专利名称：：新化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种具有多特异性的抗体。具体地，本发明的抗体与人IL-8、Gro-a、Gro-P、Gro-y、和ENA-78结合(起交叉反应)。本发明还涉及用所述抗体治疗以人IL-8、Gro-a、Gro-j3、Gro-y、和ENA-78之一种或多种的水平升高或失衡为特征的疾病或病症的方法，特别是COPD、骨关节炎(osteoarthritis)、类风;显'I"生关节炎(rheumatoidarthritis)、4憂々虫寸生关节炎(erosivearthritis)、哮喘(asthma)、动月永粥样硬化(atherosclerosis)、炎性肠病(inflammatoryboweldisease)、4艮屑病(psoriasis)、移才直物排斥(transplantrejection)、痛风(gout)、癌症(cancer)、急性月巿损伤(acutelunginjury)、急性肺病(acutelungdisease)、败血症(sepsis)、ARDS、夕卜周动月永疾病(peripheralarterydisease)、全身性硬化(systemicsclerosis)、新生儿呼吸窘迫综合征(neonatalrespiratorydistresssyndrome)、嗜喘和COPD的恶"匕(exacerbationofasthmaandCOPD)、嚢性纤维化病(cysticfibrosis)、弥漫性全细支气管炎(diffiisepanbronchiolitis)、再灌注4员伤(reperfUsioninjury)、牙口/或子宫内月莫异4立(endometriosis)。
背景技术：
：公布的数据和报告指出CXCL趋化因子的ELRCXC亚家族的成员在许多疾病中是升高的。共有16种CXCL家族成员。据报道，这些趋化因子在许多炎性疾病(包括COPD)中是上调的，其中CXCLl-3、5、和8分别也称为Gro-a、卩、y(HaskillS等(1990)ProcNatlAcadSci87:7732-7736)、ENA-78(WangD禾口RichmondA，CytokineReference.Oppenheim，JJ.和Feldman,M.编,AcademicPress,London,1023-1027;PowermCA等(1994)Gene151:333-334)、和IL-8(IizasaH和MatsushimaK,CytokineReference.Oppenheim，J.J.和Feldman,M.编,AcademicPress,London,1061-1067;MatsushimaK等(1988)JExpMed167:1883-1893)(AmJRespirCritCareMed163:349-355(2001);AmJRespirCritCareMed168:968-975(2003);Thorax57:590-595(2002))。已经假设了这些趋化因子的表达延长和升高可以牵涉疾病的形成，诸如COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、译喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、或子宫内膜异位。已知这些CXC趋化因子通过连结(engage)并活化CXCRl和/或CXCR2受体而刺激嗜中性粒细胞趋化性。如此，对这些趋化因子的抑制可以阻止炎性细胞浸润肺组织，并如此防止组织损伤。本发明致力于通过使用具有结合人IL-8、Gro-a、Gro-p、Gro-Y、和ENA-78能力的抗体(即五特异性抗体)来抑制CXCR1和CXCR2受体的活化。发明概述本发明涉及一种抗体(免疫球蛋白)，其具有包含在单一免疫球蛋白内的多特异性。具体地，本发明的抗体与人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-y、和ENA-78结合(起交叉反应)。本发明还涉及用所述抗体治疗以人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-Y、和ENA-78之一种或多种的水平升高或失衡为特征的疾病或病症的方法，特别是COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、《艮屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、和/或子宫内膜异位。一方面，本发明涉及一种分离的抗体，其具有对人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-Y、和ENA-78的多特异性(或者与它们起交叉反应)；如此，我们将本发明的抗体定义为五特异性(或泛ELR)抗体。该抗体定义包括抗体的抗原结合部分(或片段)，使得所述抗原结合部分(或片段)结合人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-Y、和ENA-78。优选地，本发明的五特异性抗体是鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。为了避免产生疑问，本发明的五特异性抗体不必只结合人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-y、和ENA-78抗原，而是其还可结合其它相关蛋白(诸如人GCP-2，或者甚至可结合IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-Y、ENA-78、和GCP-2的非人直向同源物)；换言之，本发明的五特异性抗体最4氐限度结合人IL-8、Gro-a、Gro-|3、Gro-y、和ENA-78。优选地，本发明的五特异性抗体以如通过表面等离振子共振测定的小于1(T7M、更优选小于10-8]\4、且甚至更优选小于1(^M的平衡常数(KD)值结合人IL-8、Gro-a、Gro-|3、Gro-y、和ENA-78之每一种。通常，如下文所描述的那样进行表面等离振子共振测量。在一个实施方案中，本发明包括一种经由抑制CXCR1和CXCR2受体活化来降低嗜中性粒细胞趋化性的方法，其通过用本发明的五特异性抗体中和人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、GCP画2和ENA匿78来实现。在一个实施方案中，本发明涉及一种通过施用本发明的五特异性抗体来降低有所需要的患者中嗜中性粒细胞趋化性的方法。在一个实施方案中，五特异性抗体在人IL-8中表位KELRCQCIKTYSKP(SEQIDNO:54)内结合。在一个实施方案中，本发明的五特异性抗体是通过如下方法生成的，该方法包括使用RIMM(KilpatrickKE等(1997)Hybridoma16,381)型方案的步骤，使用人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-丫、和ENA-78的混合物(鸡尾酒)以及一组五种多抗原肽(MAP)进行，每种MAP单元具有一种来自多肽IDNO:49-53的不同序列。LATELRSQSLQTLQGSEQIDNO:49SAKELRSQSIKTYSKSEQIDNO:50LRELRSVSLQTTQGSEQIDNO:51SPGPHSAQTEVIATSEQIDNO:52ESGPHSANTEIIVKSEQIDNO:53不限于理论，MAP在免疫方案内发挥两种功能。第一，MAP容许已知靶氨基酸序列向宿主免疫系统的选择性多重呈递。第二，由于经由核心(诸如但不限于赖氨酸)而相连接的多拷贝序列引起的质量增加提高了所述序列的免疫原性，其高于单独的肽的免疫原性(FrancisJP等(1991)Immunology73:249;SchoUME等(1996)CellImmuno174:199-209;TamJP(1988)ProcNatlAcadSci85:5409-5413)。用于产生本发明的MAP由多拷贝的保守靶序列(例如SEQIDNO:49-53)构成，所述保守耙序列与靶趋化因子的ELRCXC区和GPHCA区一起找到和在靶趋化因子的ELRCXC区和GPHCA区的周围找到。图1中描绘了例示性的MAP组。在一个实施方案中，本发明的五特异性抗体是通过包括以下步骤的方法生成的a.向小鼠中注射完全弗氏佐剂(cFA)中的人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-丫、和ENA-78的混合物；b.向所述小鼠中注射不完全弗氏佐剂(iFA)中的人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-y、和ENA-78的混合物；并c.向所述小鼠中注射不完全弗氏佐剂中的人IL-8、Gro-a、Gro-|3、Gro^、和ENA-78的混合物和一组五种多抗原肽(MAP)，每种MAP单元具有一种来自多肽IDNO:49-53的不同序列；d.自所述小鼠分离B细胞；e.将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成分泌所述想要的五特异性抗体的永生杂交瘤细胞；并f.自所述杂交瘤的培养物上清液分离所述五特异性抗体。若想要的话，可以任选地在步骤c和d之间向所述小鼠中注射PBS中的人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-"y、和ENA-78的混合物和一组包含氨基酸序列SEQIDNO:49-53的MAP。在另一个实施方案中，本发明的五特异性抗体是通过包括以下步骤的方法生成的a.向小鼠中注射完全弗氏佐剂中的一组五种多抗原肽(MAP)(下文中也称为MAP组)，每种MAP单元具有一种来自多肽SEQIDNO:49-53的不同序列；b.向所述小鼠中注射不完全弗氏佐剂中的所述MAP组；c.向所述小鼠中注射不完全弗氏佐剂中的所有人IL-8、Gro-cuGro-卩、Gro-y、和ENA-78的混合物和所述MAP组；d.自所述小鼠分离B细胞；并e.将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成分泌所述想要的五特异性抗体的永生杂交瘤细胞；并f.自所述杂交瘤的培养物上清液分离所述五特异性抗体。若想要的话，可以任选地在步骤c和d之间向所述小鼠中注射PBS中的人IL-8、Gro-ct、Gro-卩、Gro-y、和ENA-78的混合物和一组具有SEQIDNO:49-53的MAP。在另一个实施方案中，本发明涉及一种通过上述方法制备的五特异性抗体。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别由包含序列SEQIDNO:l和SEQIDNO:3或其保守序列修饰的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别由包含序列SEQIDNO:5和SEQIDNO:7或其保守序列修饰的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体具有由包含序列SEQIDNO:9或其保守序列修饰的核芬酸序列编码的重链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:4或其保守序列〗务饰的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:4至少90%、95%、98%或99%相同的多肽的重《连和轻《连可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:6和SEQIDNO:8或其保守序列修饰的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:6和SEQIDNO:8至少90%、95%、98°/。或99%相同的多肽的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:10和SEQIDNO:12或其保守序列修饰的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:10和SEQIDNO:12至少90%、95%、98%或99%相同的多肽序列的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体包含至少一种选自以下的可变区(i)氨基酸序列SEQIDNO:2、4、6、8、10、或12;或(ii)与上文(i)的氨基酸序列之任一项至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，五特异性抗体包含CDR序列SEQIDNO:13、14、14200880020559.315、16、17、和18;或者一种或多种所述CDR序列可以是序列SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18的保守序列修饰。在一个实施方案中，本发明涉及一种杂交瘤或转化瘤，其生成包含CDR序列SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18的五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组真核或原核细胞，其生成包含CD蔣列SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18的五特异性抗体。在一个实施方案中，五特异性抗体包含至少一种选自以下的CDR序列(i)SEQIDNO:13、14、15、16、17、或18;或(ii)(i)中所列序列的保守序列修饰。在一个实施方案中，五特异性抗体包含多肽SEQIDNO:15。在一个实施方案中，五特异性抗体包含至少四种选自由SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18组成的组的CDR序列；或者一种或多种所述CDR^列可以是SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18中所列序列的保守序列修饰。在一个实施方案中，五特异性抗体包含分别包含CDR氨基酸序列SEQIDNO:13、14、和15和CDR氨基酸序列SEQIDNO:16、17、和18的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体包含CDR序列SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24;或者一种或多种所述CDR^列可以是SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24中所列序列的保守序列修饰。在一个实施方案中，本发明涉及一种杂交瘤或转染瘤，其生成包含CDR序列SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24的五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组真核或原核细胞，其生成包含CDR^列SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24的五特异性抗体。在一个实施方案中，五特异性抗体包含至少一种选自以下的CDR序列(i)SEQIDNO:19、20、21、22、23、或24;或(ii)(i)中所列序列的保守序列修饰。在一个实施方案中，五特异性抗体包含多肽SEQIDNO:21。在一个实施方案中，五特异性抗体包含至少四种选自由SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24组成的组的CDR序列；或者一种或多种所述CDR序列可以是SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24中所列序列的保守序列修饰。在一个实施方案中，五特异性抗体包含分别包含CDR氨基酸序列SEQIDNO:19、20、和21和CDR氨基酸序列SEQIDNO:22、23、和24的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，五特异性抗体包含CDR序列SEQIDNO:25、26、27、28、29、和30;或者一种或多种所述CDR序列可以是SEQIDNO:25、26、27、28、29、和30中所列序列的保守序列修饰。在一个实施方案中，本发明涉及一种杂交瘤或转染瘤，其生成包含CDR序列SEQIDNO:25、26、27、28、29、和30的五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组真核或原核细胞，其生成包含CD蔣列SEQIDNO:25、26、27、28、29、和30的五特异性抗体。在一个实施方案中，五特异性抗体包含至少一种选自以下的CDR序列(i)SEQIDNO:25、26、27、28、29、或30;或(ii)(i)中所列序列的保守序列修饰。在一个实施方案中，五特异性抗体包含多肽SEQIDNO:27。在一个实施方案中，五特异性抗体包含至少四种选自由SEQIDNO:25、26、27、28、29、和30组成的组的CDR序列；或者一种或多种所述CDR序列可以是SEQIDNO:25、26、27、28、29、和30中所列序列的保守序列修饰。在一个实施方案中，五特异性抗体包含分别包含CDR氨基酸序列SEQIDNO:25、26、和27和CDR氨基酸序列SEQIDNO:28、29和30的重链和轻链可变区。在一个实施方案中，本发明涉及一种杂交瘤，其生成具有分别由包含核苷酸序列SEQIDNO:1、5、或9或核苷酸序列SEQIDNO:3或7的核苷酸序列编码的重链或轻链可变区的单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种杂交瘤，其生成具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:2、6、或10及其保守序列修饰或氨基酸序列SEQIDNO:4、8、或12及其保守序列修饰的重链或轻链可变区的单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分別包含氨基酸序列SEQIDNO:2、6、或10及其保守序列修饰或氨基酸序列SEQIDNO:4、8、或12及其保守序列修饰的重链或轻链可变区的五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中分别包含CD蔣列SEQIDNO:13、14、和15或CD蔣列SEQIDNO:16、17、和18的可变重链或轻链的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中选自SEQIDNO:13、14、15、16、17、或18的CDR序列的核苦酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中至少四种选自SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18的CDR序列的核苦酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含多核苦酸序列SEQIDNO:31、32、或33。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含多核苷酸序列SEQIDNO:34、35、和36。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含至少四种选自SEQIDNO:31、32、33、34、35、和36的组的多核苦酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中分别包含CDR序列SEQIDNO:19、20、和21或CDR序列22、23、和24的可变重链或轻链的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中选自SEQIDNO:19、20、21、22、23、或24的CDRyf列的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中至少四种选自由SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24组成的组的CDR序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含多核香酸序列SEQIDNO:37、38、和39。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含多核苷酸序列SEQIDNO:40、41、和42。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含至少四种选自SEQIDNO:37、38、39、40、41、和42的组的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中包含CDR序列SEQIDNO:25、26、和27的可变重链的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中选自SEQIDNO:25、26、或27的CD踏列的核香酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含多核苷酸序列SEQIDNO:43、44、和45。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别由包含序列SEQIDNO:11和序列SEQIDNO:47、59、61、或63的核苦酸序列编码的重链和轻链。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别由包含与序列SEQIDNO:ll和序列SEQIDNO:47、59、61、或63至少90%、95%、98%或99%相同的序列的核苷酸序列编码的重链和轻链。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64的重链和轻链。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和SEQIDNO:48的重链和轻链。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和SEQIDNO:60的重链和轻链。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和SEQIDNO:62的重《连和轻《连。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和SEQIDNO:64的重链和轻《连。在一个实施方案中，五特异性抗体具有分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的多肽的重链和轻链。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46或氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64的重链或轻链的五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64的重链和轻链的五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:46或氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链或轻链的五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链和轻链的五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含分别包含序列SEQIDNO:11和序列SEQIDNO:47、59、61、或63的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含分别包含与序列SEQIDNO:ll和序列SEQIDNO:47、59、61、或63至少900/。、95%、98%或99%相同的序列的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含包含序列SEQIDNO:11、47、59、61、或63的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含分别包含与序列SEQIDNO:11、47、59、61、或63至少90%、95%、98%或99%相同的序列的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码如下五特异性抗体的多核苷酸序列，所述五特异性抗体包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64的重链和轻链。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码如下五特异性抗体的多核苦S吏序列，所述五特异性抗体包含分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链和轻链。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码包含氨基酸序列SEQIDNO:46、48、60、62、或64的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含编码包含与氨基酸序列SEQIDNO:46、48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99。/。相同的氨基S殳序列的多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于在单一宿主细胞中生成五特异性抗体(免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤(i)用第一DNA序列和第二DNA序列转化所述单一宿主细胞，所述第一DNA序列编码包含多肽SEQIDNO:46的重链，且所述第二DNA序列编码包含多肽SEQIDNO:48、60、62、或64的轻链；并(ii)表达所述第一DNA序列和所述第二DNA序列，使得所述免疫球蛋白重链和轻链在所述经转化的单一宿主细胞中作为分开的分子生成；19此外，可以实施此方法以使得所述第一和第二DNA序列存在于不同载体中或者所述第一和第二DNA序列存在于单一载体中。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于在单一宿主细胞中生成五特异性抗体(免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤(i)用第一DNA序列和第二DNA序列转化所述单一宿主细胞，所述第一DNA序列至少编码所述免疫球蛋白重链中包含CDR域SEQIDNO:13、14、和15的可变域，且所述第二DNA序列至少编码所述免疫球蛋白轻链中包含CDR域SEQIDNO:16、17、和18的可变域；并(ii)表达所述第一DNA序列和所述第二DNA序列，使得所述免疫球蛋白重链和轻链在所述经转化的单一宿主细胞中作为分开的分子生成；此外，可以实施此方法以使得所述第一和第二DNA序列存在于不同载体中或者所述第一和第二DNA序列存在于单一载体中。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于在单一宿主细胞中生成五特异性抗体(免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤(i)用第一DNA序列和第二DNA序列转化所述单一宿主细胞，所述第一DNA序列至少编码所述免疫球蛋白重链中包含CDR域SEQIDNO:19、20、和21的可变域，且所述第二DNA序列至少编码所述免疫球蛋白轻链中包含CDR域SEQIDNO:22、23、和24的可变域；并(ii)表达所述第一DNA序列和所述第二DNA序列，使得所述免疫球蛋白重链和轻链在所述经转化的单一宿主细胞中作为分开的分子生成；可以实施此方法以使得所述第一和第二DNA序列存在于不同载体中或者所述第一和第二DNA序列存在于单一载体中。在一个实施方案中，本发明涉及一种抗体，其在免疫测定法(诸如ELISA测定法)中完全或部分阻断任一种上述五特异性抗体对人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-Y、ENA-78、和GCP-2的结合。在一个实施方案中，部分阻断在所述抗体阻断五特异性抗体的结合达大于10%、20%、40%或50%时发生。在一个实施方案中，本发明涉及一种抗体，其竟争任一种上述五特异性抗体对人IL-8、Gro-(z、Gro-卩、Gro-丫、ENA-78、和GCP-2的结合。在一个实施方案中，本发明涉及一种抗体，其在免疫测定法(诸如ELISA测定法)中完全或部分阻断任一种上述五特异性抗体对人IL-8中表位KELRCQCIKTYSKP(SEQIDNO:54)的结合。在一个实施方案中，部分阻断在所述抗体阻断五特异性抗体的结合达大于10%、20%、40%或50%时发生。在一个实施方案中，本发明涉及一种抗体，其竟争任一种上述五特异性抗体对人IL-8中表位KELRCQCIKTYSKP(SEQIDNO:54)的结合。在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含上述五特异性抗体和药学可接受载体。在一个实施方案中，本发明涉及一种在哺乳动物中治疗或预防COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、和/或子宫内膜异位的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的上述五特异性抗体。在一个实施方案中，本发明涉及上述五特异性抗体，其在以人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-y、GCP-2和ENA-78之一种或多种的水平升高或失衡为特征的疾病或病症的治疗中使用，特别是COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、或子宫内膜异位。一方面，本发明涉及上述五特异性抗体，其在哺乳动物中预防和/或治疗COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、和/或子宫内膜异位中使用。一方面，本发明涉及上述五特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物在哺乳动物中预防和/或治疗COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、和/或子宫内膜异位中使用。\一方面，本发明涉及上述五特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中预防和/或治疗COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬_化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、和/或子宫内膜异位。在一个实施方案中，上文的哺乳动物是人。附图简述图l描绘了用于生成五特异性抗体的例示性的一组MAP。为了避免产生疑问，描绘了5种MAP肽单元。每种单元含有选自线性肽SEQIDNO:49-53的一种相同氨基酸序列。图2显示了比较BAL样品中存在的嗜中性粒细胞的流式细胞术数据。呈现了时间段(session)1、2和3。黑色的实心柱形显示了LPS考验前5天的基线。灰色的实心柱形描绘了LPS考验后6小时的BAL数据。嵌合抗体(HcLc)处理显著地且剂量依赖地抑制嗜中性粒细胞浸润。灰色的阴影线柱形表示24小时的数据。(n=6,*p《0.05，卞p《0.01，误差工形线表示标准偏差)。图3显示了对总循环嗜中性粒细胞的血液学分析(细胞计数)。1(空心正方形，□)和10mg/kg(闭合圆形，)嵌合抗体(HcLc)的IV注射阻止吸入的LPS对循环嗜中性粒细胞的刺激。与媒介物NHP相比l和10mg/kg处理都显著降低(卞)，而与lmg/kg剂量相比10mg/kg处理也显著降低("。数据以每ul血液的总计数表示(n=6,fp《0.05对lmg/kg,卞p《0.01对媒介物，误差工形线表示标准偏差)。图4显示了抑制人IL-8刺激的嗜中性粒细胞活化(升高的CD11b表面表达)。将多个浓度的人源化五特异性抗体与10nMhlL-8预温育，之后添加至纯化的人嗜中性粒细胞。数据以4个不同供体的平均值表示(n二4)。工形线表示标准误差。将所有的样品与仅用hlL-8刺激(添加至纯化的嗜中性粒细胞前没有单抗)的纯化的嗜中性粒细胞比较。人源化构建体H0L10和H0MO在抑制hlL-8刺激的CDllb表面表达方面更有效。图5A显示了小鼠656.35单抗结合靶人趋化因子。图5B显示了嵌合抗体(HcLc)单抗结合人靶趋化因子。图5C显示了人源化单抗结合人耙趋化因子。发明详述如本文中所使用的，"分离的五特异性抗体，，或者简称"五特异性抗体"意图指如下抗体，其结合人IL-8、Gro-a、Gro-p、Gro-y、和ENA-78并因此与它们起交叉反应，并且基本上没有其它具有不同抗原特异性的抗体，此外还是单一物质组成(singlecompositionofmatter)。为了避免产生疑问，本发明的五特异性抗体不必只结合人IL-8、Gro-a、Gro-f3、Gro-y、和ENA-78抗原，而是其还可发生结合其它相关蛋白，诸如人GCP-2，或者甚至可结合IL-8、Gro-a、Gro-P、Gro-y、ENA-78、和GCP-2的非人直向同源物；换言之，本发明的五特异性抗体最低限度结合人IL-8、Gro-a、Gro-P、Gro^、和ENA-78。此外，分离的五特异性抗体基本上没有其它细胞材料和/或化学品。如此语境中所使用的，五特异性抗体还包括具有其"亲本"五特异性抗体的结合特征的抗原结合片段和/或衍生物。本发明的五特异性抗体可以包含两条相同重链和两条相同轻链，它们形成典型的、两侧对称的免疫球蛋白分子，由两个各由一条重链和一条轻链构成的异二聚体构成。因而，本发明的五特异性抗体可以包含两拷贝的通过一条重链与一条轻链的结合所形成的相同抗原结合域。本发明的五特异性抗体虽然仅具有一种结合域，但是仍能够结合人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-y、和ENA-78并因此与它们起交叉反应。如本文中所使用的，"抗体"也称为"免疫球蛋白"。如本文中所使用的，"与…起交叉反应的抗体"指抗体不仅结合一种抗原，而且也结合其它抗原。如本文中所使用的，"中和"意图指对人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、GCP-2、或ENA-78的至少一种生物学活性的部分或完全抑制。例如，人IL-8、Gro-a、Gro-p、Gro-y、GCP-2、或ENA-78的生物学活性之一是其诱导嗜中性粒细胞趋化性的能力。测量抗体结合动力学的一种方式是通过表面等离振子共振。如本文中所使用的，术语"表面等离振子共振"指如下光学现象，其容许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,Sweden和Piscataway,N丄)来进行。关于进一步的描述，参见JonssonU等(1993)AnnBiolClin51:19-26;JonssonU等(1991)Biotechniques11:620-627;JohnssonB等(1995)J.Mol.Recognit8:125-131;及JohnnsonB等(1991)AnalBiochem198:268-277。术语"表位"指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子(诸如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面编组(chemicallyactivesurfacegroupingsofmoleculessuchasaminoacidsorsugarsidechains)组成，而且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。如本文中所使用的，"单克隆抗体"或单抗(与多克隆抗体相对)意图指单一分子组成的抗体分子制备物。例如，鼠衍生的单克隆抗体(小鼠单克隆抗体)可以通过杂交瘤纟支术(诸如标准的Kohler和Milstein杂交瘤方法)来制备。抗体生成细胞可以自受试者获得，并用于通过标准技术来制备单克隆抗体，诸如最初由Kohler和Milstein(1975)Nature256:495-497记载的杂交瘤技术(还可参见Brown等(1981)JImmunol127:539-46;Brown等(1980)JBiolChem255:4980-83;Yeh等(1976)PNAS76:2927-31;及Yeh等(1982)IntJCancer29:269-75)。用于产生单克隆抗体杂交瘤的技术是公知的(一般参见KennethRH,于MonoclonalAntibodies:ANewDimensionInBiologicalAnalyses,PlenumPublishingCorp.,NewYork,N.Y.(1980);LernerEA(1981)YaleJBiolMed54:387-402;GefterML等(1977)SomaticCellGenet3:231-36)。如本文中所使用的，术语"转染瘤"包括表达抗体的重组真核宿主细胞，诸如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、植物细胞、或真菌(包括酵母)细月包。如本文中所使用的，"特异性，，结合指结合预定抗原的抗体。通常，抗体以对应于约1x10-M或更小的平衡常数(KD)结合预定的抗原，并且以对应于比其对除预定的抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的结合亲和力低至少两个数量级的KD的亲和力结合预定的抗原。短语"识别抗原的抗体"和"对抗原特异的抗体"在本文中可与术语"特异性结合抗原的抗体"互换使用。如本文中所使用的，术语"kd，，(sec-l)意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。如本文中所使用的，术语"ka"(Mxsec-l)意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数。24如本文中所使用的，术语"KD"(M)意指特定抗体-抗原相互作用的平衡常数，并且通过用kd除以ka来荻得。关于核苦酸和氨基酸序列修饰的"保守序列修饰"指不显著地影响或改变由该核普酸序列编码的或含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的变化。此类保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸替代、添加和删除。可以通过标准技术来将修饰导入序列中，诸如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸替代包括其中氛基酸残基用具有相似侧链的氛基酸残基替换的替代。本领域中已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、P-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。如此，优选地，明确公开了序列的抗体中预测的非必需氨基酸残基用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替换。如此，一方面，本发明的五特异性抗体包括明确公开了的氨基酸序列的所有保守序列修饰。本发明还涵盖明确公开了的氨基酸序列的"衍生物"，其中一个或多个氨基酸残基已经通过例如酰化或糖基化被衍生化，而不显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特征。对于核酸，术语"基本上的同一性"指明两种核酸或其指定的序列在借助合适的核苷酸插入或删除以最佳地比对和比较时在至少约80%的核苷酸、通常至少约90%至95%，更优选至少约98°/。至99.5%的核苷酸中相同。或者，基本上的同一性在所述区段会在选择性杂交条件下与该链的互补物杂交时存在。对于核苷酸和氨基酸序列，术语"同一性"指明在借助合适的插入或删除以最佳地比对和比较时两种核酸或氨基酸序列之间的同一性程度。或者，基本上的同一性在所述DNA区段会在选择性杂交条件下与该链的互补物杂交时存在。两种序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的数目的函数(即％同一性=相同位置数/位置总数乘100)，其考虑缺口的数目，和每处缺口的长度，这些缺口是实现两种序列的最佳比对而需要导入的。可以使用数学算法来实现两种序列之间的序列比较和百分比同一性测定，如下文非限制性实施例中所描述的。可以使用GCG软件包(在http:〃www.gcg.com可获得)中的GAP程序来测定两种核苷酸或多肽序列之间的百分比同一性，其使用NWSgapdna.CMP矩阵及缺口权重40、50、60、70、或80和长度权重1、2、3、4、5、或6来进行。还可以使用已经收入ALIGN程序(第2.0版)中的MeyersE和MillerW(1988)ComputApplBiosci4:11-17)算法来测定两种核苦酸或氨基酸序列之间的百分比同一性，其使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4来进行。另外，可以使用已经收入GCG软件包(在http:〃www.gcg.com可获得)中GAP程序中的Needleman和Wunsch(1970)JMolBiol48:444-453算法来测定两种氨基酸序列之间的百分比同一性，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵、和缺口权重l6、14、12、10、8、6、或4和长度权重1、2、3、4、5、或6来进行。若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是"可操作连接的"。例如，若启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子与该序列是可操作连接的。关于调控序列的转录，"可操作连接的"意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在必须连接两个蛋白质编码区的情况中意味着相邻且处于同一阅读框中。对于开关序列，"可操作连接的"指明该序列能够招致开关重组。如本文中所使用的，术语"载体"意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是"质粒"，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接入病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)能在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为"重组表达载体"(或简称为"重组载体")。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体常常采取质粒形式。在本说明书中，"质粒，，和"载体，，可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。然而，本发明意图包括发挥等同功能的其它形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。26如本文中所使用的，术语"重组宿主细胞"(或简称"宿主细胞)意指已经将重组表达载体导入其中的细胞。应当理解，此类术语意图不仅涉及特定的受试细胞，而且涉及此细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在随后的世代中发生，所以实际上此类后代可能与亲本细胞不相同，但是仍包括在本文中所使用的术语"宿主细胞"的范围内。重组宿主细胞包括例如转染瘤，诸如CHO细胞、NS/0细胞、和淋巴细胞。如本文中所使用的，术语"受试者"包括任何人或非人动物。术语"非人动物"包括所有脊推动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、牛、鸡、两栖类、爬行类等。1.抗体结构完整的抗体完整的抗体通常是包含至少两条重链和两条轻链的异多聚体糖蛋白。除IgM外，完整的抗体是约150Kda的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。通常，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫化物连接的数目有所变化。每条重链和轻链还具有链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH),接着是多个恒定区。每条轻链具有一个可变域(VO和在其另一端的一个恒定区；轻链恒定区与重链第一恒定区排列在一起，而轻链可变域与重链可变域排列在一起。根据恒定区氨基酸序列，来自大多数脊推动物物种的抗体的轻链可以归入称为卡巾自(K)和拉姆达(X)的两种型之一。根据其重链恒定区氨基酸序列，人抗体可归入五种不同的类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可进一步细分成亚类IgGl、IgG2、IgG3和IgG4;及lgAl和IgA2。存在物种变体，其中小鼠的和大鼠的至少具有IgG2a、IgG2b。抗体的可变域将结合特异性赋予抗体，其中某些展示特定变异性的区域称为互补决定区(CDR)。可变区中更加保守的部分称为框架区(FR)。完整重链和轻链的可变域各包含由三个CDR所连接的四个FR。每条链中的CDR通过FR区非常接近地保持在一起，并与另一条链的CDR—起促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定区不直接牵涉抗体与抗原的结合，^旦展现出多种效应器功能，诸如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、经由对FcY受体的结合的吞噬、经由新生儿Fc受体(FcRn)的半衰期/清除速率和经由补体级联的Clq成分的补体依赖性细胞毒性。人lgG2恒定区缺乏通过经典途径活化补体或介导抗体依赖性细胞的细胞毒性的能力。IgG4恒定区缺乏通过经典途径活化补体的能力，并且仅孩史弱地介导抗体依赖性细胞的细胞毒性。本质上缺乏这些效应器功能的抗体可称为"非溶胞性"抗体。人抗体人抗体可以通过本领域:技术人员已知的许多方法来生成。人抗体可以通过使用人骨髓瘤或小鼠-人异源骨髓瘤细胞系的杂交瘤方法来制备，参见Kozbor(1984)JImmunol133:3001和Brodeur,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp51-63(MarcelDekkerInc，1987)。备选的方法包括均利用人V区全集的噬菌体文库或转基因小鼠的应用(参见WinterG(1994)A画RevImmunol12:433-455;GreenLL(1999)JImmunolMethods231:11-23)。现在可利用转基因小鼠的数个品系，其中它们的小鼠免疫球蛋白基因座已经用人免疫球蛋白基因区段替换(参见TomizukaK(2000)PNAS97:722-727;FishwildDM(1996)NatureBiotechnol14:845-851;MendezMJ(1997)NatureGenetics15:146-156)。抗原考验后，此类小鼠能够生成人抗体全集，可从中选^r感兴趣的抗体。特别要注意Trimera系统(参见ErenR等(1998)Immunology93:154-161)(其中将人淋巴细胞移植入经照射小鼠中)、选定淋巴细胞抗体系统(SelectedLymphocyteAntibodySystem,SLAM,参见Babcook等(1996)PNAS抗体生成规程，接着进行去巻积(deconvulate),有限稀释和选择规程)和XenomouseIITM(AbgenixInc)。可自MorphotekInc获得一种备选的方法，其使用MorphodomaTM技术。可使用噬菌体展示技术来生成人抗体(及其片段)，参见McCafferty(1990)Nature348:552-553和GriffithsAD等(1994)EMBO13:3245-3260。依照此技术，以符合读码框的方式将抗体V域基因克隆入丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并且作为功能性抗体片段在噬菌体颗粒表面上展示(通常借助于辅助噬菌体)。基于抗体的功能性特性的选择导致对编码展现出那些特性的抗体的基因的选择。噬菌体展示技术可以用于从自人B细胞制备的文库选择抗原特异性抗体，所述人B细胞自罹患上文所描述的疾病或病症的个体或者自未免疫的人供体采集(参见Marks(1991)JMolBio222:581-597)。若期望包含Fc域的完整人抗体，则必须将噬菌体展示的衍生片段再克隆入包含想要的恒定区且建立稳定的表达细胞系的哺乳动物表达载体中。可以使用亲和力成熟技术(Marks(1992)Bio/technol10:779-783)来改善结合亲和力，其中如下改善初级人抗体的亲和力，即序贯地用天然存在的变体替换H和L链V区，并根据改善的结合亲和力来选择。现在还可利用此技术的变型诸如"表位印记"，参见WO93/06213。还可参见Waterhouse(1993)NuclAcidsRes21:2265-2266。嵌合的和人源化的抗体的问题，即潜在的免疫原性，尤其在重复施用该抗体后，即患者的免疫系统会将非人的完整抗体识别为非自身的并启动中和应答。在开发完全人的抗体(参见上文)外，这些年来已经开发了多种技术来克服这些问题，并且一般牵涉减少非人氨基酸序列在完整的治疗性抗体中的组成，同时保留相对容易地从人源化动物(例如小鼠、大鼠或家兔)获得非人抗体。泛泛而言，两种方法已经被用于实现这点。第一种是嵌合抗体，其一般包含与人恒定区融合的非人(例如啮齿动物，诸如小鼠)可变域。因为抗体的抗原结合位点位于可变区内，所以嵌合抗体保留其对抗原的结合亲和力，但是需要人恒定区的效应器功能，因此能够执行效应器功能，诸如上文所描述的。典型地，使用重组DNA方法来生成嵌合抗体。使用常规的规程来分离编码所述抗体的DNA(例如cDNA)，并测序(例如通过使用能够特异性结合编码本发明抗体的H和L链可变区的基因的寡核苷S交探针来实现)。杂交瘤细胞充当此类DNA的典型来源。一旦被分离，便将该DNA放置入表达载体中，然后将其转染入不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞诸如大肠杆菌(Eco//)、COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中以获得该抗体的合成。可以通过用人L和H链的编码序列替换相应的非人(例如鼠)H和L恒定区来修饰DNA,参见例如Morrison(1984)PNAS81:6851。如此，本发明的另一个实施方案提供了一种嵌合抗体，其包含与人恒定区(其可以是IgG同种型，例如IgGl的)融合的具有序列SEQIDNO:2、6、或10的Vh域和具有序列SEQIDNO:4、8、或12的Vl域。第二种方法牵涉人源化抗体的生成，其中通过将可变区人源化来降低抗体的非人含量。两种用于人源化的技术已经获得普及。第一种是通过CDR嫁接进行的人源化。CDR建立接近抗体N端的环，在那里它们形成在由框架区提供的支架中安置的表面。抗体的抗原结合特异性主要由其CD錄面的地形学和化学特征限定。这些特征继而由各个CDR的构象、CDR的相对布置、和构成CDR的残基的侧链的性质和布置决定。可以通过仅将非人(例如鼠)抗体("供体，，抗体)的CDR嫁接至合适的人框架("受体框架")和恒定区上来实现免疫原性的大大降低(参见Jones等(1986)Nature321:522-525和VerhoeyenM等(1988)Science239:1534-1536)。然而，CDR嫁接本身可能不导致抗原结合特性的完全保留，并且经常发现若要恢复显著的抗原结合亲和力，则必须在人源化分子中保留供体抗体的一些框架残基(有时称为"回复突变,，)(参见QueenC等(1989)PNAS86:10,029-10,033;CoM等(1991)Nature351:501-502)。在此情况中，可以自数据库选择与非人供体抗体显示最大序列同源性(通常60%或更大)的人V区，用以提供人框架(FR)。可以键残基替代入人受体框架中以保留CDR构象。可使用抗体的计算机建模来帮助鉴定此类结构上重要的残基，参见WO99/48523。或者，可以通过"镶饰，，(veneering)的方法来实现人源化。对独特的人和鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的统计学分析揭示了暴露残基的精确样式在人和鼠抗体中是不同的，而且大多数个别表面位置对少数不同残基具有强烈的偏爱(参见PadlanEA等(1991)MolImmunol28:489-498和PedersenJT等(1994)JMolBiol235:959-973)。因此，有可能通过替换非人Fv框架区中与那些通常在人抗体中找到的暴露残基不同的暴露残基来降低其免疫原性。因为蛋白质抗原性可以与表面可及性相关联，所以表面残基的替换可能足以使得小鼠可变区对于人免疫系统是"看不见的，，(还可参见MarkGE等(1994)于HandbookofExperimentalPharmacology第113巻ThepharmacologyofmonoclonalAntibodies,Springer-Verlag,第105页-第134页)。因为仅改变抗体的表面，支持性残基保持不变，所以此人源化规程称为"镶饰"。另一种备选方法记载于WO04/006955。其它备选方法包括WO04/006955中所陈述的和HumaneeringTM(Kalobios)的规程，其利用细菌表达系统，并生成与人种系在序歹'J上4妻近的^元体(Alfenito-MAdvancingProteinTherapeuticsJanuary2007,30SanDiego,Califomia)。另一种人源化的方法牵涉根据人CDR区与供体小鼠抗体CDR区的结构相似性而不是抗体的其它区域(诸如框架区)之间的同源性来选择人受体才匡架。at匕方法也-尔为SuperhumanisationTM(EvogenixInc.;Hwang等(2005)Methods36:35-42)。对本领域技术人员显而易见的是，术语"衍生的"不仅意图限定材料的来源，即在物理起源的意义上而言，而且还意图限定在结构上与所述材料相同但并非起源于所述来源的材料。如此不必必须自供体抗体纯化出"供体抗体中所找到的残基"。抗体片段在本发明的某些实施方案中，提供了为抗原结合片段的治疗性抗体。此类片段可以是完整的和/或人源化的和/或嵌合的抗体的功能性抗原结合片段，诸如上文所描述的抗体的Fab、Fd、Fab，、F(ab，)2、Fv、ScFv片段。缺乏恒定区的片段缺乏通过经典途径活化补体或介导抗体依赖性细胞的细胞毒性的能力。传统上，通过对完整抗体的蛋白水解消化(例如通过木瓜蛋白酶消化)来生成此类片段(参见例如WO94/29348),但是也可以自经重组转化的宿主细胞直接生成。关于ScFv的生成，参见Bird等(l988)Science242:423-426。另外，可以使用多种工程化改造技术来生成抗体片段，如下文所描述的。Fv片段表现为具有比Fab片段低的其两条链的相互作用能。为了稳定VH和Vl域的結合，已经用肽(Bird等(1988)Science242:423-426,Huston等PNAS85:5879-5883)、二硫桥(Glockshuber等(1990)Biochemistry29:1362-1367)和"穴中结，，(knobinhole)突变(Zhu等(1997)ProteinSci6:781-788)将它们连接。可以通过本领域技术人员公知的方法来生成ScFv片段，参见Whitlow等(1991)MethodscompanionMethodsEnzymol2:97-105和Huston等(1993)IntRevImmunol10:195-217。ScFv可以在细菌细胞诸如大肠杆菌中生成，但是更典型地，在真核细胞中生成。ScFv的一个缺点在于产品为单价，其排除了由于多价结合引起的亲合力提高及其短的半寿期。克服这些问题的尝试包括通过化学偶联自含有额外的C端半胱氨酸的ScFV生成的二价(ScFv')2(Adams等(1993)CanRes53:4026-4034和McCartney等(1995)ProteinEng8:301-314)或通过含有不成对的C端半胱氨酸残基的ScFv的自发位点特异性二聚化而生成的二价(ScFv，)2(参见Kipriyanov等(1995)CellBiophys26:187-204)。或者，可以通过将肽接头缩短至3至12个残基之间来迫使ScFv形成多聚体，从而形成"双抗体"，参见Holliger等(1993)PNAS90:6444-6448。更进一步缩短接头可导致ScFv三聚体("三抗体，，，参见Kortt等(1997)ProteinEng10:423-433)和四聚体("四抗体"，参见LeGall等(1999)FEBSLett453:164-168)。还可以如下实现二价ScFV分子的构建，即与蛋白质二聚化基序遗传融合以形成"微型抗体"(miniantibody)(参见Pack等(1992)Biochemistry31:1579-1584)和"迷你体，，(minibody)(参见Hu等(1996)CancerRes56:3055-3061)。还可以通过第三肽接头连接两个ScFv单元来生成ScFv-ScFv串联物((ScFV)2)，参见Kurucz等(1995)JImmol154:4576-4582。可以经由两个单链融合产物的非共价结合来生成双特异性双抗体，所述单链融合产物由来自一种抗体的VH域与另一种抗体的VL域通过短接头连接而组成，参见Kipriyanov等(1998)IntJCan77:763-772。可以如下增强此类双特异性双抗体的稳定性，即导入上文所描述的二硫桥或"穴中结"突变或者形成单链双抗体(ScDb)，其中两个杂合ScFv片段经由肽接头相连接，参见Kontermann等(1999)JImmunolMethods226:179-188。可获得四价双特异性分子，例如通过将ScFv片段与IgG分子的CH3域或者与Fab片段经由铰链区融合来实现，参见Coloma等(1997)NatureBiotechnol15:159-163。或者，已经通过双特异性单链双抗体的融合来创建四价双特异性分子(参见Alt等(1999)FEBSLett454:90-94)。还可以如下形成较小的四价双特异性分子，即二聚化具有含有螺旋-环-螺旋基序的接头的ScFv-ScFv串联物(DiBi微型抗体，参见Muller等(1998)FEBSLett432:45-49)或者以阻止分子内配对的取向二聚化包含4个抗体可变域(VH和V0的单链分子(串联双抗体，参见Kipriyanov等(1999)JMolBiol293:41-56)。可以通过Fab，片段的化学偶联或者通过经由亮氨酸拉链的异二聚化来创建双特异性F(ab，)2片段(参见Shalaby等(l"2)JExpMed175:217-225和Kostelny等(1992)JImmunol148:1547-1553)。还可获得基于分离的VH或Vi域的所谓的域抗体(DomantisLtd.),参见US6,248,516;US6,291,158;US6,172,197。异源偶联抗体异源偶联抗体是也形成本发明实施方案的衍生物。异源偶联抗体由使用任何常规的交联方法形成的两个共价连接的抗体构成。参见US4,676,980。其它修饰32本发明的抗体还可以在恒定区中掺入任何其它的修饰。例如，已知抗体在其恒定区中的保守位置处的糖基化对抗体功能(特别是效应器机能，诸如那些上文所描述的)具有深刻的影响，参见例如Boyd等(1996)MolImmunol32:1311-1318。涵盖本发明治疗性抗体的糖基化变体，其中添加、替代、删除或修饰一个或多个碳水化合物模块。天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸基序的导入为碳水化合物模块的酶促附着创建潜在的位点，因此可以用于操作抗体的糖基化。在Raju等(2001)Biochemistry40:8868-8876中，经由使用(3-l,4-半乳糖基转移酶和/或a-2,3-唾液酸转移酶的再半乳糖基化(regalactosylation)和/或再唾液酸化(resialylation)的方法来提高TNFR-IgG免疫粘附素的末端唾液酸化。认为提高末端唾液酸化延长免疫球蛋白的半衰期。与大多数糖蛋白一样，抗体本质上通常作为糖形混合物生成。此混合物在抗体在真核、特别是哺乳动物细胞中生成时是特别明显的。已经开发了多种方法来制备限定的糖形，参见Zhang等Science(2004)303:371;Sears等(2001)Science291:2344;Wacker等(2002)Science298:1790;Davis等(2002)ChemRev102:579;Hang等(2001)AccChemRes34:727。如此，本发明涉及本文中所描述的多种治疗性抗体(其可以是IgG同种型，例如IgGl的)，其包含所述抗体的限定数目(例如7个或更少，例如5个或更少，诸如2个或单个)的糖形。依照本发明的衍生物还包括与非蛋白质性质的聚合物诸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯偶联的本发明治疗性抗体。蛋白质与PEG的偶联是已建立的用于延长蛋白质半衰期以及降低蛋白质的抗原性和免疫原性的技术。已经用完整的抗体以及Fab，片段调查了具有不同分子量和式样(线性或分支)的PEG化的用途，参见KoumenisIL等(2000)IntJPharmaceut198:83-95。一个具体的实施方案包含与PEG偶联的没有以下效应器功能的本发明抗原结合片段(诸如Fab片段或scFv):a)通过经典途径活化补体；和b)介导抗体依赖性细胞的细胞毒性。认为抗体Fc区与多种Fc受体(FcyR)之间的相互作用介导抗体的效应器功能，包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、补体的固定、吞噬和抗体的半衰期/清除。根据想要的效应器特性，可以实施对本发明抗体Fc区的各种修饰。具体地，基本上缺乏a)通过经典途径活化补体；和b)介导抗体依赖性细胞的细胞毒性的功能的人恒定域包括IgG4恒定区、IgG2恒定区和含有特定突变的IgGl恒定区，如例如EP0307434(WO88/07089)、EP0629240(WO93/17105)和WO2004/014953中所披露的第234位、第235位、第236位、第237位、第297位、第318位、第320位和/或第322位突变。已经分开地描述了，重链恒定区CH2域内残基235或237处(Kabat编号方式；EU索引系统)的突变降低对FcyRI、FcYRII和FcryRIII的结合，因此降低抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Duncan等(1988)Nature332:563-564;Lund等(1991)JImmunol147:2657-2662;Chappel等(1991)PNAS88:9036-9040;Burton和Woof(1992)AdvImmunol51:l画84;Morgan等(1995)Immunology86:319-324;Hezareh等(2001)JVirol75(24):12161-12168)。此外，一些报告还已经描述了这些残基中的一些牵涉募集或介导补体依赖性细胞毒性(CDC)(Morgan等，1995;Xu等(2000)CellImmunol200:16-26;Hezareh等(2001)JVirol75(24):12161-12168)。因此，残基235和237都已经被突变成丙氨酸残基(Brett等(1997)Immunology91:346-353;Bartholomew等(1995)Immunology85:这些恒定区的抗体可以称为"非溶胞"抗体。可以将补救受体结合表位掺入抗体中以延长血清半衰期，参见US5,739,277。有五种目前公认的人Fcy受体，即FcyR(I)、FcyRIIa、FcyRIIb、Fc丫RIIIa和新生儿FcRn。Shields等(2001)JBiolChem276:6591-6604证明了，一个共同的IgGl残基集合牵涉结合所有的FqR，而FcyRII和FcyRIII利用此共同集合之外的独特位点。一组IgGl残基在改变成丙氨酸时降低对所有FcYR的结合Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn画297和Pro-239。所有的均在IgGCH2域中，并且在连接CH1和CH2的铰链附近成簇。虽然FcYRI仅利用共同的IgGl残基集合进行结合，但是FcyRII和FcyRIII与该共同集合及另外的独特残基相互作用。对一些残基的改变^又降低对FcyRI1(例如Arg-292)或FcyRffl(例如Glu-293)的结合。一些变体显示对FcYRII或FcYRIII的改善的结合，但是不影响对其它受体的结合(例如Ser-267Ala改善对FcYRII的结合，但是对FcYRIII的结合未受影响)。其它变体展现出对FcYRII或FcyRIII的改善的结合及对其它受体的结合降低(例如Ser-298Ala改善对FcyRIII的结合，而降低对FcYRII的结合)。对于FcryRnia,最好的结合IgGl变体具有Ser-298、Glu-333和Lys-334处的组合丙氨酸替代。认为新生儿FcRn受体牵涉保护IgG分子免于降解，如34此增强血清半衰期和穿过组织的转胞吞(参见JunghansRP(1997)ImmunolRes16:29-57和Ghetie等(2000)AnnuRevImmunol18:739-766)。确定与人FcRn直接相互作用的人IgGl残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。本发明的治疗性抗体可以掺入任何上文的恒定区修饰。2.生产方法
技术领域：
：本发明的抗体可以在转基因生物体诸如山羊(参见Pollock等(1999)JImmunolMethods231:147-157)、鸡(参见MorrowKJJ(2000)GenetEngNews20:1-55)、小鼠(参见Pollock等同上)或植物(参见DoranPM(2000)CurrOpinionBiotechnol11:199-204;MaJK-C(1998)NatMed4:601-606;BaezJ等(2000)BioPharm13:50-54;StogerE等(2000)PlantMolBiol42:583-590)中生产。还可以通过化学合成来生产抗体。然而，通常使用本领域技术人员公知的重组细胞培养技术来生产本发明的抗体。分离编码抗体的多核苷酸，并插入可复制的载体诸如质粒中以在宿主细胞中进行进一步的克隆(扩增)或表达。一种有用的表达系统是谷氨酸合成酶系统(诸如由LonzaBiologics出售的)，特别是在宿主细胞是CHO或NS0的情况中(参见下文)。编码抗体的多核芬酸容易使用常规规程(例如寡核苷酸探针)分离和测序。可使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒是典型的实施方案。一般而言，此类载体进一步包括与轻链和/或重链多核苷酸可搡作连接的信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列以便促进表达。可以将编码轻链和重链的多核苷酸插入分开的载体中，并同时或序贯导入(例如通过转化、转染、电穿孔或转导)同一宿主细胞中，或者若想要的话，可以将重链和轻链两者都插入同一载体中，之后进4亍此导入。本领域技术人员会直接显而易见的是，由于遗传密码的冗余，还可利用本文中所公开的多核普酸的备选多核苷酸，它们会编码本发明的多肽。信号序列本发明的抗体可以作为与在成熟蛋白质N端的、具有特异性切割位点的异源信号序列的融合蛋白生成。信号序列应当被宿主细胞识别和加工。对于原核宿主细胞，信号序列可以是^5咸性磷酸酶、青霉素酶、或热稳定的肠毒素II前导。对于酵母分泌，信号序列可以是酵母转化酶前导、a-因子前导或酸性磷酸酶前导，参见例如W090/13646。在哺乳动物细胞系统中，可利用病毒分泌前导，诸如单纯疱渗gD信号和天然免疫球蛋白信号序列(诸如人Ig重链)。典型地，将信号序列以符合读码框的方式连接至编码本发明抗体的多核普酸。复制起点复制起点是本领域中公知的，其中pBR322适合于大多数革兰氏阴性细菌，2p质粒适合于大多数酵母，而多种病毒起点诸如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV适合于大多数哺乳动物细胞。一般而言，整合型哺乳动物表达载体不需要复制起点构件，除非要求在大肠杆菌中增殖载体。然而，可以使用SV40起点，因为其含有早期启动子。选择标志典型的选择基因编码下述蛋白质，其(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤、或四环素)的抗性，或(b)补充营养缺陷型缺陷，或提供不能在复合培养基中获得的营养物，或(c)两者的组合。选择方案可以牵涉阻滞不含载体的宿主细胞的生长。已经成功用编码本发明的治疗性抗体的基因转化的细胞由于例如由共投递的选择标志赋予的药物抗性而存活。一个例子是DHFR选择系统，其中在DHFR阴性宿主菌抹中产生转化体(例如参见Page和Sydenham(1991)Biotechnology9:64-68)。在此系统中，将DHFR基因与本发明的抗体多核苷酸序列共投递，然后通过撤消核苷来选择DHFR阳性细胞。若需要的话，还采用DHFR抑制剂曱氨蝶呤来选择具有DHFR基因扩增的转化体。通过将DHFR基因可操作连接至本发明的抗体编码序列或其功能性衍生物，DHFR^基因扩增导致想要的感兴趣抗体序列的伴随扩增。CHO细胞是对此DHFR7曱氨蝶呤选择特别有用的细胞系，并且使用DHFR系统来扩增和选择宿主细胞的方法是本领域中完全确立的，参见KaufmanRJ等(1982)JMolBiol159:601-621,关于综述，参见WernerRG,NoeW，KoppK,SchluterM,"Appropriatemammalianexpressionsystemsforbiopharmaceuticals，，，Arzneimittel-Forschung.48(8):870-80,1998年8月。另一个例子是谷氨酸合成酶表达系统(LonzaBiologics)。一种适合于在酵母中使用的选择基因是trpl基因；参见Stinchcomb等(1979)Nature282:38。启动子将适合于表达本发明抗体的启动子可操作连接至编码该抗体的DNA/多核苷酸。用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、p-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸和杂合启动子诸如Tac。适合于酵母细胞中表达的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶和葡糖激酶等。诱导型酵母启动子包括醇脱氬酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白和负责氮代谢或麦芽糖/半乳糖利用的酶等。用于在哺乳动物细胞系统中表达的启动子包括RNA聚合酶II启动子，包括病毒启动子，诸如多瘤病毒、禽痘和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、巨细胞病毒(特别是立即早期基因启动子)、逆转录病毒、乙肝病毒、肌动蛋白、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和早期或晚期猿病毒40启动子和非病毒启动子i者如EF-la(Mizushima和Nagata(1990)NucleicAcidsRes18(17):5322)等。启动子的选择可以基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。增强子元件若适于例如在高等真核生物中表达，则可以包括替代那些发现位于上文所描述的启动子中的增强子元件的別的增强子元件，或者可以包括别的增强子元件以及那些发现位于上文所描述的启动子中的增强子元件。合适的哺乳动物增强子序列包括来自珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、胎蛋白、金属硫蛋白和胰岛素的增强子元件。或者，可以使用来自真核细胞病毒的增强子元件，诸如SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子、杆状病毒增强子或鼠IgG2a基因座(参见W004/009823)。虽然此类增强子通常位于载体上在启动子上游的位点处，但是它们也可以位于别处，例如在非翻译区内或聚腺芬酸化信号下游。增强子的选择和定位可以基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。聚腺苷酸化/终止在真核系统中，将聚腺苷酸化信号可操作连接至编码本发明抗体的多核苷酸。此类信号通常放置于可读框的3'。在哺乳动物系统中，非限制性的实例信号包括那些衍生自生长激素、延长因子-la和病毒(例如SV40)基因或逆转录病毒长末端重复的。在酵母系统中，聚腺苷酸化/终止信号的非限制性例子包括那些衍生自磷酸甘油酸激酶(PGK)和醇脱氬酶1(ADH)基因的。在原核系统中，通常不需要聚腺苷酸化信号，并且替代地，通常采用更短的且更限定的终止子序列。聚腺苷酸化/终止序列的选择可以基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。用于增强产率的其它方法/元件除上文的之外，可以用于增强产率的其它特征包括染色质重建元件、内含子和宿主细胞特异性密码子修饰。因此，可以修饰本发明抗体的密码子选择以适应宿主细胞的密码子偏爱，以便提升转录物和/或产物产量(例如HoekemaA等(1987)MolCellBiol7(8):2914-24)。密码子的选择可以基于与用于表达的宿主细胞的合适的相容性。宿主细月包适合于克隆或表达编码本发明抗体的载体的宿主细胞是例如原核细胞、酵母细胞、或高等真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如肠杆菌科(enterobacteriaceae)，i者如埃希氏菌属CE5c/zen.c/z/a)，例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(￡.co/z')(例如ATCC31,446;31,537;27,325)、肠杆菌属CE"fera6a"w)、欧文氏菌属CErw/m'a)、克雷伯氏菌属C0e&zW/a)、变形菌属(尸rato^)、沙门氏菌属(Sa/,"owe〃a)例如鼠伤寒沙门氏菌(，a/wo"e〃a/^p/r/mwn'wm)、沙雷氏菌属(&rra"a)例如粘质沙雷氏菌(Serra"awarcesca"s)、和志贺氏菌属(5^ge〃a),以及芽孢杆菌属(S"c/〃/)诸如枯草芽孢杆菌(及w&z7/"和地衣芽孢杆菌(凡//c/7em/orm/力(参见DD266710)、假单胞菌属CP化wtfoww"ay)诸如铜绿假单胞菌CP^rwg/"oM)、和链霉菌属CS^/7tow>r&y)。酵母宿主细胞中'还涵盖酿酒酵母或啤酒糖酵母(5"acc/7aramycMcewWw'ae)、粟酒裂殖糖酵母(6b/n,zaflcc/zara7";/ces/om6e)、克鲁纟隹酵母属(A7w"era/"yce力(例^口ATCC16,045;12,424;24178;56,500)、亚罗酵母属(7arraw&)(EP402,226)、巴斯德毕赤酵母(尸/c/2/a尸aston'力(EP183,070，还可参见Peng等J.Biotechnol.108(2004)185-192)、假丝酵母属(Cawfe/")、瑞氏木霉(7Hc/7oafermflre^/a)(EP244,234)、青霉属(尸ew'c/〃&)、弯颈霉属(7b/;^oc/a^wm)和曲霉属045pe/^7/i^)宿主诸如构巢曲霉(A"WM/a""和黑曲霉(Aw'ger)。虽然本发明明确涵盖原核和酵母宿主细胞，但是本发明的宿主细胞通常是脊推动物细胞。合适的脊推动物宿主细胞包括哺乳动物细胞，诸如COS-l(ATCCNo.CRL1650)、COS-7(ATCCCRL1651)、人胚肾系293、PerC6(Crucell)、幼仓鼠肾细胞(BHK)(ATCCCRL1632)、BHK570(ATCCNO.CRL10314)、293(ATCCNO.CRL1573)、中国仓鼠卵巢细胞CHO(例如CHO-Kl，ATCCNO.CCL61、DHFR-CHO细胞系诸如DG44(参见Urlaub等(1986)同上)，特别是那些为了悬浮培养而改编的CHO细胞系)、小鼠塞托利(sertoli)细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞(ATCCCRL1587)、HELA细胞、犬肾细胞(ATCCCCL34)、人肺细胞(ATCCCCL75)、HepG2和骨髓瘤或淋巴瘤细胞，例如NS0(参见US5,807,715)、Sp2/0、Y0。如此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种经稳定转化的宿主细胞，其包含编码本文中所描述的治疗性抗体的重链和/或轻链的载体。典型地，此类宿主细胞包含编码所述轻链的第一载体和编码所述重链的第二载体。此类宿主细胞还可以进行进一步的工程化改造或改编以修饰本发明抗体的质量、功能和/或产量。非限制性例子包括特定修饰(例如糖基化)酶和蛋白质折叠伴侣蛋白的表达。细胞培养方法可以通过本领域技术人员已知的任何方法来培养用编码本发明的治疗性抗体的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以在转瓶、摇瓶、滚瓶或中空纤维系统中培养，但是大规模生产优选使用搅拌釜反应器或袋反应器(例如WaveBiotech,Somerset,NewJerseyUSA),尤其对于悬浮培养物。典型地，改编搅拌罐以使用例如喷射器、挡板或低剪切力叶轮进行通气。对于鼓泡塔和气升式反应器，可以使用用空气或氧气气泡进行的直接通气。若宿主细胞在无血清培养基中培养，则优选的是该培养基补充有细胞保护剂(诸如PluronicF-68)以帮助阻止由通气过程引起的细胞损伤。根据宿主细胞特征，可以使用微载体作为贴壁依赖性细胞系的生长基底，或者可以改编细胞以进行悬浮培养(这是典型的)。宿主细胞(特别是脊推动物宿主细胞)的培养可以利用多种操作模式，诸如分批、补料-分批、重复分批加工(参见Drapeau等(1994)Cytotechnology15:103-109)、延长的分批工艺或灌注培养。虽然经重组方式转化的哺乳动物宿主细胞可以在含有血清的培养基诸如包含胎牛血清(FCS)的培养基中培养，但是优选的是此类宿主细胞在无血清的合成培养基诸如Keen等(1995)Cytotechnology17:153-163中所披露的或商品化培养基诸如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(CambrexNJ,USA)(必要时补充能源诸如葡萄糖和合成的生长因子诸如重组胰岛素)中培养。宿主细胞的无血清培养可能要求改编那些细胞以在无血清的条件中生长。一种改编方法是将此类宿主细胞在含有血清的培养基中培养，并且重复地用无血清的培养基更换80°/。的培养液以使得宿主细胞学会适应无血清的条件(参见例如ScharfenbergK等(1995)于AnimalCelltechnology:Developmentstowardsthe21stcentury(BeuveryEC等编),第619-623页，KluwerAcademicpublishers)。可以使用多种技术从培养液中回收并纯化分泌入该培养液中的本发明抗体，以提供适合于预期用途的純化程度。例如，在与包含治疗性抗体的培少95°/。的纯度(如通过还原性SDS-PAGE所测定的)，更典型地，98%或99%的纯度。在第一种情况中，通常使用离心来除去来自培养物培养液的细胞碎片，接着使用例如微滤、超滤和/或深度过滤进行上清液的澄清步骤。或者，可以在没有在先离心的情况中通过^(效滤、超滤或深度过滤来收获抗体。可利用多种其它技术，诸如透析、凝胶电泳和层析技术诸如羟磷灰石(HA)、亲和层析(任选地牵涉加亲和标签系统诸如多组氨酸)和/或疏水相互作用层析(HIC，参见US5,429,746)。在一个实施方案中，如下捕获本发明的抗体，即在多个澄清步骤后，使用蛋白A或G亲和层析，接着进行进一步的层析步骤诸如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻层析和硫酸铵沉淀。典型地，还采用各式各样的病毒清除步骤(例如使用例如DV-20滤器的纳米过滤)。这些各式各样的步骤后，提供了包含至少10mg/ml或更大，例如100mg/ml或更大的本发明抗体的纯化的(典型地是单克隆的)制备物，因此形成本发明的实施方案。可以通过超滤来产生100mg/ml或更大的浓度。合适地，此类制备物基本上不含本发明抗体的聚集形式。细菌系统特别适合于抗体片段的表达。此类片段位于细胞内或周质内。可以提取不溶性周质蛋白，并重折叠以形成活性蛋白，其依照本领域技术人员已知的方法来实现，参见Sanchez等(1999)JBiotechnol72:13-20及CupitPM等(1999)LettApplMicrobiol29:273-277。3.药物组合物和施用模式可以将上文所描述的本发明抗体的纯化的制备物掺入药物组合物中，供人疾病和病症(诸如那些上文所概述的)的治疗中使用。典型地，此类组合物进一步包含药学可接受的(即惰性的)载体，如可接受的药学实践所知晓40和要求的，参见例如RemingtonsPharmaceuticalSciences,第16版，(1980)，MackPublishingCo.。此类载体的例子包括用合适的緩冲剂緩沖至5至8范围内的pH的无菌载体诸如盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。合适地，供注射(例如通过静脉内、腹膜内、真皮内、皮下、肌肉内或门内(intraportal))或连续输注用的药物组合物不含明显的颗粒物质，并且可以包含0.1mg至10g的治疗性抗体，通常5mg和25mg之间的抗体。用于制备此类药物组合物的方法是本领域技术人员公知的。在一个实施方案中，药物组合物包含单位剂量形式的0.1mg至10g的本发明的治疗性抗体，任选地，以及使用说明。依照本领域技术人员公知的或显而易见的方法，可以将本发明的药物组合物冻干(冷冻干燥)，用于在施用前重建。若本发明的实施方案包含具有IgGl同种型的本发明抗体，则可以将铜的螯合剂诸如柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)或EDTA或组氨酸添加至该药物组合物以降低铜介导的对此同种型抗体的降解的程度，参见EP0612251。一般而言，用于施用本发明抗体的有效剂量和治疗方案凭经验确定，并且取决于诸如患者的年龄、重量和健康状况和要治疗的疾病或病症等因素。此类因素在主治医师的范围内。选择合适剂量的指导可以参见例如Smith等(1977)Antibodiesinhumandiagnosisandtherapy,RavenPress,NewYork,但是一般会在0.1mg和lg之间。在一个实施方案中，用于治疗人患者的剂量给药方案是每周一次或每两周一次皮下施用的或着每1或2个月静脉内输注施用的0.1mg至10g的本发明治疗性抗体。本发明的组合物还可以在预防方面使用。4.临床用途本发明涉及一种结合人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro-y、和ENA-78的抗体。本发明还涉及用所述抗体治疗以人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、和ENA-78之一种或多种的水平升高或失衡为特征的疾病或病症(特别是COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、囊性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、和/或子宫内膜异位)的方法、包含所述抗体的药物组合物及制备方法。41本发明还涉及抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗以人IL-8、Gro-a、Gro-(3、Gro^、GCP-2和ENA-78之一种或多种的水平升高或失衡为特征的疾病或病症，特别是COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、或子宫内膜异位。虽然本发明主要关于人疾病或病症的治疗进行了描述，但是本发明还可应用于非人哺乳动物中类似疾病或病症的治疗。具体的实施方式实施例l:小鼠单克隆抗体656.35、197.2、和81.1的生成好对/e老化^fS、Gra-a、Gra-々、Gra，、和五A^-7S,嫂卓我的i成。使用多种方法和方案来免疫小鼠以试图生成泛特异性单抗。遵循改良的多位点重复免疫(RepetitiveImmunizationMultipleSites,RIMMS)方案，在SJL/JOrlCrl小鼠品系中使用完全或不完全弗氏佐剂(cFA或iFA)中混合的多抗原肽(MAP)和/或完整靶趋化因子(IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、和ENA-78)的多种混合物来？1起泛特异性单抗的生成。MAP或多抗原肽在免疫方案内发挥两种功能。第一，MAP容许已知靶氨基酸序列的选择性多重呈递。第二，存在有由于例如经由赖氨酸核心相连接的多拷贝序列引起的质量增加，这还提高了所述序列的免疫原性，其高于单独的肽的免疫原性(FrancisJP等(1991)Immunology73:249;SchottME等(1996)CellImmuno174:199-209;TamJP(1988)ProcNatlAcadSci85:5409-5413)。图l是具有氨基S吏序列SEQIDNO:49-53的一组MAP的示意图。MAP中的接头可以是除赖氨酸外的任何接头。适^名瘦好柯嫂(^'me//"e」遵循上文时间线的两种不同免疫方案产生泛特异性单抗1.初次免疫(第0天)由cFA中混合的所有靶趋化因子(各10吗)的多次皮下注射(后半身、背和颈)组成。随后的4次加强由iFA中混合的所有耙趋化因子(各10呢)的混合物组成。第5次和所有后续的加强由iFA中的所有耙趋化因子和所有5种线性MAP(各10吗)的混合物组成。实施安乐死和融合前3天的最终加强由PBS中的所有靶趋化因子和线性MAP组成，并经由腹膜内(IP)注射来投递。2.初次免疫(第0天)由cFA中混合的所有5种线性MAP(各10吗)的多次皮下注射(后半身、背和颈)组成。随后的4次加强由iFA中的所有5种线性MAP(各10昭)的混合物组成。第5次和所有后续的加强由iFA中的所有5种线性MAP和所有耙趋化因子(各10吗)的混合物组成。实施安乐死和融合前3天的最终加强由PBS中的所有5种线性MAP和所有靶趋化因子(各10吗)组成，并经由腹膜内(IP)注射来投递。实施例2:已经经由时间分辨荧光免疫荧光测定法(TRFIA)证实了单抗对靶趋化因子(人IL國8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、GCP画2、和ENA-78)的泛结合简言之，个别地将每种抗原(人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、GCP-2、和ENA-78,和作为阴性对照使用时的hlL-18)包被至96孔免疫荧光板上。然后清洗平板，并用商品化封闭溶液封闭。倒空封闭溶液，将含有单抗的样品添加入每孔中，并温育40至60分钟(这容许单抗结合至靶趋化因子)。然后再次清洗平板，并将纟企测抗体添加至每孔中。对于2X656.35、嵌合物(HcLc)和人源化的单抗，检测试剂分别如下生物素化的抗小鼠IgG、生物素化的抗人IgGFab2试剂、和铕抗人IgG。将检测抗体偶联至铕或生物素。另一轮清洗后，为了除去未结合的检测抗体，将链霉亲合素-铕的溶液添加至生物素检测测定法。链霉亲合素-铕结合至生物素，这容许检测。在用以除去未结合的链霉亲合素-铕的最终清洗后，或者(在人源化单抗测定法的情况中)在洗去铕偶联的二抗后，用螯合去污剂溶液装满每孔以激活铕产生荧光。所记录的较大荧光与该孔中所存在的检测抗体量成正比，所述检测抗体量与趋化因子结合性单抗的量正相关且成正比。图5A显示了小鼠656.35单抗结合靶人趋化因子。图5B显示了嵌合抗体(HcLc)单抗结合人靶趋化因子。图5C显示了人源化单抗结合人靶趋化因子。实施例3:使用多种方法证实了鼠单抗的功能性泛抑制CXCR2介导的Ca"动员、人嗜中性粒细胞趋化性、和人嗜中性粒细胞活化(CDllb表面表达)使用基于微量滴定板的钙动员测定法，即FLIPR(荧光测定成像读板仪，43MolecularDevices,SunnyvaleCA，[Schroeder,1996])以在用hCXCR2和Ga16转染且稳定表达hCXCR2和Gal6的CHO-Kl细胞中对抗体对ELR+趋化因子诱导的[Ca"]i动员的中和效应进行功能表征。测定前那天，以每孔40000个细胞的浓度将细胞在96孔、黑壁、透明底平板(PackardView)中分配。18至24小时后，将培养液吸离细胞，并用100^1加载培养基替换，所述加载培养基含有具有Earl氏盐和L-谷氨酰胺的Eagle氏极限必需培养基(EMEM)、0.1%BSA(SerologicalsCorporation)、4jiM氟-4-乙酰氧基曱基酯荧光指示染料(Fluo-4AM)和2.5mM丙磺舒。将细胞在此含有染料的培养基中于37。C温育1小时。然后将该含有染料的培养基吸离细胞，并用没有Fluo-4AM而具有0.1。/。明胶(除去BSA)和2.5mM丙磺舒的相同培养基替换。将细胞于37。C温育10分钟，然后用KRH测定緩冲液[具有0.1。/。明胶和2.5mM丙磺舒的KrebsRingerHenselek(120rnMNaCl、4.6mMKC1、1.03mMKH2PO4、25mMNaHC03、1.0mMCaCl2、UmMMgCl2、llmM葡萄糖、20mMHEPES(pH7.4))]清洗3次。最终的缓冲液清洗后，将100^d具有0.1%明胶和2.5mM丙磺舒的KRH测定緩冲液添加至细胞，并升温至37。C达10分钟。在被放置于加载染料的FLIPR中前，将细胞暴露于来自6瓦氩激光器的激发光(488nm)。由于Fluo-4在结合至Ca"时516nm发射强度升高，监测[Ca"]i-动员。发射强度的变化与胞质溶胶钙水平，即[Ca"+]i正相关。监测基线达10秒后，将50pl3XELR+趋化因子(其已经与一定浓度范围的抗体一起预温育)添加至细胞平板，并每秒收集数据达l分钟，接着以3秒的时间间隔再记录半分钟。输出高于基础读数的最大细胞应答，用于在GraphPadPrism(v4(B)中绘图。1(250定义为在3XECso趋化因子的预处理过程中将EC8o浓度的ELR+趋化因子的CXCR2介导的刺激效应中和50%所要求的抗体浓度。监测对25pMATP的二次细胞应答以测试细胞生存力[Sarau，1999]。_<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表3种鼠单抗对人ELR+趋化因子诱导的钙通量的抑制(几何平均IC50，ug/ml)。(n-3至6)(n.cl5未测定，N/A-不可得)SchroederKS,Neagle,BD.FLIPR:anewinstrumentforaccurate,highthroughputopticalscreening.J.Biomol.Screen.1996;1-75。Sarau画，AmesRS，ChambersJ，EllisC，ElshourbagyN,FoleyJJ等Identification,molecularcloning,expression,andcharacterizationofacysteinylleukotrienreceptor.MolPharmacol.1999;56:657-663。还使用微-博伊登(Boyden)槽来证明对IL-8刺激的人嗜中性粒细胞趋化性的抑制。微-博伊登装置由两个小室构成，一个位于3微米多孔膜上方而另一个位于3樣i米多孔膜下方。用趋化剂(即IL-8)或趋化因子与五特异性单抗的混合物加载下室。上室含有纯化的非活化的人嗜中性粒细胞。一旦该槽被装面己，便形成自底部孔至上部的浓度梯度，刺激嗜中性粒细胞趋化穿过该膜。该测定法以CI(趋化指数)表示，所述CI是应答刺激物而趋化的细胞数相对于未刺激的趋化细胞数的比率。趋化因子(即IL-8)与五特异性单抗在下室中的预温育剂量依赖地抑制IL-8刺激的嗜中性粒细胞趋化性。10nM的IL-8实现3.6士0.8的CI。IL-8与递增浓度的五特异性单抗(656.35)的预温育剂量依赖地抑制人嗜中性粒细胞趋化性，在l吗/ml在CI为2.2士0.6时达到显著性。由于该测定法的量和灵敏度，不能检查其它趋化因子(Gro-a、-(3、-y、和ENA-78)。经由监测CDllb的表面表达来证明对纯化的人嗜中性粒细胞活化的抑制。CDllb或Mac-l介导对基底的粘附、聚集和趋化性，而且已知在活化的嗜中性粒细胞的表面上上调(MoladYJ等(1994)ClinImmunolImmunopathol71:281-286)。简言之，将非活化的人嗜中性粒细胞纯化，并用耙趋化因子(即IL-8)或者用与趋化因子五特异性单抗一起预温育的趋化因子离体刺激。数据以百分比活化呈现，所述活化设为由于IL-8刺激引起的最大CDllb表面表达。IL-8与656.35单抗的预温育剂量依赖地抑制CDllb表面表达的水平升高，如此指明对嗜中性粒细胞活化的抑制(在O.Ol、0.1、1、10和50)ug/ml分别为79.90/0±3.7、48.50/0±7.2、28.70/0±3.2、禾口31.60/0±3.4)。实施例4:五特异性单抗对每种耙趋化因子(人IL-8、Gro-p、和ENA-78)的结合/解离值。,伯.ac为Vf^才法对于实验指定的KL,通过伯胺偶联依照制造商指示将家兔抗小鼠IgG-Fc(BiacoreBR-1005-14)固定化在CM5芯片上。对于实验指定的BE，使用通过胺偶联而被直接固定化至芯片的纯化的抗体。在抗小鼠IgG-Fc表面上捕获来自亲本小鼠单抗的上清液或纯化的抗体。将限定浓度的每种分析物(IL8、Gro-P、和ENA-78)在固定化的或捕获的抗体表面上流过，对每次分析物注射使用分开的捕获事件。每次注射分析物后，通过注射弱酸性溶液来使表面再生，这除去所捕获的抗体，但没有显著地影响抗小鼠IgG-Fc表面运行另一次捕获事件的能力，而且也不影响直接固定化的抗体。还将缓沖液注射在抗体捕获表面上注射，并将此用于进行双重参照。使用l:l结合模型，使用机器固有的分析软件来分析数据。IL-8Gro-BENA-78单抗kdkaKDkdkaKDkdkaKDKL656.351.48E-031.53E+069.64E-102.01E-033.82E+065.26E-101.87E-031.07E+061.74E-09BE6.87E-048.〗9E+068.39E-111.46E-03I.32E+07l.lE-07.96E-042.94E+062.71E-10KL81.19.32E-031.95E+064.80E-093.12E-042.76E+061.13E-103.76E-046.UE+056.16E-10BE1.08E-011.95E+065.55E-084.89E-045.44E+068.98E-113.94E-061.65E+052.39E-11KL197.23.69E-036.27E+055.89E-099.93E-041.55E+056.39E-〗02.69E-032.99E+059.00E-09BE4.99E-047.23E+056.90E-104.80E-081.04E+064.62E-143.02E-033.01E+051.01E-08实施例5:表位作图对656.35单抗进行表位作图，并发现在人IL-8中的KELRCQCIKTYSKP(SEQIDNO:54)内结合。如此，在另一个实施方案中，本发明涉及一种在人IL-8的表位SEQIDNO:54内结合的五特异性抗体。实施例6:自656.35制备的具有重链序列SEQIDNO:56和轻链序列SEQIDNO:58的嵌合抗体的功效研究(此抗体会被称为嵌合抗体)-体内研究使用吸入LPS急性肺炎性模型来斥全查五特异性抗体抑制嗜中性粒细胞浸润入非人灵长类(NHP—猕猴)的肺中的能力。简言之，在健康和对外源添加的猕猴IL-8(cynoIL-8)的应答性方面对NHP(非人灵长类)预筛选。然后将选定的NHP进行基线样品收集(血液和支气管肺泡灌洗一一BAL),5天后进行第一次LPS考验。LPS考验包括用盐酸开他敏(约10mg/kg)的单次IM注射来使该NHP镇静。一旦该NHP镇,争下来，经由丙泊酚(约0.2mg/kg/min，46必要时)的静脉内输注来实施麻醉。将经麻醉的动物放置于循环温水加热趙上和/或循环温水加热毯内，并向每只眼睛施用眼科润滑剂。然后给动物插管，并机械通气以进行考验规程。在该规程过程中使用体积调控的正压呼吸器(Stoelting猫/家兔呼吸器www.stoeltingco.com产品目录编号5019510)。使用DeVilbissUltraneb-99超声波雾化器经由气雾剂吸入来实施脂多糖(LPS)考验。以100ug/ml施用雾化的LPS达5分钟。考验规程过程中监测并记录心率、体温、和呼吸率。初次考验证实NHP应答LPS(嗜中性粒细胞向肺中的浸润增加和cynoIL-8水平升高)。各NHP应答是通过考验后6小时和24小时的样品收集而"i正实的。然后将经初次LPS考验的NHP随机分成2组。4周恢复后，将所有参加的NHP进行另一次基线取样(血液和BAL)。基线测量后4天，受试组接受媒介物或lmg/kg嵌合抗体注射的IV注射。次日，用吸入的LPS再次考验NHP，并在考验后6小时和24小时收集供分析用的样品。又一个恢复期后，自媒介物NHP收集基线样品，4天后，用10mg/kg嵌合抗体的单次IV推注来处理这些NHP。次日，将该动物暴露于LPS考验，并在6小时和24小时时收集样品用于分析。LPS吸入是刺激趋化性趋化因子诸如IL-8(其导致嗜中性粒细胞向肺中的浸润增加)升高的急性炎性模型。嵌合抗体处理的主要功效参数是对嗜中性粒细胞向用LPS考验的NHP的肺中浸润的抑制。此急性炎性模型中的嗜中性粒细胞浸润在LPS考验后头24小时期间发生，在该点其它炎性过程变得更突出。用嵌合抗体进行的预处理显著地且剂量依赖地抑制嗜中性粒细胞向LPS考验的NHP的肺中的浸润。用嵌合抗体进行的处理还阻止循环嗜中性粒细胞的升高，而不影响实际的嗜中性粒细胞功能(即细胞进行吞噬能力)。处理也没有极大地影响肺或循环中的其它细胞类型，诸如巨噬细胞/单核细胞。参见图2。实施例7对人源化单抗的进一步研究已经生成了多种人源化五特异性抗体构建体，其中4种已经显示出紧密地结合并抑制所有的靶趋化因子。(关于每种序列，参见下文"序列信息")。47此分析由亲和力测量(BiaCore)、钙动员测定法(体外功能测定法，FLIPR)、和CDllb人和NHP嗜中性粒细胞刺激测定法(离体功能测定法，流式细胞术)组成。-BiaCore如下使用蛋白A捕获方法来为人源化的和嵌合的构建体产生动力学通过伯胺偶联依照制造商的指示将蛋白A固定化在CM5芯片上。在蛋白A表面上捕获纯化的人源化或嵌合抗体。捕获后，将限定浓度的每种分析物(IL8、Gro-(3、ENA-78)在抗体捕获表面上流过，对每次分析物注射使用分开的捕获事件。每次注射分析物后，通过注射弱酸性溶液来使表面再生，这除去所捕获的抗体，但没有显著地影响蛋白A运行另一次捕荻事件的能力。还将缓沖液注射在抗体捕获表面上注射，并将此用于进行双重参照。使用l:l结合模型，使用机器固有的分析软件来分析数据。用Gro-p进行的测量构建体ka(固s)kd(1/s)KDCM)HcLc7.39E+068.16E-041.11E-10HcLc2.11E+070.00115.21E-11H丄c1.59E+078.88E-045.57E-1IHcLc1.19E+076.16E-045.17E-11HcLc1.43E+075.43E-043.79E-11HcLc1.33E+076.76E-045.09E-11HcLc1.51E+076.73E-044.45E-11HcLc1.49E+076.44E-044.33E-11Hclx2.54E+070.0011634.57E-11HcLc1.81E+070.0010585.85E-11Hclx2.04E+078.54E-044.18E-11HcLc1.82E+075.06E-042.78E-11H0L76.99E+069.66E-041.38E-10H0L71.76E+070.0013057.40E-11H0L71.63E+070.0010396.39E-1148<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>用IL8进行的测量<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>通过检查蛋白质的结合速率(ka)和解离速率(kd)来测定亲和力(KD)。HcLc指自656.35制备的具有重链序列SEQIDNO:56和轻链序列SEQIDNO:58的嵌合抗体。-功能测定法使用CHO-K1CXCR2(w/Gal6)的4丐动员(FLIPR)使用基于微量滴定板的钙动员测定法，即FLIPR(荧光测定成像读板仪，MolecularDevices,SunnyvaleCA,[Schroeder，1996])以在用hCXCR2和Ga16转染且稳定表达hCXCR2和Gal6的CHO-Kl细胞中对抗体对ELR+趋化因子诱导的[Ca^]i动员的中和效应进行功能表征。测定前那天，以每孔40000个细胞的浓度将细胞在96孔、黑壁、透明底平板(PackardView)中分配。18至24小时后，将培养液吸离细胞，并用100[il加载培养基替换，所述加载培养基含有具有Earl氏盐和L-谷氨酰胺的Eagle氏极限必需培养基(EMEM)、0.1%BSA(SerologicalsCorporation),4|iM氟-4陽乙酰氧基曱基酯荧光指示染料(Fluo-4AM)和2.5mM丙磺舒。将细胞在此含有染料的培养基中于37。C温育1小时。然后将该含有染料的培养基吸离细胞，并用没有Fluo-4AM而具有0.1o/。明胶(除去BSA)和2.5mM丙磺舒的相同培养基替换。将细胞于37。C温育10分钟，然后用KRH测定緩冲液[具有0.1。/。明胶和2.5mM丙磺舒的KrebsRingerHenseleit(120mMNaCl、4.6mMKC1、1.03mMKH2PO4、25mMNaHC03、1.0mMCaCl2、UmMMgCl2、llmM葡萄糖、20mMHEPES(pH7.4))]清洗3次。最终的緩沖液清洗后，将100pl具有0.1。/。明胶和2.5mM丙磺舒的KRH测定緩冲液添加至细胞，并升温至37。C达10分钟。在^皮;^置于加载染料的FLIPR中前，将细胞暴露于来自6瓦氩激光器的激发光(488nm)。由于Fluo-4在结合至Ca2+时516nm发射强度升高，监测[Ca2+]i-动员。发射强度的变化与胞质溶胶钙水平，即[Ca^]i正相关。监测基线达10秒后，将50pl3XE.LR+趋化因子(其已经与一定浓度范围的抗体一起预温育)添加至细胞平板，并每秒收集数据达l分钟，接着以3秒的时间间隔再记录半分钟。输出高于基础读数的最大细胞应答，用于在GraphPadPrism(v4.03)中绘图。ICso定义为在3XEC犯趋化因子的预处理过程中将ECso浓度的ELR+趋化因子的CXCR2介导的刺激效应中和50%所要求的抗体浓度。监测对25pMATP的二次细胞应答以测试细胞生存力[Sarau，1999]。H0L7TOL8H0L10HOMO经预处理的3XECS0ELR+趋化因子ic50(ug/ml)95%C丄ic50(ug/ml)95%C丄ic50(ug/ml)95%C丄ic50(ug/ml)95%C丄3nMhlL80.300.12-0.720.830.70-0.980.190.15-0.220.190.15-0.2310nMhGROa1.480.98-2.233.522.74-4.531.090.58-2.06Ul0.67-1.836nMhGROb1.040.19-5.587.934.20-14.970.660.24-1,860.990.35-2.7630nMhENA-782.480.78-7.912.421.27-4.631.880.83-4.26.751.33-2.29100nMhGCP-211.438.19-15.9640.3838.45-42.4111.546.30-21.1713.037.20-23.56表4种人源化单抗构建体对人ELR+趋化因子诱导的钩通量的抑制(几何平均IC50,ug/ml)。(n=3)SchroederKS,Neagle,BD.FLIPR:anewinstrumentforaccurate,highthroughputopticalscreening.J.Biomol.Screen.1996;1-75。SarauHM,AmesRS,ChambersJ,EllisC,ElshourbagyN，FoleyJJ等Identification,molecularcloning,expression,andcharacterizationofacysteinylleukotrienreceptor.MolPharmacol.1999;56:657-663。-离体CD1lb人嗜中性粒细胞刺激测定法的人嗜中性粒细胞活化的能力，其通过跟踪物理细胞变化(大小和形状一颗粒形成(granulation))和通过检查表面活化标志物(升高的CDllb表面表达)来进行。使用嗜中性粒细胞对照刺激物fMLP来证实纯化的人嗜中性粒细胞的活化能力。参见图4。序列信息自656.35、197.2和81.1杂交瘤细胞提取总RNA，然后通过逆转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)来生成重链和轻链可变域cDNA序列。RT-PCR的正向引物是对鼠免疫球蛋白基因前导序列特异性的简并引物的混合物，而反向引物是对抗体恒定区(在此情况中为同种型IgG2a/K)特异性的。引物是依照由Jones和Bendig(1991)Bio/Technology9:88记载的策略而设计的。对两种V区序列均一式两份实施RT-PCR以便能够对正确V区序列进行随后的验证。克隆通过RT-PCR生成的V区产物(InvitrogenTA克隆试剂盒)，并获得序列数据。此方法对于81.1轻链可变域未获成功。如此，因此通过对在还原条件下运行53的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离的轻链进行蛋白质测序来产生下文所显示的氨基酸序列(SEQIDNO:12)。互补决定区(CDR)标有下划线。656.35的重链和轻链可变区的多核苷酸序列(分别为SEQIDNO:l和3)SEQIDNO:1CAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGACGATATCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTGACTAACTACTGGATAGTTTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGGAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCACCTCATTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCACTGGGGCCAAGGGTCTCTGGTCACTGTCTCTGCASEQIDNO:3GGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG656.35的重链和轻链可变区的多肽序列(分别为SEQIDNO:2和4)SEQIDNO:2OVOLOOSGAELVRPGTSVTISCKASGYTFTNYWIVWVKORPGHGLEWIGDLYSGGGYTFYSENFKGKATLTADTSSSTAYMHLISLTSEDSAVYFCARSGYDRTWFAHWGOGSLVTVSASEQIDNO:4DIKMTOSPSSMSASLGERVTITCOASOD正SYLSWYOOKPWKSPKTLTYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLOHGESPPTFGAGTKLELKR656.35的重链CDR的多肽序列(分别为SEQIDNO:13、14、15)SEQIDNO:13NYWIVSEQIDNO:14DLYSGGGYTFYSENFKGSEQIDNO:15SGYDRTWTFAH656.35的轻链CDR的多肽序列(SEQIDNO:16、17、18)SEQIDNO:16QASQD正SYLSSEQIDNO:17YATRLADSEQIDNO:18LQHGESPPT656.35的重链CDR的多核普酸序列(SEQIDNO:31、32、33)SEGIDNO:31AACTACTGGATAGTTSEQIDNO:32SEQIDNO:33TCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCAC656.35的轻链CDR的多核苷酸序列(SEQIDNO:34、35、36)SEQIDNO:34CAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGCSEQIDNO:35TACGCTACAAGGTTGGCAGATSEQIDNO:36CTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACG197.2的重链和轻链可变区的多核苦酸序列(分别为SEQIDNO:5和7)SEQIDNO:5GAGTTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTAATTAATCCTAAGTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAACTCCTCASEQIDNO:7GTGCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG197.2的重链和轻链可变区的多肽序列(分别为SEQIDNO:6和8)SEQIDNO:6EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFT2UMMWVKQSNGKSLEWIGYIMPKYGTTSYNOKFKGKATLTVDOSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYHCARGMGLLFGMDYWGOGTSVTVSS56SEQIDNO:8DIVMTOSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSOSLLNSGNOKNYLAWYOOKPGOPPKLLIYGASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVOAEDLAVYYCONDHSFPCTFGGGTKLEKR197.2的重链CDR的多肽序列(分别为SEQIDNO:19、20、21)SEQIDNO:19DYNMNSEQIDNO:20VINPKYGTTSYNQKFKGSEQIDNO:21GMGLLFGMDY197.2的轻链CDR的多肽序列(SEQIDNO:22、23、24)SEQIDNO:22KSSQSLLNSGNQKNYLASEQIDNO:23GASTRKSSEQIDNO:24QNDHSFPCT197.2的重链CDR的多核苦酸序列(SEQIDNO:37、38、39)SEQIDNO:37GACTACAACATGAACSEQIDNO:38CSEQIDNO:39GGAATGGGACTCCTCTTTGGTATGGACTAC197.2的轻链CDR的多核香酸序列(SEQIDNO:40、41、42)SEQIDNO:40AAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCCSEQIDNO:4GGGGCATCCACTAGGAAATCTSEQIDNO:42CAGAATGATCATAGTTTTCCGTGCACG81.1的重链可变区的多核苦酸序列(SEQIDNO:9)SEQIDNO:9GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCTTTCACTGTCTACGGCATGAACTGGGTGAGACAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAATGGATTGGAAATCA81.1的重链可变区的多肽序列(SEQIDNO:10)SEQIDNO:10EVOLOOSGPELEKPGASVKJSCKASGYSFTVYG廳WVROSNGKSLEWIGNFDPYFSVTSYNOKFODKATLTVDKSSSTAYMOLKNLTSEDSAVYFCARGSWETIFAYWGOGTLVTVSA81.1的重链CDR的多肽序列(分别为SEQIDNO:25、26、27)58SEQIDNO:25VYG画SEQIDNO:26NFDPYFSVTSYNQKFQDSEQIDNO:27GSWETIFAY81.1的重链CDR的多核苦酸序列(SEQIDNO:43、44、45)SEQIDNO:43GTCTACGGCATGAACSEQIDNO:44AATTTTGATCCTTACTTTAGTGTCACTTCCTACAACCAGAAGTTCCAGGACSEQIDNO:45GGGAGCTGGGAAACCATTTTTGCTTAC81.1的轻链可变区的多肽序列(SEQIDNO:12)K81.1的轻链CDR的多肽序列(分别为SEQIDNO:28、29、和30)SEQIDNO:28RSSTGAVTTSNYANSEQIDNO:29GTNNRAPSEQIDNO:30ALWYSNHV嵌合物*多核苷酸序列(重链可变区+经密码子优化的IgGl)SEQIDNO:55CAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGACGATATCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAACTACTGGATAGTTTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGGAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCACCTCATTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCACTGGGGCCAAGGGTCACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGT丁CCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACG加AACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCAG嵌合物*多肽序列(重链可变区+经密码子优化的IgGl)SEQIDNO:5660QVQLQQSGAELVRPGTSVTISCKASGYTFTNYWIVWVKQRPGHGLEWIGDLYSGGGYTFYSENFKGKAT卩TADTSSSTAYMHLISLTSEDSAVYFCARSGYDRTWFAHWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPJIEEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK嵌合物*多核苷酸序列(轻链可变区+经密码子优化的人cK)SEQIDNO:57GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGTCTGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGTCAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGCTGGTATCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATTACGCTACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC嵌合物*多肽序列(轻链可变区+经密码子优化的人cK)SEQIDNO:58DIKMTQSPSSMSASLGERVTITCQASQD正SYLSWYQQKPWKSPKTLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPPTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL丽FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC嵌合物*指自鼠656.35抗体制备的嵌合抗体。61成熟重《连的H0DNA序列SEQIDNO:11CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATCGTGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGACCTGTATAGCGGCGGCGGCTACACCTTCTACAGCGAGAACTTCAAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCGGCTACGACAGGACTTGGTTTGCTCACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTG入GCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG成熟重链的HO蛋白质序列SEQIDNO:46QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIVWVRQAPGQGLEWMGDLYSGGGYTFYSENFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYDRTWFAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS額SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK成熟轻链的L7DNA序列SEQIDNO:47GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGACAGACTTGGGCGAGTGC成熟轻链的L7蛋白质序列SEQIDNO:48GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQriGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC成熟轻链的L8DNA序列SEQIDNO:5963AGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGACAGACTTCACCttcACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATatcGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCaagCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAAGTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGCGAG'TGC成熟轻链的L8蛋白质序列SEQIDNO:60DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC成熟轻链的L10DNA序列SEQIDNO:61GCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGcagGACtacACCCTGACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGTCTGGGCGAGTGC成熟轻链的LIO蛋白质序列SEQIDNO:62DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPKEAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC成熟轻链的M0DNA序列SEQIDNO:63GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGCCACCCTGTCACTGTCTCCCGGCGAAAGGGCAACCCTGAGCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCGAGAGCTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACTACGCCACCAGGCTGGCCGACGGCATTCCCGCCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACTCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCTGCAGCACGGCGAGAGCCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC成熟轻链的MO蛋白质序列SEQIDNO:64DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF風GEC权利要求1.一种五特异性抗体，其具有对人IL-8、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、和ENA-78的多特异性(或与它们起交叉反应)。2.权利要求l的抗体，其是小鼠单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。3.权利要求l的抗体，其以如通过表面等离振子共振测定的小于10々M、10-8M、或10-9M的平衡常数(KD)值结合人IL-8、Gro-a、Gro-p、Gro-y、和ENA-78。4.一种制备五特异性抗体的方法，包括以下步骤a.向小鼠中注射完全弗氏佐剂(cFA)中的人IL-8、Gro_a、Gro-|3、Gro-y、和ENA-78的混合物；b.向所述小鼠中注射不完全弗氏佐剂(iFA)中的人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、和ENA-78的混合物；并c.向所述小鼠中注射不完全弗氏佐剂中的人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、和ENA-78的混合物和一组五种多抗原肽(MAP),每种MAP单元具有一种来自多肽IDNO:49-53的不同序列；d.自所述小鼠分离B细胞；e.将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成分泌所述想要的五特异性抗体的永生杂交瘤细胞；并f.自所述杂交瘤的培养物上清液分离所述五特异性抗体。5.—种制备五特异性抗体的方法，包括以下步骤a.向小鼠中注射完全弗氏佐剂中的一组五种多抗原肽(MAP)(MAP组)，每种MAP单元具有一种来自多肽IDNO:49-53的不同序列；b.向所述小鼠中注射不完全弗氏佐剂中的所述MAP组；c.向所述小鼠中注射不完全弗氏佐剂中的所有人IL-8、Gro-a、Gro-卩、Gro-y、和ENA-78的混合物和所述MAP组；d.自所述小鼠分离B细胞；并e.将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合以形成分泌所述想要的五特异性抗体的永生杂交瘤细胞；并f.自所述杂交瘤的培养物上清液分离所述五特异性抗体。6.通过权利要求4或5的方法制备的抗体。7.权利要求l的抗体，其包含分别由包含序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:3或其保守序列修饰的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区。8.权利要求l的抗体，其包含分别由包含序列SEQIDNO:5和SEQIDNO:7或其保守序列修饰的核苷酸序列编码的重链和轻链可变区。9.权利要求l的抗体，其包含由包含序列SEQIDNO:9或其保守序列修饰的核苷酸序列编码的重链可变区。10.权利要求l的抗体，其包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:4或其保守序列修饰的重链和轻链可变区。11.权利要求l的抗体，其包含分別包含与氨基酸序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:4至少90%、95%、98%或99%相同的多肽的重链和轻链可变区。12.权利要求l的抗体，其包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:6和SEQIDNO:8或其保守序列修饰的重链和轻《连可变区。13.权利要求l的抗体，其包含分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:6和SEQIDNO:8至少90%、95%、98%或99%相同的多肽的重链和轻链可变区。14.权利要求l的抗体，其包含包含氨基酸序列SEQIDNO:10或其保守序列修饰的重链可变区。15.权利要求l的抗体，其包含包含与氨基酸序列SEQIDNO:10至少90%、95%、98%或99%相同的多肽的重链可变区。16.权利要求l的抗体，其包含至少一种选自以下的可变区(i)氨基S吏序列SEQIDNO:2、4、6、8、或10;或(ii)与上文(i)的氨基酸序列之任一项至少90%、95%、98%或99°/。相同的氨基酸序列。17.权利要求l的抗体，其包含CDR序列SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18;或者一种或多种所述CDR序列可以是序列SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18的保守序列修饰。18.—种杂交瘤或转染瘤，其生成包含CDR序列SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18的五特异性抗体。19.一种重组真核或原核细胞，其生成包含CDR^列SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18的五特异性抗体。20.权利要求1的抗体，其包含至少一种选自以下的CD蔣列(i)SEQIDNO:13、14、15、16、17、或18;或(ii)(i)中所列序列的保守序列修饰。21.权利要求l的抗体，其包含多肽SEQIDNO:15。22.权利要求l的抗体，其包含至少四种选自由SEQIDNO:13、14、15、16、`17、和18组成的组的CDR序列；或者一种或多种所述CDR序列可以是SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18中所列序列的保守序列修饰。23.权利要求l的抗体，其包含分别包含CDR氨基酸序列SEQIDNO:13、14、和15和CDR氨基酸序列SEQIDNO:16、17、和18的重链和轻链可变区。24.权利要求l的抗体，其包含CDR序列SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24;或者一种或多种所述CDR序列可以是SEQIDNO:19、20、21、`22、23、和24中所列序列的保守序列修饰。25.—种杂交瘤或转染瘤，其生成包含CDR序列SEQIDNO:19、20、21、`22、23、和24的五特异性抗体。26.—种重组真核或原核细胞，其生成包含CDR^列SEQIDNO:19、20、`21、22、23、和24的五特异性抗体。27.权利要求1的抗体，其包含至少一种选自如下的CDR序列(i)SEQIDNO:`19、20、21、22、23、或24;或(ii)(i)中所列序列的保守序列修饰。28.权利要求l的抗体，其包含多肽SEQIDNO:21。29.权利要求l的抗体，其包含至少四种选自由SEQIDNO:19、20、21、22、`23、和24组成的组的CDR序列；或者一种或多种所述CDR序列可以是SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24中所列序列的保守序列修饰。30.权利要求l的抗体，其包含分别包含CDR氨基酸序列SEQIDNO:19、20、和21和CDR氨基酸序列SEQIDNO:22、23、和24的重链和轻链可变区。31.权利要求l的抗体，其包含CDR序列SEQIDNO:25、26、和27;或者一种或多种所述CDR序列可以是SEQIDNO:25、26、和27中所列序列的保守序列修饰。32.—种杂交瘤或转染瘤，其生成包含CDRyf列SEQIDNO:25、26、和27的五特异性抗体。33.—种重组真核或原核细胞，其生成包含CDR/f列SEQIDNO:25、26、和27的五特异性抗体。34.权利要求l的抗体，其包含至少一种选自如下的CDR序歹'J:(i)SEQIDNO:`25、26、或27;或(ii)(i)中所列序列的保守序列修饰。35.权利要求l的抗体，其包含多肽SEQIDNO:27。36.权利要求l的抗体，其包含包含CDR氨基酸序列SEQIDNO:25、26、和27的重链可变区。37.—种杂交瘤，其生成具有分别由包含核苷酸序列SEQIDNO:1、5、或9或核苷酸序列SEQIDNO:3或7的核苷酸序列编码的重链或轻链可变区的单克隆抗体。38.—种杂交瘤，其生成具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:2、6、或10及其保守序列修饰或氨基酸序列SEQIDNO:4或8及其保守序列修饰的重链或轻链可变区的单克隆抗体。39.—种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:2、6、或10及其保守序列修饰或氨基酸序列SEQIDNO:4或8及其保守序列修饰的重链或轻链可变区的五特异性抗体。40.—种药物组合物，其包含权利要求l的五特异性抗体和药学可接受载体。41.一种治疗或预防COPD、骨关节炎、类风湿性关节炎、侵蚀性关节炎、哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠病、银屑病、移植物排斥、痛风、癌症、急性肺损伤、急性肺病、败血症、ARDS、外周动脉疾病、全身性硬化、新生儿呼吸窘迫综合征、哮喘和COPD的恶化、嚢性纤维化病、弥漫性全细支气管炎、再灌注损伤、和/或子宫内膜异位的方法，其包括施用有效量的权利要求l的五特异性抗体。42.—种表达载体，其包含编码五特异性抗体中选自SEQIDNO:13、14、和15或CDR序列SEQIDNO:16、17、和18的可变重链或轻链的核苷酸序列。43.—种表达载体，其包含编码五特异性抗体中选自SEQIDNO:13、14、15、16、17、或18的CDR^列的核苷酸序列。44.一种表达栽体，其包含编码五特异性抗体中至少四种选自由SEQIDNO:13、14、15、16、17、和18组成的组的CDR序列的核苷Sl序列。45.—种表达载体，其包含多核苷酸序列SEQIDNO:31、32、或33。46.—种表达载体，其包含多核苷酸序列SEQIDNO:34、35、和36。47.—种表达载体，其包含至少四种选自SEQIDNO:31、32、33、34、35、和36的组的多核苷酸序列。48NO:19、20、和21或CDR^f列22、23、和24的可变重《连或轻一速的核苷酸序列。49.一种表达载体，其包含编码五特异性抗体中选自SEQIDNO:19、20、21、22、23、或24的CDR序列的核苷酸序列。50.—种表达载体，其包含编码五特异性抗体中至少四种选自由SEQIDNO:19、20、21、22、23、和24组成的组的CDR序列的核苦酸序列。51.—种表达载体，其包含多核苷酸序列SEQIDNO:37、38、和39。52.—种表达载体，其包含多核苷酸序列SEQIDNO:40、41、和42。53.—种表达载体，其包含至少四种选自SEQIDNO:37、38、39、40、41、和42的组的多核苦酸序列。54.—种表达载体，其包含编码五特异性抗体中包含CDR序列SEQIDNO:25、26、和27的可变重链的核苦酸序列。55.—种表达载体，其包含编码五特异性抗体中选自SEQIDNO:25、26、或27的CDR^列的核苷酸序列。56.—种表达载体，其包含多核苷酸序列SEQIDNO:43、44、和45。57.—种用于在单一宿主细胞中生成五特异性抗体(免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤(i)用第一DNA序列和第二DNA序列转化所述单一宿主细胞，所述第一DNA序列至少编码所述免疫球蛋白重链中包含CDR域SEQIDNO:13、14、和15的可变域，且所述第二DNA序列至少编码所述免疫球蛋白轻链中包含CDR域SEQIDNO:16、17、和18的可变域；并(ii)表达所述第一DNA序列和所述第二DNA序列，使得所述免疫球蛋白重链和轻链在所述经转化的单一宿主细胞中作为分开的分子生成。58.权利要求57的方法，其中所述第一和第二DNA序列存在于不同载体中或者所述第一和第二DNA序列存在于单一载体中。59.—种用于在单一宿主细胞中生成五特异性抗体(免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤(i)用第一DNA序列和第二DNA序列转化所述单一宿主细胞，所述第一DNA序列至少编码所述免疫球蛋白重链中包含CDR域SEQIDNO:19、20、和21的可变域，且所述第二DNA序列至少编码所述免疫球蛋白轻链中包含CDR域SEQIDNO:22、23、和24的可变域；并(ii)表达所述第一DNA序列和所述第二DNA序列，使得所述免疫球蛋白重链和轻链在所述经转化的单一宿主细胞中作为分开的分子生成。60.权利要求59的方法，其中所述第一和第二DN踏列存在于不同载体中或者所述第一和第二DNA序列存在于单一载体中。61.权利要求l的抗体，其在人IL-8的表位KELRCQCIKTYSKP(SEQIDNO:54)内结合。62.—种通过施用权利要求1的抗体来降低有所需要的患者中嗜中性粒细胞趋化性的方法。63.权利要求l的抗体，其包含分别由包含序列SEQIDNO:ll和序列SEQIDNO:47、59、61、或63的核香酸序列编码的重链和轻链。64.权利要求l的抗体，其包含分别由包含与序列SEQIDNO:ll和序列SEQIDNO:47、59、61、或63至少90%、95%、98%或99%相同的序列的核苦酸序列编码的重链和轻链。65.权利要求l的抗体，其包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64的重《连和轻4连。66.权利要求l的抗体，其包含分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的多肽的重链和轻链。67.—种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46或氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64的重链或轻链的抗体。68.—种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含氨基S交序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64的重链和轻链的抗体。69.—种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:46或氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的重《连或轻链的抗体。70.—种重组真核或原核宿主细胞，其生成具有分别包含与氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链和轻链的抗体。71.—种表达载体，其包含分别包含序列SEQIDNO:ll和序列SEQIDNO:47、59、61、或63的多核苷酸序列。72.—种表达载体，其包含分别包含与序列SEQIDNO:ll和序列SEQIDNO:47、59、61、或63至少90%、95%、98%或99%相同的序列的多核苷酸序列。73.—种表达载体，其包含包含序列SEQIDNO:11、47、59、61、或63的多核苷酸序列。74.—种表达载体，其包含分别包含与序列SEQIDNO:11、47、59、61、或63至少90%、95%、98%或99%相同的序列的多核苷酸序列。75.—种表达载体，其包含编码如下抗体的多核苦酸序列，所述抗体包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64的重《连和轻《连。76.—种表达载体，其包含编码如下抗体的多核芬酸序列，所述抗体包含分别包含与氨基S臾序列SEQIDNO:46和氨基酸序列SEQIDNO:48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的重链和轻链。77.—种表达载体，其包含编码包含氨基酸序列SEQIDNO:46、48、60、62、或64的多肽的多核芬S臾序列。78.—种表达载体，其包含编码包含与氨基酸序列SEQIDNO:46、48、60、62、或64至少90%、95%、98%或99%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。79.—种用于在单一宿主细胞中生成抗体(免疫球蛋白)的方法，包括以下步骤'(i)用第一DNA序列和第二DNA序列转化所述单一宿主细胞，所述第一DNA序列编码包含多肽SEQIDNO:46的重链，且所述第二DNA序列编码包含多肽SEQIDNO:48、60、62、或64的轻链；并(ii)表达所述第一DNA序列和所述第二DNA序列，使得所述免疫球蛋白重链和轻链在所述经转化的单一宿主细胞中作为分开的分子生成。80.权利要求79的方法，其中所述第一和第二DNA序列存在于不同载体中或者所述第一和第二DNA序列存在于单一载体中。81.权利要求1的抗体，其包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和SEQIDNO:48的重链和轻链。82.权利要求l的抗体，其包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和SEQIDNO:62的重4连和轻4连。83.权利要求l的抗体，其包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和SEQIDNO:60的重4连和轻链。84.权利要求l的抗体，其包含分别包含氨基酸序列SEQIDNO:46和SEQIDNO:64的重《连和轻链。全文摘要本发明涉及一种具有多特异性的抗体。具体地，本发明的抗体与人IL-8、Gro-α、Gro-β、Gro-γ、和ENA-78结合(起交叉反应)。文档编号A61K39/395GK101687035SQ200880020559公开日2010年3月31日申请日期2008年4月16日优先权日2007年4月17日发明者乔纳森·H·埃利斯,亚历克西斯·P·戈迪洛特,兹登卡·L·乔纳克,埃里克·多布津斯基,斯蒂芬妮·J·克莱格,沃尔克·杰马谢夫斯基,约翰·R·怀特,艾伦·P·刘易斯申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司