富烯和富瓦烯类似物及它们在治疗癌症中的应用的制作方法

专利名称：富烯和富瓦烯类似物及它们在治疗癌症中的应用的制作方法
专利说明富烯和富瓦烯类似物及它们在治疗癌症中的应用 发明领域 本发明涉及治疗原发性和转移性癌症的新方法和组合物。这些方法和组合物使用富烯和/或富瓦烯。这些化合物和包含这些化合物的药物组合物对于治疗人的原发性和转移性癌症是特别有用的。本发明也包括施用该治疗性化合物或组合物的各种模式。
本发明是在政府支持下完成的，国立卫生研究院颁发的授权号是AR47901。政府对本发明具有一定权利。

背景技术：
癌症的首要特征在于，给定正常组织产生的异常细胞数量增加，这些异常细胞侵入邻近的组织，以及恶性细胞通过淋巴或生血扩散到局部淋巴结和远端位点(转移)。癌症是一个多步骤的过程，从较小的癌前变化开始，在一定条件下可以发展成瘤形成。恶性内皮肿瘤在涉及血管内皮生长因子(VEGF)和其主要的促有丝分裂受体血管内皮生长因子受体2的自分泌环的设置中出现。
活性氧簇(ROS)据信是癌症中生长和血管发生的介导子。ROS增多通常与细胞例如Ras-变异细胞和用生长因子处理的细胞生长相关。当非变异细胞对调节ROS产生的生长因子/细胞因子应答时，培养中的肿瘤细胞通常会过度地产生H2O2。
NAD(P)H氧化酶(Nox)是一种细胞表面蛋白，具有对苯二酚(NADH)氧化酶和蛋白质二硫化物-硫醇互变活性。一般地，大多数形式的酶可以同等有效地利用NADH或NADPH。有很多形式的Nox，包括Nox 1-5、二元氧化酶1和2(Duox 1和2)以及p22(phox)、p47(phox)和小G蛋白Rac1。
Nox据信会导致在某些癌症中ROS的水平升高。产生活性氧的Nox酶涉及血管生成开关，Nox抑制剂对于体外ang-2产生和体内bEnd.3肿瘤生长具有作用，可以使用Nox酶抑制剂药理性地抑制ang-2产生，所述Nox酶抑制剂几乎消除了体内bEnd.3血管瘤的生长。因此，靶向ang-2产生的信号转导阻滞可以用于在体内治疗人的血管瘤。Journal of Investigative Dermatology advance onlinepublication，1 June 2006；doi10.1038/sj.jid.5700413。
对于特定的Nox酶，据显示，Nox1转染到前列腺癌细胞株中引人注目地增强了肿瘤生长(Arbiser等人PNAS 99715-720，2001)，前列腺瘤显示出H2O2水平升高。此外，近来发现，前列腺瘤显示了较高水平的Nox1和过氧化氢(Lim等人，Prostate.2005Feb1；62(2)200-7)。Nox1依赖性过氧化物产生也显示出会控制结肠腺癌细胞迁移(Sadok等人，Biochim.Biophys.Acta.1783(1)23-33(Jan 2008))。Sadok证明了，抑制或向下调节Nox1导致过氧化物产生减少以及α2β1整连蛋白膜利用率下降。因此，在前列腺癌中Nox蛋白水平和ROS是相关的，Nox1/H2O2的增加与致肿瘤性的增加相关。
Nox4据信涉及癌细胞例如前列腺癌细胞凋亡的抑制(Vaquero等人，J Biol Chem.2004Aug 13；279(33)34643-54)。Vaquero建议，由NAD(P)H氧化酶(极可能是Nox4)产生的生长因子诱导的ROS保护前列腺癌细胞免于凋亡，在某些前列腺细胞(即MIA PaCa-2和PANC-1细胞)中用Nox4反义寡核苷酸转染抑制了NAD(P)H氧化酶的活性和ROS产生，并会在这些细胞中刺激凋亡。
Akt是PI3K的一种下游信号分子，已知它会诱导产生ROS的酶Nox4表达。一个研究将Akt引入到放射状生长的WM35黑素瘤以检验Akt的过度表达是否足以将细胞从放射状生长转变为垂直生长。Akt的过度表达导致VEGF向上调节，过氧化物ROS产生增加以及转变为更显著的糖酵解代谢。皮下植入过度表达Akt的WM35细胞产生了体内快速生长的肿瘤，而媒介控制细胞(vector control cells)不会产生肿瘤。Arbiser等人，J.Clini.Invest.117(10)2762-2765(2007)。该数据支持了下列论断抑制Akt可以抑制向下调节Nox 4的产生，然后抑制过氧化物产生，并由此治疗癌症。
Duox 1和2是气道内皮的主要Nox种类，据信它们是气道中活性氧产生的主要来源之一(Luxen等人，Cancer Res.2008Feb 15；68(4)1037-45)。因此，对这些酶的抑制对于治疗人肺癌是非常有用的。
一些作者根据特征将Nox分为两类。一种是激素-不敏感性和药物-响应性(即，通过奎宁-位点抑制剂例如辣椒素或抗肿瘤的磺酰脲类，LY181984)，称作“tNox”，其对于癌细胞具有特异性。另一种是与非变异细胞的质膜相连的药物中立性构型，称作“CNox”(Bruno等人，1992，Biochem.J.284625-628及Morre和Morre，1995，Protoplasma184188-195)。
癌细胞显示药物敏感性以及激素和生长因子中立性(tNox)，还有药物抑制的以及激素和生长因子依赖性(CNox)活性，而非变异细胞仅有药物抑制性的激素和药物响应性CNox。像癌细胞的tNox一样，CNox能够氧化NADH，但是具有受激素和生长因子调节的活性。因此，一些作者创立的理论认为，tNox的抑制剂(据信包括一种或多种上述的Nox酶，例如Nox4)可以用于治疗癌症。
除了治疗癌症，Nox抑制剂也有望为涉及活性氧的很多其他的炎性、变性和血管疾病提供治疗效果。
例如，据报道，Nox在视网膜血管炎症中发挥作用，而且使缺血诱导的血管内皮生长因子(VEGF)和视网膜新血管形成增加(Al-Shabrawey等人，Invest，Ophthalmol，Vis，Sci.(2008))。使用野生型小鼠、缺乏Nox2的小鼠和用NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素治疗的小鼠，在内毒素血症和链脲霉素诱导的糖尿病模型中进行了研究，证明了清除Nox2显著抑制了内毒素血症和糖尿病诱导的ICAM-1表达增加和白细胞停滞。夹竹桃麻素治疗在预防糖尿病诱导的ICAM-1表达增加、白细胞停滞和血-视网膜屏障崩溃中与清除Nox2一样有效，提示Nox2是糖尿病性视网膜病的这些早期现象的主要原因。
增加ROS引导和抗氧化剂抑制了视网膜色素上皮中凋亡细胞的损失(Glotkin等人，2006 IOVS，474614-4623)。人们认为这会在干型与年龄有关的黄斑变性的发展中发挥作用。同样，使用抗氧化剂也在具有AMD的大脉网膜小疣的患者中减缓发展成为新血管形成(Coleman和Chew，2007，Curr.Opin.Ophthalmol.18(3)220-223)。
NADP+还原酶降低了视黄醛和视黄酸的浓度，接着就可以保护细胞免于视黄醛诱导的细胞死亡(Lee等人，J.Biol.Chem.，282(49)35621-8(2007)。广义上讲，抑制NADPH氧化酶与增加NADP+还原酶的比率具有相同的效果，对于视黄醛或视黄酸介导的视网膜变性具有有益效果。
在早产儿视网膜病的模型中，特异性抑制NADPH氧化酶显示出可以减少血管发生(A1-Shabraway等人，2005，Am.J.Pathol.167(2)599-607和Saito等人，2007，Mol.Vision，13840-853)。此外，在糖尿病动物中观察到了ROS增加，这种增加与VEGF活性增强相关。类似地，人们认为，氧化应激是糖尿病性视网膜病发生的重要因素(Kowluru和Chan，2007，Expt.Diabetes Res..Article ID 43603)。
the anatomic basis of visual field loss.ROS在青光眼的发生中具有两种不同的效果。首先，ROS增加导致小梁网的细胞质增加(并且由此使眼内压增加，Sacca等人，2007，Exp.Eye Res.84(3)389-399)。随着时间的推移，活性氧簇的增加也被认为会刺激视网膜神经节细胞凋亡(Tezel，2006，Prog.Retin.Eye Res.25(5)490-513)，丧失了视野的解剖学基础。
在非眼部皮肤组织中，来自花粉的NADPH氧化酶显示出了可以延长变应性应答。抑制NADPH氧化酶减小了肥大细胞脱颗粒作用，可以用于变应性眼病(Nishikawa等人，2007，BBRC，362(2)504-509)。
尽管缺乏抑制NADPH氧化酶会为一些所述眼病提供治疗效果的直接实验证据，但是抑制NADPH氧化酶有望改变细胞的氧化还原平衡，这样可以通过间接手段在各种疾病中具有治疗性。
NADPH氧化酶的抑制剂对于治疗干眼也是有效的，这是基于下列观察NADPH氧化酶在角膜上皮和基质细胞中构成性地表达(O′Brien等人，2006，IOVS，47853-863)。作者建议，过氧化阴离子的产生会在角膜的炎症中发挥作用。
至于特异性的Nox酶在炎性疾病中的作用，据信包含Nox2-的NADPH氧化酶和Akt激活会在加压素II-诱导的心肌细胞肥大中发挥关键作用(Physiol.Genomics 26180-191，2006)。
因此，据信Nox会在一些癌症和炎性疾病中导致ROS水平升高，用适当的抑制剂治疗对于治疗这些癌症和炎性疾病是有用的。
仍然需要不具有一般由非选择性常规化疗剂导致的不良作用的癌症治疗剂。此外还需要与活性氧簇有关的炎性、变性和血管性疾病的其他治疗剂。本发明提供了这样的化合物、组合物和方法。
发明简述 公开了化合物，包含这些化合物的药物组合物，其制备方法及应用。在一个实施方案中，该化合物是富烯和/或富瓦烯类似物，其可以是通过环戊二烯基阴离子与在适当的中间体上的一个或多个酮或醛基反应而形成的。在另一个实施方案中，该化合物是富烯和/或富瓦烯类似物，其可以是通过包含富烯和/或富瓦烯的羧酸(或者酸的卤化物或其酸酐)与在糖、核苷、核苷酸或氨基酸、或寡核苷酸和肽(包括核苷酸或氨基酸)上的羟基、硫醇或胺基反应而形成的。
代表性的化合物包括类固醇和类固醇前体例如胆固醇、黄体酮、睾酮或雌激素，染料例如靛青和苯甲酮，姜黄素以及包含醛和酮的姜黄烯类的富烯和/或富瓦烯类似物。
也公开了这些包含富烯和/或富瓦烯的化合物的合成、特征和抗肿瘤能力的评价。
不希望受特定理论的限制，据信，这些化合物通过下列机制中的一种或多种来发挥功能 a)抑制所有形式的Nox， b)特异性抑制Nox 1-5， 特异性抑制Nox 2和/或Nox 4(后者在癌细胞中比在正常细胞中更为普遍)， d)抑制Nox酶，其在癌细胞中比在正常细胞中更为普遍，Nox酶下文称作tNox， e)抑制ROS，和 f)刺激过氧化物清除剂，例如清除酶系统的促酶、过氧化物歧化酶I(Zn2+/Cu2+SOD)和II(MN-SOD)，以及谷胱甘肽过氧化物酶。
在本文的实施例中给出了这些化合物可以抑制ROS的证据，它表明，电子自旋共振谱证明了当这些化合物加到过氧化物歧化酶上，它们改变了过氧化物歧化酶的光谱，显然将其转变成自由基。
用这些化合物中的一种或多种治疗选择性地杀死了癌细胞，而不会杀死健康细胞，因此提供了选择性的抗癌疗法。最重要的是，这些化合物可以有效对抗已经变为转移性的癌细胞。如上所讨论，杀死癌细胞的机制包括抑制tNOX，而不会显著影响CNox，这样有效地抑制了细胞增殖，特别是在转移性肿瘤中更是如此，或者抑制任何的Nox酶例如在癌细胞中普遍存在的Nox4。也就是说，在一些实施方案中，Nox是在癌细胞中而非正常细胞中选择性表达的物质，在其他实施方案中，Nox在癌细胞中表达的浓度高于正常细胞。
药物组合物包含有效量的本文所述的化合物和药学可接受的载体或赋形剂。当以有效量使用时，该化合物可以发挥治疗剂的作用，预防和/或治疗种类广泛的癌症，特别是转移性癌症，据信在这种作用中该化合物是安全和有效的。可以治疗和/或预防的代表性的癌症包括黑素瘤，白血病，非小细胞性肺、结肠、中枢神经系统(CNS)、肾、卵巢、乳腺和前列腺癌。其他药物组合物可以用于治疗眼病。
在下文的详述和实施例中将会更详细地解释本发明的前述和其他方面。
附图简述 附

图1的图，代表的是各种受试化合物对Nox2活性的抑制，这是在用不同浓度的载体对照物或各种受试化合物处理的PMA-刺激的Cos-phox细胞中通过H2O2的产生确定的。
附图2的图，显示的是姜黄素富烯对于体内肿瘤细胞的效果(平均肿瘤体积)。
附图3的图，显示的是用载体或或富烯-5(4-(环戊-2，4-二烯亚基甲基)-5-甲基-1H-咪唑)治疗并暴露于暗光或亮光下的小鼠的平均ERG b-波振幅(μm)。
附图4是过氧化物歧化酶和富烯5(“靛青富烯”)的电子自旋共振(“ESR”)谱。
发明详述 公开了化合物，包含该化合物的药物组合物，其制备方法及应用。
下列定义用于理解如本文所述的本发明的边界和范围。
本文使用的“烷基”是指直链或支链的烷基，包括C1-C8，优选C1-C5，例如甲基、乙基或异丙基；“取代的烷基”是指还具有一个或多个取代基例如羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、芳基、杂环、卤素、氨基、羧基、氨甲酰基、氰基等等的烷基；“烯基”是指直链或支链并具有至少一个碳碳双键的的烃基，包括C1-C8，优选C1-C5；“取代的烯基”是指还具有一个或多个上述定义的取代基的烯基；“环烷基”是指包含3到8个碳原子，优选3到6个碳原子的饱和或不饱和、非芳香的、包含环的基团；“取代的环烷基”是指还具有一个或多个上述定义的取代基的环烷基；“芳基”是指具有6到10个碳原子的芳香基；“取代的芳基”是指还具有一个或多个上述定义的取代基的芳基；“烷芳基”是指被烷基取代的芳基；“取代的烷芳基”是指还具有一个或多个上述定义的取代基的烷芳基；“芳烷基”是指被芳基取代的烷基；“取代的芳烷基”是指还具有一个或多个上述定义的取代基的芳烷基；“杂环基”是指包含一个或多个杂原子(例如O，N，S)作为环结构的一部分并且在环上具有2到7个碳原子的饱和或不包含环基；“取代的杂环基”是指还具有一个或多个上述定义的取代基的杂环基。
I.化合物 该化合物是富烯和/或富瓦烯类似物，这些化合物的前药或代谢产物，及其药学可接受的盐。在一个实施方案中，该化合物一般落入下文提供的通式之一中
其中 X是O、S、CH2或NR′，其中各个R′分别是氢、C1-6烷基、环烷基、杂环基、芳基、或芳烷基(例如苄基)；并且 该芳基或杂芳环可以在任何的游离位置被H或如本文所述的取代基G取代，并且x和y是0到3的整数。
在其他实施方案中，该化合物是化合物的醚、硫醚或胺衍生物，其中化合物最初包括羟基、硫醇或氨基，其中如本文所述，该基团已与包括富烯或富瓦烯部分和羧酸或活化的羧酸部分的化合物反应。一种包含富烯的羧酸如下所示
其中羰基与中间体上的羟基、硫醇或氨基相连形成酯、硫酯或酰胺键。例如可以通过使用不同的包含酮或醛的羧酸，通过与环戊二烯基阴离子的类似反应制备类似的化合物。
可以用于通过与包含富烯-或富瓦烯的羧酸、酸的卤化物或酸酐反应制备本文所述的化合物的代表性的包含羟基、硫醇和胺的部分包括天然或合成的糖、多元醇、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、核苷和核苷酸(例如，通过与这些化合物上的3′和/或5′-羟基反应)、短(即25mer或更少的)寡核苷酸，包括包含核苷，羟基、硫醇和/或胺的氨基酸、包括这些氨基酸的肽和蛋白质，以及下式的化合物
或其他如上所述的包含富烯-或富瓦烯的羧酸部分或活化的羧酸部分，条件是至少一个R不是H。
代表性的取代基G包括C1-6烷基(包括环烷基)、烯基、杂环基、芳基、杂芳基、卤素(例如，F、Cl、Br或I)、-OR、-NR′R″、-CF3、-CN、-NO2、-C2R′、-SR′、-N3，-C(＝O)NR′R″、-NR′C(＝O)R″、-C(＝O)R′、-C(＝O)OR′、-OC(＝O)R′、-OC(＝O)N R′R″、-NR′C(＝O)OR″、-SO2R′、-SO2NR′R″和-NR′SO2R″，其中R′和R″独立地是氢、C1-6烷基、环烷基、杂环基、芳基或芳烷基(例如苄基)； 该化合物可以发生不同程度的对映体过量，可以用已知的手性分离技术精制外消旋混合物。
该化合物可以是游离碱或盐(例如，作为药学可接受的盐)的形式。适当药学可接受的盐的例子包括无机酸的加成盐例如硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐；有机酸的加成盐例如乙酸盐、二氯乙酸盐、半乳糖二酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、羟乙酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐和抗坏血酸盐；与酸性氨基酸的盐例如天冬氨酸盐和谷氨酸盐；碱金属盐例如钠或钾盐；碱土金属盐例如镁和钙盐；铵盐；有机碱的盐例如三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、二环己胺和N，N′-二苄基乙二胺的盐；以及与碱性氨基酸例如赖氨酸和精氨酸的盐。这些盐在一些情况下可以是水合物或乙醇的溶剂化物。盐的化学计量随着组分的性质而各异。
代表性的化合物包括下列化合物















上述鉴定为靛青富烯的化合物在本文中也称作“富烯-5”。
如果需要，这些化合物中的一些可以通过在该结构的氮原子上用C1-6烷基、环烷基、杂环基、芳基、或芳烷基部分取代氢，或用环烷基、杂环基、芳基或芳烷基部分取代烷基部分而具有更大的疏水性。例子包括如下化合物
II.制备化合物的方法 在一些实施方案中，可以通过将环戊二烯钠与醛或酮反应来制备该化合物。使用这种途径，可以由轻易可得的包含酮或醛的原料制备很多富烯类。
代表性的醛和酮如下文所提供















其中任何的芳基/杂芳环可以被一个或多个如本文所述的取代基取代，胺(即，-NH基)可以被本文所述的R′基取代。
在其他实施方案中，可以通过将羟基、硫醇或胺基与包含富烯或富瓦烯部分和羧酸或活化的羧酸部分的化合物反应来制备该化合物。
一般地，在脱水剂和/或碱存在下，羟基、硫醇或胺基与包含富烯-或富瓦烯的羧酸或其活化的衍生物(例如，酸的氯化物或酸酐)反应。各种条件都是可以的。
使用酸催化剂，羧酸可以与羟基或酯基直接偶合，随后形成水(典型地通过共沸蒸馏除去)，或者典型地在叔铵例如三乙胺存在下与酸的卤化物或酸酐反应。所得的化合物具有酯或硫酯键，通过该键与富烯和/或富瓦烯相连。
使用用于形成酰胺键的各种试剂中的一种(例如，在肽合成中使用的那些)可以将具有游离胺官能团的中间体与包含羧酸、包含富烯或富瓦烯的部分偶合。这些试剂包括N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷磷六氟磷酸盐(PyBOP)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-二(四亚甲基)脲六氟磷酸盐(HBPyU)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)，和含有1-羟基苯并三唑(HOBt)的(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)(EDCI)。在一些情况下，这些试剂可以作为聚合物供体的变体从商业上购得，它们可以极大地促进偶合产物的分离。这些试剂的一个例子是与聚苯乙烯键合的N，N′-二环己基碳二亚胺(PS-DCC)。
可以例如通过将包含羧酸的部分与任意的各种试剂例如亚硫酰氯或草酰氯反应来制备酸的卤化物。酸的氯化物和羧酸之间的反应典型地是在叔胺(一般是受阻的一种)存在下进行的。
典型地，在形成酯、硫酯或酰胺键后，除去任何的保护基(例如，叔丁氧羰基或苄基)以得到所需的化合物。保护基和除去它们的方法是本领域技术人员公知的，例如在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley &Sons，New York(1999)中进行了描述。
用于制备本文所述的化合物的包含富烯和/或包含富瓦烯的羧酸是商业购得的，或者可以由商业可购得的原料制备。可以通过涉及所需的特定部分和特定取代的各种合成方法来制备商业无法购得的那些。合成方法的各种改变对于有机合成领域的技术人员将是显而易见的。
例如，一种包含富烯和/或包含富瓦烯的羧酸如下所示
其中羰基与中间体上的羟基、硫醇或胺基相连以形成酯、硫酯或酰胺键。可以通过，例如将适当保护的3-酮丁酸(或相应的丁酸盐)与环戊二烯基阴离子反应形成富烯环来制备该中间体。可以将该羧酸盐酸化以重新形成羧酸部分，如果需要，其可以进一步反应以形成酸酐或酸的卤化物。使用上述的酯化、硫酯化或酰胺化化学，该羧酸、酸的卤化物或酸酐中间体可以用于形成事实上任何包含羟基、硫醇或胺的化合物的富烯类似物。
上述中间体仅是可以用于将富烯或富瓦烯部分加入到化合物上的很多化合物中的一种。例如，可以通过使用不同的包含酮或醛的羧酸，使用环戊二烯基阴离子，通过类似反应来制备类似的化合物。
可以用于制备本文所述的化合物通过与包含富烯或富瓦烯的羧酸、酸的卤化物或酸酐反应的代表性的包含羟基、硫醇或胺的部分如下所述。
天然或合成的糖、多元醇、聚亚烷基二醇例如聚乙二醇、核苷和核苷酸(例如，通过与这些化合物上的3′和/或5′-羟基反应)、短(即25mer或更少的)寡核苷酸，包括包含这些核苷、羟基、硫醇和/或胺的氨基酸、包括这些氨基酸的肽和蛋白质，以及下式的化合物
或其他如上所述的包含富烯或富瓦烯的羧酸部分或活化的羧酸部分，条件是至少一个R不是H。
本领域技术人员很容易即可理解将其他取代基加入到用作原料的环戊二烯环上以制备富烯/富瓦烯，很容易即可意识到富烯/富瓦烯骨架中的其他位置。这些取代基本身可以提供有用的性质或者用作进一步合成操作的着手点。
典型地可以在形成环戊二烯钠(即，通过加入碱)之前将取代基加入到环戊二烯上，所述环戊二烯钠与适当的酮或醛反应形成本文所述的化合物，或形成包含富烯/富瓦烯的羧酸/酸的卤化物/酸酐，再与羟基、硫醇或胺基反应以形成本文所述的化合物。
例如，可以用Cram和Partos，Electrophilic Substitution和Other Reactions of Diazocyclopentadiene，J.A.C.S.p.1273-1277(1962)的技术制备重氮基环戊二烯。
根据特定的卤素而异，可以使用各种已知的方法将重氮基环戊二烯卤化。适当的试剂的例子包括在浓HBr中的溴/水、亚硫酰氯、pyr-ICl、氟和Amberlyst-A。
通过重氮基环戊二烯中间体，可以由相应的氨基化合物合成很多其他的类似物，所述类似物在重氮基环戊二烯的重氮位上具有取代基。可以用已知的化学，例如如上所述来制备重氮基环戊二烯。
重氮基环戊二烯的硝化产生了两种异构体，2-硝基和3-硝基环戊二烯化合物。苯重氮基四氟硼酸盐导致了2-取代的产物，而溴化得到了四溴重氮基环戊二烯。用碘化汞汞化可以得到2，5-二碘重氮基环戊二烯。
通过典型地在酸存在下与亚硝酸盐反应可以将硝基衍生物还原成胺化合物。使用本领域技术人员已知的一般技术，可以由重氮盐中间体制备其他取代的类似物，包括但不限于，羟基、烷氧基、氟、氯、碘、氰基和巯基。例如，可以通过将重氮盐中间体与水反应，保护所得到的羟基，形成环戊二烯基阴离子并将其与适当的醛或酮反应来制备羟基-富烯类似物。同样，可以通过重氮基环戊二烯与醇的反应来制备烷氧基富烯类似物。如本领域技术人员所知，重氮基环戊二烯也可以用于合成氰基或卤素化合物。使用在Hoffman等人，J.Med.Chem.36953(1993)中所述的技术可以获得巯基取代。接着通过与氢化钠和适当的烷基溴反应将这样产生的硫醇转变为烷硫基取代物。然后氧化，得到砜。使用有机合成领域技术人员已知的技术，通过将相应的氨基化合物与适当的酸酐或酸的氯化物反应，可以制备上述化合物的酰氨基类似物。
羟基取代的类似物可以用于通过与适当的酸、酸的氯化物或酸酐反应来制备相应的烷酰氧基取代的化合物。同样，羟基化合物是通过在缺电子芳香环上亲核芳香取代的芳氧基和杂芳氧基的前体。这些化学是有机合成领域的技术人员公知的。也可以通过用烷基卤化物和适当的碱烷基化或者通过Mitsunobu化学，由羟基化合物制备醚衍生物，其中典型地使用三烷基或三芳基膦和偶氮二甲酸二乙酯。典型的Mitsunobu条件参见Hughes，Org.React.(N.Y.)42335(1992)和Hughes，Org.Prep.Proced.Int.28127(1996)。
氰基取代的类似物可以水解，得到相应的羧氨基取代的化合物。进一步水解导致形成相应的羧酸取代的类似物。用氢化锂铝还原氰基取代的类似物得到相应的氨甲基类似物。可以使用有机合成领域的技术人员已知的技术，通过与适当的烷基锂反应，由相应的羧酸取代的类似物制备酰基取代的类似物。
可以通过与适当的醇和酸催化剂反应，将羧酸取代的类似物转变为相应的酯。可以用硼氢化四钠或氢化锂铝还原具有酯基的化合物，产生相应的羟甲基取代的类似物。接着，使用常规技术，通过与氢化钠和适当的烷基卤化物反应将这些类似物转变为具有醚部分的化合物。可替代地，羟甲基取代的类似物可以与甲苯磺酰氯反应，得到相应的甲苯磺酰氧甲基类似物，通过连续用亚硫酰氯和适当的烷基胺处理可以将其转变为相应的烷基氨酰基类似物。已知这些酰胺中的一些容易发生亲核酰基取代，形成酮。
羟基取代的类似物可以通过与N-烷基或N-芳基异氰酸酯(盐)反应，用于制备N-烷基或N-芳基氨甲酰氧基取代的化合物。使用有机合成领域的技术人员已知的技术，氨基取代的类似物可以通过分别与烷基氯甲酸酯和N-烷基-或N-芳基异氰酸酯反应，用于制备烷氧基羧氨基(carboxamido)取代的化合物和脲衍生物。
类似地，可以用已知的化学，包括上述讨论的反应取代苯环(和吡啶、嘧啶、吡嗪和其他杂芳环)。例如，硝基苯上的硝基可以与亚硝酸钠反应，形成重氮盐，如上述讨论处理该重氮盐以在苯环上形成各种取代基。
III.药物组合物 本文所述的化合物可以并入到药物组合物中，用于在易患这样的疾病或病症的患者中预防疾病或病症，和/或治疗患疾病或病症的患者。本文所述的药物组合物包括本文所述的一种或多种富烯和/或富瓦烯类似物，和/或其药学可接受的盐。旋光活性化合物可以使用外消旋混合物、纯对映体或者各种对映体纯的化合物。
施用该化合物的方式可以不同。该组合物优选是口服(例如，在溶剂例如水性或非水性液体中以液体形式，或在固体载体中)。口服的优选组合物包括丸剂、片剂、胶囊、胶囊形片剂、糖浆和溶液，包括硬明胶胶囊和定时释放胶囊。可以使用可以配制成单位剂型，或是多或亚剂量。优选的组合物是液体或半固体形式。可以使用包含液体的药学惰性载体例如水或者其他药学上相容的液体或半固体的组合物。这些液体和半固体的使用是本领域技术人员公知的。
该组合物也可以通过注射施用，即静脉内、肌内、皮下、腹膜内、动脉内、鞘内；和脑室内注射。静脉内施用是注射的一种优选方法。注射用的适当载体是本领域技术人员公知的，包括5％葡萄糖溶液、盐水和磷酸盐缓冲盐水。该化合物也可以作为输注或注射剂(例如，作为在药学可接受的液体或液体的混合物中的混悬液或乳剂)施用。
也可以使用其他方法，例如直肠给药来施用该制剂。用于直肠给药的制剂例如栓剂是本领域技术人员公知的。该化合物可以通过吸入(例如，以气雾剂的形式通过鼻或使用如Brooks等人的U.S.专利4,922,901所述类型的递送装置，将其内容以整体引入本文)、局部(例如，以洗剂的形式)；或经皮(例如，使用透皮贴剂，使用Novartis和Alza Corporation可购得的技术)施用。尽管也可以以大块活性化学品的形式施用该化合物，但是优选各化合物都以药物组合物或制剂的形式存在以有效和有力地施用。
该化合物可以掺入到药物递送装置例如毫微粒、微粒、微囊等等中。代表性的微粒/毫微粒包括用环糊精例如PEG化的环糊精、脂质体制备的那些，所述脂质体包括小的单层囊泡和大小设计为用于宿住于生长的肿瘤周围的毛细血管床上的脂质体。例如在Heidel JD等人，Administration in non-human primates of escalating intravenousdoses of targeted nanoparticles containing ribonucleotidereductase subunit M2siRNA，Proc Natl Acad Sci U S A.2007Apr3；104(14)5715-21；Wongmekiat等人，Preparation of drugnanoparticles by co-grinding with cyclodextrinformationmechanism and factors affecting nanoparticle formation，ChemPharm Bull(Tokyo).2007Mar；55(3)359-63；Bartlett和Davis，Physicochemical and biological characterization of targeted，nucleic acid-containing nanoparticles，Bioconjug Chem.2007Mar-Apr；18(2)456-68；Villalonga等人，Amperometric biosensorfor xanthine with supramolecular architecture，Chem Commun(Camb).2007Mar7；(9)942-4；Def aye等人，Pharmaceutical useof cyclodextrinesperspectives for drug targeting and controlof membrane interactions，Ann Pharm Fr.2007Jan；65(1)33-49；Wang等人，Synthesis ofOligo(ethylenediamino)-beta-Cyclodextrin Modified GoldNanoparticle as a DNA Concentrator；MoI Pharm.2007Mar-Apr；4(2)189-98；Xia等人，Controlled synthesis of Y-junctionpolyaniline nanorods and nanotubesusing in situ self-assemblyof magnetic nanoparticles，J Nanosci Nanotechnol.，2006Dec；6(12)3950-4；和Nijhuis等人，Room-temperature single-electrontunneling in dendrimer-stabilized gold nanoparticles anchoredat a molecular printboard，Small.2006Dec；2(12)1422-6中描述了适当的药物递送装置。
施用这些化合物的示例性方法对于技术人员而言是显而易见的。这些制剂的有用性取决于所使用的特定组合物和接受治疗的特定患者。这些制剂可以包含液体载体，其可以是油性的、水性的、乳化的或者包含某些适合施用方式的溶剂。
该组合物可以间歇地施用或逐步地、连续地、持续地或速率可控地施用于温血动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、猫、兔、狗、猪、牛或猴子)，但是有利地，施用于人。此外，施用该药物制剂的每日时间和每日的次数可以不同。
优选地，施用该组合物以使活性成分与癌细胞集中的区域相互作用。本文所述的化合物对于治疗这些癌症是特别有效的。
在一些情况下，本文所述的化合物可以与预防或治疗特定癌症的其他化合物用作药物组合物的一部分，即作为联合治疗。除了有效量的本文所述的化合物，该药物组合物也可以包含各种其他的组分作为添加物或辅助剂。
与蛋白质络合 本文所述的富烯和富瓦烯类似物可以与肽和蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、VEGF、bFGF等等络合。这些络合物是易于制备的，并且比未络合的化合物毒性更低。
本领域技术人员很容易即可认识到如何将本文所述的化合物与蛋白质或肽络合。这些络合物可以以施用未络合化合物的任何方式施用。
联合治疗 联合治疗可以施用(a)单一的药物组合物，其包含本文所述的富烯和/或富瓦烯类似物、至少一种本文所述的其他药物和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体；或(b)两种单独的药物组合物，包括(i)第一组合物，包含本文所述的富烯和/或富瓦烯类似物和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体，和(ii)第二组合物，包含至少一种本文所述的其他药物和药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。药物组合物可以同时或连续并以任意顺序施用。
在用于治疗或预防癌症时，本文所述的富烯和/或富瓦烯类似物可以与作为单一药物组合物的一部分的至少一种其他化疗剂一起施用。可替代地，除其他抗癌化疗剂外，可以施用该富烯和/或富瓦烯类似物。在这个实施方案中，该富烯和/或富瓦烯类似物与至少一种其他抗癌化疗剂是基本上同时施用的，也就是说这些化合物是同时或一个接一个地施用的，只要这些化合物在血液中在一段时间达到治疗水平即可。
联合治疗包括联合施用本文所述的富烯和/或富瓦烯类似物或本文所述的化合物的药学可接受的盐或前药、和至少一种抗癌化疗剂，理想地后者通过不同机制发挥作用(即，VEGF抑制剂、烷化剂等等)。
可以用于联合治疗的已知抗癌剂的例子包括但不限于，烷化剂例如白消安、顺铂、丝裂霉素C和碳铂；抗有丝分裂剂，例如秋水仙碱、长春碱、紫杉醇和多西紫杉醇；拓扑酶I抑制剂，例如喜树碱和托泊替康；拓扑酶II抑制剂，例如多柔比星和依托泊苷；RNA/DNA抗代谢药，例如5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤；DNA抗代谢药，例如5-氟-2′-脱氧-尿苷、ara-C、羟基尿和硫鸟嘌呤；和抗体，例如

和

可以用于联合治疗的其他已知的抗癌剂包括三氧化二砷、吉西他滨、美法仑、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、长春新碱、米托胍腙、表柔比星、阿柔比星、博来霉素、米托蒽醌、依利醋铵、氟达拉滨、奥曲肽、视黄酸、他莫昔芬和阿拉诺新。下面将描述可以与富烯和/或富瓦烯类似物联合使用的其他种类的抗癌化合物。
该富烯和/或富瓦烯类似物可以与α-1-肾上腺素受体拮抗剂例如多沙唑嗪、特拉唑嗪和坦洛新联合，所述拮抗剂可以通过诱导凋亡抑制前列腺癌细胞生长(Kyprianou，N.，等人，Cancer Res 604550-4555，(2000))。
Sigma-2受体以高密度在各种肿瘤细胞类型中表达(Vilner，B.J等人，Cancer Res.55408413(1995))，sigma-2受体激动剂例如CB-64D、CB-184和氟哌啶醇激活了一种新的凋亡途径，使得抗肿瘤药能够用于乳腺肿瘤细胞株(Kyprianou，N.，等人，Cancer Res.62313322(2002))。因此，该富烯和/或富瓦烯类似物可以与至少一种已知的sigma-2受体激动剂或所述药物的药学可接受的盐联合。
该富烯和/或富瓦烯类似物可以与洛伐他汀(一种HMG-CoA还原酶抑制剂)和丁酸盐(小鼠的路易斯肺癌中凋亡的诱导剂)联合，可以增强抗肿瘤效果(Giermasz，A.，等人，Int.J.Cancer 97746 750(2002))。可以用于联合治疗的已知HMG-CoA还原酶抑制剂的例子包括但不限于，洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿伐他汀和西立伐他汀及其药学可接受的盐。
某些HIV蛋白酶抑制剂，例如茚地那韦或沙奎那韦具有有效的抗血管生成活性，并且促进卡波西肉瘤退化(Sgadari，C.，等人，Nat.Med.8225 232(2002))。因此，(除了形成这些化合物的富烯和/或富瓦烯类似物外)，富烯和/或富瓦烯类似物可以与HIV蛋白酶抑制剂或所述药物的药学可接受的盐组合。代表性的HIV蛋白酶抑制剂包括但不限于，安泼那韦、阿巴卡韦、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、茚地那韦、那非那韦、替拉那韦、利托那韦、沙奎那韦、ABT-378、AG 1776和BMS-232，632。
在小细胞肺癌株中，合成型维甲类例如芬维A胺(N-(4-羟基苯基)视黄酰胺，4HPR)与其他化疗剂例如顺铂、依托泊苷或紫杉醇的组合具有良好的活性(Kalemkerian，G.P.，等人，Cancer Chemother.Pharmacol.43145 150(1999))。据报道，4HPR与γ-辐射组合对于膀胱癌细胞株也具有良好的活性(Zou，C.，等人，Int.J.Oncol.131037 1041(1998))。代表性的维甲类和合成型维甲醇类包括但不限于，贝沙罗汀、维甲酸、13-顺式视黄酸、9-顺式视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、芬维A胺和N-4-羧苯基视黄酰胺。
蛋白酶体抑制剂例如乳胞素在体内和体外的肿瘤细胞中显示了抗肿瘤活性，包括对常规的化疗剂耐受的那些肿瘤。通过抑制NF-κB的转录活性，蛋白酶体抑制剂也可以防止体内血管生成和转移，此外还能增强癌细胞对凋亡的敏感性(Almond，J.B.，等人，Leukemia 16433 443(2002))。代表性的蛋白酶体抑制剂包括但不限于，乳胞素、MG-132和PS-341。
酪氨酸激酶抑制剂例如STI 571(甲磺酸伊马替尼，

)与其他抗白血病药例如依托泊苷的组合具有有效的协同效果(Liu，W.M.，等人Br.J.Cancer 861472 1478(2002))。代表性的酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于，

ZD1839(

)、SH268、染料木素、CRP2563、SU6668、SU11248和RMD121974。
异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂例如法尼基蛋白转移酶抑制剂R115777对于人乳腺癌具有抗肿瘤活性(Kelland，L.R.，等人，Clin.Cancer Res.73544 3550(2001))。也报道了蛋白法尼酰基转移酶抑制剂SCH66336和顺铂在人癌细胞株中的协同作用(Adjei，A.A.，等人，Clin.Cancer Res.71438 1445(2001))。异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂包括法尼基蛋白转移酶抑制剂、二牛龙牛儿基-蛋白转移酶I型(GGPTase-I)和二牛龙牛儿基(geranylgeranyl)-蛋白转移酶II型抑制剂，或所述药物的药学可接受的盐可以与本文所述的富烯和/或富瓦烯类似物联合使用。已知的异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂的例子包括但不限于R115777、SCH66336、L-778、123、BAL9611和TAN-1813。
周期素依赖性蛋白激酶(CDK)抑制剂例如夫拉平度与其他抗癌剂例如CPT-11(一种DNA拓扑异构酶I抑制剂)的组合对人结肠癌细胞具有有效的，通常是协同的效果(Motwani，M.，等人，Clin.Cancer Res.74209 4219，(2001))。代表性的周期素依赖性蛋白激酶抑制剂包括但不限于，夫拉平度、UCN-01、roscovitine和奥罗莫星。
已知某些COX-2抑制剂能够阻断血管形成，抑制实体瘤转移并减缓植入的胃肠癌细胞生长(Blanke，C.D.，Oncology(Hunting)16(No.4Suppl.3)17 21(2002))。代表性的COX-2抑制剂包括但不限于，塞来考昔、伐地考昔和罗非考昔。
任意的上述化合物可以与富烯和/或富瓦烯类似物在联合治疗中使用。此外，这些化合物中的很多可以使用本文所述的化学，通过该化合物上的酮、醛、羟基、硫醇和/或胺官能团的反应转化为富烯和/或富瓦烯类似物。这些化合物的富烯和/或富瓦烯类似物在本发明的范围内。
此外，该富烯和/或富瓦烯类似物可以通过与治疗上有用的抗体例如

或

生长因子例如DGF、NGF；细胞因子例如IL-2、IL-4或结合到细胞表面的任何分子相连而靶向于肿瘤位点。抗体和其他分子将把本文所述的化合物递送到它的靶点，使其成为有效的抗癌药。这种生物结合也可以增强这些治疗上有用的抗体例如

或

的抗癌效果。
该化合物也可以通过在手术前和/或后施用该化合物与外科上的肿瘤清除结合使用，和通过在放射治疗前、期间和/或后施用该化合物与放射治疗结合使用。
该化合物的适当剂量是有效预防疾病的症状发生或者治疗患者所患疾病的某些症状的量。“有效量”、“治疗量”或“有效剂量”是指足以产生所需的药理学或治疗学效果，因此有效地预防或治疗疾病的量。
当治疗癌症时，该富烯和/或富瓦烯类似物的有效量是足以抑制肿瘤生长的量，并且理想地，是缩小肿瘤，更理想地，是破坏肿瘤的足够量。通过以预防的方式施用本文所述的化合物可以在开始时预防肿瘤或防止肿瘤复发。优选地，有效量足以获得所期望的结果，但是不足以产生可感知的副作用。
根据各种因素，例如患者的情况、癌症的严重度以及药物组合物的施用方式，有效剂量可以不同。当然，患者与患者之间化合物的有效剂量是不同的，但是一般下限为发生所期望的治疗效果时的量，但是低于观察到显著的副作用时的量。
当根据本文所述的方法以有效量使用时，该化合物对于特定癌细胞是选择性的，但是对于正常细胞没有显著的影响。
对于人类患者而言，典型的化合物的有效剂量一般需要以至少约1，通常至少约10，常常至少约25μg/24小时/患者的量施用该化合物。有效剂量一般不超过约500，通常不超过约400，常常不超过约300μg/24小时/患者。此外，施用有效剂量以使患者血浆内的化合物浓度正常为不超过500ng/mL，常常不超过100ng/mL。
IV.使用该化合物和/或药物组合物的方法 本文所述的化合物和包含该化合物的药物组合物可以用于治疗癌症。可以治疗的代表性的疾病包括赘生物例如血管瘤，和恶性肿瘤例如，涉及血管内皮生长因子(VEGF)及其主要的粗有丝分裂受体血管内皮生长因子受体2的自分泌环引起的那些。
癌症包括其中Nox酶(即，Nox 1，Nox 4等等)以较高浓度存在的那些，或者其中ROS介导癌生长的那些。
代表性的恶性肿瘤包括恶性内皮肿瘤例如黑素瘤。可以治疗的其他癌症包括但不限于人肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤(lymphangioendotheliosarooma)、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、腺癌(cystadeno carcinorna)、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病，例如急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病(成骨细胞的、早幼粒细胞性、粒单细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症和重链病，和这些癌症的恶性形式。
在一个实施方案中，癌症是黑素瘤、直肠癌、结肠癌、乳腺瘤(breast carcinoma)、卵巢癌、小细胞肺癌、结肠癌、慢性淋巴细胞癌、毛细胞白血病、伴食管癌(esophogeal carcinoma)、前列腺癌、乳腺癌、骨髓瘤或淋巴瘤。据信，在患癌症的患者的血清中，这些癌症具有循环水平的tNOX(可以包括Nox4或其他Nox酶)(参见例如U.S.5,605,810，因此将其以整体通过参考引入本文)。
在一些实施方案中，患者已经患癌症并且正在治疗癌症，可以或可以不具有癌症转移(即，继发性癌症)。
癌症可以体现为肿瘤的形式，例如上皮组织、淋巴组织、结缔组织、骨或中枢神经系统的肿瘤。
在治疗上述类型的癌症时，该化合物也可以用作辅助疗法，与现有的疗法组合。在这些情况下，优选以对癌细胞包括耐药性癌细胞效果最佳，同时对正常细胞类型影响最小的方式施用活性成分。尽管这主要是通过该化合物本身的行为的特点完成的，但是也可以通过靶向的递送药物和/或通过调整剂量以获得期望的效果而又不超过达到显著的副作用所需的阈剂量来完成。
骨质疏松症的治疗 本文所述的化合物也可以用于治疗骨质疏松症。细胞因子RANKL(NF-κB配体的受体活化剂)通过活化破骨细胞而导致骨质疏松症。该化合物通过产生细胞凋亡、抑制破骨细胞产生和通过调节细胞核因子-κB活化途径抑制侵入来抑制RANKL活性(参见，例如Mol Cancer Res.2006Sep；4(9)621-33)。
炎性疾病的治疗 本文所述的化合物可以用于治疗或预防炎性疾病。活性氧会在炎性疾病例如类风湿性关节炎、哮喘、牛皮癣、excema、狼疮、硬皮病、某些心脏疾病例如动脉粥样硬化和冠状动脉疾病等等中产生NFκB。由于该化合物能有效地抑制活性氧的产生，因此它们对于炎性疾病是有活性的。
该化合物也抑制某些炎症信号，可以通过抑制这些信号减轻炎性疾病例如炎性关节炎。
类风湿性关节炎(RA)被认为是最常见的系统性自身免疫性疾病，但是使用本文所述的化合物也可以治疗其他疾病例如甲状腺机能减退、全身性红斑狼疮(SLE)等等。很多疾病与慢性炎症和TNF-α和IL-6的水平升高有关，包括类风湿性关节炎、心脏病和癌症。炎症导致了很多胃肠疾病，包括但不限于，克劳恩病、肠应激综合征和炎性肠综合征，使用本文所述的化合物也可以治疗和/或预防这些疾病。
有人提出由于非洲淋巴瘤病毒(EBV)的再激活，类风湿性关节炎与慢性炎症之间的联系，在世界90％以上的的人口中非洲淋巴瘤病毒潜伏性地感染了一定比例的记忆B细胞。在病毒发病所涉及的EBV编码的蛋白质中，相当多的注意力集中于潜在膜蛋白1(LMP1)。在EBV-变异细胞中表达为蛋白质的9种EBV基因中，LMP1是最有特征的，是能够在体外和体内使细胞变异，导致淋巴组织增生改变和变为恶性的唯一一种EBV编码的基因产物。除了已经确定的它在B细胞淋巴瘤和其他恶性肿瘤的发病学中的作用外，EBV感染还与很多人自身免疫性疾病包括RA和SLE的恶化有关。
小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型(Myers等人，Life Science 611861-1878(1997))在很多病理学和免疫学方面与类风湿性关节炎相似，为评价化合物治疗慢性炎症的治疗能力提供了一种稳定的、可预测的模型。该模型可以用于，例如评价本文所述的化合物治疗和/或预防这些疾病的能力。
在体外用本文所述的化合物治疗小鼠B细胞株表明，在主要的小鼠B细胞中观察到细胞因子随着CD40和LMP1-介导的NFκB和AP-1活化具有并发性的剂量依赖性的降低。以剂量依赖性方式降低CD40和LMP1-介导的NFκB和AP-1活化的那些化合物通过抑制导致慢性炎症和其他病理学的细胞因子，不论是在免疫应答的认知期还是在效应期均有望具有抗炎活性。
眼病的治疗 该化合物也适合用于治疗具有炎性因素的眼病，例如湿型和干型与年龄有关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病(DR)、青光眼、新生血管性青光眼、视网膜脉管炎、眼色素层炎例如后色素层炎、结膜炎、视网膜炎、青光眼引发的视网膜炎、巩膜外层炎、巩膜炎、视神经炎、球后视神经炎、眼科手术后的眼部炎症、由物理性眼损伤导致的眼部炎症、白内障、眼变应性和干眼。
目前眼部递送的方法包括局部施用(滴眼剂或其他适合直接施用于眼部的局部用制剂)、结膜下注射、眼周注射、玻璃体内注射、手术植入和系统性途径。
特别地，当使用口服和静脉途径施用会担心系统性毒性时，可以使用玻璃体内注射、眼周注射和持续释放植入剂在眼组织中达到药物的治疗水平。滴眼剂用于治疗影响眼的外表面或眼前部的组织的疾病，一些制剂可以渗透到眼后部治疗视网膜疾病。
某些疾病影响眼后部的组织，因此治疗时难以递送。在这些实施方案中，可以使用离子电渗(inotophoresis)来将本文所述的化合物递送到眼后部。例如，眼的离子电渗系统OcuPhorTM可以安全和非侵入性地将药物递送到眼后部(Iomed)。离子电渗使用小的电流将电离的药物运输到并穿过身体组织。必须小心，不要使用太高的电流密度，否则会损害眼组织。
离子电渗典型地包括使用给药器、无效电极和电子离子电渗剂量控制器。给药器可以是一个小的硅酮壳，包含一个传导单元例如银-氯化银。水凝胶盒可以吸收该药物制剂。小的柔软的电线将该传导单元与剂量控制器连接起来。在使用前立即用药物溶液使药盒水合，将给药器置于下眼睑下面的眼的巩膜上。在治疗期间眼睑将给药器保持于原位。通过设计和设置电子控制器来控制药物剂量和施用速度。
神经变性疾病的治疗和/或提供神经保护 活性氧也诱导炎症和神经变性。抑制这些活性氧簇也会产生神经保护，包括在缺血性脑损伤例如中风后或由钝伤导致的缺血性脑损伤后保护其免于进一步的损害，并且治疗或预防神经变性疾病例如视网膜变性、阿尔茨海默病、老年痴呆、早老性痴呆、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化等等。
活性氧簇也会导致癫痫发作，因此，本文所述的化合物具有γ-氨基丁酸能(GABA能)活性，能够改善癫痫发作。
血管性疾病的治疗 其中涉及ROS的血管性疾病例如勃起机能障碍和偏头痛也会对NADPH氧化酶抑制剂产生应答。
在所有这些治疗中，据信该化合物通过抑制一种或多种Nox酶例如Nox1-5，或者通过刺激过氧化物清除剂(并由此抑制ROS产生)，或者直接与钝化的ROS反应来发挥作用。
据信，包含Nox2的NADPH氧化酶和Akt激活在血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大中发挥关键的作用(Physiol.Genomics 26180-191，2006)。因此，抑制这种Nox酶可以用于治疗或预防血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大。
下面提供的实施例是用于解释本发明，而不应当认为是对其进行限制。在这些实施例中，除非另有说明，所有的份和百分比都是指重量。以摩尔百分比报告反应收率。
实施例 下面提供的实施例是用于解释本发明，而不应当认为是对其进行限制。在这些实施例中，除非另有说明，所有的份和百分比都是指重量。以摩尔百分比报告反应收率。
实施例1NADH氧化酶的分光光度测定 可以在37℃下，在包含25mM Tris-Mes缓冲液(pH 7.2)，1mM KCN，和150μM NADH的反应混合物中，测定340nm处NADH的消失来确定NADH氧化酶的活性。例如，可以在搅拌下，用Hitachi U3210分光光度计来测定活性，以每次5分钟的2次间隔来连续记录。可以使用6.22的毫摩尔消光系数来确定特异性活性。
实施例2测量细胞生长 来自BALB/cf C3H小鼠的小鼠乳房肿瘤亚群株4T1可以在DME-10，Dulbecco′s改良型Eagle′s培养基中生长，该培养基中补充有5％胎牛血清，5％新生牛血清，1mM混合的非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)(Miller等人，1987，Brit.J.Can.56561-569和Miller等人，1990，Invasion Metastasis10101-112)。
实施例3各种受试化合物对Nox2酶的抑制 通过在12-十四酸佛波酯13-乙酸盐(phorbol 12-myristate13-acetate(PMA))刺激的Cos-phox细胞中确定过氧化氢(H2O2)的产生，来检验各种受试化合物对Nox2酶的活性。所述Cos-phox细胞用不同浓度的载体对照和表1所示的受试化合物处理。
表1.受试化合物 Cos-phox细胞已经在Price等人，Blood，992653-61(2002)中进行了描述，将其通过参考引入本文。
使用如Martyn等人，Cellular Signalling，1869-82(2006)和Perry等人，J.Invest.Dermatol，1262316-22(2006)所述的高香草酸分析来测定H2O2释放，将它们通过参考引入本文。简言之，用Cos-phox细胞以1.5-1.75x105个细胞/孔植入到12孔板中。次日，用Hank′s平衡盐溶液将细胞洗涤1次，用0.4mg/ml的12-十四酸佛波酯13-乙酸盐(PMA)刺激，然后用载体对照或不同浓度(即，1μM，5μM，或20μM)的受试化合物8，10，15，16，17或18号在1ml的培养基中预培养15分钟。然后用Hank′s平衡盐溶液将细胞洗涤1次。在相同浓度加入载体对照或不同浓度的受试化合物8，10，15，16，17或18号，在0.5ml的高香草酸分析溶液(100mM高香草酸分析，在含Ca2+和Mg2+的Hank′s平衡盐溶液中包含4U/ml的辣根过氧化物酶)中预培养，并在37℃下用细胞培养1小时。通过加入75ml的高香草酸分析停止缓冲液(0.1M甘氨酸/0.1M NaOH(pH 12)和25mMEDTA的磷酸盐缓冲盐水溶液)使反应停止。在320nm的激发波长和440nm的发射波长下，在BioTek Synergy HT(BioTek Instruments Inc.，Winooski，Vermont，CA)上读取荧光。
在加入(数据未显示)或不加入受试化合物的情况下，没有PMA刺激Cox-phox细胞就不会产生H2O2，因此，在这种特定的系统中，检测Nox 2活性需要PMA。受试化合物8，10，15，16，17或18号抑制Cox-phox细胞中H2O2产生的能力如附图1所示，表示为相对于未处理的对照物(100％)的百分比。
结果表明，受试化合物8，10，15，16，17和18号以剂量依赖性的方式抑制Nox2酶。
实施例4各种受试化合物的体外测定 用约100万个肿瘤细胞皮下注射于裸小鼠。当肿瘤变得可见时，用每日40mg/kg的姜黄素富烯治疗它们。用100微升的乙醇重新溶解该化合物，并用900微升的20％英脱利匹特稀释，每日腹膜内注射0.3ml的该混合物。用游标卡尺测量肿瘤，用式(宽度2x长度)0.52来计算肿瘤体积，其中宽度是最小的边，2代表平方，1代表长度。
结果如下表1和附图2所示。
表1用姜黄富烯治疗 实施例5NADPH氧化酶抑制剂富烯-5在小白鼠(albino mice)中减小光诱导的视网膜功能受损。
将小白鼠暴露于光亮下导致视网膜的功能受损，这种结果部分是由活性氧簇(ROS)导致的损伤介导的。通过各种应激物激活NADPH氧化酶增加了ROS的产生。这些实验的目的是测定光诱导的视网膜功能受损是否是由NADPH氧化酶活性介导的。
方法 将Balb-C小鼠暴露于暗(20lux)或亮(10,000lux)的白光下6小时。小鼠注射溶解于载体(英脱利匹特-DMSO)的富烯-5或仅注射载体，富烯-5是一种抑制NADPH氧化酶的三苯基甲烷。每日进行腹膜内注射，共2周。在暴露于光后0，7，和14天取视网膜电流图(ERGs)。
结果 与暴露于亮光但用富烯-5治疗的小鼠相比或者于暴露于暗光的小鼠相比，注射载体并暴露于亮光的小鼠显示了ERGa-波和b-波的振幅显著减小。结果如附图3所示。
结论 如ERG所测定，用NADPH氧化酶抑制剂富烯-5治疗消除了亮光暴露对视网膜功能的损害效果。可能是，亮光暴露导致NADPH氧化酶激活，使得ROS产生增加，从而使视网膜细胞受损。现在分析视网膜形态学、细胞凋亡、NADPH氧化酶的酶活性、氧化还原情况和ROS含量。
小鼠暴露于暗光(对照)或导致视网膜变性的一定强度的亮光下(光诱导的视网膜变性；LIRD)。这是一种经典的啮齿动物视网膜变性的模型。在各种光照条件下，一半的动物注射载体，另一半注射富烯5。在暴露1周后测定所治疗小鼠的视网膜电流图(ERGs)。ERG是对一束光应答的穿过眼球的电势改变的一个测定值，用作视网膜功能的指示。
数据表明，在一周时，亮光暴露诱导约50％的ERG b-波振幅被抑制。但是，每日用富烯5注射的大鼠显示出ERG振幅没有被抑制，提示在一周时富烯5防止了视觉功能受损。该数据概述于附图3。
实施例6代表性的富烯和过氧化物歧化酶的ESR谱 Li使用ESR来证明通过分离的内含体，NADPH依赖性地O2的产生(Li等人，Molecular and Cellular Biology，January 2006，p.140-154，26(1)140-154(2006))。ESR分析是在室温下使用Brukermodel EMX ESR分光计(Bruker)进行的。在包含50mM 5，5-二甲基-1-吡啶N-氧化物(DMPO)的总体积为500μl的PBS，pH 7.4中，用旋转陷阱混合各样品的泡状部分。该溶液包含亚胺二醋酸-螯合型树脂(10ml/L；Sigma-Aldrich)。通过加入NADPH至100μM来引发反应，并立即置于ESR分光计中。分析DMPO-羟基加成物的形成10分钟。设备设置如下接收器放大，1x106；调制频率，100kHz；微波功率，40.14mW；调节振幅，1.0G；和扫描速度，1G/s。
在立即应用时，富烯5和过氧化物歧化酶的ESR谱是在基本上如Li等人所述的条件下取得的。ESR谱(附图4)表明，富烯5显然通过与过氧化物反应形成了原子团，因此抑制了过氧化物歧化酶产生ROS的能力。
本发明并不限于本文所述的特定实施方案所限的范围。的确，除了它们所述的意外，根据前文的描述和所附的附图，本发明的各种改变对于本领域技术人员将变得显而易见。这些改变也意欲落入所附的权利要求的范围内。
本文应用了各种出版物，将其内容以整体通过参考引入本文。
权利要求
1.一种在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括给所述哺乳动物施用治疗有效的量的组合物，所述组合物包括含有富烯或富瓦烯的治疗剂，该治疗剂的量足以抑制治疗足够量的NOX或ROS表达，以至少部分抑制肿瘤的生长。
2.权利要求1的方法，其中哺乳动物是人。
3.权利要求1的方法，其中癌症选自血管瘤、黑素瘤、直肠癌、结肠癌、乳腺瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、结肠癌、慢性淋巴细胞癌、毛细胞白血病、食管癌、前列腺癌、乳腺癌、骨髓瘤和淋巴瘤。
4.权利要求1的方法，其中癌症是转移性癌症。
5.权利要求1的方法，其中在施用该组合物前出于进行抗癌治疗的原因，人是免疫抑制的。
6.权利要求1的方法，其中癌症表现为具有细胞的实体瘤的形式，该细胞表达的一种或多种NOX酶的浓度高于在非癌细胞中所表达的浓度。
7.权利要求6的方法，其中该肿瘤是上皮组织、淋巴组织、结缔组织、骨或中枢神经系统的肿瘤。
8.权利要求1的方法，其中该化合物是经胃肠外、口服施用的或直接施用到肿瘤中。
9.权利要求1的方法，其中该化合物是通过植入装置施用的。
10.权利要求1的方法，其中使用持续释放制剂进行施用。
11.权利要求1的方法，其中该化合物具有下式之一
其中
X是O、S、NH或CH2，
x和y是0到3的整数，
G选自C1-6烷基、烯基、杂环基、芳基、杂芳基、卤素、-OR′、-NR′R″、-CF3、-CN、-NO2、-C2R′、-SR′、-N3、-C(＝O)NR′R″、-NR′C(＝O)R″、-C(＝O)R′、-C(＝O)OR′、-OC(＝O)R′、-OC(＝O)NR′R″，-NR′C(＝O)OR″、-SO2R′、-SO2NR′R″和-NR′SO2R″，其中R′和R″分别是氢、C1-6烷基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基。
12.权利要求1的方法，其中该化合物具有下式之一
条件是至少一个R不是H。
13.权利要求1的方法，其中该化合物选自
14.一种治疗眼病的方法，包括给哺乳动物施用足以治疗眼病的量的含有富烯或富瓦烯的化合物。
15.权利要求14的方法，其中含有富烯或富瓦烯的化合物的量足以抑制治疗足够量的NADPH氧化酶。
16.权利要求14的方法，其中哺乳动物是人。
17.权利要求14的方法，其中眼病选自湿型或干型与年龄有关的黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病(DR)、青光眼、新生血管性青光眼、视网膜脉管炎、葡萄膜炎例如后色素层炎、结膜炎、青光眼引发的视网膜炎、巩膜外层炎、巩膜炎、视神经炎、球后视神经炎、白内障、眼科手术后的眼部炎症、由物理性眼损伤导致的眼部炎症、眼变应性和干眼。
18.权利要求14的方法，其中该化合物是以滴眼剂或其他适合直接施用于眼的局部用制剂的形式，通过局部给药施用的。
19.权利要求14的方法，其中该化合物是通过结膜下注射、眼周注射或玻璃体内注射施用的。
20.权利要求14的方法，其中该化合物是通过手术植入施用的。
21.权利要求14的方法，其中该化合物是通过系统性施用或通过离子电渗疗法施用的。
22.权利要求14的方法，其中使用持续释放制剂进行施用。
23.权利要求14的方法，其中该化合物具有下式之一
其中
X是O、S、NH或CH2，
x和y是0到3的整数，
G选自C1-6烷基、烯基、杂环基、芳基、杂芳基、卤素、-OR′、-NR′R″、-CF3、-CN、-NO2、-C2R′、-SR′、-N3、-C(＝O)NR′R″、-NR′C(＝O)R″、-C(＝O)R′、-C (＝O)OR′、-OC(＝O)R′、-OC(＝O)NR′R″，-NR′C(＝O)OR″、-SO2R′、-SO2NR′R″和-NR′SO2R″，其中R′和R″分别是氢、C1-6烷基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基。
24.权利要求14的方法，其该化合物具有下式之一
条件是至少一个R不是H。
25.权利要求14的方法，其中该化合物具有下式之一
26.下式之一的化合物
其中
X是O、S、NH或CH2，
x和y是0到3的整数，
G选自C1-6烷基、烯基、杂环基、芳基、杂芳基、卤素、-OR′、-NR′R″、-CF3、-CN、-NO2、-C2R′、-SR′、-N3、-C(＝O)NR′R″、-NR′C(＝O)R″、-C(＝O)R′、-C(＝O)OR′、-OC(＝O)R′、-OC(＝O)NR′R″，-NR′C(＝O)OR″、-SO2R′、-SO2NR′R″和-NR′SO2R″，其中R′和R″分别是氢、C1-6烷基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基。
27.下式任意的化合物
条件是至少一个R不是H。
28.一种化合物，选自
29.下式的化合物
其中R′选自H、C1-6直链、支链或环烷基、芳基、芳烷基或烷芳基。
全文摘要
公开了化合物，包含该化合物的药物组合物，其制备方法及应用。该化合物是富烯和/或富瓦烯类似物。该化合物和组合物可以用于治疗和/或预防广泛种类的癌症，包括耐药性癌症，以及很多炎性、变性和血管疾病，包括各种眼病。代表性的富烯和/或富瓦烯类似物包括各种染料、激素、糖、肽、寡核苷酸、氨基酸、核苷酸、核苷和多元醇的富烯和富瓦烯类似物。据信这些化合物至少是通过抑制Nox或ROS发挥功能。在一些实施方案中，Nox是在癌细胞而非正常细胞中选择性表达的物质，或者是在癌细胞中比在正常细胞中以更高的量表达的物质。因此，该化合物是各种癌症和其他疾病的新治疗剂。
文档编号A61K31/045GK101772344SQ200880020674
公开日2010年7月7日 申请日期2008年5月2日 优先权日2007年5月3日
发明者J·L·阿比瑟 申请人:埃默里大学, 由退伍军人事务部代表的美国政府