各成分在方法例如本发明的方法中的使用的说明书。在本发明的试剂盒中可包括有助于或者使得能够执行这种方法的辅助材料。辅助材料包括能结合第一结合成员并与可检测标记(例如荧光标记、；改射性同位素或酶)缀合的不同的第二结合成员。基于抗体的试剂盒也可包含用于进行免疫沉淀法的珠粒(bead)。试剂盒的每个成分通常装在其自身合适的容器中。因此，这些试剂盒通常包括适合于每个结合成员的不同容器。此外，试剂盒的方法的说明书。本发明还提供如上所述的结合成员用于在竟争性测定申测量抗原水平的用途，也就是说通过在竟争性测定中采用本发明所提供的结合成员来测量样品中的抗原水平的方法。这可能是不需要将结合的抗原与未结合的抗原进行物理分离的情况。一种可能的做法是，将报道分子连接到结合成员，以使得在结合时出现物理或光学变化。报道分子可直接或间接产生可定量的可检测信号。报道分子的连接可以是直接或间接地、共价地(例如通过肽键)或非共价地连接。通过肽键的连接可以是因编码抗体和报道分子的基因融合物的重组表达而产生。在各个方面和实施方案中，本发明扩展到能与任何本文所定义的结合成员竟争与IgE的结合的结合成员，所述本文所定义的结合成员例如亲本抗体或抗体2-28中任一个抗体，例如为IgGl形式。各结合成员之间的竟争可容易地在体外进行测定，例如这样测定将特异性报道分子标记到一个能在其他未加标记的结合成员存在下进行检测的结合成员，以使得可以鉴定能结合同一表位或重叠表位的各结合成员。竟争可例如用ELISA来测定，其中IgE固定化到板上，将加标记的(tagged)或标记的(labelled)第一结合成员连同一个或多个其他未力口标记的(untagged)或未标记的(unlabelled)结合成员加到该才反。能与力口标记的结合成员竟争的未加标记的竟争成员，其存在由加标记的结合成员所发射的信号的减少来观察到。例如，本发明包括鉴定IgE结合化合物的方法，所述方法包括(i)将IgE固定化到载体，(ii)使所述固定化IgE同时或以逐步方式与至少一个加标记的或标记的本发明结合成员和一个或多个未加标记的或未标记的受试结合化合物接触，和(iii)通过观察来自加标记的结合成员的结合标记(boundtag)的量的减少，来鉴定出新的IgE结合化合物。这种方法可用多孔板(multiwell)或阵列形式以高通量方式进行。这种测定还可在溶液中进行。参见例如U.S.5,814,468，该专利通过引用全文并入本文。如上所述，对结合的检测可由执行该方法的人员直接阐释，例如通过目测观察可检测标记或者标记存在量的减少来阐释。或者，本发明的结合方法可以如下形式产生4艮告放射自显影图、照片、计算机打印输出、流式细胞术报告、图(graph)、图表(chart)、含有结果的试管或容器或孔(well),或者该方法的结果的任何其他可视或物理表示法。竟争性测定还可用于表位作图。在一个例子中，可用表位作图来鉴定被任选可具有优化的中和和/或调节特性的IgE结合成员所结合的表位。这种表位可以是线性的或者有构象的。构象表位可包含IgE的至少两个不同片段，其中所述片段在IgE折叠成其三级或四级结构而形成可被IgE抑制剂如IgE结合成员识別的构象表位时，被定位成互相靠近在一起。在试验竟争情况时，可采用抗原的肽片段，特别是包括目的表位或者基本上由目的表位組成的肽。可使用具有表位序列加上在任一末端有一个或多个氨基酸的肽。本发明的结合成员可以是，其对抗原的结合可被具有或包括给定序列的肽所抑制。本发明进一步提供编码本发明结合成员的分离核酸。核酸可包括DNA和/或RNA。在一个实施方案中，本发明提供编码如上定义的本发明CDR或一组CDR或VH结构域或VL结构域或抗体-抗原结合位点或抗体分子如scFv或IgGl的核酸。本发明还提供包含至少一个如上所述多核苷酸的质粒、载体、转录盒或表达盒形式的构建物。本发明还提供包含一个或多个如上所述的构建物的重组宿主细胞。编码本发明所提供的任何CDR或一组CDR或VH结构域或VL结构域或抗体-抗原结合位点或抗体分子如scFv或IgGl的核酸，其本身构成本发明的一个方面，而产生编码产物的方法也构成本发明的一个方面，所述方法包括从编码核酸进行表达。表达可便利地通过在适当条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来实现。进行表达生产后，化，然后加以适当使用。本发明的核酸可包含DNA或RNA，且可以是完全或部分合成的。若提到本文所给出的核苷S殳序列，则涵盖具有指定序列的DNA分子，和涵盖具有其中U置换T的指定序列的RNA分子，除非上下文另有要求。-又一方面是提供产生抗体VH可变结构域的方法，所述方法包括引起从编码核酸的表达。这种方法可包括在用于生产所述抗体VH可44变结构域的条件下培养宿主细胞。作为本发明的进一步的方面，提供了用于生产VL可变结构域以及包含VH和/或VL结构域的结合成员的类似方法。生产方法可包括分离和/或纯化产物的步骤。生产方法可包括将产物配制成包括至少一种另外的成分如药物可接受赋形剂的组合物。用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是7>知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。抗体和抗体片段在原核细胞中的表达是本领域已确立的。有关综述参见例如Pmckthun[参考文献60]。通用的细菌宿主是大肠杆菌(Eco/z')。在培养物中的真核细胞中的表达，也可作为生产结合成员的可选方法供本领域技术人员^f吏用[参考文献61，62,63]。本领域可供用来表达异源多肽的哺乳动物细胞系，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠黑素瘤细胞、人胚胎肾细胞、人胚胎视网膜细胞和许多其他细胞。合适的载体可进行选择或构建，含有适当的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他视所需而定的序列。载体纟见所需而定可以是质粒如噬菌粒或者病毒如噬菌体[参考文献64]。在Ausubel等人[参考文献65]中，详细描述了许多已知的用来操纵核酸和分析蛋白质的技术和方案，所述操纵核酸例如是制备核酸构建物、诱变、测序、将DNA导入到细胞中及基因表达。本发明的又一个方面提供含有本文所公开的核酸的宿主细胞。这种宿主细胞可以是体外的和可以是在培养物中的。这种宿主细胞可以是体内的。宿主细胞的体内存在可使得本发明的结合成员作为"胞内抗体，，或者说细胞内部的抗体进行胞内表达。胞内抗体可用于基因治疗。本发明再一个方面提供这样的方法，它包括将本发明的核酸导入到宿主细胞中。导入可采用任何可用的技术进行。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和用反转录病毒或其他病毒(例如牛痘，或者对于昆虫细胞用杆状病毒)进行的转染。将核酸导入在宿主细胞特别是真核细胞中，可使用基于病毒或质粒的系统。质粒系统可以附加型形式保持，或者可掺入到宿主细胞中或者掺入到人工染色体中。掺入可通过将一个或多个拷贝随机或定向整合在单个或多个基因座来进行。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和用噬菌体转染。导入后，接着例如通过在适于基因表达的条件下培养宿主细胞，来引起或允许从核酸的表达。表达产物的纯化可通过本领域技术人员知道的方法来实现。本发明的核酸可整合到宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可通过按标准的技术添加能促进与基因纽的重组的序列，来促进整合。本发明还提供这样的方法，它包括在表达系统中使用如上所述的构建物，以表达上述的结合成员或多肽。本发明的结合成员可用于诊断或治疗人或动物受试者特别是人的方法中。IgE结合成员可用来治疗以IgE介导的生物效应为特征的病恙，特别是过敏症和哮喘。例如，本发明的结合成员可用来治疗过敏性鼻炎、变应性接触性皮炎、特应性皮炎、过敏反应、食物过敏、荨麻瘆、炎性肠病、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、药源性皮疹、过敏性眼病或过敏性结膜炎。粒，减少FcsRl介导的体内或体外生物应答，以及减少人或动物患者中的循环IgE。因此，本发明提供抑制哺乳动物中过敏原引起的肥大细胞脱粒的方法，所述方法包括将本发明的结合成员，例如抗体、VH结构域或VL结构域，以足以中和IgE的量给予所述哺乳动物。本发明还提供减少FcsRI-生物应答并有或没有同时减少FcsRII46介导的生物应答的作用的方法，所述方法包括使表达FcsRI和/或FcsRII的细胞与本发明的结合成员，例如抗体、VH结构域或VL结构域，在IgE的存在下进行接触。本发明还提供减少Fc必i/介导的生物应答并有或没有同时减少FcERII介导的生物应答的作用的方法，所述方法包括使表达FcsRI和/或FcsRII的细胞与本发明的结合成员，例如抗体、VH结构域或VL结构域，在IgE的存在下进行接触。当试验细胞与本发明的结合成员在体外接触时，还可将对照细胞用于阳性对照(例如不含结合成员的反应)和/或阴性对照(例如不含IgE和/或抗原的反应)。当细胞在体内被结合成员接触时，例如通过将本发明的结合成员给予显示FcsRI和/或FcsRII介导的生物应答的哺乳动物来进行接触时，本发明的结合成员是以足以中和IgE的量给予。此外，本发明还提供减少哺乳动物如人中的循环IgE的方法，所述方法包括将本发明的结合成员，例如抗体、VH结构域或VL结构域，以足以中和和减少循环游离1gE的量给予。种或多种疾病或病恙过4文性鼻炎、变应性接触性皮炎、特应性皮炎、过敏反应、食物过敏、荨麻渗、炎性肠病、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、药源性皮渗、过敏性眼病、鼻结膜炎、过敏性结膜炎、支气管哮喘、气道高反应性、化妆品过敏、药源性过敏、药源性超敏性综合症、金属过敏、职业性超敏性肺炎、慢性超敏性肺炎、冷超敏性、蠕虫感染引起的超敏性、乳胶过敏和枯草热。本文针对IgE的结合和中和所给出的数据因此表明，本发明的结合成员可用来治疗或预防这些病恙，包括减轻病恙的严重性。因此，本发明提供治疗或减少任何本文所述病恙的至少一个症状的严重性的方法，所述方法包括将有效量的一种或多种本发明结合成员单独地或者在与本领域知道的或本文所述的另一适当药物的组合治疗方案47中，给予有需要的患者，使得任何上述病恙的至少一个症状的严重性得到减少。本发明的结合成员可用于适当的动物和用于疾病的动物模型特别是猴子中。因此，本发明的结合成员可在涉及IgE,例如IgE产生、表达和/或活性特别是异常产生、表达或活性的疾病或病恙的治疗中用作治疗剂。治疗方法可包括将有效量的本发明结合成员给予有需要的患者，其中IgE的产生、表达和/或活性因此得到降低。治疗方法可包括(i)例如使用上述的诊断方法，鉴定出显示IgE水平或活性提高的患者，和(ii)将有效量的本发明结合成员给予该患者，其中IgE的提高的产生、表达和/或活性得到降低。另选的治疗方法可包括(i)鉴定出IgE水平没有明显提高、但据认为能受益于本发明IgE的给予的患者，和(ii)将有效量的本发明结合成员给予该患者。本发明的有效量，是能降低IgE的提高的产生、表达和/或活性，从而降低或减轻所治疗的特定疾病或病恙的至少一个症状的严重性，^^未必治愈该疾病或病恙的这么一个量。本发明还提供拮抗IgE的至少一个效应的方法，所述方法包括接触或给予有效量的一种或多种本发明结合成员，使得IgE的所述至少一个效应得到拮抗。可通过本发明方法拮抗的IgE效应，包括FcsRI和/或FcsRII介导的生物应答，和因为这些结合反应而出现的任何下游效应》因此，本发明的更多方面提供本发明的分离结合成员，如抗体、VH结构域或VL结构域用于制造供治疗如本文所讨论与IgE有关或由IgE介导的病恙的药物的用途。药物或药物组合物的这种用途或制造方法，包括将结合成员与药物可接受的赋形剂进行配制。药物可接受的赋形剂可以是这样的化合物或者化合物的组合，它进入到药物组合物中，但没有引起次生反应，能例如促进活性化合物的给予、提高活性化合物在体内的有效期和/或功效、提高活性化合物在溶液中的溶解度，或者改善活性化合物的保存。这些药物可接受的介质是公知的，本领域技术人员会根据所选的活性化合物的性质和给予方式进行调整。本发明的结合成员通常会以药物组合物的形式给予，该药物组合物除了结合成员外还可包含至少一种成分。因此，根据本发明且供按本发明使用的药物组合物，除了活性成分外，还可包含药物可接受的赋形剂、载体、緩沖剂、稳定剂或本领域技术人员公知的其他材料。这些材料应当是无毒的，不应干扰活性成分的功效。载体或其他材料的明确性质要取决于给予途径，给予途径如下所述可以是口服、吸入、气管内、局部、嚢内给予或注射给予。本发明也设想到了供口服给予的药物组合物，例如单结构域抗体分子(例如"nanobodiesTM")等。这种口服制剂可以为片剂、胶嚢剂、散剂、液体剂或半固体剂形式。片剂可包含固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、右旋糖或其他糖'溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。对于静脉内注射或者在患病部位的注射，活性成分将是无热原且具有合适的pH、等渗性和稳定性的胃肠外可接受水溶液的形式。本领域具有相关技能的人员完全有能力用例如等渗介质制备出合适的溶液，如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液。可按需应用防腐剂、稳定剂、緩沖剂、抗氧化剂和/或其他添加剂，包括緩冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二曱基节基氯化铵、六曱氯铵、苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯曱酸烷基酯，如对羟基苯曱酸曱酯或对羟基苯曱酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3，-戊醇；和间曱酚)；低分子量多肽；蛋白质，如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化49合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA;糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子，如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTm、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。视分子的理化性质和递送途径而定，本发明的结合成员可以以液体、半固体或固体形式配制。制剂可包括赋形剂或赋形剂的组合，例如糖类、氨基酸和表面活性剂。液体制剂可包括^f艮宽范围的抗体浓度和pH。固体制剂可例如通过冷冻干燥、喷雾干燥或超临界流体技术进行的干燥来产生。抗IgE的制剂要取决于预定的递送途径例如，肺部递送制剂可由具有能确保在吸入时渗入肺部深处的物理性质的颗粒组成；局部制剂(例如用于治疗疤痕，如皮肤疤痕)可包括能延长药物停留在作用部位的时间的稠度调节剂。结合成员可用能保护结合成员不被快速释放的载体制备，如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶嚢递送系统。可使用生物可降解、生物相容性的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、月交原、聚原酸酯和聚乳酸。许多制备这些制剂的方法是本领域技术人员知道的[参考文献66]。抗IgE治疗可口服给予(如单结构域抗体分子(例如"nanobodies")),注射给予(例如皮下、关节内、静脉内、腹膜内、动脉内或肌肉内注射)，吸入给予，气管内给予，嚢内途径给予(滴注到膀胱)，或者局部给予(例如眼内、鼻内、直肠内、伤口内、皮肤上)。治疗可通过脉沖式灌注来给予，特别是以结合成员剂量逐渐减低的方式灌注。给予途径可由治疗的理化特性、由对疾病的特殊考虑或者由优化功效或使副作用减至最低的要求来决定。一个特定的给予途径是静脉内给予。另一个给予本发明药物组合物的途径是皮下给予。设想到，抗IgE治疗不会局限于临床使用。因此，使用无针头装置进行的皮下注射也是有利的。静脉内制剂的实例包括制剂(i:i包含本发明的分离结合成员(任选10、50、100或150mg/ml的所述结合成员，例如抗体)50mM乙酸钠lOOmMNaClpH5.5制剂C2)包含本发明的分离结合成员(任选10、50、IOO或150mg/ml的所述结合成员，例如抗体)20mM琥珀酸盐105mMNaCl10mM精氨酸pH6.00组合物可以单独给予或者与其他治疗法组合给予，组合给予时视所要治疗的病症而定同时给予或依次给予。IgE的结合成员可用作与另外的医药成分联用的组合疗法的一部分。组合治疗可用来提供显著的协同作用，特别是抗IgE结合成员与一种或多种其他药物的组合。IgE的结合成员可与另一治疗剂或几种治疗剂同时地或者依次地或者作为组合制剂进行给予，以治疗一种或多种本文所列的病症。本发明的结合成员可与其他可用的针对哮喘和过敏性疾病或其他涉及IgE介导效应的病恙的治疗法进行联合配制和/或使用。本发明的结合成员可与一种或多种以下药剂组合提供，或者提供本发明的结合成员时另外提供一种或多种以下药剂-细胞因子或者细胞因子功能的激动剂或拮抗剂(例如作用于细胞因子信号转导途径的药剂，如SOCS系统的调节剂)，如a-,(3-和/或？干扰素；胰岛素样生长因子I型(IGF-1),其受体和相关结合蛋白；白细胞介素(IL)，例如IL-1至33中的一个或多个，和/或白细胞介素拮抗剂或抑制剂，如阿那白滞素(anakinra);白细胞介素家族成员的受体的抑制剂或者这种受体的特异性亚单位的抑制剂，肿瘤坏死因子a(TNF-oc)抑制剂，如抗TNF单克隆抗体(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗和/或CDP-870)和/或TNF受体拮抗剂，例如免疫球蛋白分子(如依那西普)和/或低分子量药剂，如已酮可可豆碱；-B细胞的调节剂，例如靶向B淋巴细胞(如CDM(利妥昔单抗)或MRA-alL16R)或者T淋巴细胞(例如CTLA4-Ig、HuMax11-15或Abatacept)的单克隆抗体；-抑制破骨细胞活性的调节剂，例如抗RANXL抗体；-趋化因子或趋化因子受体功能的调节剂，如CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO和CCRll(对于C-C家族)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR5和CXCR6(对于C-X-C家族)和CX3CR1(对于C-X3-C家族)的拮抗剂;-基质金属蛋白酶(MMP)的抑制剂，例如多西环素之类的药剂，所述酶即以下酶中的一个或多个溶基质素、胶原酶和明胶酶以及聚集蛋白聚糖酶，特别是胶原酶-1(MMP-1)、胶原酶-2(MMP-8)、胶原酶-3(MMP-13)、溶基质素-1(MMP-3)、溶基质素-2(MMP-10)和/或溶基质素-3(MMP-11)和/或MMP-9和/或MMP-12;-白三烯生物合成抑制剂、5-脂肪加氧酶(5-LO)抑制剂或5-脂肪加氧酶激活蛋白(FLAP)拮抗剂，如齐留通；ABT-761;芬留顿；替泊沙林；Abbott-79175;Abbott-85761;N-(5-取代)-漆吩-2-烷基磺酰胺；2，6-二叔丁基苯腙；曱氧基四氢吡喃如ZenecaZD-2138;化合物SB-210661;吡咬基取代的2-氰基萘化合物，如L-739,010;2-氰基唾啉化合物，如L-746，530;巧l哚和/或喹啉化合物，如MK-591、MK-886和/或BAYx1005;画白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4的受体拮抗剂，选自吩p塞溱-3画ls,如L-651,392;脒基化合物，如CGS腸25019c;benzoxalamine，如昂唑司特；苯曱脒，如BIIL284/260;和诸如以下的化合物扎鲁司特、阿鲁司特、孟鲁司特、普仑司特、维鲁司特(MK-679)、RG-12525、Ro画245913、伊拉司特(CGP45715A)和BAYx7195;-磷酸二酯酶(PDE)抑制剂，如曱基黄噤呤(methykanthanine),例如茶碱和/或氨茶石咸；和/或选择性PDE同工酶抑制剂，例如PDE4抑制剂和/或同种型PDE4D的抑制剂和/或PDE5的抑制剂；-组胺l型受体拮抗剂，如西替利嗪、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿伐斯汀、特非那定、阿司咪唑、氮卓斯汀、左卡巴斯汀、氯苯那敏、异丙嗪、赛克力嗪和/或咪唑斯汀(通常口服、局部或胃肠外应用)。-质子泵抑制剂(如奥美拉唑)或胃保护性组胺2型受体拮抗剂；-组胺4型受体的拮抗剂；-ot-l/oc-2肾上腺素受体激动剂血管收缩剂拟交感神经剂，如六氬脱氧麻黄碱、苯肾上腺素、苯丙醇胺、麻黄碱、伪麻黄碱、盐酸萘甲唑啉、盐酸羟甲唑啉、盐酸四氬唑啉、盐酸赛洛唑啉、盐酸萘胺唑啉和盐酸乙诺那林；-抗胆碱能剂，例如毒蕈碱性受体(M1、M2和M3)拮抗剂，如阿托品、东t菪碱、格隆铵、异丙托溴铵、噻托溴铵、氧托溴铵、哌仑西平和替仑西平；-卩-肾上腺素受体激动剂(包括(3受体亚型1-4)，如异丙肾上腺素、沙丁胺醇、福莫特罗、沙美特罗、特布他林、奥西那林、曱磺酸比托特罗和/或吡布特罗，例如它们的手性对映异构体；-色酮，例如色甘酸钠和/或奈多罗米纳；-糖皮质类固醇，如氟尼缩松、曲安萘德、二丙酸倍氯米松、布地奈德、丙酸氟替卡松、环索奈德和/或糠酸莫米松；-调节核激素受体的药剂，如PPAR;-免疫球蛋白(Ig)或Ig制品或者调节Ig功能的拮抗剂或抗体，如其所结合的表位与本发明结合成员相同或不同的抗IgE;-其他全身应用或局部应用的抗炎剂，例如沙利度胺或其衍生物、类视色素、地蒽酚和/或卡泊三醇；-对氨基水杨酸和磺胺吡啶的組合，如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、巴柳氮和奥沙拉嗪；和免疫调节剂，如硫嘌呤；和皮质类固醇，如布地奈德；画抗细菌剂，例如青霉素彩亍生物、四环素、大环内酯、(3-内酰胺、氟p奎诺酮、曱硝唑和/或吸入的氨基糖苷；和/或抗病毒剂，例如阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、西多福韦、金刚烷胺、金刚乙胺；利巴韦林；扎那米韦和/或奥司他韦；蛋白酶抑制剂，如茚地那韦、奈非那韦、利托那韦和/或沙奎那韦；核苷反转录酶抑制剂，如去羟肌苷、拉米夫定、司他夫定、扎西他滨、齐多夫定；非核苦反转录酶抑制剂，如奈伟拉平、依法韦仑；-心血管剂，如钩通道阻断剂、p-肾上腺素受体阻断剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、血管紧张素-2受体拮抗剂；降脂剂，如抑制素和/或fibmte;血细胞形态的调节剂，如已酮可可豆碱；溶解血栓剂和/或抗凝剂，例如血小板聚集抑制剂；-CNS剂，如抗抑郁剂(如舍曲林)、抗帕金森病药物(如立司吉林(deprenyl)、L-多巴、罗匹尼罗、普拉克索；MAOB抑制剂,如司立吉林和雷沙吉林；comP抑制剂，如托卡朋(tasmar);A-2抑制剂、多巴胺重摄取抑制剂、NMDA拮抗剂、烟碱、尼古丁激动剂和/或神经元氧化氮合酶的抑制剂)和抗阿尔茨海默病药物，如多奈哌齐、利凡斯的明、他克林、COX-2抑制剂、丙戊茶碱或美曲膦酯；-治疗急性和慢性疼痛的药剂，例如作用于中枢系统或外周系统的止痛剂，如阿片类似物或衍生物、卡巴米。秦、苯妥英、丙戊酸钠、amitryptiline或其它抗抑郁剂、朴热息痛或非甾体抗炎药；-胃肠外或局部应用的(包括吸入)局部麻醉剂，如利诺卡因或其类54似物；-抗骨质疏松剂，例如激素剂，如雷洛昔芬，或者二膦酸盐，如阿仑膦酸；-(i)类胰蛋白酶抑制剂；(ii)血小板激活因子(PAF)拮抗剂；(iii)白细胞介素转换酶(ICE)抑制剂；(iv)IMPDH抑制剂；(v)黏着分子抑制剂，包括VLA-4拮抗剂；(vi)组织蛋白酶；(vii)激酶抑制剂，例如以下激酶的抑制剂酪氨酸激酶(如Btk、Itk、Jak3MAP,抑制剂的实例可包括吉非替尼、甲磺酸伊马替尼)、丝氨酸/苏氨酸激酶(例如MAP激酶如p38、JNK、蛋白激酶A，B和C及IKK的抑制剂)，或者参与细胞周期调节的激酶(例如细胞周期蛋白依赖性激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脱氢酶抑制剂；(ix)激肽B.subl.-和/或B.sub2.-受体拮抗剂；(x)抗痛风剂，例如秋水仙》威；(xi)黄嘌呤氧化酶抑制剂，例如別噪醇；(xii)促尿酸尿剂，例如丙磺舒、磺吡酮和/或苯溴马隆；(xiii)生长激素促分泌素；(xiv)转化生长因子(TGFP);(xv)血小板衍生生长因子(PDGF);(xvi)成纤维细胞生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);(xvii)粒细胞巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF);(xviii)辣椒素软膏；(xix)速激肽NK.subl.和/或NK.sub3.受体拮抗剂，如NKP-608C、SB-233412(他奈坦)和/或D-4418;(xx)弹性蛋白酶抑制剂，例如UT-77和/或ZD-0892;(xxi)TNF-a转换酶抑制剂(TACE);(xxii)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂或者(xxiii)在TH2细胞上表达的化学引诱物受体同源物分子(如CRTH2拮抗剂)；(xxiv)P38的抑制剂；(xxv)调节Toll样受体(TLR)的功能的药剂和(xxvi)调节嘌呤能受体的活性的药剂，如P2X7;(xxvii)转录因子激活的抑制剂，如NPkB、API和/或STATS。抑制剂可以是特异性的，或者可以是混合抑制剂，例如靶向超过一个上述分子(例如受体)或分子类别的抑制剂。结合成员还可与化学治疗剂如酪氨酸激酶抑制剂if关合，以共给予或免疫缀合物的形式使用。所述抗体的片段还可用于通过重組机制或生化偶if关获得的双特异性抗体，然后将上述抗体的特异性与其他能够识别参与涉及IgE的活性的其他分子的抗体的特异性相关联。对于治疗炎性疾病，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、哮喘、过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)或牛皮癣，可将本发明的结合成员与一种或多种药剂进行组合，例如非甾体抗炎药剂(下文称NSAIDs)，包括非选择性环氧合酶(COX)-l/COX-2抑制剂，不管是局部应用还是全身应用，如吡罗昔康、双氯芬酸、丙酸如萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、酮洛芬和布洛芬、芬那酸如曱芬那酸、巧l。朵美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑啉酮如苯基丁氮酮、水杨酸如阿司匹林)；选择性COX-2抑制剂(如美洛昔康、塞来考昔、罗非考昔、伐地考昔、lumarocoxib、帕瑞考昔和依托考昔)；环氧合酶抑制性氧化氮供体(cyclo-oxygenaseinhibitingnitricoxidedonors，CINODs);4唐皮质类固醇(不管通过局部、口服、肌肉内、静脉内还是关节内途径)；曱氨喋呤、来氟米特；羟氯喹、d-青霉胺、金诺芬(auranofm)或其他胃肠外或口服金制品；止痛剂；双醋瑞因；关节内治疗，如透明质酸衍生物；和营养补充物如葡糖胺。本发明的结合成员和一种或多种上述的另外医药成分可用于药物的制造中。药物可供单独或组合给予个体，因此可包含结合成员和另外成分作为组合制品或作为单独制品。单独制品可用来帮助单独的和依次的或同时的给予，使得各成分可通过不同的途径来给予，例如口服和胃肠外给予。根据本发明，可将所提供的组合物给予哺乳动物。给予通常是以"治疗有效量，，给予，这足以显示对患者的好处。这种好处可以至少是至少一种症状的改善。实际的给予量、给予的速度和时程，要取决于所治疗疾病的性质和严重性、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病恙的原因、组合物的递送部位、结合成员的类型、给予方法、给予时序安排和执业医生知道的其他因素。治疗的处方，例如有关剂量等的决定，是在一般执业者和其他医师的责任范围内，可根据症状的严重性和/或所治疗疾病的进展而定。抗体的适当剂量是本领域公知的[参考文献67,68]。可以使用本文中或者Physician'sDeskReference(2003)中所指明的对所给予的药物的类型适当的具体剂量。本发明结合成员的治疗有效量或合适剂量，可通过在动物模型中比较其体外活性和体内活性来确定。将小鼠和其他试验动物中的有效剂量外推到人类的方法是公知的。精确的剂量要取决于多个因素，包括抗体是用于诊断、预防还是用于治疗、要治疗的区域的大小和位置、抗体的准确性质(例如完全抗体、片段或双抗体)和任何可才企测标记或与抗体连接的其他分子的性质。典型的抗体剂量，对于全身应用而言会在100pg-lg的范围，对于局部应用而言在1吗-1mg的范围。一开始可给予较高的负荷剂量(loadingdose),然后给予一个或多个较低的剂量。通常，抗体将是完全抗体，例如IgGl同种型、IgG2同种型、IgG3同种型或IgG4同种型。这是对于成人患者的单次治疗的剂量，对于儿童和婴儿可按比例调整，对于其他抗体形式也可按分子量比例调整。治疗可由医生处置，按每日一次、每周两次、每周一次或每月一次的时间间隔重复进行。治疗可以是对于皮下给予而言每两到四周进行，对于静脉内给予而言每四到八周进行。治疗可以是周期性的，各次给予之间的时间为约两周或更长时间，例如约三周或更长时间，约四周或更长时间，或者约一个月。治疗可以在手术之前和/或之后给予，和/或可以直接在手术治疗的解剖部位给予或应用。表格和附图的简述表1列出抗体1-28中每一个抗体的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列。表2a显示在受体-配体结合HTRF⑧测定法中试验时从定向诱变文库鉴定的克隆的示例性效价。表2b显示用SPR(BIACORE)获得的示例性的本发明结合成员与人IgE和食蟹猴IgE的结合亲和力(KD)。表2b进一步显示示例性的本发明结合成员在RBL-ER51钙信号转导测定(25ng/ml人或100ng/ml食蟹猴IgE,在4小时时)中的效价，以IC50表示。列，序列表中的SEQIDNO与表3a中所示的对应。表3b显示所附序列表中所示的、来自临时申请的示例性的本发明结合成员的VLDNA和VL氨基酸序列，序列表中的SEQIDNO与表3b中所示的对应。表4.种系化抗体用BIAcore得到的示例性结合亲和力计算值和用RBL-ER51钩信号转导测定法得到的效价测量值。表5显示在对相互作用1的X射线晶体学研究中IgECs3-Cs4和抗体11Fab之间的直接相互作用。表6显示在对相互作用2的X射线晶体学研究中IgECs3-Cs4和抗体11Fab之间的直接相互作用。表7显示X射线晶体学研究的晶体参数和X射线数据处理和精确统计(RefinementStatistics)。表8显示安全性研究中的研究设计概要(实施例8)。图1代表实施例2.7,在x轴上显示以log表示的抗体摩尔浓度，在y轴上显示在RBL-ER51钓信号转导测定中的峰高。空心正方形指抗体ll，十字号指不相关的IgGl对照抗体，空心倒三角形指抗IgE交if关抗体(Biosource)。注意在本图中空心正方形和十字号互相重叠。图2显示食蟹猴Cs3-4FLAGHislO的序列。图3显示编码人抗雌二醇scFv(D12J/H)和食蟹猴IgHE基因单元型(hapIotype)之一(cylgHETQ)的可变重链的序列。图4显示编码人抗雌二醇scFv(D12—VH)和食蟹猴IgHE基因单元型之一(cylgHEME)的可变重链的序列。图5显示人抗雌二醇scFv(D12一VL)和食蟹猴人恒定区基因cylGLC4的可变轻链的序列，序列范围1-708。58图6显示人抗雌二醇scFv(D12—VL)和食蟹猴、恒定区基因cyIGLC7的可变轻链的序列。图7涉及实施例3,显示在没有用封闭性抗IgE处理的B细胞中最大IgE表达的抑制百分数，其中x轴是抗体11的浓度(nM)，y轴是抑制百分数。上曲线指抗体ll,下曲线指对照抗体。图8涉及实施例4,显示(3己糖胺酶的总释放的抑制百分数+/-SEM,其中x轴是抗体11的浓度(nM),y轴是抑制百分数。上曲线指抗体ll,下曲线指对照抗体。图9涉及实施例5。该图显示随着抗IgE抗体即抗体11的浓度的提高，人血清中结合的IgE的百分数。x轴表示抗体11的浓度(微克/ml),y轴显示结合的IgE的量(以作为总IgE的函数分析和作图的游离IgE的百分数表示)。图10涉及实施例7，显示a)IgECs3-Cs4二聚体的带状显示图(ribbonrepresentation)，其中两个单体示为igEl和lgE2，与两个抗体11Fab分子发生相互作用。Asn394处的糖基化以球棍模型显示；和b)90。旋转俯视图，显示出来自Fab片段的与IgE的相互作用大部分是由重链提供。该图是用PyMOL程序(DeLanoScientificLLC,SanCarlos，California,U.S.A)产生。图11涉及实施例7，显示IgE的位置Asn394处的糖基化。图12涉及实施例8,显示抗体11IgG。抗体11IgGz和E48在食蟹猴中投与1mg/kg(第1天)、30mg/kg(第8天)和100mg/kg(第16天及以后)剂量后的平均毒性动力学曲线。误差条代表标准偏差。y轴是抗体的血清浓度，x轴是第一次投与后的时间(天数)。组l(抗体11IgG1)用实心圓圏表示，组2(抗体11IgG2)用空心三角形表示，组3(另外的抗IgE分子E48)用实心正方形表示。图13涉及实施例8,显示每周投与抗体11IgG,、抗体11IgG2和E48(第1天1mg/kg、第8天30mg/kg和第16天及以后100mg/kg)方形表示。图14涉及实施例8，显示组1动物(用抗体11处理)的血小板数目(x109/L,以相对于2个投与前数值的平均值的变化百分数表示)对血浆浓度的曲线。该曲线代表了3个组中没有显示对血小板的显著作用的其他16只动物。x轴显示时间(小时)，左y轴显示血小板水平(以相对于处理前平均水平的变化百分数表示)，左y轴显示抗IgE抗体的浓度(nmol/L)。封闭(closed)正方形表示血小板浓度，实心菱形表示抗IgE抗体的浓度。封闭三角形表示抗IgE抗体的投与量(mg/kg)。图15涉及实施例8,显示组1某只动物(用抗体11IgGl处理)的血小板数目(x109/L,以相对于2个投与前数值的平均值的变化百分数表示)对血浆浓度的曲线，该只动物在第29天显示出血小板数目的短暂显著下降(比基线值低35%)。x轴显示时间(小时)，左y轴显示血小板水平(以相对于处理前平均水平的变化百分数表示)，左y轴显示抗lgE抗体的浓度(nmol/L)。封闭正方形表示血小板浓度，实心菱形表示抗IgE抗体的浓度。封闭三角形表示抗IgE抗体的投与量(mg/kg)。图16涉及实施例9,显示抗体11对IgE/FceRI介导的细月包毒性的抑制。x轴是抗体11的摩尔浓度，y轴是细胞毒性百分数。在图中，空心三角形和实心圆圈代表Movl8IgE实验，其中空心三角形是同种型对照，实心圆圈是抗体ll,且在图中，粗体空心三角形(隐藏在图的右手边的各点下方)和空心圆圏表示NIPIgE对照，其中空心粗体三角形是同种型对照，空心圆圈是抗体ll。图17涉及实施例9,显示抗体11对IgE/CD23介导的吞噬作用的抑制。x轴是抗体11的摩尔浓度，y轴是吞噬作用百分数。在图中，三角形和实心圆圏代表Movl8IgE实验，其中空心三角形是同种型对照，实心圓圏是抗体ll，且在图中，粗体空心三角形和空心圓圏表示NIPIgE对照，其中空心粗体三角形是同种型对照，空心圆圈是抗体11。实施例使用克隆到基于丝状噬菌体M13的噬菌粒载体的幼稚人单链Fv(scFv)噬菌体展示文库，来进行选择[参考文献69，70]。在重组人IgE上使用一系列的选择循环，从噬菌体展示文库分离抗IgE特异性scFv抗体。对选出的scFv抗体在与人IgE的结合和/或效价方面进行优化，并重形成(reformat)IgG抗体。序列示例性的本发明结合成员的序列在所附序列表中显示，其中SEQIDNO对应于下表3a中所示，其中i)在抗体编号后跟着GL的情况中，例如8GL,这是指其中一个或多个残基已被突变回到种系构型的抗体，一般来说，在使用GL的情况中，所有的能突变回到种系而没有可观的活性损失的非种系残基已被种系化；和ii)在抗体编号后跟着PGL的情况中，例如11PGL,这是指其中一个或多个残基已被突变回到种系构型的抗体，一般来说，在使用PGL的情况中，有比GL更多的残基已被突变回到种系，但导致与非种系化者相比有一定的活性损失。表3a<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>HCDR21095HCDR310335VL脂A10336VL/氨基酸1098LCDRI1099LCDR210100LCDR311101VH/DNA11102VH/氨基酸1103HCDR111104HCDR2n105HCDR3ii337VL/DNAii338VL/氨基酸ii108LCDR1ii109LCDR2ii1101XDR312111VH/DNA12112VH/氨基酸12113HCDR112114HCDR212115HCDR312339VL/DNA12340VL/氨基酸12118LCDR112119LCDR212120LCDR313121VH扁A13122VH/氨基酸13123HCDR113-124HCDR213125HCDR313341VL脂A13342VL/氨基酸13128LCDR113129LCDR213130LCDR3143VH細A14132VH/氨基酸14133HCDR114134HCDR214135HCDR314343VL纖A14344VL/氨基酸14138LCDR164<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>11PGL315LCDR2和在本公司进行了修饰)一起在溶液中温育。然后，按珠粒生产商的建议,将结合抗原的scFv-噬菌体捕捉在链霉亲和素包被的顺磁性珠粒(DynabeadsM280)上。然后按之前的描述(Vaughan等人，NatureBiotechnology14:309-314(1996))将所选的scFv-噬菌体颗粒回收，在递减浓度的生物-人IgE的存在下重复进行选择过程((250nM-25pM,5轮选择)。完成5轮选择后，将VH和VL随机化文库进行组合，形成其中各克隆含有随机配对的个体随机化VH和VL序列的单一文库。然后按之前的描述在递减浓度的生物人IgE的存在下继续进行选择(100pM-lpM,再进行3轮选择)。2.2^戎傳-鉱傳^^溯Ot法姿;t^;t命谬^r攻遽^^發将来自定向诱变选择结果(selectionoutput)的scFv表达在细菌周质中，在表位竟争HTRF(均相时间分辨荧光)测定模式中对其进行筛选，确定其对标记上铕穴状化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的人IgE(U266形r生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])与抗人IgE的结合(抗体1,在实施例1分离)的抑制作用。详细的测定方法在"材料和方法，，章节中提供。将显示显著抑制作用的scFv进行DNA测序，将独特的scFv制备成纯化制品。23趟必^^cFv乂,/g五^Fcei/^潜合^/伊教在受体-配体结合HTRF(均相时间分辨荧光)测定才莫式中，试验纯化的scFv对标记上铕穴状化合物(CISbioInternational62JEUSPEA)的人IgE(U266书亍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第p"9-167页])或食蟹猴IgE(重组的，参见"材料和方法，，)与人FcsRl-Fc(本公司NSOcell所产生)的结合的抑制作用。示例性的scFv效价数据在表2a中列出。表2a:在受体-配体结合HTRF⑧测定中试验时从定向诱变文库鉴定到的克隆的示例性效价<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>抗体281(n=l)7(n=l)么4趟必W/gG^"i^Z-五/"勿f哞辨/,#脊^^#賴在重形成IgG后，用改进的RBL-ER51钙信号转导测定法，测出优化的克隆的效价。这个测定法是从先导分离时所使用的方法改进而来，以改善效价更高的抗体的检测灵敏度。该方案的详细描述在"材料和方法，，章节中提供。对人和食蟹猴IgE的IC5Q效价的数据在表2b中给出。表2b:对优化抗体用BIAcore进行的结合亲和力计算和用RBL-ER51钙信号转导测定进行的效价测量RBL-ER51钙信号转导BiacoreKD(nM)IC50(nM)抗体(几何平均值)几何平均值(95%CI)人IgE食蟹猴IgE人IgE食蟹猴IgE42.18.00扁0.151(0.039-0.199)(0.086-0.265)2.47.90.091(0.005-1.79)0.18162.13.70.0960.16882.66.30.112(0.02-0.62)0.188(0.103-0.340)111.69.30細(0.042-0.12)0.153(0.068-0.34)122.32300.1340.334132.39.90駕(0.038-0.02)0.244(0.134-0.43)164.6620.292(0.10-0.85)4.38188.00.5322.97192.57.90.095(0.043-0.21)0,111(0.008-1.55)203.310.50.1910.31210.3063.58220.2622.66232.74.30.1090.523260.3985.1283.27.20.0990.253(0.017-0.586)782.5.神,秀化fGWvn/z'油gj将优化的抗IgE抗体的Vh和Vi结构域的氨基酸序列，与VBASE数据库(Tomlinson1997;JournalofMolecularbiology,224.487-499)中的已知的人种系序列进行比对，通过序列相似性鉴定出最接近的种系。对于抗体1语系的VH结构域，最接近的种系是VhlDP-3(l-f)。对于VL结构域，最接近的种系VXlDPL8(le)。不考虑保持不变的Vernier残基(Foote&Winter1992),在抗体1的VH结构域的构架中有10个偏离种系的变化，在VL结构域中有2个。将VH结构域中的5个变化和VL结构域中的两个变化回复到最接近的种系序列，以相同地(identically)匹配人抗体。VH结构域的Kabat编号l、20、82a、83和89处的变化保持不变，以保留效价(抗体8GL和抗体11GL)。以适当的诱变引物，用标准的定点诱变技术，对这些氨基酸残基进行种系化。然后对种系化的IgG进行再评估，以确认亲和力或效价没有降低。种系化(GL)抗体的示例性亲和力和效价在表4中提供。4('W神^必W戎琳^5"co"迷/fW^"辨遂潜合黃和力伊岸弄^及i5i:-五i5J^/,子脊^抓定遽斤W妓汾浙量<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>2.6銷^^/g(^/7g￡与CD"^错吾^^伊浙用之前描述的IM9结合测定法，对一些优化的抗体评估其对IgE/CD23相互作用的抑制作用。发现在这个系统中试验的抗体能抑制gE/CD23相互作用。抗体8和抗体11的ICso值分别为16.5nM和23nM。2.7FcsW潜合的/g五的Jt炎用RBL-ER51钙信号转导测定法，评估了一些优化抗体与FcsRI结合的IgE交联的潜力。给"材料和方法"中描述的RBL-ER51细胞最大地负荷IgE。将优化抗体与IgE荷载细胞一起温育，评估它们刺激4丐应答的能力。没能检测到信号转导(图1)。2.&D五ZJ^Z4(^衷在f爭JV定哞的遂举嫂和类fit义^^'胜用如前所述的DELFIA⑧表位竟争测定法(参见1.6节和"材料和方法")，对先导抗体的选择性和类型交叉反应性进行再评估。在每个测定中试验了纯化的IgA、IgM、IgD和IgG(均获自Calbiochem)的被滴定液，以确定在测定中由IC50值测量出的每个结构相关蛋白的特异性概况。在每个测定中试^r了IgE各类型的被滴定液，这些类型包括人IgE入(U266衍生的)、人IgEK(Calbiochem)、食蟹猴IgECe3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)和人IgECe3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)，以确定抗体的类型交叉反应性。全长人IgE入和K以及人和食蟹猴IgECs3-Cs4结构域产生了抑制曲线。对于任何结构相关人蛋白(IgA、IgM、IgD和IgG)，没有观察到抑制情况。这些数据证明，所试验的一批抗体能结合人IgEX和K、IgE的Cs4-Ce4结构域，对食蟹猴IgE有交叉反应性。但是，这些抗体不能结合与IgE最相关的蛋白质。-^岸炎'必义J^么黄和力炎兹基本上按Karisson等人,1991;JournalofImmunologicalMethods145(1-2)229-240的描述，用BIAcore2000生物传感器(BIAcoreAB)，通过表面等离振子共振，测定代表性数目的克隆的纯化IgG样品对人和食蟹猴IgE的结合亲和力。筒单的说，按照生产商的说明书80(BIAcore),用标准的胺偶联试剂将G蛋白(SigmaAldrich,P4689)共价结合到CM5传感器芯片的表面。用这个G蛋白表面通过Fc结构域捕捉纯化的抗IgE抗体，以提供50RU的表面密度。使在HBS-EP緩沖液(BIAcoreAB)中以125nM和7.6nM之间的一系列浓度制备的人IgEX或食蟹猴IgE经过传感器芯片表面。在各次抗体注射之间，用lOmM甘氨酸，pH1.75使表面再生。所得的传感图谱用BIA评估3.1软件进行评估，并拟合二价分析物模型(bivalentanalytemodel),以提供相对结合数据。试验的IgE的示例性亲和力在表2b和表4中显示。材料和方法-实施例1和2采趁化的scFv乂,/g五与Fcs/7的潜合的,尸斜在基于受体-酉己体结合均相FRET(荧光共振能量转移)的测定模式中，对选择结果筛选其是否能抑制标记上铕螯合物(PerkinElmer1244-302)的人IgE(Calbiochem401152)与人FcsRI-Fc(本公司NSO细胞所产生)的结合。先导分离期间的结果作为含有未纯化scFv的未稀释细胞周质提取物进行筛选，制备于50mMMOPS緩冲液pH7.4，0.5mMEDTA和0.5M山梨糖醇中。将15(il的未纯化scFv样品加到384孔测定板(PerkinElmer6006280)。接着加入15(il的llnM人FcsRI-Fc(基于260kDa的分子量)、15pi的40nM标记上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的抗人FcIgG，然后加入15|il的0.75nM铕标记人IgE。用300nM人IgE(Calbiochem)定义非特异性对照结合。所有稀释都在含有250mM氯化钠和0.05%Tween20(测定緩冲液)的50mMTris-HCl(pH7.8)中进行。接着将各测定板在室温下温育1.5小时，然后用VICTOR2读板器(PerkinElmer)在615nm和665nm发射波长处依次读取时间分辨荧光。数据通过VICTOR2软件归一化，以计算每秒计数(CPS)。随后用CPS值如方程1所迷计算％特异性结合。方程1:%特异性结合=(样品的CPS-非特异性结合对照的CPS)X100(总结合^j"照-非特异性结合对照的CPS)磁^的scFv乂:/7g五与FceW的/#合的#尸#在基于受体-配体结合均相FRET(荧光共振能量转移)的测定模式中，对来自筛选工作所鉴定到的阳性克隆的纯化scFV，试验其对标记上铕螯合物(PerkinElmer1244-302)的人IgE(Calbiochem401152)与人FcsRI-Fc(本公司NSO细胞所产生)的结合的抑制作用。利用scFv浓度的滴定，以确定在测定中由IC5o值测量的scFv效价。将15ial的纯化scFv样品被滴定液加到384孔测定板(PerkinElmer6006280)。接着加入15pi的llnM人FceRI-Fc(基于260kDa的分子量)、15pl的40nM标记上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的抗人FcIgG,然后加入15|al的0.75nM铕标记人IgE。用300nM人IgE(Calbiochem)定义非特异性对照结合。所有稀释都在含有250mM氯化钠和0.05%Tween20(测定緩冲液)的50mMTris-HCl(pH7.8)中进行。接着将各测定板在室温下温育1.5小时，然后用VICTOR2读板器(PerkinElmer)在615nm和665nm发射波长处依次读取时间分辨焚光。数据通过VICTOR2软件归一化，以计算每秒计数(CPS)。随后用CPS值如方程1所述计算％特异性结合。方程1:%特异性结合=82f样品的CPS-非特异性结合对照的CPS)X100(总结合对照-非特异性结合对照的CPS)使用GraphPadPrism软件，用四参数logistic方程(方程2)通过曲线拟合测定ICs。值。方程2:Y:最小值(bottom)+(最大值(top)-最小值)/(l+10A((LogEC50-Xy斜率(HillSlope)))X是浓度的对数。Y是特异性结合。Y从最小值开始，以S形状到达最大值。遂化^scFvf口/g(在處定脊染^"乂Fcei/勿/《^isu/B勿應^^tv^t^脊^^#浙用RBL-ER514丐信号转导测定法，评估纯化的scFv和IgG制品对通过FcsRI介导的人IgE生物活性的中和效价。将人FceRI从人外周血淋巴细胞克隆到pcDNA3.1载体中，用标准的电穿孔方法转染到RBL-2H3细胞(大鼠嗜碱性细胞系)中。将转染的细胞通过有限稀释进行克隆，分析表面FcsRI表达情况。将所得的RBL-ER51细胞维持在含有G418(Invitrogen10131-027)的培养基中，以保持稳定的受体表达。细胞附近的游离IgE会结合FcsRI,受体结合的IgE随后的交联会导致能用荧光成像读板器(FLIPR)检测的钙动员。将RBL-ER51细胞以5xl0Vl00iil/孔的密度接种到96孔黑壁平底的姐织培养处理过的板(Costar),其中的各孔在培养基[DMEM(Invitrogen41966)，含9%v/v非热灭活FBS(Invitrogen10100-147)和400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，接着在370C,5%C02下温育18-24小时。这个时间后，将培养基吸出，保持细胞单层完整，换上100uL/孔的FLUO-4AM荷载緩沖液[DMEM,含0.1%FBS,20mM说明书第79/122页HEPES,2.5mM丙磺舒(probenicid)和2ug/mLFLUO-4AM(TeffLabs)]在37°C，5%C02下保持1-2小时。将荷载緩冲液吸出,用200uL/孔的PBS洗涤细胞3次。将最终洗涤液吸出，换上70uL/孔的FLIPR緩冲液[125mMNaCl2,5nMKCl，lmMMgCl2，1.5mMCaCl2，30mMHepes,2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01%v/vFCS]。将各板在37°C,5%C02下温育5-45分钟。将纯化的scFv或IgG的试验溶液(一式两份)在V底板(Greiner)中稀释在FLIPR緩冲液中至期望的浓度。不抗IgE的非相关抗体用作阴性对照。将IgE(Calbiochem或U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])在FLIPR緩冲液中制备，与适当的试验抗体混合，产生在40(il/孔的总体积中3.33pg/mL的最终IgE浓度。将测定中所使用的IgE的浓度，选择成在最终测定浓度下产生最大钙应答的大约80%的这么一个剂量。所有样品在室温下温育30分钟，然后将的IgE/抗体混合物转移到以上制备的荷载染料的细胞中。将各测定板在37。C下温育10分钟，让游离IgE结合RBL-ER51细胞。为测量加入交联性抗IgE后的钙动员，将FLIPR(MolecularDevices)按照生产商说明书校准以进行合适的暴露。将稀释于FLIPR緩沖液的抗IgE(BiosourceAffl0501)加到测定板中，至lOug/mL的最终浓度。以1秒的间隔时间进行80次测量，然后以8秒的时间间隔进行40次测量，记录FLUO-4AM染料的荧光。输出每个孔的峰值应答，然后用GraphpadPrism软件分析数据。i^丄-五i57叙應#^我/g￡Jt^的^/量为测量纯化的IgG交联FcsRI结合的IgE的能力，按抑制测定中所述制备RBL-ER51细胞并荷载染料。将细胞在稀释于FLIPR緩冲液的1OOuL的lug/mL人IgE(Calbiochem或U266书亍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])中温育10分钟，以让IgE结合细胞表面上的FcsRI。将测定中所使用的IgE的浓84度，选择成产生最大钙应答的大约80%的这么一个剂量。为测量加入交联性抗IgE后的钙动员，将FLIPR(MolecularDevices)按照生产商说明书校准以进行合适的暴露。将在FLIPR緩沖液中稀释至适当浓度的30uL试验抗体加到荷载IgE的测定板。用抗IgE(BiosourceAHI0501)作为阳性对照。以1秒的间隔时间进行80次测量，然后以8秒的时间间隔进行40次测量，记录FLUO-4AM染料(TeffLabs)的焚光。输出每个孔的峰值应答，然后用GraphpadPrism软件分析数据。戎傳在/)￡丄尸"@《扭^爭W/;t^w这举^和类型x叉^:,^将纯化的IgG以这样一个浓度吸附到96孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)(于PBS中)上，该浓度是当将生物素酰化的人IgE以大约其对该特定IgG的估计KD加入时，产生出显著的信号。用PBS-Tween(0.1%v/v)洗去过量的IgG,并用PBS-Marvel(3%w/v)封闭各孔1小时。以生物素酰化人IgE与分别的IgG之间的相互作用KD值的大约1000倍的浓度开始，在PBS中制备每个以下竟争物(competitor)的稀释系列人IgEX(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986,MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])、人IgEK(Calbiochem)、人IgECe3-Ce4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)、食蟹猴IgECs3-Cs4结构域(本公司HEK-EBNA衍生的)、人IgA、IgM、IgD和IgD(均获自Calbiochem)。向这个系列加入等体积的浓度大约在KD的生物素酰化人IgE(产生出以竟争抗原:生物素酰化人IgE为大约1000:1的这么一个比例开始的系列)。然后将这些混合物转移到被封闭的IgG，让它们平衡1小时。用PBS-Tween(0.1%v/v)洗涤除去未结合的抗原，而剩余的生物素酰化人IgE通过链霉亲和素-铕3+缀合物进行检测(DELFIA⑧检测，PerkinElmer)。在EnVision读板器(PerkinEImer)上620nm处测量时间分辨荧光。用GraphpadPrism或Microsoft"Excel软件分析荧光数据。^在傳-豕傳^必解定法#定^遽嫂《^以表位竟争HTRF(均相时间分辨荧光)测定模式，对选择输出(selectionoutput)筛选其对标记上铕穴状化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的穴状化合物标记人IgE(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pi59-167页])与抗人IgE抗体(抗体)的结合的抑制作用。在先导优化过程中，选择输出作为含有未纯化scFv的未稀释或稀释细胞周质提取物进行筛选，制备于50mMMOPS緩沖液pH7.4,0.5mMEDTA和0.5M山梨糖醇中。，将4nM抗人IgE抗体与标记上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的20nM抗人FcIgG进行预混合。将10jul的未纯化的scFv样品加到384孔低容量测定板(Costar3676)。接着加入5(il的抗人IgE抗体抗Fc-XL665混合物(mix),然后加入5)il的穴状化合物标记人IgE(大约2.3nM穴状化合物标记人IgE)的1/245稀释液。用300nM人IgE(U266书f生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])定义非特异性对照结合。所有稀释都在含有0.4M氟化钾和0.1%BSA的磷酸緩沖盐水(PBS)(测定緩沖液)中进行。然后将测定板在室温下lOOOrpm离心1分钟，在室温下温育3小时，接着用EnVision读板器(PerkinElmer)于620nm和665nm发射波长处读取时间分辨荧光。通过计算每个样品的％DeltaF值对数据进行分析。DeltaF按照方程1进行测定。方程1:%DeltaF=(样品665nm/620nm比值)-C非特异性对照665nm/620nm比值)X100(非特异性对照665nm/620nm比值)随后用％DeltaF值按方程2所述计算。/。特异性结合。方程2:0/0特异性结合=_样品的％DeltaFX100总结合对照的％DeltaF攻遽的scFvf磁化^j^/"/g五与FcgW的潜合^#斜以受体-配体结合HTRF⑧(均相时间分辨焚光)测定模式，对纯化的scFv试验其对标记上铕穴状化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的人IgE(U266衍生的[Ikeyama等人.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])或食蟹猴IgE(重组的，参见"材料和方法，，)与人FcsRl-Fc(本公司NS0细胞产生的)的结合的抑制作用。利用scFv浓度的滴定，以确定在测定中由IC5o测量出的scFv功效。将1.9nM人FcsRl-Fc(基于260kDa的分子量)与标记上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的20nM抗人FcIgG进行预混合。将10)ul的纯化scFv样品被滴定液加到384孔低容量测定板(Costar3676)。接着加入5pi的FcsRl-Fc抗Fc-XL665混合物，然后加入5pi的穴状化合物标记的人或食蟹猴IgE的1/197稀释液(大约2.9nM穴状化合物标记的人或食蟹猴IgE)。用300nM的人或食蟹猴IgE(本公司衍生的)定义非特异性对照结合。所有稀释都在含有0.4M氟化钾和0.1%BSA的磷酸緩冲盐水(PBS)(测定緩冲液)中进行。然后将测定板在室温下lOOOrpm离心1分钟，在室温下温育3小时，接着用EnVision读板器(PerkinElmer)于620nm和665nm发射波长处读JF又时间分辨荧光。通过计算每个样品的。/。DeltaF值对数据进行分析。DeltaF按照方程l进行测定。方程l:%DeltaF=(样品665nm/620nm比值〗-(非特异性对照665nm/620nm比值)X00(非特异性对照665nm/620nm比值)随后用％DeltaF值按方程2所述计算％特异性结合。方程2:%特异性结合=_样品的％DeltaF_X100总结合对照的％DeltaF使用GraphPadPrism软件，用四参数logistic方程进行曲线拟合，测定IC5。值(方程3)。方程3:Y二最小值+(最大值-最小值)/(l+10A((LogEC50-Xf斜率》X是浓度的对数。Y是特异性结合。Y从最小值开始，以S形状到达最大值。^/^Hi5/辨/,##^浙定#婆定攻遽^^/^以对先导分离所述的RBL-ER51钙信号转导测定法的修正版本，评估来自改进的抗体的纯化IgG制品的中和功效。将RBL-ER51细胞以5xl0Vl00jil/孔的密度接种到96孔黑壁平底的組织培养处理过的板(Costar),其中的各孔在培养基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非热灭活FBS(Invitrogen10100-147)和400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，并在37。C,5%C02下温育18-24小时。这个时间后，将培养基吸出，换上50uL/孔的试验抗体(6.67nM-1.33pM)于测定培养基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非热灭活的FBS(Invitrogen10100-147)、400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)和1.6%青霉素/链霉素(Invitrogen15140-122)]中的稀释液，然后加入稀释于测定培养基中以分别产生25ng/mL和lOOng/ml的最终IgE浓度的IgE[人(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])或食蟹猴(重组的，参见"材料和方法")]。将各测定板在37°C,5%C02下温育4小时。这个时间后，将抗体/IgE混合物吸出，保持细胞单层完整，换上100uL/孔的FLUO-4AM荷载緩沖液[DMEM,含0.1%FBS,20mMHEPES,2.5mM丙磺舒和2ug/mLFLUO-4AM(Invitrogen)]在37°C，5%C02下保持1-2小时。将荷载緩沖液吸出,用200uL/孔的PBS洗涤细胞3次。将最终洗涤液吸出，换上100uL/孔的FLIPR緩沖液[125mMNaCl2,5nMKC1,lmMMgCl2,1.5mMCaCl2，30rnMHepes,2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01%v/vFCS]。将各板在37°C,5%C02下温育5-45分钟。为测量加入交联性抗IgE后的4丐动员，将FLIPR(MolecularDevices)按照生产商说明书校准以进行合适的暴露。将稀释于FLIPR緩冲液的抗IgE(BiosourceAffl0501)加到测定板中，至2.3ug/mL(以交联人IgE)或20ug/mL(以交联食蟹猴IgE)的最终浓度。以1秒的间隔时间进行80次测量，然后以3秒的时间间隔进行40次测量，记录FLUO-4AM染料的焚光。输出每个孔的峰值应答，然后用GraphpadPrism软件分析数据。说'化我傳J^Fce//潜合W/g5^x^的^/量为测量纯化的IgG交联FceRI结合的IgE的能力，按抑制测定中所述制备RBL-ER51细胞以评估改进的抗体。将RBL-ER51细胞以5xl(yVl00^d/孔的密度接种到96孔黑壁平底的组织培养处理过的板(Costar),其中的各孔在培养基[DMEM(Invitrogen41966)，含9%v/v非热灭活FBS(Invitrogen10100-147)和400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，并在37。C，5。/。C02下温育18-24小时。这个时间后，将培养基吸出，换上100uL/孔的于测定培养基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非热灭活FBS(Invitrogen10100-147)、400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)和1.6%青霉素/链霉素(Invitrogen15140-122)]中稀释至lug/mL的人IgE(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167页])。选定IgE浓度，以产生RBL-ER51细胞的最大负荷。将各测定板在37QC,5%C02下温育4小时。这个时间后，将IgE溶液吸出，保持细胞单层完整，换上100uL/89孔的FLUO-4AM荷载緩冲液[DMEM，含0.1%FBS，20mMHEPES,2.5mM丙磺舒和2ug/mLFLUO-4AM(Invitrogen)]在37°C，5%C02下保持1-2小时。将荷载緩冲液吸出,用200uL/孔的PBS洗涤细胞3次。将最终洗涤液吸出，换上100uL/孔的FLIPR緩沖液[125mMNaCl2，5nMKC1,lmMMgCl2,1.5mMCaCl2,30mMH印es，2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01°/。v/vFCS]。将各板在37°C,5%C02下温育5-45分钟。为测量加入交联性抗IgE(1.53uM-2.33nM)后的钩动员，将FLIPR(MolecularDevices)按照生产商说明书校准以进行合适的暴露。将30uL的在FLIPR緩冲液中稀释至适当浓度的试验抗体加到测定板中。用抗IgE(BiosourceAHI0501)作为阳性对照。以l秒的间隔时间进行80次测量，然后以3秒的时间间隔进行40次测量，记录FLUO-4AM染料(Invitrogen)的荧光。输出每个孔的峰值应答，然后用GraphpadPrism软件分析数据。磁化的/gG对/g五与/M9细/《J:的CD"的潜合的一伊浙用IM9细胞结合测定法，评估抗体是否能抑制IgE/CD23相互作用。用标准的组织培养程序，将IM9细胞(人B细胞系)保持在培养基[RPMI1640glutamax(Invitrogen61870-010);9%v/v热灭活FBS(Invitrogen10100-147)]。'为试验优化的IgG,将IM9细胞用25ng/ml人IL-4(Peprotech,200-04)在37。C/5。/。C02下预处理3天，以上调CD23表达。收获IM9钿胞，以lxl(^个细胞/mL重悬在流动緩冲液[PBS,含10/o山羊血清(Sigma)和0.1。/oBSA流份V(Sigma)]。通过加入Fc片段(TEBU-bio)至5ug/mL的最终浓度，进行Fc受体封闭。将这个细胞悬浮液以100uL/孔接种在U形底聚丙烯板(Greiner)中，在冰上温育30分钟。在U形底聚丙烯板(Greiner)中制备抗体稀释液(667nM-lnM),并与IgE(U266书亍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-l67页])混合至10ug/mL的最终IgE浓度，在室温下保持30分钟。将各细胞板在2000rpm下离心2分钟，吸出上清液，保持细胞沉淀完整。将细胞重悬在100uL/孔的抗体/IgE混合物中，在冰上温育1小时。将各细胞^l在2000rpm下离心2分钟，吸出抗体/IgE上清液。细胞通过重悬在200uL/孔的流动緩沖液中进行洗涤，如上进行离心。用稀释1/30，v/v,100uL/孔的抗IgE藻红蛋白(Caltag)检测与细胞表面结合的IgE。将各测定板在冰上黑暗温育20分钟，然后在2000rpm下离心2分钟，如上所述用2x200uL的流动緩冲液进行洗涤。将细胞重悬在100uL细胞固定液(CellFix,BDbiosciences),用FACSCalibur(BDBiosciences)分析以检测FL2染色。数据用CellQuest软件(BDbiosciences)进行分析。输出FL2几何平均^f直焚光，然后用MicrosoftExcel和GraphpadPrism專欠件分析凄丈氺居。C^威标记才FL」G历WO乂/g五CW一的/^人IgECs3-4的片段如之前在Wurzburga/.(2000)StructureoftheHumanIgE-FcCs3-C4RevealsConformationalFlexibilityintheAntibodyEffectorDomains(人IgE-FcCs3-C4的结构揭示抗体效应子结构域中的构象挠性)中所述。用RT-PCR从IL13剌激的PBMC的总RNA扩增涵盖核苷酸2135-2868(GenBank登录号J00222)的cDNA片段。将这个PCR产物克隆到pCR2.1TA(Invitrogen)中。为使表达的蛋白质能分泌出来，和为产生掺入了符合读框的C末端FLAG表位和聚组氨酸标签(HislO)的序列，将IgECs3-4片段用掺入了5，BssHII位点和3，FLAG表位、聚组氨酸标签(HislO)和XbaI位点的引物进行PCR扩增，随后插入到pEU8.2载体中。该经修饰的pEU8.2载体含有EF-1启动子、鼠IgGl前导肽的基因组序列、oriP复制起点，该复制起点使得载体转染到表达EBNA-1基因产物的细胞系(如HEK293-EBNA细胞)中时能进行附加型质粒复制。用IMAC层析法将蛋白质从条件培养基純化，然后进行尺寸排阻91层析(SEC)纯化。C^媒标记才尸L4(7/^^的斧黉^^五通过对用包含人IgHE(IgE的重链)基因座的核苷酸l174-2989(GenBank登录号J00222)的引物从基因组DNA扩增的PCR产物进行直接测序，测定食蟹猴IgE恒定区。外显子通过与人序列的同源性进行鉴定，因此可以预测食蟹猴IgE重链恒定区的cDNA序列。合成出编码鼠IgGl前导肽的序列、食蟹猴Cs3-4(图2)及C末端FLAG表位和聚组氨酸标签的cDNA(DNA2.0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。然后使用LRGateway⑧反应(Invitrogen),将目的基因转移到表达载体pDEST12.2(Invitrogen)中，该表达载体通过插入来自pCEP4载体(Invitrogen)的oriP复制起点进行修饰，以使得转染到表达EBNA-1基因产物的细胞系(如HEKW3-EBNA细胞)中时能进行附加型质粒复制。用IMAC层析法将蛋白质从条件培养基纯化，然后进行尺寸排阻层析纯化。嵌合的D12可变区和食蟹猴IgE恒定区的产生合成出编码可变重链区域(其编码人抗雌二醇scFv(D12—VH)和两个不同的单元型食蟹猴IgHE基因(cyIGHETQ和cyIGHEME)之一的cDNA(DNA2,0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。还合成出代表可变轻链人抗雌二醇scFv(Dl2一VL)和两个食蟹猴、恒定区基因(cylGLC4和cylGLC7)之一的cDNA(DNA2.0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。然后使用LRGateway⑧反应(Invitrogen),将目的基因转移到表达载体pDEST12.2(Invitrogen)中，该表达载体通过插入来自pCEP4载体(Invitrogen)的oriP复制起点进行修饰，以使得转染到表达EBNA-1基因产物的细胞系(如HEK293-EBNA细胞)中时能进行附加型质粒复制。使用Ikeyam等人(1986)MolImmunol23pl59-67中所述的方法纯化重组嵌合IgE蛋白，该重组嵌合IgE蛋白代表着与食蟹猴IgECsl-4融合的人抗雌二醇scFv的可变重链区(图3和4)和与食蟹猴人恒定区融合的人抗雌二醇scFv的可变轻链区(图5和6)，从HEK293EBNA细胞表达。人FcsRI-Fc(本公司NSO细胞产生的)将包含核苷酸67-711(GenBank登录号NMJ)02001)的FcsRI克隆在人IgGlFc的基因组区域的上游，如同来自Persic等人(1997)187;9-18首次描述的pEU1.2。将这克隆到pcDNA3.1EcoRI-Xbal(SEQIDNO:391和392)中。通过用pcDNA3.1FcsRI—Fc构建物稳定转染NSO细胞，实现重组融合蛋白FcsRI_Fc的表达。如下建立稳定表达用G418进行选择，通过有限稀释分离克隆，和鉴定具有高表达水平的克隆。然后用A蛋白亲和层析法将FcsRI—Fc融合蛋白从条件培养基纯化，接着进行制备型尺寸排阻层析纯化。实施例3:人B细胞-胞内IgE的抑制通过在Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)上进行离心，从人肝素化全血分离外周血单核细胞(PBMC)。随后采用使用磁珠(Miltenyi)进行的阳性抗CD19选择，从PBMC群体分离B细胞。在细胞通过磁性柱过程中，收集阳性和阴性B细胞流份。将来自除B细胞外含有所有PBMC细胞的阴性B细胞流份的细胞用丝裂霉素C处理，以防止增殖。将细胞与50|ag/mL丝裂霉素C温育30分钟，然后用组织培养基(RPMI1640，含有Glutamax(Gibco)/10%FCS(Gibco)/50U/mL青霉素/50pg/mL链霉素(Gibco》进行洗涤，接着与PBS温育70分钟后进行最后洗涤，以确保所有的丝裂霉素C被去除。为诱导B细胞的分化，将4xl(^个B细胞和来自B细胞阴性流份的9.2x105个细胞接种在96孔板中，该板在补充有3.5|_iMp-巯基乙醇(Sigma)和20|ig/mL转铁蛋白(Chemicon)的组织培养基中，接着与0.001-1OOnM的抗IgE单克隆抗体或对照抗体预温育30分钟，然后加入10ng/mL的人白细胞介素-4(IL_4)。随后将细胞在加湿的C02培养箱中温育12-14天。在第12-14天，对各板稍作离心，收集上清液，用以下方案对细胞进行染色，确定是否存在胞内IgE。首先将细胞与含1%人血清的PBS—起温育10分钟，以封闭Fc受体结合。接着用BectonDickinson的Cytofix/Cytoperm试剂盒，将细胞在水上固定并透化处理。然后洗涤细胞，加入1:6最终稀释的多克隆兔抗人IgE-FITC抗体(DAKO)和1:10最终稀释的单克隆小鼠抗人CD19-RPE/Cy5抗体(DAKO)。重要的是将细胞彻底洗涤，以避免残余的抗IgE单克隆抗体的干扰。温育30分钟后，洗涤细胞，样品在使用HTS96孔板荷载装置(loaderdevice)的FACSCalibur上进行分析。然后记录CD19+群体中共表达IgE的细胞的百分数，胞内IgE的表达以不用封闭性抗IgE单克隆抗体处理的细胞中的最大IgE表达的％抑制表示。抗体11以1.6nM的IC50抑制了IgE阳性细胞的诱导(图7-上曲线)。相同形式的非相关抗体用作阴性对照(CAT-002)，它没有抑制IgE阳性细胞的诱导(图7-下曲线)。实施例4:肥大细胞系(XAD2)-p-己糖胺酶释放的抑制将LAD2细月包[v4.51.A7ra/7e打6aww等人丄ewfewz.amsearc/z27p00"]以0.25-0.6x1(^个细胞/mL的细胞密度，在补充有StemPro-34营养补充物、2mML-谷氨酰胺和100ng/mL重组人干细胞因子(rhSCF,R&D)的无血清培养基(StemPro-34，LifeTechnologies)中进行培养。对于p-己糖胺酶测定，将细胞以2.5x104个细胞/孔的密度接种，在96孔聚丙烯板中与在0.0001-100nM浓度范围的封闭性抗IgE单克隆抗体一起预温育。将细胞在37。C下温育30分钟，然后加入0.15nM浓度的IgE,再将细胞温育4小时。与IgE温育后，用緩冲液洗涤细94胞以除去任何过量的IgE,随后将结合LAD2细胞上的FceR的IgE与otlgE(600pg/mL山羊抗人IgE,Sigma)在37。C下交联30分钟。通过冷冻离心停止温育，收集细胞上清液，转移到96孔板。用Smith等人，[5"m她《/爭乂7!(7卯7J323，W7-WS]所公布的方法的稍作改进的版本，分析(3-己糖胺酶含量。简单的说，用2mMp-硝基苯基-N-乙酰-D-氨基葡糖苷(于0.2M柠檬酸盐緩冲液，pH4.5中)作为己糖胺酶的底物。加入1MTris緩冲液pH9.0停止反应。用MolecularDevices的Spectramax读数器，于405^处分光光度测量光密度(减去570nm处的数值)。计算出抗IgE单克隆抗体抑制P-己糖胺酶的释放的作用，以总释放的抑制百分数+ASEM表示。抗体ll以0.04nM的IC50抑制了(3-己糖胺酶(图8-上曲线)，而相同形式的非相关单克隆抗体(CAT-002)没有抑制f3-己糖胺酶(图8-下曲线)。实施例5:用ELISA测定抗IgE抗体与血清中IgE的结合测定法说明从来自人供体的血液样品制备血清样品。用150[J/孔的稀释于PBS的1吗/mlFcERI-Fc-His包净皮96孑LELISA板(NuncMaxisorp,No.442404),在4°C下温育过夜。过夜温育后，将各板用含有0.05%Tween20(PBST,Medicago09-9401-100)的PBS洗涤三次。为减少背景结合，随后将各板与200pl/孔的由含有0.5%BSA的PBS组成的封闭緩沖液一起，在室温下温育2小时，如上所述用PBST洗涤三次。将各样品(含有不同数量的抗IgE抗体即抗体11的人血清或血浆)和标准样(ImmunoCAP总IgE(人)校准品，Phadia,Uppsala)在舍有0.05%Tween20的PBS中稀释，在冰上保持，直到将它们以150pl/孔的体积施加到测定板。将各板密封，各样品在室温下温育2小时。为除去未结合的样品，如上所述用PBST洗涤各板三次。随后加入150(il/孔的以0.25昭/ml浓度稀释于PBST中的兔抗人IgE(D€l,30-1917-00,420036-02,841204,9911302,获自Phadia，Uppsala),以检测结合的人IgE。然后将各板再次密封，在室温下温育l小时。为除去未结合的兔抗人IgE抗体，如上所述用PBST洗涤各板三次。用HRP缀合的第二抗体(山羊抗兔IgG,HRP缀合.Pierce.0.8mg/ml)检测兔抗人IgE。将缀合物1:25000稀释于PBST,每孔加入150将各板密封，在室温下温育l小时。然后如上所述用PBST洗涤各板三次。然后向每个孔加入TMB-底物溶液(DAKO底物-色原，No.S1599),150)ul/孔，将各板在室温下温育IO分钟。通过力口入150lal/孔的终止溶液(2MH2S04)停止反应，在TecanSAFIRE仪上读取450nm吸光度。由于IC50的测量取决于测定中的配体(即IgE)浓度，在本测定中，ICso将随人血清样品中存在的IgE配体量而变。在代表性的实验中，抗体11具有202pM的IC50[图9]。在同一实验中，XoIairTM具有57nM的IC50。实施例6:IgE和纯化的IgG之间的复合物形成的测量通过高效尺寸排阻液相层析法，对纯化的人IgE和纯化的抗IgEIgG(抗体ll)之间形成的免疫复合物进行表征。另外，用在线多角度光散射(MALS)估计复合物大小。复合物是通过将IgE和IgG以三个不同的摩尔比(分别为3:1、1:1和l:3)在Dulbecco，sPBS中18。C温育1小时来形成。对于l:l摩尔比，每个蛋白质的浓度为2.5|iM。更高的比例是通过将相关蛋白质的浓度增加到7.5pM来达到。将这些样品在两根串联的Bio-S印-SEC-S4000柱(300x.8mm)上进行分析。对柱子进行平衡，样品在AgilentHP1100HPLC系统上以1ml/min的流速在Dulbecco，sPBS中进行分析。用二极管阵列检测器于220和280nm处检测各峰，还^吏洗脱液通过WyattTechnologiesDAWNEOS(MALS)和OptilabrEX(折光指数)检测器。l:l摩尔比样品的层析产生出没有完全分开的、对应于13.88分钟和14.9分钟保留时间的双峰(由UV吸光度检测)。这些保留时间表明了IgE与IgG的非共价复合物的形成。MALS分析得出1，085kDa(13.88min峰)和702kDa(14.9min峰)的分子量。这些质量与对应于异型四聚体(预测质量674kDa,2IgE:2IgG)和异型六聚体(预测质量1010kDa，3IgE:3IgG)的复合物相一致。3:1和1:3(IgE:IgG)摩尔比样品的层析分析和MALS分析得出与1:1样品相似的谱图，其中对应于异型四聚体和异型六聚体的峰可由UV吸光度检测。检测到对应于样品中过量IgE或IgG的另外的峰。实施例7:被种系化抗体ll结合的表位的测定使用X射线晶体学以原子分辨率测定蛋白质的精确3维结构，这是本领域公知的，已被用来使与抗体发生相互作用的蛋白质的各部分得到详细可视化(Padavattanetal,2007;Karpusasetd.，2001)。这是最权威性的表位作图技术，但要求相当的工作量和有赖于能够获得质量足够高的晶体，而这又取决于蛋白质样品的纯度和质量以及能够找到适当结晶条件的窍门。一旦获得蛋白质-抗体复合物的晶体，用X射线对它们进行辐照以产生衍射图样，这取决于精确的原子分布。衍射图样可由结晶学家分析，以确定结构中的原子的三维位置坐标。这使得可以详细研究蛋白质和抗体之间的相互作用位点。7J/g￡C^-CW在谬！合參的Z射i4'^傳潜栂^/定出于结构测定的目的，将IgE结构域Ce2-Ce3克隆、表达和纯化。同样，通过对开发来结合IgE的完全抗体ll进行消化和纯化，制备Fab片段。复合物是这样形成的混合，并通过尺寸排阻层析进行纯化以除去非复合的IgE结构域和Fab分子。获得了IgECe3-Cs4/Fab复合物的晶体，它们属于三方晶系空间群P3221。将它们在位于法国格勒诺布尔市(Grenoble)的欧洲同步辐射实验室(EuropeanSynchrotronRadiationFacility,ESRF)进行分析。获得了至2.85A分辨率的完全衍射数据。可使用Fab片段的可变和恒定部分作为分别的搜索才莫型，通过分子置换(MolecularReplacement,Rossman,1972)对结构进行解析，从而对晶体学不对称单元中的Fab片段进行定向和定97位。在非对称单元中总共鉴定出三个Fab片段。随后，可将三个IgECe3-Cs4分子放置在不对称中心中。每个IgE二聚体能结合两个Fab分子，从而不对称单元总共包含一个半的完全IgE/Fab复合物。7.7j7g￡Ce3-CW/^傳/7FW复合參^全面^多迷晶体结构表明，每个igECs3-Cs4二聚体以对称或接近对称的方式结合两个Fab片段(图10)。由于晶体的不对称单元包含一个半的IgE/Fab复合物，此不完全复合物能通过二重轴与毗邻的不对称单元中的对称相关伴侣形成二聚体。IgE二聚体的两个分子(表示为IgEl和IgE2)能与抗体11的Fab片段发生相互作用。大部分的相互作用是由能与IgEl和IgE2两者发生相互作用的Fab重链提供，而轻链仅被观察到与IgEl发生相互作用。抗原的表位主要位于结构域Cs3，其中位于结构域C"中的铰链近邻的一个氨基酸作出了贡献。晶体的不对称单元中的IgECe3-Ce4和Fab之间的三个相互作用位点非常相似。但是，进行精修(refinement)后清楚知道，有一个Fab分子其有序性比其他两个Fab分子低得多。这在晶体结构中是常见的，可由如下事实解释在晶体当中，特定的区域是柔韧的，能呈现不同的取向，使得电子密度不太明晰(wdldefined)。因此，在分析中不考虑这个Fab分子和它与IgECe3-Ce4分子所发生的相互作用。已知IgE在Fc区残基Asn394处发生糖基化(Wurzburg等人)。在胰蛋白酶消化后通过质谱分析对Fc糖基化的表征，显示了三个不同的与Asn394结合的聚糖变体，组成核心结构Man3GlcNAc2,并有2、3或4个己糖延伸出来，或许都是甘露糖(图11)。的确，从所有三个IgECs3IgE结构域的残基Asn394,有延伸的电子密度突出到二聚体中的两个IgE分子之间的空穴。该电子密度提示高甘露糖类型的结构，每条链中可见两个N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)和三个或四个甘露糖单元，这与质谱分析相一致。在核心结构外部只有一个己糖即与Man4偶联的Man6在电子密度中可见，这表明其余的1-3个己糖是柔韧的。7.7.2羞在^g一/份p眞topg)^潜迷这个晶体结构使得IgECs3-Cs4和Fab之间的表位相互作用得以在原子细节上进行研究。在所解析的结构中有两个独立的IgE/Fab相互作用，排除了第三个Fab分子，因为它的电子密度图4艮不清晰，对此将作描述。由用Cs位置(重叠，CCP41994)计算出的两个相当的Fab可变链片段之间0.31A的均方根差，和相当的各IgE单体之间分别为0.82和0.96A的均方根差表明，它们是十分相似的。尽管这个高相似性，两个相互作用将分别进行描述，并将分别表示为IgE/Fabl和IgE/Fab2。有关相互作用的细节收录在表5和表6中，其中残基号码含有链代号(HC:Fab重链，LC:Fab轻链，IgEl，IgE2)。抗体11的氨基酸残基的编号是根据Kabat体系(Kabat等人，1991)。距离是用CCP4程序CONTACT(CCP4,1994)获得。两个相互作用都涉及来自抗体片段的重链和轻链的互补决定区(CDR)、来自构架(Fab的CDR外部的区域)的残基和来自IgECs3-Cs4单体中的两个单体的氨基酸残基。抗体轻链与IgECs!3-Cs々二聚体中的IgEl发生相互作用，而重链与两个单体都发生相互作用。但是，大部分的接触是在抗原的重链和单体IgE2之间。这两个相互作用在下文作详细描述。7.1.3Fabl和IgE的相互作用-相互作用1的详细描述定义IgECs3-Cs4的表位的相互作用位点覆盖着1100人2的面积(用程序areaimol计算，参见参考文献CCP4，1994)，由IgEl的氨基酸残基Glu390至Asn394包括端点在内和抗原的IgE2中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Glu472组成。另夕卜，糖部分即IgEl中的GlcNAcl和Man6和IgE中的Man5与Fab分子发生接触。与抗原相互作用的重链的氨基酸残基，包括糖部分在内，来自CDRl:Tyr32,来自CDR2:Asp53和Asn54，来自CDR3:Va95、Met96、IelOO、GlylOOb、GlylOOc、AsplOl和Tyrl02,和来自构架Glul、Lys23、Thr30、Ala71至Arg77包括端点在内和Tyr79。由Fab轻链贡献的残基是来自CDR2的Asp50和Ser56和来自构架的Leu46和Tyr49。相互作用除了非极性范德华接触外,还包括19个氢键。7.1.4Fabl和IgE的相互作用——^目互作用2的详细描述定义IgECs3-Cs4的表位的相互作用位点覆盖着1165A2的面积(用程序areaimol计算，参见参考文献CCP4，1994),由IgEl的氨基酸残基Glu390、Gln392至Asn394包括端点在内和抗原的IgE2中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Glu472组成。另夕卜，糖部分即IgEl中的GlcNAcl和Man6与Fab重链发生接触。与抗原相互作用的重链的氨基酸残基，包括糖部分在内，来自CDR1:Tyr32，来自CDR2:Pro52a、Asp53和Asn54,来自CDR3:Val95、Met96、IlelOO、Glyl00b、Glyl00c、AsplOl和Tyrl02，和来自构架Glul、Lysl9、Lys23、Thr30、Ala71至Ser75包括端点在内、Arg77和Tyr79。由Fab轻链贡献的残基是来自CDR2的Ser56和来自构架的Tyr49。相互作用除了非极性范德华接触外，还包括19个氢键。表5:IgECs3-Cs4和抗体llFab之间的直接相互作用，相互作用1链Fab残基Fab单体IgE残基IgE距离(A)Tyr32OHIgElGlcNAc1072.58Met960IgElAsn394ND23.08GlylOObOIgElArg393NH12.60Gly100c0IgElArg393NE2.80Tyr102OHIgElGlcNAc1063.08Asp530IgE2Met430N2.83Asp530IgE2Arg431NHl2.67Asp53OD1IgE2Arg431NH12.77Asp53OD1IgE2Arg431NH22.60Ala710IgE2Ser432OG2.64Asp72OD2IgE2Arg342NH13.06Asp72OD2IgE2Thr434N3.02Asp72OD2IgE2Thr43402.97Thr73OG1IgE2Ser432N2,79键cccccccccccccc々^HHHHHHHHHHHHH链Fab残基Fab单体IgE残基IgE距离(A)HCThr73OG1IgE2Ser43203.05HCSer74NIgE2Ser43203.08HCSer74OGIgE2Arg342NH13.10HCSer74OGIgE2Thr433OG12.87HCArg77NH1IgE2Glu472OE22.56非极性接触〈4ALeu46IgElArg3933.79LCTyr49IgElGln3923.85Tyr49IgElArg3933.66LCAsp50IgElArg3933.71IXSer56IgElGlu3903.47LCSer56IgElLys3913.87HCGlu1IgElMair63.40HCVal95IgElArg3933.49HCHe100IgElArg3933.55HCAsp101IgElArg3933.50HCMet96IgElGlcNAc13.67HCLys23IgE2Glu4723.43HCThr30IgE2Arg4313.80HCAsp53IgE2Leu4293.34HCAsn54IgE2Ala4283.45HCAsp72IgE2Ser4323.22HCAsp72IgE2Thr4333.53HCThr73IgE2Met4303.98HCThr73IgE2Arg4313.22HCSer74IgE2Leu3403.33HCSer75IgE2Arg3423.32HCAsp76IgE2Man53.27HCArg77IgE2Thr4363.84HCTyr79IgE2Thr4363.43HCTyr79IgE2Ser4373.27用于氢键的距离截值(cut-off)是3.2A,用于非极性相互作用的是4.0A表6:IgECs3-Cs4和抗体11Fab之间的直接相互作用，相互作用2链Fab残基Fab单体IgE残基IgE距离(A)氢键ECSer56OGIgElGlu390OE12.44Ser56OGIgElGlu390OE22.99HCTyr32OHIgElGlcNAc1072.41HCGly100b0IgElArg393NH22.58HCGly100c0IgElArg393NE3.011链Fab残基Fab单体IgE残基IgE^巨离(A)HCTyr102OHIgElGlcNAc1062.73HCAsp530IgE2Met430N2.74HCAsp530IgE2Arg431NH12.62HCAsp53OD1IgE2Arg431NH12.88HCAsp53OD1IgE2Arg431NH22.65HCAla710IgE2Ser432OG2.87HCAsp72OD1IgE2Ser432O3.〗3HCAsp72OD2IgE2Arg342NH13.17HCAsp72OD2IgE2Thr434O3.UHCThr73OG1IgE2Ser432N2.94HCSer74NIgE2Ser432O3.17HCSer74OGIgE2Arg342細3.00HCSer74OGIgE2Thr433OG12.77HCTyr79OHIgE2Ser437N3.09非极性接触<4ALCTyr49IgElGin3923.76LCTyr49IgElArg3933.63IXSer56IgElGln3923.89HCGlulIgElMan63.25HCVal95IgElArg3933.48HCMet96IgElGlcNAc13.68HCMet96IgElAsn3943.31HCHe100IgElArg3933.44HCAsp101IgElArg3933.81HCLys19IgE2Ser4373.53HCLys23IgE2GIu4723.70HCThr30IgE2Arg4313.88HCPro52aIgE2Met4303.95HCAsp53IgE2Leu4293.51HCAsn54IgE2Met4303.90HCAsn54IgE2Ala4283.47HCAsp72IgE2Thr4333.61HCThr73IgE2Arg4313.26HCSer74IgE2Leu3403.30HCSer75IgE2Arg3423.55HCArg77IgE2Thr4363.88HCArg77IgE2Glu4723.27HCTyr79IgE2Thr4363.37用于氢键的距离截值(cut-off)是3.2A,用于非极性相互作用的是4.0A实施例7的材料和方法IgECs3-C"的过量表达102勿腐和絲差在本研究中，使用了稳定表达EpsteinBarr病毒核抗原-l基因的原始贴壁细胞系HEK293-EBNA(Invitrogen,斯德哥尔摩，瑞典)。使细胞适应悬浮生长，然后通过逐步培养基置换转移(Davies等人2005)到DHI培养基。所用的Dffl培养基与原先描述的稍有不同之处在于不含CA2+。在适应后，制备工作细胞库，将两个细胞系在无CA2+的Dffl培养基中常规生长多达20代，所述培养基补充有4mM谷氨酰胺、2%v/v超低IgG胎牛血清、250jig/mlG418(均获自Invitrogen,斯德哥尔摩:瑞典)和0.1%w/vPluronicF68(Sigma-Aldrich，斯德哥尔摩，瑞典)。絲餅在水中制备线性25kDa聚乙烯亚胺(PolysciencesEurope,Eppenheim,德国)的lmg/ml储备溶液，pH调至7.0，无菌过滤，以小等分试样保藏在-80。C下备用。在转染前不久，在非补加DHI培养基中，以相当于十分之一转染体积的体积，制备转染混合液(cocktail)。为制备转染混合液，将Dffl培养基分成两半。将0,8jugDNA/ml转染体积加到一半的DHI培养基，向另一半培养基加入2吗PEI/ml转染体积。对两个溶液稍作振荡并将它们温育5分钟后，将DNA溶液慢慢加到PEI溶液。将转染混合液在室温下温育20-30分钟，然后加到Wave生物反应器(WaveBiotechAG,Tagelswangen，瑞士)。转染后四小时，将培养4勿用才卜力口DHI培养基和HypPep1510(KerryBio-Sciences，Almere,荷兰)加到最终生产体积至0.3%(w/v)的最终浓度。为扩增种子培养物，将细胞在放在定轨振荡器培养箱(InforsAG，Bottmingen，瑞士)中的塑料振荡瓶中37。C，5%0)2气氛下生长。细胞每周两次常规进行传代，达到大约2x106个细胞/1111,再进行分割。Cedex自动细胞计数器(InnovatisAG,Bielefeld,德国)评估细胞密度和活力。对于Wave培养物，在转染前一天将细胞分割成lxl(^个细力包/ml，以确保它们在实验开始时处于对数生长期。Wave培养物直接从振荡器接种。所有种子培养物都通过离心进行浓缩，重悬在新鲜的培养基中，然后加到生物反应器中。在Wave生物反应器(WaveBiotechAG，Tagelswangen，瑞士)中以10L的工作体积进行表达。给Wave生物反应器的4.5L补加Dffl培养基接种至lx106个细胞/1111。2小时适应期后，用0.5L转染混合液转染培养物。转染后四小时，将培养物用补加Dffl培养基和HypPepl510加到10L总体积至0.3。/。(w/v)的最终浓度。每日提取样品，测定细胞密度、活力和蛋白质浓度。表达载体表达具有C末端Flag标签和10组氨酸标签的人IgECs3-Cs4载体，衍自Persic等人(1997)所描述的载体。该系统处于EFl-a启动子的控制下。IgECs3-Cs4的纯化将20L的细胞上清液浓缩五倍，用10kDa分子量截断错流膜(Pellicon2，Mmipore)透析到2xPBS(308mMNaCl,20mM磷酸盐，pH7,4)。将培养基在4。C下与30mLNiSepharose(GEHealthcare)批量结合两小时，用五体积的2xPBS洗涤，装到XK26柱中。然后将柱子用五柱体积的40mM咪唑(于2xPBS中)洗涤，以洗去污染性蛋白质。最后用400mM咪唑(于2xPBS中)洗脱IgE。集合液(pool)含有高纯度的IgE,将其浓缩约四倍(至5mg/mL),然后用2xPBS作为运行緩冲液使其流过Superdex20050/60SEC柱(1200mL，GEHealthcare)。一些较大的蛋白质被分离出来，IgE存在于主峰中。只将主峰流份进行集合，因为其他两个流份中有污染。这个步骤将样品的纯度提高到~99%。所产生的总量为42mg,纯化的IgE具有2mg/mL的浓度。IgECs3-Cs4的糖基化的分析^應奢冷渗^溶^哞冻必将人IgE最小结构域，IgECe3-Ce4,2mg/ml，于2xPBS(组成308mMNaCl，20mM磷酸盐，pH7.4)中，与100|al胰蛋白酶0.02mg/ml于25mMNH4HC03中进行混合。在37°C下过夜进行消化，用2Jul曱酸水溶液(67%)终止。7V譜-丄CMS/MSV在与LTQ-Orbitrap质i普仪(Thermo)连接的、装有ReproSil-PurC18-AQ3jum多孔颗粒的20cmx50inm内径熔融二氧化硅柱上进行分析。进行8iul样品注射(Agilent自动进样器)，分离前使肽捕集在4.5cmxlOOjum内径的前柱上。用0.1。/。曱酸线性运行5分钟后，在5-30分钟期间梯度为10-50%乙腈(Agilent),200nl/min,洗脱液/人发射极尖端(emittertip)进行电喷雾。仪器以数据依赖性模式操作，以在三种最丰富的多重质子化离子的Orbitrap(FT-MS)全谱扫描(surveyscan)和离子阱(IT-MS/MS)之间切换。静态电喷雾MS/MS:为验证糖肽片段的电荷状态，将选定的前体用ESI针在1.6kV下分析，在与nano-LC分析中的线性离子阱相对的Orbitrap中片段化和检测。糖肽数据分析用GlycoMod工具(http:expasy.org/tools/glycomod)(Cooper等人，2001)检查可能的糖肽的计算MH"质量，确定是否存在糖基化。输入蛋白质序列和10ppm的质量偏差。对所有提议的糖肽检查是否存在105含聚糖的片段。抗体11Fab的产生/gG趟必用MabSelectSuRe(GEHealthcare)A蛋白层析介质，从CHO-EBNA瞬态物质纯化抗体11。用PD-10柱(GEHealthcare)将A蛋白洗脱液进行緩沖液交换到PBS,pH7.2,然后用Millex-GP注射针头滤器(Millipore)进4亍0.22jam过滤。渴雞和遂必制备了30mMDL-盐酸半胱氨酸溶于GIBCOPBS(Invitrogen)的消化緩沖液。将来自木瓜乳的木瓜蛋白酶(Sigma)在消化緩冲液中复溶，产生10mg/mL溶液，使用前在室温下保持最少30分钟。将半胱氨酸加到抗体11IgG,产生30mM溶液，并将木瓜蛋白酶以lmg木瓜蛋白酶比lOOmgIgG的比例加入。在90分钟后，通过加入0.5M碘代乙酰胺(Sigma)以在最终消化混合物中产生50mM碘代乙酰胺，来终止消化。用MabSelectSuRe(GEHealthcare)A蛋白层析介质，以非结合模式从消化混合物纯化Fab。用PD-10柱(GEHealthcare)将得自MabSelectSuRe步骤的Fab流份进行緩冲液交换成50mM乙酸钠/100mMNaCl,pH5.5，然后用AmiconUltra-155kDaMWCO离心过滤器装置(Millipore)浓缩至10mg/mL。将最终产物用MustangQacrodisc(Pall)进一步纯化，然后用Millex-GP注射针头滤器(Millipore)进行0.22,过滤。/g￡CW-在傳J7尸"6茇合參将2mg/mL的IgECs3-Cs4溶液(于308mMNaCl和20mM磷酸盐，pH7.4緩沖液中)与10.6mg/mL的抗体11Fab溶液(于50mM乙酸钠，100mMNaCl,pH5.5中)，以IgEFc3-4同型二聚体分别和抗体11Fab异型二聚体的1-1.1的化学计量比例进行混合。将混合液水中放置过夜，然后在平#]"于20mMTrisHC1pH7.6和0.15MNaCl的HiLoadSuperdex20016/60柱(GEHealthcare)上进行凝胶过滤。收集含有复合物的主峰，浓缩至10.4mg/mL,以备用于结晶实验。/g五Cd-CW戎傳〃Fa6复合參^潜^结晶按照设置液滴蒸汽扩散的方法进行。液滴含有等体积的蛋白质和储存溶液(reservoirsolution)(150+150nL)，建立具有80uL储存体积(reservoirvolume)的CrystalQuick96孑L;f反(GreinerBio-one)中。使复合物晶体在具有100mMMgCl2,100mM柠檬酸钠pH5.0和15%PEG4000的储存溶液的液滴中4°C下生长2-3周时间。将晶体收获到抗冻溶液(100mMMgCl2,100mM柠4象酸钠pH5.0和15%PEG4000，通过添加100%甘油制备20%甘油(made20%glycerolbyadditionof100%glycerol)),在液氮中快速冷却。/gECW-CW戎#尸a6,^參^炎拔炎桌*潜<###在法国格勒诺布尔市的欧洲同步辐射实验室(ESRF)，以光束线(beamline)ID-29从单晶收集衍射数据。初始数据集(数据集1，表7)记录至3A分辨率，然后更高分辨率数据集收集至2.85A分辨率，两者均属空间群P3221。数据用autoPROC(GlobalPhasingLimitedGPhL，Cambridge,英国)进行加工。从数据加工获得的统计数据在表7中给出。不对称单元含有三个Fab分子和三个对应于54%的溶剂含量的IgECs3-Cs4分子。用程序PHASER(Read2001,Storoni等人，2004,McCoy等人，2005)通过分子置换的方法对结构进行解析。Fab片段和IgEFc结构域的初始模型从之前报道的结构1AQK(Faber等人:1998)和1FP5(Wurzburg等人，2000)产生。因为可变结构域和恒定结构域之间的铰链区中的角度的变化，使用整个Fab作为搜索模型失败了。相反，在PHASER(Read2001,Storoni等人，2004,McCoy等人，2005)的初次运行中，制备和鉴定了两个单独的由可变结构域和恒定结构域分别组成的搜索^^莫型。随后将这两个模型连接以完成Fab片段。以这种方式总共鉴定了两个Fab片段和一个可变结构域。随后运行几次分子置换定位了三个IgECs3-Cs4分子，其中一个必须进行削减(trimback)以仅包含结构域4。在这个阶段，已收集到更好质量的数据(数据集2，表7),用程序autoBUSTER(GlobalPhasingLimitedGPhL,Cambridge,英国)将这个模型对新数据进行精修。随后，用图形程序COOT(Emsley&Cowtan2004)将Fab分子的氨基酸人工改成抗体11的正确序列。用Refmac(CCP41994)中的各向同性B因子作第二轮的约束最大或然性精修(restrainedmaximum-likelihoodrefinement)后,将最后的Fab和IgE分子的其余结构域人工拟合到电子密度。观察到伸长的电子密度的两个额外特征，即从氨基酸残基Asn394突出到IgE分子之间的空穴中。这被解释为糖基化，因此将两个N-乙酰-葡糖胺和三至四个甘露糖单元加到IgE模型。更多轮精修包括在COOT(Emsley&Cowtan2004)中人工重建环区，并间以在autoBUSTER(GlobalPhasingLimitedGPhL,Cambridge,UK)或Refmac5(Murshudov等人，1997)中将TLS应用于各个结构域和将非晶体学对称性(NCS)约束应用于IgE分子进行精修。用Refmac5(Murshudov等人，1997)中的"装水(waterpicking)"选项共装入213个水分子，然后进行人工检查。在最后一轮精修，解除NCS约束，产生出最终模型，其中R=20.0%和Rfree-27.00/。。表7:晶体参数和X射线数据-加工和精修统计数据__数据集..l数据集2空间群^"~波长(A)0.97<5ft976细胞常数a(A)b(A)爐62",5(52c(A)分辨率范围(A)—7卯."分辨率最高壳(shdl)(A)這-292完全性总体(％)，/歸完全性最高壳(％)皿0反射，独特多样性10.7多样性最高壳11.0Rmerge总体C5/0)10.1330.099Rmerge最高壳(％)0.9140.75平均值(I)/标准偏差(1)13.120.2平均值(iy标准偏差(i)最高壳R值匿al1(0/0)2編扁R值free(0/0)柳27.01EmergefSM/[(S,:|/,-</>|)/&力]2lvaluell尸obsl_l尸calcll/4/|F0bs|^free是对5%独特反射的试验集计算的交叉验证R因子实施例7中引用的参考文献DaviesA.GreeneA.LullauE.AbbottWM.Optimisationandevaluationofahigh-throughputmammalianproteinexpressionsystem(高通量哺乳动物蛋白表达系统的优化和评估).Prate/"五xpmw/o"&Pwn;/ca"o".42(1):111-21.(2005)CCP4(CollaborativeComputationalProject,Number4)(1994)TheCCP4suite:programsforproteincrystallography(CCP4套4牛蛋白质结晶学的程序).^ctoCoAyto〃ogrD50:760—763CooperC.A.,GasteigerE.,PackerN.GlycoMod-AsoftwareToolforDeterminingGlycosylationCompositionsfromMassSpectrometricData(GlycoMod-从质谱数据测定糖基化组成的软件工具)Prafeom/cs1:340-349(2001).Emsley,P.&Cowtan,K.Coot:model-buildingtoolsformoleculargraphics(分子图形学的建模工具).^ctoO^to//ogrD60:2126-2132(2004)Faber,C.,Shan,L.,Fan,Z.,Guddat,L.W.,Furebring，C.,Ohlin,M.,Borrebaeck,C.A.,Edmundson,A.B.Three-dimensionalstructureofa'humanFabwithhighaffinityfortetanustoxoid(对破伤风类毒素有高亲和力的人Fab的三维结构)./m,"otec/z"o/og^J.253-270(1998)Kabat，E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.和Foeller,C.(1991)iSe《Mewc&yo/o/7mm柳o/og7:ca//wfez-e"(《免疫相关蛋白质的序列》)，FifthEdition.NIHPublicationNo.91-3242.Karpusas，M.,Lucci,J.,Ferrant，J.,Benjamin,C.,Taylor,F.R.，Strauch,K.,Garber,E.,Hsu,Y.M.(2001)StructureofCD40ligandincomplexwiththeFabfragmentofaneutralizinghumanizedantibody(与中和性人源化抗体的Fab片段复合的CD40配体的结构).5Vra"脏9,321，(2001)LeslieA.(1991)Macromoleculardataprocessing(大分子数据处理).InMoras,D.,Podjarny,A.D.和Thierry,J.C.(eds)，C，to〃ogra卢.cC師pi"zVgOxfordUniversityPress,Oxford,UK,pp.27—38McCoy,A丄，Grosse-Kunstleve，R.W.，Storoni,L.C.&Read,R丄Likelihood-enhancedfasttranslationfunctions(或然'寸生i曾强的'l"夬速翁3i奪'功能).」cto458-464(2005)Murshudov,G.N.,Vagin,A.A.,和Dodson,E.J.(1997)RefinementofMacromolecularstructuresbythemaximum-likelihoodmethod(用最大或然性法精修大分子结构),爿cto0^^//0^053:240-255Padavattan，S.,Schirmer,T.，Schmidt,M.,Akdis,C.,Valenta,R.,Mittermann,I.,Soldatova,L.,Slater,J.,Mueller,U.&Markovic-Housley:Z.IdentificationofaB-cellEpitope'ofHyaluronidase,aMajorBeeVenomAllergen,fromitsCrystalStructureinComplexwithaSpecificFab(从透明质酸酶这种主要蜂毒过敏原的B细胞表位与特异性Fab110复合的晶体结构对该表位的鉴定).J"Mo/5z'o/368,742-752.(2007)PersicL.RobertsA.WiltonJ.CattaneoA.BradburyA.HoogenboomHR.Anintegratedvectorsystemfortheeukaryoticexpressionofantibodiesortheirfragmentsafterselectionfromphagedisplaylibraries(从噬菌体展示文库选择后用于抗体或它们的片段的真核生物表达的集成载体系统).187(1):9-18.(1997)Read,R丄Pushingtheboundariesofmolecularreplacementwithmaximumlikelihood(用最大或然性推进分子置换的边界).^ctaOyW.D57，1373-1382(2001)Rossma叫M.G.(编辑)"TheMolecularReplacementMethod(分子置换方法)"Gordon&Breach,NewYork(1972)Storoni,L.C.,McCoy,A.J.&Read,R丄Likelihood-enhancedfastrotationfunctions(或然性增强的快速旋转功能).爿ctoD60,432-438(2004)Wurzburg，B.A.,Garman,S.C.禾口Jerdetzky,H.S.Structure'ofthehumanIgE-FcCepsilon3-Cepsilon4revealsconformationalflexibilityintheantibodyeffectordomains(人IgE-FcCs3-Cs4的结构揭示抗体效应子结构域中的构象挠性)./m,簡mXv,13，375-385(2000).实施例8:种系化抗IgE单克隆抗体诱导幼龄食蟹猴体内血小板数降低的一般安全性和能力的评估在幼龄食蟹猴中进行了调查性(没有遵循GLP)研究，以评估本发明抗体抗IgE单克隆抗体11IgG,抗体11IgG2和另一抗IgE抗体E48造成血小板数降低的一般安全性和相对能力。研究的目标是l)测定三种候选抗IgE单克隆抗体在幼龄食蟹猴中诱导血小板计数/TCP降低和相关效应的一般安全性和相对能力，2)测定单克隆抗体在食蟹猴中的初步药代动力学参数，3)评估三种候选单克隆抗体造成游离IgE降低的能力和测定单克隆抗体浓度和游离IgE水平之间的(PK/PD)关系。实施例8的材料和方法十八只专门培育的食蟹猴(MGcaca/asdcw/aKs)获自毛里求斯Bioculture。这些动物在开始投药时在63-67周龄。对猴子进行预选择(从IOO只动物的更大群体)，选出具有高IgE水平(U/ml)的猴子，在三个组中归一化，每组雄猴和雌猴各三只，分别接受抗体11IgG,(组1)、抗体llIgG2(组2)或E48(组3)。三种单克隆抗体各自在50mM乙酸钠，100mMNaCl，pH5.5中配制，以1mL/min的速度慢慢静脉注射(使用电动注射器/输注泵)，以2mL/kg的剂量体积给予动物。各动物每周投药一次(5周/5次剂量)，剂量水平逐渐提高，在第1、8、16、22和29天给予lmg/kg、30mg/kg和100mg/kg(x3)(表8)。在第37天给组1和组2分别另外l殳与抗体11IgGi和抗体11IgG2。两个最高剂量水平据预测能实现之前用Xolair在幼龄食蟹猴中证实能导致血小板减少症(TCP)的血清浓度。低剂量预期可以测定单克隆抗体实现游离IgE水平的降低的能力。表8研究设计概要在以下各天的剂量水平动物数目組别说明(mg/kg/天)1816222937雄性雌性1Ab11IgG!301001001001003Ab11lgG213010010010010033E48130100100100-33(Ab11=抗体11)在第28天投药后观察动物8周，检查是否从任何毒性作用中恢复。每曰观察所有动物的健康不佳或明显毒性的征候，记录体重和食物消费量。另外，在投药周期内每日给每只动物进行详细体格检查，在非投药周期内至少每周一次进行体格检查。还在每次投药前和在投药后0.5、2、6、24、48和168小时后，对所有动物进行观察。在处理前两次(-2周和-l周)从股静脉/动脉获取血液样品，供分析标准的血液学参数(包括血小板计数；收集在EDTA中)和凝血参数(收集在柠檬酸三钠中)。在每次投药后24小时和144小时(第2、7、9、14、17、22、23、26、30和35天；组1和组2的样品仅在第38天和第43天)，和在8周恢复期每2周(第43、5"7、"和W天)，收集更多的样品进行血小板计数和标准血液学检查。在每次投药后144小时(第7、14、22、26和35天)和在恢复期结束时(第82天)收集凝血样品。凝血样品还在第57天收集。在处理前(-1周)和处理周期结束后大约24小时(第30天)收集一次血液样品进行补体激活(C3a、C3b和BB片段)试验。在以下时间从所有的组收集血清样品进行TK分析在第1天投药前和投药后0.5、6、12、24、48、144小时，在第8、16、22和29天投药后0.5、24和144小时，在第29天(仅组3和组4)投药后336、672、1008、1272小时，在第37天(仅组1和组2)投药后0.5、24、144、480、816、1080小时。使用通用的夹心免疫测定(使用针对单克隆抗体的生物素酰化人IgE和Alexa-647标记鼠抗人IgG检验试剂)和GyrolabBioaffy平台(加入链霉亲和素珠粒柱)，对样品进行单克隆抗体分析。在以下时间收集更多的血清样品进行IgE分析第1天投药前、投药后0.5、6、12、24、48、144小时，第8、16、22和29天投药后0.5、144小时和研究结束时(第82天)最终投药后1272小时(组3和组4)或1080小时(组1和组2)。用ImmunoCap系统(PhadiaAB，Uppsala,瑞典)通过免疫测定对样品进4亍游离IgE分析，其中人IgG-FcsRIa用于游离IgE捕捉，兔抗人IgE(PCS-缀合物)用于检测。在第85天结束时，在病理学家的全面监督下进行全面目视检查，记录所有的损伤情况。测定绝对器官重量和器官:体重比。从多个器113官收集组织，冻藏，但没有进行显微镜检查(除了目视异常或不按时间表发生的死亡外，见下文)。实施例8的结果一般安全性观察所有三种单克隆抗体总的来说都很好地被动物耐受，除了有一只接受抗体11的动物因为临床状况恶化和体重减轻而被提前送去验尸外，在这个研究中没有健康不佳的临床征候。由于该只动物一直到恢复期都恶化，且在对这些动物的病理学或血液学检查过程中没有发现结果被记录到，因此不认为所观察到的作用与单克隆抗体有关。在所有各组记录到软质或流体粪便的发生，但是由于这些发现结果非剂量相关，不在所有的动物中见到或者不在同一动物的所有时间点见到，且在投药期和恢复期都以同样的频率见到，因此它们不太可能与单克隆有关。平均体重和平均体重增加表明，在研究中每个组当中的各动物间存在一些个体变动。但是，在治疗期所有的动物都如所预期那样增重。各组之间没有明显的差异(除了以上讨论的1只动物外)。在任何组都没有记录到对绝对或相对器官重量的明显治疗相关作用。在总体病理学和微观病理学检查中，在有限范围的可提示单克隆抗体治疗的作用的受检组织中没有记录到发现结果。毒性动力学(TK)和IgE水平在本研究中没有观察到TK方面的性别差异。总体上，对于这三种单克隆抗体，暴露情况都相似,且在1-100mg/kg剂量范围似乎与剂量线性相关。抗体11IgG"抗体11IgG2和E48的平均TK谱在图12中显示。即使在最低剂量水平，也没有观察到对TK的明显IgE下沉效应(IgE-sinkeffect)。这三种抗体的TK似乎是人IgG在食蟹猴中的典型TK。对于抗体11igG,、抗体11IgG2和E48,在最后100mg/kg剂量后的平均最大观察浓度(Cmax)分别为18700、15900和24000nM。在最后100mg/kg剂量后的平均终点TK半寿期大约为10-13天。没有证据表明由于在这些动物中会潜在产生灵长类动物抗人抗体，而造成TK暴露降低。在食蟹猴中每周投与不同剂量水平的抗体11IgG!、抗体11IgG2和E48后的平均游离IgE谱在图13中显示。动物接受首次剂量前的平均基线IgE,对于抗体11IgG,组、抗体11IgG2组和E48组分别为514、414和690ng/m。在第1天，lmg/kg剂量在投与1小时后诱导了游离IgE降低75-80%。由于在1mg/kg剂量后的低暴露，游离IgE在1周内回复到基线水平。更高的剂量导致了游离IgE在治疗期内的持续抑制。对于两个抗体ll组，在研究结束时游离IgE回复到基线，而在E48组游离IgE保持^皮抑制。对血小板的作用除一只动物例外外，三种单克隆抗体(抗体11IgG，、抗体11IgG2和E48)在任何动物中在任何时间点都没有诱导显著的血小板计数下降，该例外的一只动物接受抗体11IgG,,在第29天的单个时间点(在第28天第三次100mg/kg剂量后24小时)出现血小板降低(34.9%)。在第37天第四次对殳与抗体11IgG，和抗体11IgG2,在这个动物或这两组当中的任何动物都没有诱导任何进一步的血小板降低。图14显示组1动物(用抗体11IgGl处理)的血小板数目(x109/L,以相对于2个投与前数值的平均值的变化百分数表示)对血浆浓度的曲线图。这个曲线图代表了3个组中其他16只没有显示对血小板的显著作用的动物[抗体11动物的变化]。图15显示在第29天呈现血小板数目短暂显著下降(比基线值低35°/。)的组1动物(用抗体11IgGl处理)的相同曲线图。有趣的是，在第29天投药后呈现血小板数目短暂降低的用抗体11IgGl处理的猴子，在这个时间具有最高的Cmax值(29400nmol/L)(但不暴露)。血浆水平随后剧烈下降，血小板计数回复到投药前数值。这暗示这样的可能性，即可能需要更高的血浆浓度阈值来引起血小板数目的下降。但是，有一只用E48处理的动物达到类似的水平(28500nm/L),没有相应的血小板作用(图l4)。其他血液学作用除了血小板计数外(见下文)，在大多数的血液学参数(血红蛋白浓度、细胞密实体积、平均细胞体积、平均细胞血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、血小板比积、血小板分布宽度、红血细胞计数、平均细胞血红蛋白、血红蛋白分布宽度、平均血小板体积、网织红细胞计数、总体和差异白血病计数)和凝血参数(凝血素时间、活化部分促凝血酶原激酶时间)上，没有记录到单克隆抗体治疗的一致性作用。在所有的组中观察到网织红细胞数目的增加，但是这个变化不是剂量/暴露相关性的，在组中不一致(组中的各动物具有相比于投药前数值更高、更低或不变的水平)或者在动物中不一致(在各时间点之间动物中的数值不依赖于暴露而升降)，且在平行对照组不存在下，在这个时间不能完全确定与单克隆抗体治疗的关系。任何这种变化在恢复期结束时通常已逆转。没有记录到对补体激活(C5a、C3a或BB片段)的显著治疗相关作用。讨论和结论本研究证实，抗IgE单克隆抗体即抗体11IgG,、抗体11IgG2和E48当以反复的高剂量水平(最高达100mg/kg)给予幼龄食蟹猴时，受到很好地耐受，没有显著的不良毒理学作用。在18只猴子当中只有1只在投与100mg/kg抗体11IgG,后的单个时间点显示出显著的血小板数目下降，此时单克隆抗体的血浆浓度达到几乎30000nmol/L。本研究中所有三种单克隆抗体所达到的血浆Cmax浓度，预期远超过在临床中将会达到的浓度(例如200nmol/L)。实施例9:IgE对FcgRI和CD23的作用的功能抑制在文编自Bracher等人，(JournalImmunol.Methods2007323:160-171)的IgE介导细胞杀灭测定中，评估优化的抗体11在功能上抑制IgE与FceRI和CD23的相互作用的能力。证实用IL-4预处理的U937细胞能表达FceRI和CD23。当在对IGROVl细胞上表达的抗原有特异性的IgE存在下与卵巢肿瘤细胞IGROVl共培养时，U937细胞能够杀灭肿瘤细胞。该杀灭是通过细胞毒性和吞噬作用这两种机制介导的，这两种机制被证实通过IgE分别与U937效应细胞上的FceRI和CD23的相互作用引发。在本测定中评估了抗体11和同种型对照是否能抑制通过FceRI或CD23进行的IgE介导杀灭。这个程序的详细方案在"材料和方法"中提供。简单的说，将试验IgG的被滴定液与靶标特异性(MOvl8)或非相关(NIP)IgE混合，然后与IL-4刺激的U937效应细胞和标记的IGROVl耙标细胞进行温育。温育2.5小时后，将细胞洗涤，用抗CD89-藻红蛋白抗体(BDBiosciences)和硪化丙锭(MolecularProbes)染色。洗涤后，用FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences)分析细胞焚光。上述荧光染料用来将活细胞与被细胞毒性杀灭的细胞和被吞噬作用杀灭的细胞区分开来。与同种型对照抗体相反，抗体ll能够同时抑制IgE/FcsRI介导的细胞毒性(图16)和IgE/CD23介导的吞噬作用(图17)。材详+和方法-实施例9评估抗体是否能抑制U937细胞的IgE介导IGROVl肺瘤细胞杀灭。采用标准的组织培养程序，将IGROVl细胞(人卵巢癌细胞系)和U937细胞(人骨髓单核细胞系)保持在培养基[RPMI1640，10%v/vFCS:2mM谷氨酰胺，5000U/ml青霉素，100ug/ml链霉素(均获自Invitrogen)]中。抗IGROVl细胞上表达的FBP(叶酸结合蛋白)的MOvl8IgE用作肺瘤特异性抗体。NIP(半抗原4-羟基-3-硝基-苯乙酰)特异性IgE用作对照非相关抗体。MOvl8和NIP抗体按Gould等人，(1999)Eur.J.Immunol.29:3527-3537中所述制备。在杀灭实验前用10ng/ml重组人IL-4(R&DSystems)对IJ937细胞预处理4天，以上调CD23的表达。在杀灭实验前一天，将IGROV1把标细胞用荧光染料CFSE(羧基-二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯，MolecularProbes)进行标记。简单的说，将细胞用胰蛋白酶处理(胰蛋白酶/EDTA,Gibco),在培养基中洗涤，以50xl06个细胞/ml重悬于PBS中。然后将细胞与0.01mM的CFSE在37。C下温育IO分钟。标记后，将细胞在冰冷的培养基中洗涤一次，然后在37°C,5%C02下温育过夜。为评估抗体11的抑制作用，在12x75mm管子(Falcon，BDBiosciences)中制备抗体稀释液，加入2ug的MOvl或NIPIgE,产生80ul的最终体积。将此混合物在不加细胞情况下温育30分钟。将IL-4刺激的U937细胞在培养基中洗涤一次，以1.33xl()S个细胞/ml重悬。将CFSE标记的IGROV1细胞用胰蛋白酶处理，在培养基中洗涤一次，以4xl()S个细胞/ml重悬。将细胞加到含有抗体(对于U937细胞为120ul,对于IGR0V1细胞为200ul)的管子中，混合，在37°C,5%C02下温育2.5小时。然后将细胞在冰冷的FACS緩冲液(无钙/^美的PBS,5%正常山羊血清)中洗涤，与抗CD89-藻红蛋白抗体(BDBiosciences,10ug/ml)—起温育25分钟，以标记U937效应细胞。将细胞在冰冷的FACS緩冲液再洗涤一次，加入0.25ug/ml石舆化丙锭(MolecularProbes)对死细胞进行染色。在4GC下15分钟后，将细胞在水冷的FACS緩沖液中洗涤，重悬在250ul冰冷的FACS緩沖液中，用FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences)按照生产商说明书分析焚光。用具有相关单一染色的细胞调整检测通道(FL1、FL2和FL3)的电压和补偿。本测定中所用的荧光染料的组合使得可以对不同的细胞群体进行门选(gating)[活效应细胞(藻红蛋白阳性)、被吞噬的IGROV1肿瘤细胞(藻红蛋白和CFSE阳性)、活肺瘤细胞(CFSE阳性)、死肿瘤细胞(CFSE和硤化丙锭阳性)、死效应细胞(藻红蛋白和碘化丙锭阳性)]。这些门(gate)用来计算被FcsRI介导的细胞毒性(方程l)和被CD23介导的吞噬作用(方程2)杀灭的靶标细胞的百分数。方程l:%细胞毒性"[(R1SL对照—R1)+R3]/R1SL}x100式中Rl=CFSE阳性肿瘤细胞的总数R3=被杀灭但完整的肿瘤细胞(无片段化或吞噬)的数目R1SL对照=无抗体的效应细胞和靶标细胞的3个对照样品的平均R1(Rl自发损失对照)。方程2:%吞噬作用(R2/RlSL对照)x100式中R2=被效应细胞吞噬的肿瘤细胞的数目R1SL对照=无抗体的效应细胞和靶标细胞的3个对照样品的平均R1(R1自发损失对照)。参考文献本说明书引述的所有参考文献，包括上文引述的参考文献，都通过引用整体地和为所有目的并入本文。1Haan&Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1漏A62Koideetal.(1998)JournalofMolecularBiology,284:1141-1151.3Nygrenetal.(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,7:463-4694Wess,L.In:BioCentury,TheBernsteinReportonBioBusiness,12(42),A1-A7,20045Kabat，E.A.etal,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest她Edition.USDepartmentofHealthandHumanServices.19876Kabat，E.A.etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEdition.USDepartmentofHealthandHumanServices,PublicService,NTH,Washington7Segaletal"PNAS,71:4298-4302,19748Amitetal.,Science,233:747-753，19869Chothiaeta.，J.MoLBiol,196:901-917,198710Chothiaetal"Nature,342:877-883,198911Catonetal.,J.Immunol.,144:1965-1968，199012Sharonetal.，PNAS,87:4814-4817，199013Sharonetal"J.Immunol"144:4863-4869,199014Kabatetal.，J.Immunol.,147:1709-1719，199115Holliger&Hudson,NatureBiotechnology23(9):1126-1136200516Kontermann,R&Dubel,S,AntibodyEngineering,Springer-VerlagNewYork,LLC;2001,ISBN:354041354517Mendez,M.etal.(1997)NatureGenet,15(2):146-15618Knappiketal.J.Mol.Biol.(2000)296,57-8619Krebsetal.JournalofImmunologicalMethods254200167-8420Ward,E.S.etal.,Nature341，544-546(1989)21McCaffertyetal(1990)Nature,348,552-55422Holtetal(2003)TrendsinBiotechnology21,484-49023Birdetal,Science,242,423-426,198824Hustonetal，PNASUSA，85，5879-5883,198825Holliger,P.etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,199326Reiter，Y.etal，NatureBiotech,14,1239-1245,199627Hu,S.etal,CancerRes"56，3055-3061,199628HolligerandBohlen1999Cancerandmetastasisrev.18:411-41929Holliger,P.andWinterG.CurrentOpinionBiotedmol4，446-449199330GlennieMJetal.,1987J.Immunol.139，2367-237531ReppR.etal.,1995丄Hemat.377-38232StaerzU.D.andBevanM.J.1986PNAS8333SureshM.R.etal"1986MethodEnzymol,121:210-22834Merchandetal"1998NatureBiotech.16:677-68135Ridgeway,J.B.B.etal,ProteinEng.,9，616-621,199636HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborN.Y.,pp.726,198837K5hlerandMilstein,Nature,256:495-497,197538Wold,etal.Multivariatedataanalysisinchemistry.Chemometrics-MathematicsandStatisticsinChemistry(Ed.:B.Kowalski)，D.ReidelPublishingCompany,Dordrecht,Holland,1984(ISBN90-277-1846-6)39Normanetal.AppliedRegressionAnalysis.Wiley-Interscience;3rdedition(April1998)ISBN:047117082840Kandel,Abraham&Backer,Eric.Computer-AssistedReasoninginClusterAnalysis.PrenticeHallPTR，(May11,1995)，ISBN:013341884741Krzanowski,Wojtek.PrinciplesofMultivariateAnalysis:AUser'sPerspective(OxfordStatisticalScienceSeries,No22(Paper)).OxfordUniversityPress;(December2000)，ISBN:019850708942Witten，IanH.&Frank,Eibe.DataMining:PracticalMachineLearningToolsandTechniqueswithJavaImplementations.MorganKaufmann;(October11,1999),ISBN:155860552543DenisonDavidG.T.(Editor),ChristopherC.Holmes,BaniK.Mallick,AdrianF.MSmith.BayesianMethodsforNonlinearClassificationandRegression(WileySeriesinProbabilityandStatistics).JohnWiley&Sons;(July2002)，ISBN:047149036944Ghose，ArupK.&Viswanadhan,VellarkadN..CombinatorialLibraryDesignandEvaluationPrinciples,Software,Tools,andApplicationsinDrugDiscovery.ISBN:0-8247-0487-845ChothiaC.etal.JournalMolecularBiology(1992)227,799-81746Al-Lazikani,etal.JournalMolecularBiology(1997)273(4),927-94847Chothia，etalScience,223,755-758(1986)48Whitelegg,N.R.u.andRees,A.R(2000).Prot.Eng.,12,815-82449Guex,N.andPeitsch,M.C.Electrophoresis(1997)18,2714-272350Altschuletal,(19卯)J.Mol.Biol.215:405-41051PearsonandLipman(1988)PNASUSA85:2444-244852SmithandWaterman(1981)J.MolBiol.147:195-19753Voet&Voet，Biochemistry,2ndEdition,(Wiley)1995.54Grametal,1992，Proc.Natl.Acad.ScL,USA，89:3576-358055Barbasetal,1994，Proc.Natl.Acad.Scl，USA，91:3809-381356Schieretal,1996,J.MolBiol.263:551-56757MarksetalBio/Technology,1992,10:779-78358Kay,B.K.,Winter,J"andMcCafferty,J.(1996)PhageDisplayofPeptidesandProteins:ALaboratoryManual,'SanDiego:AcademicPress59HunterW.M.andGreenwoodF.C.(1962)Nature194:49560PHickthun,A.Bio/Technology9:545-551(1991)61ChaddHEandChamowSM(2001)CurrentOpinioninBiotechnology12:188-19462AndersenDCandKrummenL(2002)CurrentOpinioninBiotechnology13:11763LarrickJWandThomasDW(2001)CurrentOpinioninBiotechnology12:411-41864SambrookandRussell,MolecularCloning:aLaboratoryManual:3rdedition,2001，ColdSpringHarborLaboratoryPress65Ausubeletal.eds.,ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,4thedition199966Robinson,J.R.ed.,SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,MarcelDekker，Inc.,NewYork,197867LedermannJ.A.etal.(1991)Int.J.Cancer47:659-66468BagshaweK.D.etal.(1991)Antibody,ImmunoconjugatesandRadiopharmaceuticals4:915-92269Vaughan,T.J.,etal.(1996).NatureBiotechnology14，309-314.70Hutchings,C.GenerationofNaiveHumanAntibodyLibraries,inAntibodyEngineering,R.KontermannandS.Dubel，Editors.2001,SpringerLaboratoryManuals,Berlin,p.93<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>表ld<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>权利要求1.一种对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，所述结合成员抑制RBL-ER51细胞中由25ng/mlIgE诱导的钙信号转导的IC50几何平均值小于1nM。2.权利要求1的分离结合成员，其中所述抑制钙信号转导的IC50几何平均值小于O,lnM。3.—种对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，所述结合成员结合血清中的免疫球蛋白E的IC50比XolairTM低至少10倍。4.权利要求3的分离结合成员，其中所述结合成员的IC50比Xolair丁M低至少50倍。5.—种对人免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，所述结合成员包含一组CDR:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR相比于参考组的CDR具有10个或更少个氨基酸添加、置换、缺失和/或插入，其中HCDR1具有SEQ.ID.NO:103的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ.ID.NO:104的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ.ID.NO:105的氨基酸序列；LCDRl具有SEQ.ID.NO:108的氨基酸序列;LCDR2具有SEQ,ID.NO:109的氨基酸序列；LCDR3具有SEQ.ID.NO:110的氨基酸序列。6.权利要求5的对人免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所述氨基酸置换包含6个或更少个氨基酸置换。7.—种分离结合成员，所述分离结合成员包含一组CDR:HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2和LCDR3，其中HCDR3包含SEQ.ID.NO:105的氨基齡列。8.权利要求5的分离结合成员，所述分离结合成员包含一组CDR:HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中该组CDR包含HCDR1具有SEQ.ID.NO:103的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ.ID.NO:104的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ.ID.NO:105的氨基酸序列；LCDR1具有SEQ.ID.NO:108的氨基酸序列;LCDR2具有SEQ.ID.NO:109的氨基酸序列；LCDR3具有SEQ.ID.NO:110的氨基酸序列。9.一种分离结合成员或VH结构域，所述分离结合成员或VH结构域包含具有一个或多个以下置换的抗体1HCDR3(SEQIDNO:5):Kabat残基96被S、M或T置换；Kabat残基97被L或G置换；Kabat残基98,皮K置换；Kabat残基99被S、W、A、T或E置换；Kabat残基100被A或I置换。10.—种分离结合成员或VL结构域，所述分离结合成员或VL结构域包含具有一个或多个以下置换的抗体1LCDR3(SEQIDNO:10):Kabat残基94被T、R、D、P、E、N、H、Q或A置换；Kabat残基95^皮T、K、S、I、G、H、M、F、R、N、K或Q置换；Kabat残基95A被L、H、D、G、R、N、Q、K或E置换；Kabat残基95B被T、H、S、Y、L或N置换；Kabat残基96被G或A置换；Kabat残基97被P、S或G置换。11.一种对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，所述结合成员能结合包含来自第一IgE重链的元件和来自第二IgE重链的元件的表位。12.—种对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所述结合成员能结合免疫球蛋白E中包含以下残基的表位第一IgE重链中的残基Glu390至Asn394包括端点在内，和第二IgE重链中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Glu472。13.权利要求12的对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所述表位还包含第一IgE重链中的糖部分GIcNAc1和Man6和第二IgE重链中的糖部分Man5。14.一种对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所述结合成员能结合免疫球蛋白E中包含以下残基的表位第一IgE重链中的残基Glu390、Gln392至Asn394包括端点在内，和第二IgE重链中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端点在内、Thr436、Ser437和Glu472。15.权利要求14的对免疫球蛋白E有特异性的分离结合成员，其中所述表位还包含第一IgE重链中的糖部分GIcNAc1和Man6。16.权利要求1-15中任一项的结合成员，其中所述结合成员是单克隆抗体。17.—种编码权利要求1-16中任一项的分离结合成员的分离核酸分子。18.—种转化有权利要求17的核酸分子的宿主细胞。19.一种产生权利要求1-17中任一项的分离结合成员的方法，所述方法包括在适于产生所述结合成员的条件下培养权利要求18的宿主细胞。20.—种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-16中任一项的结合成员和药物可接受赋形剂。21.权利要求20的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-16中《壬一项的分离结合成员；20mM琥珀酸盐；105mMNaCl;10mM精氨酸；pH6氛22.权利要求20或21的组合物，所述组合物用作药物。23.权利要求22的组合物用于治疗与IgE有关的疾病的用途。24.权利要求20或21的组合物的用途，其中所述疾病是过敏症、哮喘或支气管炎中的一种或多种。25.权利要求20或21的组合物的用途，其中所述疾病是以下疾病中的一种或多种过敏性鼻炎、变应性接触性皮炎、特应性皮炎、过敏反应、食物过^t、荨麻渗、炎性肠病、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、药源性皮渗、过敏性眼病、过敏性结膜炎、支气管哮喘、气道高反应性、化妆品过敏、药源性过敏、药源性超敏性综合症、金属过敏、职业性超敏性肺炎、慢性超敏性肺炎、冷超敏性、蠕虫感染引起的超敏性、乳胶过敏和枯草热。全文摘要本发明涉及IgE的结合成员，特别是抗体分子。结合成员尤其可用于治疗IgE介导的疾病，包括过敏症和哮喘。文档编号A61P11/00GK101675079SQ200880012211公开日2010年3月17日申请日期2008年2月15日优先权日2007年2月15日发明者C·L·多布森,D·科克兰,K·冯-瓦申费尔特,P·D·蒙克,P·-O·F·埃里克森,S·科亨申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司;免疫医疗有限公司