用于皮肤增强的芦荟制剂的制作方法

专利名称：用于皮肤增强的芦荟制剂的制作方法
用于皮肤增强的芦荟制剂 相关申请的交互参照 本申请要求于2007年5月11日提交的美国临时专利申请第60/928， 924号的优 先权，在此通过弓I用将其公开内容并入本文。

背景技术：
在一个方面，本发明涉及从库拉索芦荟(Aloe vera)植物或其部分制备、分离、提 取、以其为基础或从其衍生的生物活性组合物用于皮肤增强和用于疼痛减轻的用途。本发 明还涉及免疫剌激性组合物、稳定化的免疫剌激性组合物以及制备和使用所述组合物的方 法。 戸荟属(百合科)是具有肉质长叶的灌木热带/亚热带植物。在超过360种已知 的戸荟中，翠叶戸荟(Aloe barbadensis Miller)(库拉索戸荟)由于商业和其治疗性能而 使用最广泛。库拉索芦荟植物含有两种主要的汁液材料第一种，含有高浓度的蒽醌化合 物的黄色渗出液，其已经在数个世纪以来被用作泄药和用于药用清洗；第二种，透明的粘质 凝胶，其自古以来就被用于治疗烧伤和其他伤口 ，被认为可以提高愈合率并减少感染的风 险。参见Grindlay，D. Reynolds, T. ， J. Ethnopharmcol. 1986， 16 (2-3) ， 117-151 ;和Joshi， S. P. ， J. Med. Aromat. Plant Sci. 1998， 20 (3) ， 768-773。 数个世纪以来，芦荟植物被认为具有并已经使用了其药用和治疗性能，而对于这 些性能的基础没有任何明确的认识或科学分析。亚里斯多德(Aristotle)认识到，芦荟 的愈合性能对于战斗中受伤的士兵是无价的，并建议他的学生亚历山大三世(Alexander III(" the Great"))征服一切成长芦荟的土地，尤其是东部非洲海岸的索科特拉岛。 PedaniusDioscorides是罗马军队中的医生，在他的百科全书Greek herbal DeMateria Medica(大约75BC)中提到了药用芦荟。此外，已知新鲜芦荟植物的生物活性衰退的相当迅 速。 过去的几十年中，对于芦荟的活性组分的了解产生了高度兴趣，因为其在加强免 疫功能方面提供了有益效果。在这个领域中的研究主要侧重于多糖和诸如糖蛋白等其他含 有碳水化合物的物质。 根据美国专利第7， 196,072号(〃 '072专利〃 )、第5， 902， 796号、第4， 735， 935 号、第4， 851， 224号、第4， 917， 890号、第4， 957， 907号、第4， 959， 214号和第4， 966， 892号 的记载，芦荟叶的活性化学物质和混合物，包括例如多糖或其他含有碳水化合物的物质，已 经被鉴定、分离和稳定化。 —组活性化学物质被称为库拉索戸荟粘多糖(mucilaginouspolysaccharide)，其 由多糖的混合物构成。术语"多糖"广义上包括碳水化合物或单糖的低聚物和多聚物，并且 在本文中以类似方式使用。 一组这样的多糖已被命名为乙酰化甘露聚糖(acema皿an)。
根据文献记载，乙酰化甘露聚糖是可从Carrington Laboratories, Inc. (Irving, Tex.)得到的基本上乙酰化的甘露糖单体的有序线性聚合物，并在实验室研究中显示出，在 48小时内将组织培养中的成纤维细胞复制增多至300%，已知成纤维细胞负责治愈烧伤、 溃疡和皮肤及胃肠道内衬(gastrointestinal lining)的其他伤口。
在三年时间内，对实验室大鼠进行了测试，它的胃的反应类似于人类的。乙酰化甘 露聚糖被发现相当于或优于目前用于胃溃疡治疗的药物。大多数这类产品起抑制胃中盐酸 的作用。乙酰化甘露聚糖以不同原理起作用，并显然没有改变消化酸的自然流动。参见美 国专利第5， 902， 796号，第2栏，第20-25行。 乙酰化甘露聚糖已被证实是通过在培养物中的人外周血贴壁细胞产生IL-I和 前列腺素E2(PGE2)的诱导剂。IL-I是一种文献报道的重要的巨噬细胞产物，影响淋巴细 胞、成纤维细胞、B淋巴细胞和内皮细胞的活性和产生。参见01d， Scientific American, 258(5) :59-60,69-75(1988)。 IL-1诱导对于伤口愈合至关重要的成纤维细胞增殖。IL-1还(1)增强骨髓的活
性；它在骨髓降低的个体中可以是治疗性的；和(2)通常增强免疫系统。 根据文献记载，使用混合的淋巴细胞培养物(MLC)的一系列实验表明，乙酰化甘
露聚糖以剂量相关方式提高了这些淋巴细胞的同种抗原反应。单核细胞与乙酰化甘露聚糖
的孵育允许单核细胞驱动的信号增强T淋巴细胞对凝集素的反应。乙酰化甘露聚糖对MLC
影响的相关研究表明，吞噬作用和自然杀伤细胞的活性增加。在这些体外测试系统中，乙酰
化甘露聚糖被认为是无毒性的并且是免疫增强剂。 据称，乙酰化甘露聚糖剌激淋巴细胞分泌淋巴因子，并导致HIV-感染的淋巴细胞
通过类似于糖苷酶I抑制剂的机制产生改变的糖蛋白(GP-120)。参见Gruters等人，Nature
330 :74-77(1987)和Pal等人，Intervirol. 30 :27-35(1989)。乙酰化甘露聚糖被吞噬，并
显然被泵至单核细胞的高尔基/糖蛋白器，在那里直接干扰糖蛋白的合成。 芦荟产品的其他用途已被记载在例如美国专利第5， 106， 616号、第5， 118， 673号、
第5， 308， 838号、第5， 441， 943号和第5， 443， 830号中。所描述的研究主要偏重于库拉索戸
荟的生物活性化学物质作为抗病毒药物、抗肿瘤药物、免疫增强剂、免疫调节剂、疫苗佐剂、
减少机会性感染的手段、控制炎症的手段、剌激免疫系统和伤口愈合过程的手段的活性。 在专利文献中和他处，已经公开了基于从库拉索芦荟分离的含多糖部分的许多其
他产品。例如，据报道分子量为275， 000 374， 000道尔顿的聚糖醛酸酯可用于治疗表面
伤口 (参见Farkas，A.，美国专利第3， 103,466号(1963))。 另据报道，70kD的多糖Aloeferon也具有治疗潜力(参见Madis， V. H. ;Omar， M. M. ;Madis， V.，美国专利第4， 861， 761号(1989))。 从芦荟分离的其他活性组分包括由等量葡萄糖和甘露糖构成的420，000 520，000道尔顿的多糖(参见Farkas， A.，美国专利第3， 362， 951号(1968))。
此外，几个研究组已经用酶法从芦荟中天然存在的碳水化合物制备了改变的多糖 组合物(参见Strickland, F. M. ;Pelley， R. P. ;Kripke， M. L.，美国专利第5， 824， 659号 (1998))。 库拉索芦荟多糖在受控研究中也显示出提高动物愈合率。库拉索芦荟多糖在动物 研究中也被证明可有效地治疗胃溃疡。 库拉索芦荟凝胶的抗炎活性已通过口头陈述和有关的科学杂志而被报道。 Rubel [Cosmetics and Toiletries, 98 :109-114 (1983)]讨论了戸荟凝胶的抗炎作用的可 能机制。Ukai等人，[Journal ofPharmacobio-Dynamics， 6 (12) :983-990(1983)]指出了从 若干真菌的子实体提取的多糖的抗炎活性。据称，这种多糖对角叉菜胶诱导的水肿表现出显著的抑制作用。 一种聚合物，0-乙酰化-D-甘露聚糖(T-2-HN)对于烫伤痛觉过敏也表 现出比苯基丁氮酮更加显著的抑制作用。Ukai等人，同上。这篇文章中的观点(即多糖据 说没有蛋白和脂质)表明，抗炎作用仅是由于乙酰化的甘露聚糖造成的。
其他研究人员也报道了复合多糖[Saeki等人，Japanese Journal ofPharmacology，24(1) :109-118 (1974)]、糖蛋白[Arita等人，Journal ofBiochemistry， 76(4) :861-869(1974)]和硫酸化的多糖[Rocha等人，Biochemical Pharmacology, 18 : 1285-1295(1969)]的抗炎作用。 因此，可能的是，库拉索芦荟植物组分粘质凝胶(其基本上是多糖)和其中的组 分对库拉索芦荟的药用性能负部分责任。据说一系列化学纯化步骤解决了关于该多糖 是否是葡甘露聚糖、甘露聚糖、果胶或者具有其他一些组成的争议。Yagi等人，[Planta Medica，31 (1) : 17-20 (1977)]，使用略加修改的提取方法；从木立戸荟(Aloe arborescens Millervar. natalensis)分离出乙酰化的甘露聚糖(戸荟甘露聚糖)。然而，Ovodova[Khim， Prior, Soedin， 11 (1) :325-331 (1975)]，更早地分离出作为同一芦荟种的主要组分的果胶。
近来已经对库拉索芦荟凝胶进行了许多其他的药理学研究。结果包括更快速愈 合辐射烧伤[Rowe， J. Am. Pharm. Assoc. ，29 :348-350(1940)]和加速伤口愈合[Lushbaugh 等人，Cancer,6 :690-698(1953)]。用库拉索戸荟凝胶处理热烧伤愈合地比未经处理的 烧伤快得多[Ashley等人，Plast. Reconstr. Surg. ，20 :383-396(1957)， Rovatto，同上， Rodriguez-Bigas等人，J. Plast. Reconstr. Surg. ，81 :386-389 (1988)]。这种凝胶可用于 治疗腿部溃疡[El Zawahry等人，Int. J. Dermatol. ， 12 :68-73(1973)]和加速手术后愈合 (Payne，提交到贝勒大学学系(Waco， Tex.)的论文，硕士学位)。实验证据表明，库拉索芦 荟提取物具有抗感染特性[Solar，Arch. Inst. Pasteur Madagascar, 47 :9-39(1979)]和加 强吞噬作用[St印anova， Fiziol. Akt. Veshchestva， 9 :94-97 (1977)]。
在芦荟产品的商业加工和质量控制过程中，微生物分析被认为是一个重要的问题 (Waller TA等人，In Aloes :The genus Aloe ;ReynoldsT， Ed. ;CRC Press :NY，2004 ;第8 章，pp 139-205)。微生物可以源自诸如环境等外部来源和芦荟植物本身的内部。内源性菌 群是芦荟内自然存在的微生物，在独特的环境中进化生长良好。对内源性细菌的主要兴趣 在于控制其由于收获后的不恰当处理方法(例如缺少巴氏杀菌或不正确的巴氏杀菌)导致 的潜在过度生长。此外，已经强调指出，芦荟产品中的高细菌负荷很可能会导致生物活性的 损失。这已被如下观察所报道，即高细菌含量(> 100，000生物体/克凝胶)与芦荟保护皮 肤免疫系统免于紫外线诱导抑制的能力的损失相关(Waller TA等人，InAloes :The genus Aloe ;Reynolds T， Ed. ;CRC Press :NY， 2004 ;第8章，pp 139-205)。 本领域中的参考文献记载了芦荟中有关内毒素(也称为脂多糖)污染的细菌 组分，其在评价声称的活性物质(如乙酰化甘露聚糖多糖)的生物活性时作为混杂因素 (Confounding factor)。例如，Tizard(Tizard IR禾口 Ramamoorthy L. In Aloes :The genus Aloe ;Reynolds T，Ed. ;CRCPress :NY，2004 ;第13章，pp 311-332)强调了这一点"难于生 产无污染内毒素的芦荟碳水化合物溶液。对这种材料的早期研究中含有少但显著量的细菌 内毒素，并且有可能的是，归因于乙酰化甘露聚糖的一些生物活性可能是内毒素作用"。因 此，芦荟制剂中的细菌产物被认为是污染物。 美国专利第5， 902， 796号描述了从库拉索芦荟获得不同因子的多种方法和分离过程。所描述的一种因子被称为"微颗粒因子(microparticulate factor)"，可通过使从 芦荟溶液的低速离心(180g)得到的上清液在20，000g下离心，作为沉淀获得。也描述了使 用过滤获得这种因子的方法。这种微颗粒因子是巨噬细胞的活化剂。该微颗粒因子的大小 估计约为1 P m。 微粒(microparticles)的表征记载在后面的论文中(Ni Y等人，International Immunopharmacology，2004，4 :1745-1755)。据报告，微粒含有富半乳糖的多糖，组成如下 40. 2%的半乳糖，32. 2%的甘露糖，20. 6%的葡萄糖和其他次要糖。该论文将微粒鉴定为叶 肉细胞的退化的细胞器，并总结如下"在通过均质化破坏浆肉之后，通过连续离心分离出 三种组分。它们是薄的透明片、微粒和粘性液体凝胶，基于形态和化学分析，它们对应于叶 肉细胞的细胞壁、退化的细胞器和液体内含物"。显然，这些微粒不被认为是细菌，而是具有 明确的碳水化合物组成，并且是植物结构组分(即，叶肉细胞的退化的细胞器)。
革兰氏阳性微球菌细菌种类是最常见的芦荟相关生物体。这些细菌在芦荟植物 内进化生长良好，而在其他环境中没有很好地生长(Waller TA等人，In Aloes :The genus Aloe ;Reynolds T， Ed. ;CRC Press :NY， 2004 ;第8章，pp 139-205)。 最近的研究表明，食入含有某些革兰氏阳性细菌的食物会对免疫系统产生有益 影响。对于酸奶和类似食物中发现的益生乳酸菌乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌 (Bifidobacterium)菌株的摄入进行了最广泛的研究(参见，Nutr Rev. ，2006,64:1-14)。 这些免疫增强作用中的许多并不需要存活的细菌细胞，因为可以通过食入热灭活生物体模 仿所述作用。 常常与变老有关的问题包括皮肤弹性损失以及肌肉或关节疼痛。这些症状可能是 也可能不是相关的，尽管在了解衰老过程中正迈出重大多步，但很多仍是未知的。皮肤弹性 治疗在本质上往往只有化妆品。通过用化妆品覆盖皮肤，在某些情况下可以获得更年轻的 外观。有些产品实际上使松弛的皮肤胶粘在一起，从而显得更紧。还有手术方法，在通常被 称为"拉皮(face-lifts)"的过程中可以包括去除多余的皮肤和/或收紧皮肤。然而，如果 皮肤弹性可以通过使用摄入或局部施用的且实际上直接影响皮肤弹性的制剂而加以改善， 那么手术可以推迟或完全避免，需要的化妆品可能更少。 类似地，关节疼痛也有许多可能的病因，包括关节炎，并且有许多策略来治疗它 们。这些策略包括局部产品(topical products)、药物制剂和甚至关节置换手术。但是，对 于关节疼痛或皮肤弹性，仍然需要改进治疗方法。如果活性成分是纯天然的产品可用于提 供主要减轻，或可与其他策略相结合，则这种结果将是高度期望的。

发明内容
在一个方面中，本发明涉及衍生于库拉索芦荟的表现出至少一定量免疫剌激活性 的材料("IAvD")。如通过在浓度约250ii g/mL以下，THP-1单核细胞中NF-k B指导的 荧光素酶表达测量的有资格作为IAvD所需的免疫剌激活性程度为，由浓度约10 g/mL的 细菌脂多糖实现的最大NF-k B指导的荧光素酶表达的至少约50%。这种测量的标准是从 Sigma Chemical Co.获得的细菌的粗脂多糖"ELPS"(大肠杆菌，血清型026 :B6)。
本发明的另一方面是组合物，其包括脂蛋白和脂多糖和任选地至少一种多糖的混 合物，所有这些都可以从库拉索芦荟分离，尽管所述混合物可以合成产生。该混合物在本文称为"PLL"。 IAvD和PLL混合物可以含有任意组合的两种或更多种材料。这些混合物可以与药物载体或赋形剂共混。 在优选的实施方案中，免疫剌激性组合物包括以下中至少任意两种的混合物(1)衍生于芦荟的多糖，(2)衍生于芦荟的脂蛋白，和(3)衍生于芦荟的脂多糖，所述混合物表现为由浓度约10 y g/mL的细菌脂多糖实现的最大NF- k B指导的荧光素酶表达的至少约50%的免疫剌激活性，其中该免疫剌激活性通过在浓度约250 ii g/mL以下，THP-1单核细胞中NF-KB指导的荧光素酶表达而测量。 所述混合物可以包括衍生于芦荟的多糖、衍生于芦荟的脂蛋白和衍生于芦荟的脂多糖。 在优选的实施方案中，PLL是特定的混合物，本文称作〃 AloeEx〃 ，包括1) '072专利中公开的衍生于库拉索芦荟的多糖，特此通过引用将其公开内容并入，2)衍生于芦荟的脂蛋白〃 ALP〃 ，和3)衍生于芦荟的脂多糖〃 ALPS"。优选地，这种混合物包括足够的免疫剌激活性，从而有资格作为本文所述的IAvD。 优选地，PLL包括约0. 01% 约50%重量比的Aloeride多糖和约0. 0001 % 约10%重量比的ALP和ALPS(ALP和ALPS的总组合量)。在其他实施方案中，Aloeride多糖为约1%至约15%重量比，ALP和ALPS为约O. 0001% 约10%重量比。在另一个实施方案中，Aloeride多糖为IAvD的约10_15%重量比，ALP和ALPS为IAvD的约0. 0001% 约10%重量比。 据认为，这些ALP和ALPS实际上来自与库拉索芦荟相关的微生物。还认为，ALP和ALPS具有独立的免疫剌激性能。除了或者代替衍生于芦荟的免疫剌激性多糖(其包括例如'072专利的那些)，还可以使用这些，以在治疗或预防本领域此前所述的与在先芦荟衍生物相关的任何状态及其它中提供多种益处，所述状态如治疗烧伤和伤口 、治疗皮肤和胃肠道溃疡、增强骨髓抑制个体中的骨髓活性、整体上增强免疫系统、作为抗病毒药物、抗肿瘤药物、免疫剌激剂、免疫调节剂、疫苗佐剂、减少感染的手段、控制炎症的手段、剌激伤口愈合过程的手段、提高愈合率的手段、抑制烫伤痛觉过敏、辐射烧伤和热烧伤的快速愈合、治疗腿部溃疡、加速术后愈合、抗感染应用、增强吞噬作用、治疗免疫缺陷病症、癌症、传染病或其他疾病和状态、改善症状、降低肌肉和关节疼痛、改善代谢过程、改善皮肤的外观、肌理、硬度和/或弹性、以及作为膳食补充剂或营养助剂。 在本发明的另一个方面中，免疫剌激性组合物包括衍生于芦荟的脂蛋白。所述衍生于芦荟的脂蛋白表现出由浓度约10i! g/mL的细菌脂多糖实现的最大NF-k B指导的荧光素酶表达的至少约50%的免疫剌激活性，其中该免疫剌激活性通过在浓度约250ii g/mL以下，THP-1单核细胞中NF-k B指导的荧光素酶表达而测量。 在本发明的另一个方面中，所述组合物是包括一种或多种IAvD的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物是包括一种或多种PLL以及与PLL组合的药物载体或赋形剂的药物组合物。在优选的实施方案中，PLL是AloeEx。这些药物组合物可用于与PLL相关的以上所述的任何目的。 根据本发明可以使用的某些IAvDs可能难以操作和配制。在分散或溶解特定的IAvD并产生其均质混合物方面可能会有问题。当配制剂型时，这特别地可以成为问题。非均质混合物存在使剂型至剂型并因而剂量至剂量的剂量变化处于不可接受水平的风险。因此，非常希望找到合适的加工助齐U、溶剂或赋形剂，所述加工助齐U、溶剂或赋形剂与IAvD相容，并且对IAvD的免疫剌激性能或稳定性不会产生不利影响，并且更优选不会不必要地稀释活性，从而需要更大量的较昂贵的材料。 根据本发明的另一个方面，各种"第二"材料可以与PLL或IAvD —起使用。已经发现，与"第二"材料的组合可以允许制备PLL或IAvD的均质分散液、乳液、悬浮液或溶液等。这些"第二"材料可以是也可以不是衍生于芦荟的材料，并且的确可以是也可以不是IAvD，例如，它们可以不具备有资格作为本文定义的IAvD的足够的免疫剌激性。
然而，在一个优选的实施方案中，这些第二材料衍生于库拉索芦荟。特别地，已经发现，可以使用第二衍生于芦荟的材料而分散、悬浮、乳化和/或溶解某些高度活性的第一IAvD，在一些优选实施方案中，所述第二衍生于芦荟的材料是第二 IAvD，例如，符合本文所述的对IAvD的活性要求的衍生于芦荟的材料。 在其他优选实施方案中，第二材料是衍生于芦荟的材料，其如果具有任何的免疫剌激活性 ，则表现出低于IAvD水平的活性。所述第二、非IAvD的衍生于芦荟的材料通常具有显著的多糖含量，其中约50%以上的多糖的分子量约1，500，000道尔顿以下。例如，250 ii g/ml的MagnAloe AG表现出小于25%的活化。 此外，所述第二材料也应该改善或增强第一 IAvD的加工性。第二衍生于芦荟的材料(不论是第二 IAvD或第二非IAvD)的用量应该是足以允许制备所需要的第一 IAvD的均质分散液、溶液、悬浮液或乳液的量。通常，相对于第一 IAvD和第二衍生于芦荟的材料的重量百分比，需要至少约10%的该第二衍生于芦荟的材料。 在根据本发明的优选实施方案中，第一材料是PLL，第二材料是非IAvD、具有上述多糖含量(通常至少50%小于1， 500， 000道尔顿)并允许形成稳定的均质分散液、溶液、悬浮液或乳液的衍生于芦荟的材料。在特别优选的实施方案中，PLL是AloeEx，第二材料是MagnAloeAG。还涉及制备这些制剂的方法。 在本发明的再一个方面中，提供治疗肌肉或关节疼痛、用于改善皮肤的外观、肌理、硬度和/或弹性和/或用于提供新皮肤细胞的加速生长的方法，包括给予有此需要的个体治疗剂量的IAvD或PLL组合物。组合物可以口服、局部或透皮给予，每天一次或数次，可以单独给予、与药学上可接受的载体或赋形剂一起给予和/或与其他活性或非活性成分一起给予。 在这方面的一个实施方案中，IAvD是PLL。
在一个特定的实施方案中，PLL是AloeEx。 在另一个实施方案中，IAvD组合物包括衍生于芦荟的多糖或多糖的混合物，例如但不限于'072专利中记载的衍生于芦荟的多糖。 本发明的另一个方面是制备IAvD的方法，包括提供库拉索芦荟来源材料；从库拉索芦荟来源材料提取液体芦荟溶液；过滤液体芦荟溶液；加入絮凝剂，从而产生含有微生物或微生物组分/碎片的聚集体；和收集聚集体。 在另一个实施方案中，可以处理收集的聚集体，以除去可能存在的蒽醌类。
在一个实施方案中，库拉索芦荟来源材料选自库拉索芦荟凝胶、全叶库拉索芦荟、库拉索芦荟外皮、库拉索芦荟粘液和库拉索芦荟幼体(pup)。库拉索芦荟幼体是小的库拉索芦荟植物，常被认为是废品。
在优选的实施方案中，库拉索芦荟来源材料包括库拉索芦荟外皮和库拉索芦荟粘液。可以使用其他芦荟基材料，如常被认为是废弃材料的来自其他过程的用过的芦荟材料。
在本发明的另一个方面中，制备化学标准化的衍生于库拉索芦荟的材料的方法包括提供衍生于库拉索芦荟的材料；测定衍生于库拉索芦荟的材料中的2， 3_ 二羟基丙基半胱氨酸的含量；和将衍生于库拉索芦荟的材料中的2，3-二羟基丙基半胱氨酸的量与标准制剂中的2，3-二羟基丙基半胱氨酸的量作比较，从而确定衍生于库拉索芦荟的材料的标准化值。 在一个实施方案中，所述方法还包括在测定衍生于库拉索芦荟的材料中的2，3_ 二羟基丙基半胱氨酸的含量之前，纯化衍生于库拉索芦荟的材料. 在本发明的再一个方面中，制备生物标准化的衍生于库拉索芦荟的材料的方法包括提供衍生于库拉索芦荟的材料；测定衍生于库拉索芦荟的材料的免疫细胞的活化水平；和将衍生于库拉索芦荟的材料的活性水平与标准免疫剌激性值作比较，从而确定衍生于库拉索芦荟的材料的标准化活性值。 在一个实施方案中，所述方法还包括在测定衍生于库拉索芦荟的材料的免疫细胞的活化水平之前，纯化衍生于库拉索芦荟的材料。 在本发明的另一个方面中，增强免疫功能的方法包括给予有此需要的个体治疗剂量的至少一种IAvD。


图1示出占总碳水化合物摩尔％的AloeEx批号56 (ALOE 056)的糖基残基组成。
图2示出按秒计的平均皮肤反弹时间的统计显著降低(皮肤弹性或硬度提高的指标)。 图3示出按性别和年龄的皮肤弹性研究的人口统计学。
图4示出研究小组成员的人口统计学。
图5示出测量随机化参数。
图6示出治疗/组随机化。 图7A-图7D示出对于试验材料组和安慰剂组的弹性测量仪(Cutometer)测量的统计分析。 图8A-图8B示出分配到积极治疗的测试受试者的问巻调查结果。 图9A-图9B示出分配到安慰剂治疗的测试受试者的问巻调查结果。 图10A-图10B示出TLR2参与AloeEx的NF_ k B活化。 图11示出THP-1细胞对AloeEx (批号056)和AloeEx粗部分的反应。 图12示出AloeEx苯酚层部分的4% SDS提取物的蛋白酶K消化和SDS聚丙烯酰
胺凝胶分析。 图13示出AloeEx苯酚层部分的4% SDS提取物的脂蛋白脂肪酶消化。
图14示出THP-1细胞对不同的库拉索戸荟叶部分的反应。
具体实施例方式
虽然本说明书以特别指出和明确要求保护本发明的权利要求书作为结束，但是据认为，从下面的说明可更好地理解本发明。 除非另有指定，本文所用的所有百分比和比率均按总组成的重量计，并且所有测
量均在25t:和常压下进行。 除非另有指明，所有温度均为摄氏度。 本发明可以包括(开放式)本发明的组分以及本文所述的其他成分或要素，或者基本上由它们构成。本文所用的"包括"指引述的要素，或其结构或功能的等同物，加上未引述的任何其他的一个或多个要素。术语"具有"和"包括"也应解释为开放式的，除非上下文另有提示。本文所用的"基本上由...构成"是指，本发明可以包括除了权利要求所引述之外的成分，但只有当另外的成分没有实质上改变所要求保护的发明的基本和新颖特征时。优选地，这些添加剂根本不存在或仅存在微量。然而，可以包括重量高达约10%重量比的可能会实质上改变发明的基本和新颖特征的材料，只要组合物的实用性(而不是效用度)得以保持。 本文引述的全部范围均包括端点，包括引述在两个值之间的范围的那些。诸如"大约"、"通常"和"基本上"等都被解释为修饰术语或值，使得它们不是绝对的，但是不包括现有技术。这类术语应根据它们所修饰的情况和术语限定，而那些术语是本领域技术人员可以理解的。最低限度，这包括对于用来测量一个值的给定技术而言，预期的实验误差、技术误差和仪器误差的程度。 应指出，虽然本说明书和权利要求书可以指本发明的例如含有颗粒(具有一定的粒径或分布)或某种类型的例如填料的片剂或其他剂型，但是可能很难分辨满足引述的最终剂型。然而，例如，如果使用的材料在最终混合和配制之前满足这一引述，则可以满足这样的引述。 在另一个实例中，虽然可能很难知道在最终剂型中实际存在的包衣对包被颗粒贡献的重量增加或其粒径分布，但是如果确定，用来制备剂型的包被颗粒在例如最终混合和压縮步骤之前(在片剂情况下)的确表现出所需的包衣水平和/或粒径，则是充分的。
实际上，可能很难建立特定组分在特定制剂中的含量，或者特定组分在最终制剂中的活性。如果这可以基于起始或中间材料建立，则是充分的。实际上，对于任何无法从最终产品直接确定的性能，如果这种性能刚好在最终制备之前的制剂中存在，则是充分的。可以理解的是，足以如本文所述定义IAvD的免疫剌激活性可以在配制之前或之后的任何时间建立。 本文所用的治疗和/或改善，当用于关节疼痛或皮肤弹性或者本文所述的确实其他状态时，指关节或肌肉疼痛的任何减轻(无论长期或者临时的，持久或短暂的)，或皮肤弹性的任何增加，这些都可以归因于PLL和/或IAvD组合物的给予或与PLL和/或IAvD组合物的给予有关。治疗和改善还包括本文所述产品在防止状态或其复发中的应用。还要注意改善和治疗可以互换使用，除非文本或上下文另有所指。 特别地，为在本文中有资格作为IAvD，材料必须对组合物的免疫剌激性能作出实质贡献。本文中所使用的短语，对组合物的免疫剌激性能"作出实质贡献"指本文所述的免疫剌激作用。 本文所用的术语免疫剌激性、免疫剌激作用或免疫剌激性能和/或活性指根据本发明的IAvD引起巨噬细胞活化的能力，特别是如前所述的、由THP-1单核细胞中NF-kB指导的荧光素酶表达的表达增加所指示的免疫剌激活性(相当于在浓度250 g/mL以下，10 g/mL的ELPS的约50% )。这可基于任何单独的衍生于戸荟的组分或其集合物或其混合物来测量。因此，活性可以例如反映衍生于芦荟的多糖或其与ALP和/或ALPS组合的活性。测量这种类型的巨噬细胞活化的方法公开在'072专利，第5栏第12行至第6栏第22行中，通过引用并入本文。 通常，巨噬细胞活化可以在THP-1人单核细胞中使用荧光素酶报告基因检测进行测量。这种检测测量通过NF- k B驱动的荧光素酶报告基因的表达增加所指示的免疫剌激活性。在37"、5% 0)2和95%空气下，在用胎牛血清(10% v/v)和丁胺卡那霉素(60mg/L)补充的RPMI1640-培养基中培养THP-1细胞。使用DEAE-葡聚糖(10 y g/1 X 106细胞)和含有NF-kB的两个结合位点的pBIIXLUC报告基因质粒(IP g/lXl()6细胞)瞬时转染积极生长的细胞。将含有THP-l细胞的转染溶液在37t:水浴中温育7分钟。然后，将转染的细胞重悬浮在10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，并以2 X 105细胞/孔的细胞密度铺在96孔板中。24小时后，将测试样品加到转染的细胞中。加入样品4小时后，收获细胞，并测量荧光素酶活性。使用Packard过滤板收获细胞，并使用30 iiL的荧光素酶混合物(1 : 1，LucLiteTM荧光素酶lXPBS，lmM Ca和Mg)使其裂解。使用单光子模式的Packard微孔板闪烁计数器测量荧光素酶光发射。活化报道为相对于10yg/mL ELPS(作为阳性对照)造成的NF-k B的最大活化的百分比。其他检测方法也包括在本发明中。
本文所用的术语非免疫剌激性的衍生于库拉索芦荟的材料和表明这种概念的其他词语定义作没有满足本文定义的IAvD的免疫剌激性要求的衍生于库拉索芦荟的材料。
术语衍生于芦荟的脂蛋白或〃 ALP〃指库拉索芦荟内源细菌的细菌脂蛋白。这并不意味着，细菌必须来自库拉索芦荟，因为细菌也可以单独培养或培育。革兰氏阳性微球菌的细菌种类是最常见的芦荟相关生物体。这些细菌在芦荟植物内进化生长良好，而在其他环境中没有很好地生长(Waller TA等人，In Aloes :The genus Aloe ;Reynolds T，Ed. ;CRCPress :NY， 2004 ;第8章，pp 139-205)。革兰氏阳性细菌含有脂蛋白，但没有脂多糖。如本文所公开的，脂蛋白被认为是革兰氏阳性细菌对体外巨噬细胞活化的重大贡献者。由于革兰氏阳性菌是芦荟中细菌的最常见类型，因而脂蛋白代表了衍生于芦荟的重要积极分子。
最近的研究表明，食入含有某些革兰氏阳性细菌的食物会对免疫系统产生有益影响。对于酸奶和类似食物中发现的益生乳酸菌乳酸杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifido bacterium)菌株的摄入进行了最广泛的研究(参见，Ezendam和van Loveren，Nutr Rev. ，2006,64 :1_14)。这些免疫增强作用中的许多并不需要存活的细菌细胞，因为可以通过食入热灭活生物体模仿所述作用。 本文所用的术语衍生于库拉索芦荟的脂多糖和ALPS指包括通过共价键连接的脂质和多糖(碳水化合物)的大分子。ALPS是库拉索芦荟中发现的或与其有关的革兰氏阴性细菌外膜的主要组分，其对细菌的结构完整性作出了重大贡献，并保护膜免受某种化学攻击。ALPS是内毒素，诱导正常动物免疫系统的强烈反应。 LPS通常起原型内毒素的作用，因为它结合CDl 4/TLR4/MD2受体复合体，所述CD14/TLR4/MD2受体复合体促进许多细胞类型中但尤其是在巨噬细胞中的促炎性细胞因子分泌。免疫学中的"LPS攻击(challenge)"是使受试者暴露于可能起毒素作用的LPS。 LPS也增加了细胞膜的负电荷，并有助于稳定整体膜结构。LPS还是外源热源(外部发热诱导组合物)。ALP不同于ALPS(其也是本发明的PLL的所需组分)，因为它们的免疫剌激活动被认为是通过Toll样受体2介导的，而ALPS被认为是通过Toll样受体4介导的。
—些IAvD组合物没有对组合物的免疫剌激性能起实质性贡献的ALP或ALPS存在。然而，其他IAvD组合物不包括多糖，但非对组合物的免疫剌激性能起实质性贡献的ALPS。还有一些IAvD组合物仅具有对组合物的免疫剌激性能起实质性贡献的ALP。
优选地，有多糖、ALP和/或ALPS中的两种或更多种，它们中的任一种或所有单独或协同地对IAvD组合物的免疫剌激活性起实质性贡献。 —些IAvD组合物包括具有免疫剌激活性的衍生于微生物(如在库拉索芦荟中发现的或与其有关的某些细菌、酵母菌、真菌、霉菌等)的ALP和/或ALPS。这些ALP和ALPS也可以从已经培养的微生物回收，只要该属和种可在库拉索芦荟中发现或与其有关。可在库拉索芦荟植物上或其内发现的这些ALP和ALPS可被浓縮或合成，可以与多糖一起使用或代替多糖使用，以在关节和肌肉疼痛等的治疗中，和增强皮肤的外观、肌理、硬度和/或弹性中提供多种益处。含有衍生于芦荟的多糖(如在'072专利中记载的)以及ALP和APLS的PLL的这些用途也包括在本发明中。 本文所用的术语衍生于芦荟的材料，指库拉索芦荟中包含的或其上存在的任何材料，包括但不限于衍生于芦荟的多糖、脂蛋白和脂多糖。所述材料可以从芦荟植物分离出来和/或被合成。 本文所用的术语合成的或被合成，指人造和/或制造的并具有与天然存在的那些材料相同或类似组成的材料。在ALP和ALPS的情况下，也指单独培养的。
本文所用的术语〃 AloeEx〃指从库拉索芦荟提取的或合成产生的免疫剌激性PLL混合物，包括'072专利的多糖以及ALP和ALPS。诸如AloeEx的PLL可以从库拉索戸荟叶的外皮和/或粘液(即，内部凝胶和外部外皮之间的区域)中分离出来，并可以从芦荟废弃材料(即，在其他过程中使用并在目前工业标准中被认为是废品的用过的外皮)获得。
通常，根据本文所述技术测量的AloeEx的免疫剌激活性为5 y g/mL。这意味着浓度约5 ii g/mL的AloeEx，使THP-1单核细胞中NF- k B指导的荧光素酶表达增加至通过使用浓度10 y g/mL的ELPS实现的表达的50%以上的水平。当然，在这种活性水平内可以发生批间变化。 本文所用的术语Aloeride(与下面讨论的商标八乙0￡1110￡@相区分)指从库拉索芦荟分离的或合成产生的免疫剌激性多糖组合物，其中多糖的表观分子量大于约200万道尔顿，并包括'072专利中报道的葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。特别地，Aloeride多糖组合物可以包括约25 % 约70 %的葡萄糖、约0. 5 %至35 %的鼠李糖、约5 % 约30%的半乳糖、约3% 约25%的甘露糖和约0% 约15%的阿拉伯糖(按摩尔百分比)。在'072专利中，Aloeride多糖也称作NP18298。为本发明目的，Aloeride和NP 18298指同一组合物。 本文所用的术语MagnAloe AG指具有http:〃www. f irstaloevera. com/magnAloeinformation, htm中记载的分子量分布的衍生于芦荟的多糖的粉末状混合物。为本文所述IAvD或非IAvD的目的，涉及包含高分子量衍生于芦荟的多糖材料的任何混合物。
产生'072专利的初步发现表明，以前已知的芦荟组分不能解释在粗芦荟汁液和凝胶中的可检测水平的免疫剌激。市售芦荟制剂(200 g/mL)在巨噬细胞检测中仅造成微不足道的NF-k B活化。解释这种活性的Aloeride "NP18298"被发现包括含有多糖的部分，其中存在的多糖的表观分子量超过200万道尔顿。其中报道的它的主要糖基组分包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。根据'072专利中使用和报道的纯化程度和方法，据认为Aloeride不包括实质水平的ALP和/或ALPS。 在研究含有Aloeride的材料的大规模生产的其他来源和方法时，后来发现，其他部分，可以包括'072专利中描述的部分的部分以及包括ALP和ALPS的其他材料，具有所希望的免疫剌激活性。 使用所述起始材料，'072专利中描述的方法提供了相对纯的含多糖部分，其没有足够的ALP和ALPS以提供显著的另外的免疫剌激活性。 不希望受到任何特定的操作理论的约束，据认为，ALP和ALPS具有独立的免疫剌激性能，可以与多糖一起使用，或者代替多糖，用来在关节和肌肉疼痛等的治疗和皮肤弹性增强中提供多种益处。 测试结果表明，包括Aloeride多糖、ALP和ALPS的AloeEx全体地对AloeEx的巨噬细胞活化性能(免疫剌激性能)负责。 IAvD可以包括PLL、 AloeEx、 ALP和ALPS的混合物、多糖和Aloeride多糖(基本上没有ALP和ALPS) 。 IAvD还可以包括其他材料，包括市售多糖制剂，所述制剂具有免疫剌激性的衍生的组成并已被证明导致THP-1细胞中NF- k B指导的荧光素酶表达的一定程度的活化，以致符合本文对于IAvD所述的标准。 由于需要IAvD的稳定化制剂和组合物，因此这些制剂可以包括与IAvD材料组合的第二衍生于芦荟的非IAvD材料。第二衍生于芦荟的非IAvD材料包括较低免疫剌激活性的材料和至少50%的通常分子量为1， 500， 000道尔顿以下的多糖。 如果IAvD与第二衍生于芦荟的材料混合，无论是第二 IAvD或非IAvD，当然，单个碳水化合物的百分比以及总体分子量可以改变。此外，混合物的整体活性可能会改变。例如，AloeEx和MagnAloe AG20% : 80%的混合物对于多糖通常具有较低的总体分子量，具有比AloeEx低的整体活性，并具有作为最普遍的碳水化合物的甘露糖。
这些第二非IAvD的衍生于芦荟的材料的非限制性实例包括选自以下的那些MagnAloe AG、库拉索芦荟凝胶1 X (天然的磨粹片、微粉化的片或者脱色的)、库拉索芦荟凝胶10X (天然的或脱色的)、库拉索芦荟凝胶200X (脱水的粉末或喷雾干燥的粉末)、库拉索芦荟全叶喷雾干燥的粉末100X、库拉索芦荟全叶脱色的液体(1X、2X、4X或10X)乙酰化甘露聚糖、库拉索芦荟粘多糖(AVMP)和蜜露宝(Manapol)。 相对于第二衍生于芦荟的材料和第一 IAvD的总量，存在于制剂中的第二衍生于芦荟的材料的量通常是至少约10% 约90%重量比。第二衍生于芦荟的材料溶解、悬浮、乳化和/或分散第一 IAvD的能力越大，以及第二衍生于芦荟的材料的活性越大，其需要量就越小。在一个优选的实施方案中，第二衍生于芦荟的材料是MagnAloe AG，并且MagnAloeAG的量大于AloeEx的量，在一个特别优选的实施方案中，以MagnAloe AG比AloeEx 4 : 1重量比提供它们。在由这两种物质形成的所得均质混合物中，MagnAloe AG为其约80X。如本文所述和定义的，MagnAloe AG不被认为有资格作为本文定义的IAvD。
其他IAvD和非IAvD包括市售多糖制剂，如库拉索芦荟粘多糖(AVMP)和蜜露宝，其可从Carrington Laboratories Inc. (Irving, TX)得到，具有免疫剌激性的衍生的组成并已被证明在200 g/mL下导致THP-1细胞中NF- k B指导的荧光素酶表达的活化。特别地，AVMP和蜜露宝被认为是非IAvD，其具有的所报道的活化处于相对于lOii g/mLELPS的NF-kB最大活化的2-4^范国。 上述组合物中的任一种均可以在本发明中单独使用或组合使用。
皮肤治疗 本发明的一个方面是在有此需要的受试者中改善皮肤的外观、肌理、硬度和/或弹性或者治疗皮肤弹性下降的方法。有此需要的受试者是需要增强或改善皮肤弹性的任何哺乳动物，特别是人。通过给予有此需要的受试者有效量的IAvD组合物足以获得受试者皮肤弹性改善的时段来实现。就皮肤弹性而言，根据本发明的改善或治疗都不需要超过主观基础上的某种可辨别的、可测量的改善。除非另有说明，这可以是例如基于视觉和触觉观察的主观基础的任何受试者的改善。 然而，通常基于统计显著性改善测量改善。根据ANOVA测定，当该方法与临床研究中待测试的受试者限定组使用时，通过本文所述的任一种测试来测量测试。例如，弹性测量仪参数Ur/Ue描述了皮肤弹性，因为它涉及拉伸和收縮。第一组受试者中的70%在弹性测量仪参数Ur/Ue中表现出改善。相对于基线，参数Ur/Ue的显著增加相当于摄取本发明补充剂的受试者在第12周29%的改善。 实现统计显著性所需的改善的量由若干因素控制，包括但不限于受试者的数量、测试长度、用于测量弹性改善的技术、受试者的状态、剂型种类、使用的日剂量等。此外，本发明不要求使用每一种测试方法都达到统计显著性，只要在至少一种弹性测试中取得即可。 本发明的IAvD组合物可以通过任何正常途径给予。然而，口服和局部途径(包括透皮途径)是优选的。当然，给予途径可以控制用于实现给予的剂型设计中的许多。
—次剂量中IAvD组合物的量受到是否局部施用或摄入和为了什么目的使用它的影响。然而，一般来说，不论选择何种剂型，用于治疗皮肤弹性的根据本发明使用的IAvD组合物的量为每天约0. 0025mg 约lg。这是指IAvD的量，而不是指衍生于戸荟的材料的总量。可能无法区分IAvD制剂的单个组分。足以实现这些目的是，IAvD在与其他材料混合之前具备这些性能。 例如，IAvD和衍生于戸荟的非IAvD可以存在，或者IAvD可以存在。
改善皮肤弹性的IAvD制剂可以作为单剂量或作为分次剂量在一天给予，给予的剂量次数为每天1至约6次，更优选每天1至4次，最优选每天1至2次。这是基于表现出活性的IAvD，所述活性的特征在于，浓度约5 ii g/mL下测试时( 一般在AloeEx中发现)，将THP-1细胞中NF- k B指导的荧光素酶表达增大至如本文所记载的由浓度约10 ii g/mL的ELPS实现的约50%水平。应注意，单核细胞/巨噬细胞活化的水平随批次有变化，因而可能需要或多或少的PLL来提供同等水平的活性。此外，与PLL相比，其他IAvD可能或多或少具有免疫剌激性。可能需要一定量的每一种提供与PLL可比拟的活性的这些IAvD。
因此，根据本发明的每种剂型中的IAvD组合物的量可以为约0. 0005毫克 约1克，其随日剂量、剂量次数以及给予途径变化。 最优选地，对于通过口服改善的皮肤弹性和/或加速的皮肤细胞更新，IAvD组合物的量为每天约0. 2毫克(mg)至约5克(g)，更优选约5mg至约lg，最优选约10mg至约500mg。当局部提供时，该量为约0. 0005mg至约2. 5mg，更优选约0. 0025mg至约0. 25mg，再更优选约0. 0025mg至约0. 025mg。这些量基于使用约5微克/毫升(y g/mL)活性的AloeEx。产生类似结果的其他IAvD的量也在本发明的范围中。 在根据本发明的优选实施方案中，IAvD组合物的每日给予持续至少7天，更优选至少2周，更优选至少2月。最优选地，本发明的材料在受试者的整个生命内持续给予以改善和保持皮肤弹性。然而，治疗给予的量可能最终降低到实现维持一定所需水平的皮肤弹性或加速的皮肤细胞更新。因此，在治疗一段时间之后，一旦皮肤弹性有所改善，可以给予较低剂量以进行维护。 当局部施用时，剂量可以在受折磨区域直接展开。在某些情况下可以将其擦到皮
肤中。在其他情况下，它不被操作，而是允许被吸收或留在施用的应用区域上。IAvD也可以
应用于闭塞绷带(occlusivebandage)或一些其他类型的含有它的包裹上。 可选择地，IAvD可以配制成贴片。这些局部应用可被设计成将IAvD输送到皮肤
表面或皮肤本身的某个或某些层。可选择地，也可以将其配制成将IAvD透皮输送，从而更
深入的局部或全身分布。本文讨论了可用于配制口服和局部剂型的更多材料类型。 当口服给予时，IAvD组合物可以片剂、胶囊、粉末、香粉、锭剂、口香糖或任何其他
可摄取形式提供。IAvD也可以作为在摄取之前首先在液体中溶解或与其混合的液体或固体
提供。剂型可以是可吞咽的，或可以在口中是固体并且在摄取之前在口中崩解。IAvD甚至
可以洒在食物上，并与其一起摄取。 应注意，"加速的细胞再生"是其自身权利的终点，并且使用IAvD组合物增强加速的细胞再生的方法和使其完成的产品也在本发明中。加速的细胞再生是，在希望脱落的死亡的皮肤层下，皮肤细胞的再生。使用针对皮肤弹性所述的相同技术和产品可实现这一点。
关节/肌肉疼痛 本发明的另一个方面是通过使用根据本发明的IAvD组合物，在有需要的受试者中改善或治疗关节和/或肌肉疼痛。 一般来说，前面根据皮肤弹性所讨论的给予途径和剂型同样适用于这些方法。局部应用可以影响特定的肌肉或肌肉群和/或特定的关节。系统性给予(口服或透皮)可以减少同一位置的疼痛和/或可以对许多肌肉群和/或关节提供更广泛的减轻。 同样如之前针对皮肤弹性所提到的，根据本发明这一方面的治疗是指关节疼痛和
/或肌肉疼痛降低，其可以针对不同受试者在主观上测量。然而，更优选地，根据本发明的成
功产品当长时间给予至治疗的受试者组时，可以统计显著性方式提供充分的治疗。希望的
是，至少75%的受试者在治疗12周后，将表现出更低频率的肌肉和/或关节疼痛、疼痛强度
降低或疼痛持续时间縮短。这可以是全身或特定的肌肉或关节中的疼痛。 关节疼痛和/或肌肉疼痛中受试者状态的改善经常通过主观评分系统确定，由每
一个人对治疗之前、期间和/或之后他或她的特定部位或全身的疼痛评分。 同样如以前所指出的那样，根据本发明这一方面给予的IAvD组合物的量随给予
途径、待治疗区域、疼痛的程度和类型等变化。然而，该量一般与之前关于改善皮肤弹性的
方法在同一范围。在该方法和改善皮肤弹性的方法中，也可能同时或在同一天内，或者以一
些替代或补充的时间表，既口服又局部给予IAvD组合物，从而提供一般和更具体靶向的减
轻或改善。
根据本发明可以使用任何IAvD组合物。例如，可以使用表现出本文所述的免疫剌 激性能的任何PLL、任何AloeEx或任何Aloeride多糖制剂。本发明包括使用任选地与可接 受的药物载体或赋形剂组合的IAvD的药物组合物和方法。
组合物 适用于本发明的药物组合物包括含有有效量的活性成分以实现其预期目的的组 合物。更具体地说，治疗有效量指，有效地防止正接受治疗的受试者的现有症状发展或使其 减轻的量。有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，特别是参照本文提供的详细公 开内容。 组合物的给予量取决于正接受治疗的状态、正接受治疗的受试者、受试者体重、痛 苦的严重程度、给予方式和个人的医生或个人的判断。 如上所述，合适的给予途径例如可以包括口服、透粘膜、局部或透皮。 本发明的药物组合物可以本身已知的方式制造，例如，通过常规混合、溶解、粒化、
包糖衣、粉化、研粉、乳化、包囊、包封或冻干过程。 因此，根据本发明使用的药物组合物可以常规方式使用一种或多种包括赋形剂和 助剂的生理可接受的载体配制，所述赋形剂和助剂促进组合物和化合物加工成可作为药物 使用的制剂。适宜的制剂取决于选择的给予途径。 对于口服给予，组合物可以单独给予，或者通过将活性组合物与本领域公知的药 学上可接受的载体组合而容易地配制。这种载体能够使本发明的组合物配制作为片剂、丸 剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、浆液、混悬液等，用于将要接受治疗的患者的口部摄取。 口服和/或局部使用的药物制剂可以按下述步骤获得使用固体赋形剂，任选地 研磨或碾碎制剂和/或所得混合物的单个组分，如果需要，在加入合适的助剂后，加工颗 粒组分和/或混合物，从而获得例如乳霜、洗剂、血清、粉末、泡腾制剂、片剂或糖衣丸核心 (dragee cores)。然而，粒化仅是可以使用的许多已知技术中的一种。 适合的赋形剂特别是填料，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制 剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲 基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。 如果需要，可以加入崩解剂，如PVP、羟基乙酸淀粉钠、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼 脂或海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。 糖衣丸核心具有适当的包衣。为此，可以使用浓縮的糖溶液，其可以任选地含有阿 拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液以及适 当的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以加到片剂或糖衣丸包衣中，以识别或表征活 性组合物剂量的不同组合。 可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊以及由明 胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的密封软胶囊。推入配合胶囊可以含有活性成分，所述 活性成分与填料(如乳糖)、粘结剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及 任选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性组合物可以溶解或悬浮于合适的液体中，如脂肪油、 液体石蜡或液态聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。所有口服给予的制剂均应是适于这种 给予的剂量。
对于口腔给予，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于局部给予，还可以制备乳液、微乳液或其他局部乳霜、洗剂、洗面奶、洗涤剂、 药膏、血清或凝胶。AloeEx可能直接乳化，例如制备AloeEx水包油乳液，其中疏水核心或油 相主要由AloeEx构成。可以加入其他表面活性剂或药典赋形剂以物理地稳定乳液。
适于局部给予的药物制剂特别是含有约0. 05% 约5%重量比的IAvD组合物的 乳霜、药膏和凝胶以及糊剂、泡沫、酊剂和溶液。优选地，制剂是约0. 5%重量比的IAvD组 合物。这些组合物包括衍生于芦荟的材料的总量，其根据需要包括至少一种IAvD和任何 其他基于芦荟的材料。在临床研究所讨论的制剂中，例如，O. 5% IAvD组合物由AloeEx和 MagnAloe AG的1 : 4混合物构成。 乳霜或洗剂可以是通常含有超过50%水的水包油乳液。用作油基的，特别是脂肪 醇，特别是含有12 18个碳原子的那些，例如月桂醇、十六烷醇或硬脂醇，脂肪酸，特别是 含有10 18个碳原子的那些，例如棕榈酸或硬脂酸，液体蜡到固体蜡，例如肉豆蔻酸异丙 酯、羊毛蜡或蜂蜡，和/或烃类，特别是液体、半固体或固体物质或其混合物，例如凡士林油 (矿脂)或石蜡油。合适的乳化剂是主要具有亲水性能的表面活性物质，如相应的非离子型 乳化剂，例如多元醇的脂肪酸酯或其环氧乙烷加成物，特别是具有(聚)乙二醇、(聚)丙 二醇或山梨醇的相应的脂肪酸酯，脂肪酸部分尤其含有10 18个碳原子，尤其是甘油的脂 肪酸偏酯或聚羟基乙烯山梨聚糖的脂肪酸偏酯，如聚甘油脂肪酸酯或聚氧乙烯山梨聚糖脂 肪酸酯(吐温)，以及聚氧乙烯脂肪醇醚或脂肪酸酯，脂肪醇部分尤其含有12 18个碳原 子，脂肪酸部分尤其含有10 18个碳原子，特别是具有约2 23个乙二醇或环氧乙烷单 元的那些，如聚羟基乙烯十六烷基硬脂基醚(例如Cetomacrogol)、聚羟基乙烯_(4)_月桂 基醚和聚羟基乙烯甘油脂肪酸酯(例如Tagat S)，或者相应的离子型乳化剂，如脂肪醇硫 酸盐的碱金属盐，特别是脂肪醇部分具有12 18个碳原子，如十二烷基硫酸钠、十六烷基 硫酸钠或十八烷基硫酸钠，它们通常在脂肪醇(例如十六烷醇或硬脂醇)存在下使用。
水性相的添加剂是防止乳霜干燥的试剂，例如保湿剂，如多元醇，如甘油、山梨醇、 丙二醇和/或聚乙二醇，以及防腐剂、香料等。 药膏或洗剂可以是油包水乳液，其通常含有高达70%但优选约20% 约50 %的 水或水性相。烃类特别适合作为脂肪相，例如凡士林油、石蜡油和/或硬质石蜡，为了提高 水结合能力，优选含有合适的羟基化合物，如脂肪醇或其酯，例如，十六烷基醇或羊毛蜡醇， 或羊毛蜡。 乳化剂是相应的亲脂性物质，如山梨聚糖脂肪酸酯(Spans)，例如山梨聚糖油酸酯 和/或山梨聚糖异硬脂酸酯。水性相的添加剂是保湿剂，如多元醇，例如甘油、丙二醇、山梨 醇和/或聚乙二醇，以及防腐剂、香料等。 微乳液是基于以下四种组分的同向性体系水、乳化剂(例如，上述类型的，如表 面活性剂，例如emulgin)、脂质(如非极性油，例如，石蜡油)和含有亲脂性基团的醇(例如 2-辛基十二烷醇)。如果需要，其他添加剂可以加到微乳液中。 脂肪药膏是无水的，并尤其是含有烃类作基质，例如石蜡、凡士林油和/或液体石 蜡，以及天然或部分合成的脂肪，如甘油的脂肪酸酯，例如椰子脂肪酸甘油三酯，或优选硬 化的油，例如氢化的落花生油或蓖麻油，以及甘油的脂肪酸偏酯，例如甘油单硬脂酸酯和甘 油二硬脂酸酯，以及例如提高水吸收能力的脂肪醇、针对药膏所述的乳化剂和/或添加剂。
关于凝胶，在水性凝胶、无水凝胶和具有低含水量的凝胶之间作出区分，凝胶由可 溶胀的成凝胶材料构成。尤其可以使用基于无机或有机大分子的透明的水凝胶。具有凝胶 形成性能的高分子量无机组分主要是含水的硅酸盐，如硅酸铝，例如膨润土，硅酸镁铝，例 如Veegum或胶体硅酸，例如氧相二氧化硅。用作高分子量有机物质的有例如天然、半合成 或合成的大分子。天然和半合成的聚合物例如衍生自含有很多种碳水化合物组分的多糖， 如纤维素、淀粉、黄蓍胶、阿拉伯树胶和琼脂以及明胶、海藻酸和其盐(例如，海藻酸钠)及 其衍生物，如低级烷基纤维素，例如甲基或乙基纤维素、羧基或羟基低级烷基纤维素，例如， 羧甲基或羟乙基纤维素。合成的凝胶形成大分子的组分例如是适当取代的不饱和的脂肪族 化合物，如乙烯醇、乙烯吡咯烷、丙烯酸或甲基丙烯酸。这种聚合物的实例是聚乙烯醇衍生 物，如polyviol，聚乙烯吡咯烷，如三甲基吡啶，聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯，特别是其具 有约80， 000至约100万的分子量，或其盐，如Rohagit S、 Eudispert或卡波姆。常用的添 加剂，如防腐剂、稳定剂或香料，可以加到凝胶中。 例如从压力容器给予泡沫，其是气溶胶形式的液态水包油乳液；未取代的或卤代 烃类，如烷烃，例如丙烷或丁烷，或氟氯低级烷烃，例如二氯二氟甲烷和二氯四氟乙烷，被用 作推进剂。作为油相，可以使用烃类，如石蜡油，脂肪醇，如十六烷醇，脂肪酸酯，如肉豆寇 酸异丙酯和/或其他蜡，等等。作为乳化剂，可以使用具有主要是亲水性能的乳化剂的混 合物，如聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，和具有主要是亲脂性能的乳化剂，如山梨聚糖脂肪酸 酯，等等。也可以加入常用的添加剂，如防腐剂等。 酊剂和溶液一般具有乙醇基质，水可以加入其中，还可以加入多元醇，例如甘油、 乙二醇和/或聚乙二醇，作为降低蒸发的保湿剂，和脂肪恢复(fat-restoring)物质，如低 分子量聚乙二醇的脂肪酸酯，即在水性混合物中可溶解的亲脂性物质，作为通过乙醇从皮 肤去除的脂肪物质的替代，并且在必要时，可以加入其他辅剂及添加剂，等等。通过适当的 装置，还可以喷雾形式使用适合的酊剂或溶液。 可局部给予的药物制剂的生产以本身已知的方式进行，例如通过在基质中或者在 必要时在其部分中，溶解或悬浮活性成分。当活性成分以溶液形式给予时，一般在乳化之 前，将其溶解在两相中的一相中；当活性成分以悬浮液形式给予时，在乳化后将其与一部分 基质混合，然后加到制剂的其余部分中。 —种IAvD组合物或多种IAvD组合物的组合可以作为局部药物应用，起到局部作 用，如增强的皮肤弹性和/或加速的皮肤细胞生长或再生。这是一种施用于皮肤并在施用 部位直接起作用的治疗。它必须放置在病理部位，通过皮肤直接吸收，并发挥作用。据认为， 对于这种作用的发生不需要全身吸收。 IAvD组合物或IAvD组合物的组合可以作为局部药物应用，起到全身作用。这是一 种施用于皮肤并在远离施用部位的部位起作用的治疗，用于降低肌肉或关节疼痛，增强皮 肤弹性或二者兼有。这种药物可以在身体的任何部位施用并实现其作用。这种制剂必须通 过皮肤吸收，进入血流，在血液中达到有效水平，然后前往其作用部位以发挥其作用。
本领域技术人员已知的是，皮肤渗透增强剂可以用于促进IAvD的一种或多种组 合物的全身性输送或者甚至更深的肌肉或关节渗透。在这一方面，渗透增强剂已经被用来 增加皮肤表面对药物的渗透性，并常常是接受质子的溶剂，如二甲基亚砜(DMS0)和二甲基 乙酰胺。已经研究和报告的其他有效渗透增强剂包括2-吡咯烷、N， N- 二乙基间甲苯甲酰胺(Deet) 、1-十二烷基-氮杂环庚烷_2-酮、N， N_ 二甲基甲酰胺、N_甲基-2-吡咯烷，巯 基乙酸钙、己醇、脂肪酸和酯、吡咯烷酮衍生物、l，3-二氧杂环己烷和1，3-二氧戊环的衍生 物、1-N-十二烷基-2-吡咯烷酮-5-羧酸、2-戊基-2-氧代吡咯烷乙酸、2-十二烷基-2-氧 代-1-吡咯烷乙酸U-氮杂环庚烷_2-酮-2-十二烷基乙酸和氨基醇衍生物，包括1，3- 二 氧杂环己烷的衍生物，等等。 IAvD组合物或IAvD组合物的组合可以包含在用于治疗任何反应性状态的剂型 中，如关节疼痛、肌肉疼痛、皮肤弹性损失或皮肤皱纹。 药物组合物还可以包含适合的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的 实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶以及诸如聚乙二醇的 聚合物。 提供稳定的组合物，用于治疗、预防或减轻任何状态、疾病、痛苦和伤口等，包括但 不限于关节或肌肉疼痛的一种或多种症状，以及用于增强皮肤弹性。本文提供的组合物是 免疫剌激性库拉索芦荟提取物或其衍生物的稳定制剂，其处于药理适合的流体中，在长期 储存过程中是稳定的。该组合物可以适合直接给予到有此需要的受试者或者可以是浓縮形 式。药理适合的流体包括但不限于极性流体，包括质子流体。在某些实施方案中，该组合物 是水性溶液。在其他实施方案中，该组合物是非水性的或者是乳液。 IAvD组合物可以用药理适合的流体或溶剂配制。药理适合的流体包括但不限于极 性溶剂，包括但不限于含有羟基或其他极性基团的化合物。这类溶剂包括但不限于水或醇 类，如乙醇、异丙醇和二醇类(包括丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚、甘油和聚氧乙 烯醇)。 极性溶剂也包括质子溶剂，包括但不限于水、含有一种或多种药学上可接受的盐 的盐水溶液、醇类、二醇类或其混合物。对于作为溶剂或作为其组分的盐水溶液，特别适合 的盐是在给予后没有显示出或仅显示出微不足道的药理活性的那些。 本文提供的组合物还可以包括赋形剂和添加剂。用于长期储存的组合物中使用的 特定赋形剂或添加剂可以使用本领域技术人员公知的方法凭经验确定。赋形剂和添加剂是 任何药理适合的且治疗有用的物质，但不是活性物质。赋形剂和添加剂一般没有药理活性， 或至少没有不希望的药理活性。赋形剂和添加剂包括但不限于表面活性剂、稳定剂、络合 剂、抗氧化剂、延长最终药物制剂使用期限的防腐剂、香料、维生素或本领域中已知的其他 添加剂。 络合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐(如二钠盐)、柠檬酸、次氮基三 乙酸和其盐。在一个实施方案中，络合剂是EDTA。防腐剂包括但不限于防止溶液被致病粒 子污染的那些，包括苯扎氯铵或苯甲酸或苯甲酸盐(如苯甲酸钠)。抗氧化剂包括但不限于 维生素、维生素原、抗坏血酸、维生素E或其盐或其酯。 本文提供的组合物还可以包括助溶剂，所述助溶剂增大添加剂或活性成分的溶解
度。用于本文所提供的长期储存的组合物中的特定助溶剂可以使用本领域技术人员公知的
方法凭经验确定。本文所用的助溶剂包括但不限于羟基化的溶剂或其他极性溶剂，如醇类，
如异丙醇，二醇类，如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚、甘油和聚氧乙烯醇。 在其他实施方案中，组合物还含有缓冲剂，包括但不限于柠檬酸/磷酸盐、醋
酸盐、巴比妥、硼酸盐、Britton-Robinson、卡可基酸盐、柠檬酸盐、三甲基吡啶、甲酸盐、马来酸盐、Mcllvaine、磷酸盐、Prideaux-Ward、琥珀酸盐、柠檬酸盐-磷酸盐-硼酸盐 (Teorell-Stanhagen)、醋酸巴比妥、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、BIS-TRIS(双(2-羟 基乙基)亚氨基-三-(羟基甲基)甲烷)、八0八(^(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸)、 ACES(N-(氨基甲酰基甲基)-2-氨基乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N， N'-双(2-乙磺酸))、 M0PS0(3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸)、BISTRISPR0PANE(l，3-双(三(羟基甲基)甲基氨 基)丙烷)、BES(N，N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸)、M0PS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、 TES(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、HEPES(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N' -(2_乙 磺酸)、DIPS0(3-(N，N-双(2-羟基乙基)氨基)-2-羟基丙磺酸)、M0BS(4-(N-吗啉代)-丁 磺酸)、TAPS0(3-(N-三(羟基甲基)甲基氨基)-2-羟基丙磺酸)、TRIZMA.RTM.(三(羟基 甲基氨基甲烷)、HEPPS0(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N' -(2-羟基丙磺酸)、P0PS0(哌嗪-N， N' _双(2-羟基丙磺酸))、TEA(三乙醇胺)、EPPS(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N' -(3_丙 磺酸)、TRICINE(N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸)、GLY-GLY(双甘氨肽)、BICINE(N， N-双 (2-羟基乙基)甘氨酸)、HEPBS(N-(2-羟基乙基)哌嗪-N' - (4-丁磺酸))、TAPS (N-三 (羟基甲基)甲基_3-氨基丙磺酸)、AMPD (2-氨基-2-甲基-1， 3-丙二醇)和/或本领域 技术人员已知的任何其他缓冲剂。 对于本文提供的给定组合物的特定缓冲剂和缓冲剂浓度，可以使用本领域技术人 员公知的标准稳定性测定法根据经验确定。 如有需要，组合物可以置于可以含有一种以上含有活性成分的单位剂型的包装或 分配装置中。该包装可以包括例如金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配装置可以伴随 着给予说明书。也可以制备在可兼容药物载体中配制的含有本发明组合物的组合物，将其 放置在适当的容器内，并打上治疗所指状态的标签。在标签上标明的适宜状态可以包括对 状态的治疗。 制剂还可以含有任选的成分，包括例如草药、维生素、矿物质、促进剂、着色剂、甜 味剂、调味剂和惰性成分等。这种任选的成分可以是天然存在的或浓縮的形式。选择这些 成分中的一种或几种是配制、设计、消费者喜好和最终用户的问题。 根据本发明的另一个方面，已经发现可被用来允许制备IAvD的均质分散液、乳 液、悬浮液和溶液等的多种材料。特别是，已经发现，某些高度活性的但一般不溶解的IAvD 可以通过使用第二衍生于芦荟的材料而分散、悬浮、乳化和/或增溶。第二衍生于芦荟的材 料可以是第二 IAvD或没有足够活性来有资格作为IAvD的材料。第二衍生于芦荟的材料的 量应该是，足以允许根据需要制备第一 IAvD的均质分散液、溶液、均质悬浮液或均质乳液 的量。 一般地，相对于第一 IAvD和第二衍生于芦荟的材料的总重量的重量百分比，需要按 重量百分比计至少约10%的第二衍生于芦荟的材料。 在根据本发明的特别优选实施方案中，第一 IAvD是AloeEx。可以使用能够改善 第一 IAvD的可加工性的任何衍生于芦荟的材料。第二衍生于芦荟的材料通常由多糖构 成，其中至少50%的多糖的分子量为1，500，000道尔顿以下。第二衍生于芦荟的材料可 以包括但不限于选自以下的芦荟基材料MagnAloe AG、库拉索芦荟凝胶1 X (天然的磨粹 片、微粉化的片或者脱色的)、库拉索芦荟凝胶10X (天然的或脱色的)、库拉索芦荟凝胶 200 X (脱水的粉末或喷雾干燥的粉末)、库拉索芦荟全叶喷雾干燥的粉末100X 、库拉索芦 荟全叶脱色的液体(1X、2X、4X或10X)、乙酰化甘露聚糖、库拉索芦荟粘多糖(AVMP)和蜜露宝。MagnAloe AG是可从Costa Rica， S. A.的First Aloe得到的粉末。可以从www. firstAloevera. com/magnAloe_information. htm获得信息。MagnAloe AG的多糖水平超过 800千道尔顿(KDa)，如下所示。比市售的喷雾干燥的200-1库拉索芦荟粉末平均高40% 。据 报道，MagnAloeAG含有42. 65mg/g的分子量(丽)为50_200KDa的多糖、118. 5mg/g的丽为 200-800KDa的多糖、366. 2mg/g的丽800-1400KDa的多糖、155. 8mg/g的丽1400-2000KDa 的多糖，总多糖为683. lmg/g。 MagnAloe的水溶解性通常为约15%。 库拉索芦荟凝胶1 X (天然的磨粹片、微粉化的片或者脱色的)、库拉索芦荟凝胶 10X (天然的或脱色的)、库拉索芦荟凝胶200X (脱水的粉末或喷雾干燥的粉末)、库拉索 芦荟全叶喷雾干燥的粉末100X、库拉索芦荟全叶脱色的液体(1X、2X、4X或10X)均可 以从Improve USA， Inc. ， 215Dalton Drive, Suite D，DeSoto，TX 75115得到。库拉索戸荟 凝胶200 X的水溶解性通常为约90-100 % 。 乙酰化甘露聚糖、库拉索芦荟粘多糖(AVMP)和蜜露宝可以从Carrington Laboratories, Irving， TX得到。在一个特别优选的实施方案中，IAvD中一种最常用的碳 水化合物是葡萄糖，第二衍生于芦荟的材料中一种最常用的碳水化合物是甘露糖。
在一个实施方案中，按第一 IAvD和第二衍生于芦荟的材料的总量计，第一 IAvD的 量为约10X 约90X重量比，按第一IAvD和第二衍生于芦荟的材料的量计，第二材料的 量为约90% 约10%。在一个优选的实施方案中，第二材料的量大于第一 IAvD的量，在 特别优选的实施方案中，以第二材料第一IAvD 4 : l重量比提供它们。在由这两者形成 的所得均质混合物中，第二材料为其约80 % 。在另一个优选方面中，第一 IAvD是AloeEx， 第二材料是含有多糖的衍生于芦荟的材料，其中至少50%的多糖的分子量为约1， 500， 000 道尔顿以下，如MagnAloe A G，并且按AloeEx和MagnAloe的量计，AloeEx的量为约10% 约90X重量比，按AloeEx和MagnAloe AG的量计，MagnAloe AG的量为约90X 约10%。 在一个优选的实施方案中，MagnAloe AG的量大于AloeEx的量，在特别优选的实施方案中， 以MagnAloe AG :AloeEx 4 : 1重量比提供它们。在由这两者形成的所得均质混合物中， MagnAloe AG为其约80% 。 在一个实施方案中，AloeEx和第二材料，优选第二衍生于芦荟的材料可以通过混 合原料AloeEx与已加热到约8(TC的水来配制。该混合物搅拌至少10分钟，以均质化材料。 然后过滤该混合物，优选使用孔径不大于15微米的过滤器。由此产生的滤液可以用于配制 本文所述的多种IAvD组合物。 取决于使用的设备，AloeEx的均质化可能需要或不需要加热。例如均质器可以用 作过程的一部分，以得到均一的微粒悬浮液。公知的"彩色"均质器可以用于减小AloeEx粒 径，以配制水性AloeEx悬浮液和/或乳液。 AloeEx的表征显示在图1中。这种材料形成棕色至绿色的片状粉末。 参照图l，该图示出一个批次的AloeEx材料(批号56)以及按总碳水化合物摩尔
百分比计的相关的糖含量。 图1不出由The University of Georgia, Complex CarbohydrateResearch Center进行的糖基组合物分析结果，其借助经酸性甲醇解从样品制备的单糖甲基糖苷的 per-0-三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物的联用气相色谱/质谱(GC/MS)。
甲基糖苷首先通过在1M HC1的甲醇中在8(TC下进行甲醇解(18-22小时)，然后在甲醇中用吡啶和乙酸酐再N-乙酰化(用于检测氨基糖)，从而从本发明人提供的干样品 制备。然后，样品在80。C下用Tri-Sil (Pierce)处理(0. 5小时)而进行per-O-三甲基 甲硅烷基化。[根据之前Merkle和Poppe (1994)Methods Enzymol. 230 :1-15 ;York等人 (1985)Methods Enzymol. 118 :3-40中的记载进行这些过程。]经加入Tri Sil立即注意到 显著程度的沉淀。使用All Tech EC-1熔融二氧化硅毛细管柱(30mX0. 25mm ID)，在连接 到5970MSD的HP 5890GC上，进行TMS甲基糖苷的GC/MS分析。 通过与标准相比的保留时间鉴定单糖，它们的碳水化合物特征由其质谱证实。为 了解释质谱数据，碎片离子73是所有TMS甲基糖苷的特征基础碎片，204和217具有中性糖 的特征，173具有氨基糖的特征。碎片217也具有糖醛酸的特征，碎片离子298具有唾液酸 的特征。 图1鉴定了糖基残基组成，按摩尔百分比计。各值表示为总碳水化合物的摩尔百 分比。总百分比碳水化合物计算为8.6%。测得的成分值为葡萄糖61. 1%，阿拉伯糖9.5%， 半乳糖9. 2%，半乳糖醛酸7. 9%，甘露糖6. 6%，木糖1. 6%，核糖1. 5%，鼠李糖1. 4%和海 藻糖1. 1%。 临床研究-皮肤弹性_局部制剂下面描述的临床研究证实了一种以商标ALOERIDE⑧出售的IAvD组合物的效
果。ALOERIDE⑧可以局部给予，以改善皮肤弹性，也可以用作一种营养补充剂的成分。
在临床研究中由Fairfield, NJ的Consumer Product Testing, Inc.测定
ALOERIDE⑧凝胶0. 5%产品ftl0849LL，批#11939对皮肤弹性或硬度的影响。测试制剂 (八乙0￡11106@凝胶0. 5% )含有按重量4 : 1的MagnAloe AG和AloeEx的混合物，并与 水、醇(10% )和少量卡波姆(0. 5% )混合，然后使用均质器分散。AloeEx、水、醇和少量卡 波姆的分散液用于构成测试凝胶悬浮液。 测试产品以小容器供应，以致当施用到确定的面部区时足以持续8周(醇作为防 腐剂)。 临床试验是AloeEx功能的双重测试卡波姆倾向于是干燥的，负面测试性能因子 估计为(_)15%。临床试验证明了 AloeEx/MagnAloe AG的以下能力1)在4周和8周时， 统计学多数的测试对象中细线和皱纹减少；2)AloeEx克服与卡波姆相关的任何负面干燥 的能力。 该临床试验中使用的AloeEx是非分散性/不溶性的，并难于均质化。然而，当以 1 : 4与MagnAloe AG混合时，得到均质凝胶/乳液。 31名合格的男性和女性受试者，年龄从40至65岁，被选作研究。测试材料表明4 周和8周评估间隔时，皮肤反弹时间均显著减少。研究参与者在研究结束时，皮肤弹性或硬 度达到72%的改善(图2)，100%的研究参与者经历了皮肤弹性的普遍改善。基于年龄和 性别的研究人口统计学显示在图3中。 受试者在测试第一天以清洁的面部在实验室报道，用于基础测量。在进行任何 读数或评分之前，受试者在以下环境条件下，在环境受控的房间中平衡15分钟温度在 21°C +/_2°C ;相对湿度在40% +/-2%。 使用Shanahan. R. W.等人，Parameters for Assessing the Efficacy ofSkin Care Products (护肤品功效评价参数).Drug&Cosmetic Industry, 140， No. 1， 42-48， 1987公开的掐捏测试(pinch test)，测量皮肤弹性(硬度)。通过专家测试者在拇指和食指之 间抓住眼睛的侧眼眶下区域的皮肤，来获得皮肤弹性或硬度评分。释放由此产生的褶皱， 观察从释放直到没有进一步移动的皮肤所有可见运动的时间，并测量到最接近的百分之一 秒。将评分记录在数据记录表上，对测量进行统计分析。 如果在基线测量和随后的4周和8周治疗后评分间隔之间的平均得分统计显著性 (使用非独立t-检验的P小于或等于0. 05)下降，那么皮肤弹性改善被认为得到证实。
图2示出按秒计的平均皮肤反弹时间的统计显著性下降(皮肤弹性或硬度增大的 指标)。左和右测量的所有基线测量的平均值分别为2.09秒和1.96秒。在第4周测试间 隔观察到显著下降，分别产生1. 60秒和1. 53秒。在第8周测试间隔时测量到对于左和右， 平均皮肤反弹时间进一步下降到1. 19秒和1. 18秒。如前所述，结果是有统计显著性的，因 为对于所有测量间隔，计算的P小于或等于零(图2)。 下面描述的另一项临床研究证实了 口服给予的另一种IAvD组合物改善肌肉和/ 或关节疼痛和皮肤弹性的效果。 临床研究-皮肤弹性_关节/肌肉疼痛_ 口服制剂 由Clinical Research Laboratories, Inc.进行研究，评估被设计用于改善皮 肤弹性和硬度以及减少肌肉和关节疼痛的本发明的口服补充剂在12周内的功效。(双盲 安慰剂对照试验研究，以评估被设计用于减少衰老的口服补充剂的安全性和功效，研究号 CRL34706，通过引用其整体并入本文)。在临床研究中使用的安慰剂片剂含有微晶纤维素、 交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸、二氧化硅和硬脂酸镁。活性片剂含有与安慰剂片剂相同的无 活性成分以及50mg MagnAloe AG和AloeEx的4 : 1的混合物。这些片剂每天给予两次， 口服，起床和就寝时间各一次。 该研究在2006年8月30号启动，并于2006年12月15日完成。最初，对每个受
试者进行如下的安全筛选。 安全评价血液分析 在指定的研究访问时，从每个受试者抽取血液，进行以下的血液测试
全血球计数(CBC)并分类，以及血小板计数。化学板(Chemistry Panel) +HDL AST (GOT) 、 ALT (GPT) 、 y Gt、 LDH (LD)、总蛋白 (TP)、尿酸(UA)、总胆红素、脲氮(UN)、总胆固醇(HDL、LDL、TG)、Na、K、Ca、Cl。
尿液分析 在指定的研究访问时，从每个受试者获得尿液样品，进行以下的尿液化验
葡萄糖，蛋白，尿胆素原，血液，pH
坐姿生命体征 在筛选访问时，记录对坐姿生命体征的评价(即，脉搏，血压和呼吸)。
妊娠检查 在筛选访问时，对所有小组成员进行尿液妊娠检查(除了绝经后妇女)。
皮肤评价 为了确定治疗对皮肤的影响，CRL技术人员对每个受试者的面部进行皮肤评价，检 查存在的红斑、水肿和干燥。利用以下评分表记录皮肤剌激证据的程度和/或严重度
红斑、水肿和干燥的评分表
0 =无，1 =轻度，2 =中度，3 =严重
功效评价
弹性测量仪 通过可变真空泵产生吸力，光学测量皮肤渗入探针的深度，精度至0. Olmm。探针连
接到计算机，它控制真空应用并作为时间的函数绘制皮肤变形。从得到的曲线，可以外推许
多变量，包括即时、延迟、最终延伸和即时回縮(Eisner 1990)。 这些变量估计皮肤的弹性、粘弹性和纯粘性行为(Barel等人1995)。 测量以下的参数 在10秒时测量最终延伸Uf 。在0. 1秒时测量即时延伸Ue。延迟延伸，Uv。即时 回縮，Ur。 变形参数是依赖于皮肤厚度的外部参数。 为了绕开皮肤厚度的测量，使用以下的比例来评估皮肤的弹性性质(Ei sner 1990， Cua等人1990， Krushe和Wonet 1995和Dobrev 1995): Ur/Ue是皮肤的生物弹性。其测量皮肤在变形后恢复到其初始结构的能力。值为 l表示100%的弹性。 Uv/Ue是延迟和即时变形之间的比例，即它是粘弹性与弹性的比例。该比值的增大
表明，变形的粘弹性部分增加和/或弹性部分相对减少。
Ur/Uf是皮肤净弹性的量度。 本研究包括预筛选访问，在此期间，由临床研究技术员检查受试者，以确定资格。 符合条件的受试者在面部的眼角皱纹区域表现出轻度至中度的细线和皱纹，并经历慢性肌 肉和/或关节疼痛。此时，受试者被告知在预定的筛选访问之前，晚上9点后不要吃或喝， 以预备血液和尿液分析。 在研究启动之前，受试者抵达进行预定筛选访问的CRL实验室。从各个受试者抽 取血液，将血液采集用的前臂记录在病例报告表上。从每个小组成员获得尿液样品，进行尿 液分析，对坐姿生命体征(即，脉搏、血压和呼吸)进行评价和记录，对所有小组成员进行尿 液妊娠检查(除了绝经前受试者)。在余下的调节期和在研究持续期，受试者停用所有的口 服补充剂，除了在研究持续期间为每个受试者提供的口服补充剂。 为在基线标准化研究人群的皮肤状态并使由于使用不同护肤疗程的变化最小，进 行为期一周的调节期后开始研究。受试者需要接受为期一周的调节期，在此期间，甘油肥皂 被用于在研究开始之前所有的面部清洗。在筛选访问时，每个受试者被提供了详细的研究 说明，一块甘油肥皂以用于所有面部清洗，Cetaphi产每日面部润肤露SPF15以每天使用一
次，以及日记以记录肥皂的使用和核查遵守。受试者开始用肥皂每天两次清洗面部(早上 和晚上)，在基线访问7天之前开始。在该筛选访问中，每个受试者完成筛选问巻。
根据前面提到的筛选访问安全评价，合格的受试者具有正常的血液和尿液化验结 果，每个小组成员的生命体征在正常范围内。此外，同意后续访问和研究要求并符合所有入 选/排除标准的合格受试者将被列为研究对象。 回到基线访问的CRL测试设施，受试者在评价之前适应实验室环境条件30分钟。 在适应期后，由经过训练的CRL技术员对每个受试者的面部进行皮肤评价，判断是否存在 红斑、水肿和干燥。对于每个受试者，经由计算机生成的随机码确定，选择脸部的右侧或左侧进行测量(图4)。测量指定在整个研究中保持一致。从脸部同一侧的眼睛下方的颧骨区 捕获弹性测量仪读数。所有的测量都得到适当的记录。每个受试者完成了基线消费者感知 调查问巻，以评价肌肉和关节疼痛的类型和频率。 将指定的测试材料随机分配给每个受试者，以致第一组的小组成员收到活性片 剂，第二组收到安慰剂片剂。根据计算机生成的随机码确定受试者组指定。治疗指定/组 分配在整个研究中保持一致(图5-图6)。 每个受试者被供给指定的测试材料，详细的研究指示和新的日记，其中以记录补 充剂使用的每天次数、每天应用的Cetaphil⑧每日面部润肤露SPF15和任何有关补充剂使 用的意见。 打印的研究指示详细列出了每次访问的研究程序以及回访Clinical Research Laboratories, Inc.的预约日期和次数。受试者被指示继续使用提供的甘油肥皂，每日2
次，以及使用Cetaphil⑧每日面部润肤露SPF15，每天1次。 每个受试者通过电话与CRL技术员联系，第4周进行依从检查。摄入指定口服补 充剂8周，之后，受试者向CRL测试设施报道，并且每个小组成员适应环境温度和湿度30分 钟的时段。适应后，由经过训练的CRL技术员对每个受试者的面部进行皮肤评价。采集弹 性测量仪读数。按先前对基线研究间隔的解释，进行这些程序和评价，并进行记录。
受试者在12周的补充剂使用后，向Clinical Research Laboratories, Inc.报 道，每个受试者适应环境温度和湿度30分钟的时段。血液抽取自各个受试者，血液采集用 的前臂被记录在病例报告表上。从每个小组成员获得最终尿液样品。由经过训练的CRL技 术员对面部进行皮肤评价，确定红斑、水肿和干燥是否存在。从脸部同一侧的眼睛下方的颧 骨区捕获弹性测量仪读数。所有的测量都得到适当的记录。 在第12周，所有受试者都完成了最终调查问巻，返回未用的测试材料部分和日 记。 统计方法 对于这项研究产生显著结果的主要功效参数是弹性测量仪测量和消费者感知问 巻调查。 单向AN0VA测试(重复测量)被应用于每个小组，以确定对于所有参数是否在基 线和第8周之间以及在基线和第12周之间有差异。如果整体F检验是显著性的，那么进一 步应用图基(Tukey)多重比较测试，以确定是否存在显著性差异。ANOVA测试使用F-检验， 以确定是否在治疗方法或时间间隔之间存在显著性差异。当F-检验拒绝零假设时，通常需 要进行因素水平作用性质的全面分析。图基测试是一种多重比较程序。该方法同时检查或 比较多于一对的方法或比例，但将整体显著性水平控制到与一对比较所明确的相同。
第一组(分配给本发明测试材料补充剂的受试者)和第二组(分配给安慰剂测试 材料补充剂的受试者)之间的比较基于在每个时间间隔(第8周和第12周)从基线的百 分比变化。应用双样品t-检验，以确定是否在第一组和第二组之间存在显著性差异(图 8A-图8D)。 0.05以下的双尾p-值是显著性的标准，相应于置信水平为95X。所有的统计计 算使用Microsoft Excel或SAS⑧统计分析软件。
结果 20名受试者完成了研究。 一名受试者(#7)出于与测试材料无关的理由停止了研 究参与。 不良事件 在2006年11月20日，受试者恥(分配给安慰剂产品)报告说，在2006年11月 17日，在约9周的安慰剂片剂摄入后，她发现在她面部两侧的脸颊区域和她的前胸上部出 现红色皮疹和麻疹样肿块。这个受试者还报告说，她的这些区域痒。在2006年11月20日， 经CRL认证的皮肤科医生检查，这个受试者被诊断出接触过毒藤。受试者恥继续参与研究。 调查人员确定，这种中度严重的不良事件绝对与测试材料的使用无关。CRL技术人员进行了 后续电话拜访，并将每次通话信息记录如下在2006年11月22日，受试者报告说，麻疹已 消失，面部发红正在减弱。 在2006年11月27日，受试者恥表示，皮疹在干燥，并且几乎所有发红都消失。在 2006年12月8日，受试者报告说，中毒消失，不良的面部皮肤状态已完全解决。
仪器测量、皮肤评价和调查问巻答复 对于两组受试者，图7A-图7D总结了在每一指定研究间隔时每个小组成员的弹性 测量仪测量。表VI列出了为比较第8周和第12周测量与基线之间的差异而确定的统计变 量。对于每个受试者，表VII列出了红斑、水肿和干燥存在的基线、第8周和第12周皮肤评 价的分数。表VIII列出了筛选调查问巻的调查问巻数据[两个受试者组相结合]，基于百 分比。表IX和表X列出了对于第一组(分配给活性片剂的受试者)和第二组(分配给安 慰剂片剂的受试者)的基线和第12周(最终)食入者感知调查问巻的调查问巻数据，基于 百分比。开放式的问题也包括在这些调查问巻表格中。
结i仑 对于每个受试者，研究程序包括血液和尿液分析、坐姿生命体征、妊娠检查(除了 绝经前的小组成员)、弹性测量仪测量结果和食入者感知调查问巻。
血液分析 对于每个受试者，如上所述，在基线和第12周研究间隔进行血液分析。相对于基 线所揭示的，在第12周没有确定临床显著发现。
尿液分析 如上所述，尿液样品在基线和第12周研究间隔从每个受试者获得。相对于基线所 揭示的，在第12周没有确定临床显著发现。
功效评价 根据弹性测量仪参数Ur/Ue的分析，对于第一组受试者(分配给原料成分测试材 料补充剂，10853LLA)，在基线和第12周之间存在统计显著性差异。弹性测量仪参数Ur/Ue 描述了皮肤弹性，因为它涉及到拉伸和收縮。70X的第一组受试者的弹性测量仪参数Ur/Ue 改善。相对于基线，参数Ur/Ue的这种显著增加相当于在第12周时29X的改善，这表明摄入 10853LLA本发明补充剂的第一组受试者的皮肤弹性和扩张性改善。图7A-图8D总结了研 究结果的统计分析。图7D示出从基线到第12周的Ur/Ue统计显著性改善(P = 0. 0109)。
通过Z-分值分析的调查问巻答复包括在第12周(最终)调查问巻中的问题序号 10 15。在每个受试者完成的调查问巻中，如下所列的、适用于Z分值分析的、在第12周(最终访问)的研究人群的有利的食入者感知调查问巻答复被测量为具有统计显著性(Z分 值大于或等于绝对值1. 96)。 显著比例的分配给10853LLA活性片剂的第一组研究人群在补充剂使用12周后， 感知到改善，并且受试者对于下列治疗功效给出了有利的答复 约85%的受试者同意，使用产品12周后，他们经历的肌肉和/或关节疼痛的频率 更低。 约85%的受试者同意，使用产品12周后，总体疼痛的强度更低。 约90%的受试者同意，使用产品12周后，疼痛不再持续那么长。 约85%的受试者同意，该产品对关节和/或肌肉疼痛产生了积极作用。详细的统
计结果显示在图SA-图8B中。 对于分配给10853LLB安慰剂片剂的第二组研究人群，补充剂使用12周后，没有有 利的答复报告。结果显示在图9A-图9B中。
研究的参考文献 Basel, Courage and Clarys， Handbook of Non-InvasiVe Methods andthe
Skin(非侵入性方法与皮肤手册)，Serup andjemec， eds. 1995. Blichman and Serup， Acta Derm Venereol， 1988. Cua，Maibach and Wilhelm，Dermatologica Research, 1990. Dobrev，Sixth Congress of Dermatology and Venerology，Pleve，Bulgaria,May
11-13，1995. Eisner, Eighth International Symposium 〃 B ioengineering and theskin， 〃 Stresa/ltalia， June 1990. Frankowski， Chen and Huth， Photonics West Annual Symposium, Electronics Imaging 2000， San 了ose， 了a丽ry 23_28，2000.Fiorentini， Becheroni， Iorio. Int. J. Cosmet. Sci. 26-29. 1988. Friedman,Skover，Payonk and Geronemus，Seminars in CutaneousMedicine and Surger，200，21(4) :266-273. Krushe and Worre， Archives of Dermatologica Research. 287-293，1995.
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Randeau， Kurdian， Sirvent， Closs and Girard， Cosmetics andToiletries Manufacture Worldwide 2002. Simon，Arzliche Kosmetologie，256-259，1984. 上面提到的所有参考文献都通过引用明确地并入本申请中。单核细胞活化分析用 方法 单核细胞活化分析用于评价免疫剌激活性。用上述包含两拷贝HIV/IgK的NF- k B 基序的荧光素酶报告基因构建体，转染THP-l人单核细胞细胞系。该单核细胞活化分析是 体外检测系统的实例，其可以用于库拉索芦荟提取物和产品材料的生物活性基标准化。
Toll样受体2 (TLR2)表达载体实验的方法 在37°〇、5% C02下，在用胎牛血清(10%)和1 %青霉素_链霉素补充的DMEM/F 12培养基中培养HEK 293细胞。使用电穿孔(150V和一个70毫秒脉冲)用适当的质粒瞬时转染积极生长的细胞。在电穿孔后，将细胞以每培养基孔200iU的5乂104细胞的密度 接种。48小时后，将待测试的试剂加到转染的细胞中。加入样品6小时后，收获细胞并进行 荧光素酶活性测量。NF- k B质粒构建体(pBIIXLUC)包含两拷贝的HIV/IgK的NF- k B基 序。共表达人CD14和人TLR2的质粒(pDU0-hCD14/TLR2)购自InvivoGen。酵母聚糖购自 Sigma，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)肽聚糖购自Fluka，超纯明尼苏达沙门 氏菌(Salmonella mi皿esota) LPS购自List Biological Laboratories, Inc.。
AloeEx通过TLR2依赖性过程在体外活化NF_ k B。 图10A-图10B描绘AloeEx (批号2_5_05)通过TLR2作用。用含有NF_ k B的两 个结合位点的荧光素酶报告基因构建体单独(图10A)或与pDU0-hCD14/TLR2表达质粒结 合(图10B)瞬时转染HEK 293细胞(最小TLR表达的细胞系)。pDU0-hCD14/TLR2表达质 粒表达支持TLR2-(CD14和TLR2)依赖性NF-k B活化的蛋白。转染48小时后，用指定浓度 (yg/ml)的AloeEx TLR2激动剂肽聚糖(PG)或酵母聚糖(Z)或TLR4激动剂超纯明尼苏达 沙门氏菌脂多糖(LPS)处理细胞。在加入试剂的6小时后测定荧光素酶活性。
TLR2特异性(肽聚糖或酵母聚糖)或TLR4特异性(超纯LPS)配体或者AloeEx， 在单独用报告基因质粒转染的HEK 293细胞中都不活化NF-KB-依赖性荧光素酶表达(图 10A) 。 AloeEx在支持TLR2-依赖性(表达CD12和TLR2)活化的细胞中活化NF-k B(图 10B)。肽聚糖和酵母聚糖也在表达TLR2和CD14的细胞中活化NF- k B，而超纯LPS不活化 NF_k B。 ALPS和ALP在AloeEx中的存在 本发明者已经证实，AloeEx含有最可能源于与库拉索芦荟相关的微生物的细菌 LPS和细菌脂蛋白。在AloeEx中存在的这些细菌组分被认为有助于从AloeEx衍生的产品 的治疗性能。 在7(TC下用90^水性苯酚水(1 : 1)提取AloeEx。经冷却提取物并随后离心， 形成两层(水和苯酚)和不溶性材料沉淀。水层包含ALPS。由于脂蛋白上的非极性脂质 部分，苯酚层含有ALP。使用此过程，AloeEx(批号056)分离进水层部分、苯酚层部分和不 溶性材料中。水层部分被冻干(8.9%产率)。通过加入2体积的醚丙酮(1 : 5)和4体 积的乙酸乙酯，使苯酚层中的材料沉淀。用乙酸乙酯和异丙醇充分洗涤苯酚层沉淀，然后在 6(TC下干燥(45%产率)。对原始AloeEx材料、水层部分、苯酚层部分和不溶性材料都进行 单核细胞分析(图11)。用NF- k B荧光素酶报告基因质粒转染24小时后，用所示样品处理 细胞4小时(浓度yg/ml)。测定荧光素酶活性，并作为LPS-处理的细胞最大光输出的百 分比记录。水层和苯酚层均表现出实质单核细胞活性，被认为分别是由于细菌ALPS和ALP 的原因。不溶性材料也是活性的，这通过在5ii g/ml下测试时，它将NF-k B活化增强35% 的能力指示。 在AloeEx苯酚层部分中的ALP的表征 用4%的十二烷基硫酸钠(SDS) (26mg/ml)在10(TC下提取苯酚层部分材料30分 钟，进行三次。通过离心除去SDS不溶性材料，当在单核细胞分析中测试时，SDS不溶性材 料仅占原始苯酚层部分中存在的总活性的约1_2%。 在50mM TRIS(pH 7. 5)、5mM P-巯基乙醇和5mM CaCl2中，将来自白色念球菌 (Tritirachium album)的0. lmg/ml (3. 9单位/ml)蛋白酶K(Sigma)与苯酚层部分的SDS提取物在5(TC下温育2小时。然后在9『C下加热消化10分钟。对照样品，没有蛋白酶K，在相同条件下实验。对于SDS聚丙烯酰胺凝胶分析，提取物(蛋白酶K处理和未经处理的)与1体积的Tris-Tricine样品缓冲液(Bio-Rad)混合，并上样到16. 5% Tris-Tricine预制凝胶(Ready Gel，Bio-Rad)的不相邻泳道中。上样样品量代表130 y g AloeEx苯酚层部分中存在的SDS可提取材料。宽分子量范围蛋白标志物(Sigma)在凝胶中运行。将各凝胶泳道切为12等长段(0. 5cm/段)，并在95。C下用150 yl的1. 5%辛基葡糖苷、2. 5mMTRIS(pH7. 5) 、5mM CaCl2提取5分钟。收集样品上清液，并在单核细胞活化分析中评价活性。
图12表明，该蛋白似乎不直接负责AloeEx苯酚层部分对单核细胞的活化，然而，该蛋白是对该活性负责的分子的一部分。这一点由在蛋白酶K处理后的活性化合物的表观大小下降表明，其通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的分离来确定。在蛋白酶K处理后，在66kDa和6. 5kDa之间区域的活性存在实质降低，而在6. 5kDa和凝胶前沿之间区域的活性增大。这一结果与使用细菌脂蛋白所得的结果相似，因为蛋白酶K消化不会降低脂蛋白的活性(即，脂蛋白的蛋白组分对于单核细胞活化是不必要的)，但是当在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离时，蛋白酶K处理的确减少了脂蛋白大小。图12中〃 C〃和〃 PK〃标记的黑条分别代表在凝胶分离之前未经处理和蛋白酶K处理的AloeEx苯酚层部分的活性。
为确定AloeEx苯酚层部分的4% SDS提取物对脂蛋白脂肪酶的敏感性，使用SDS-out试剂(Pierce)在0. 88%辛基葡糖苷存在下除去SDS。然后将样品调节到最终浓度10 ii M AEBSF蛋白酶抑制剂鸡尾酒溶液(Sigma)和0. 2% BSA (Sigma号A-9418)。将来自假单胞菌(Pseudomonas)物种的39， 600单位/ml (lmg/ml)脂蛋白脂肪酶(Sigma号L9656)与该样品在37t:下温育16小时。对照样品(没有脂蛋白脂肪酶)在相同条件下实验。使用单核细胞活化分析评价脂蛋白脂肪酶处理和未处理的样品的活性。 图13所示的结果表明，AloeEx苯酚层部分的4X SDS提取物中存在的活性被用脂
蛋白脂肪酶的处理完全消除。该结果与图12中提出的结果一起证实，AloeEx苯酚层部分
中的活性是由于ALP的原因。这个过程表明，AloeEx含有ALP，其被认为是源于与库拉索芦
荟相关的微生物。该细菌组分的存在(其与AloeEx中的其他组分相组合)，被认为对该产
品的治疗性能起显著贡献。 AloeEx中的ALPS的表征 以下总结了在AloeEx (批号056)和两种源于这种材料的部分(水层部分和苯酚
层部分)中存在的ALPS的量。 AloeEx (批号056) 625_6250EU/mg AloeEx水层部分62， 500-625， OOOEU/mg AloeEx苯酚层部分< 4. 8EU/mg 使用Pyrosate LAL分析试剂盒(Associates of C即e Cod Inc)，根据生产商说明，估计ALPS的量。正如所料，与苯酚层部分相比，水层部分基本上含有AloeEx中存在的所有ALPS。这一数据证明，AloeEx含有被认为是源于与库拉索芦荟相关的微生物的ALPS。与AloeEx中的其他组分相组合的该细菌组分的存在被认为对该产品的治疗性能起贡献。
在库拉索芦荟中，外皮和粘液含有大部分单核细胞活化组分。 库拉索芦荟叶可分为三个基本结构部分凝胶、外部外皮和粘液(在凝胶和外部外皮之间的层)。进行了一项实验，以确定芦荟叶的哪部分含有最高水平的单核细胞活化组分。通过使刀平行于内部外皮表面通过，从一片库拉索芦荟叶仔细切下凝胶。除去凝胶 后，将叶子在小瓶边缘刮擦，收集粘液部分，并将其与外部外皮分离。所有的三种组分和全 叶芦荟的一部分被冷冻干燥并研磨成细粉末。然后，用甲醇充分提取每种样品，以除去在单 核细胞活化分析中具有抑制作用的非极性物质，如蒽醌。除去非极性物质的样品被制备成 在水中的微细悬浮液。用NF-k B荧光素酶报告基因质粒转染24小时后，使用制备的样品 处理THP-1细胞4小时。测定荧光素酶活性，并记录为ELPS-处理的细胞的最大光输出的 百分比。图14示出不同库拉索芦荟叶部分和整个叶材料的反应。这一数据表明，粘液层和 外部外皮含有芦荟叶中的大部分单核细胞活化组分。在这个实验中，每个叶部分占芦荟叶 总干重的百分比是凝胶(8. 7% )、粘液层(6. 2% )和外皮(85. 1% )。
由于外部外皮和粘液层含有大部分单核细胞活化组分，并且这些部分也包括芦荟 叶中的大部分干固体，因此本发明人认为，外部外皮和粘液层是有市售利益的。通常，在取 出凝胶后或已将整个芦荟叶加工以产生芦荟汁后，外部外皮被作为废品弃去。另一种废品 是芦荟幼体(在较大植物外生长的小的芦荟植物)。由于芦荟幼体主要含有外皮，凝胶极 少，而且被认为几乎没有市售价值。外皮和芦荟幼体的废品可以被加工，以产生例如增强免 疫功能的膳食补充剂。干的外皮可以磨成粉末，并被加工以除去蒽醌。这种材料可以进一步 通过提取而加工，以产生粗提取物和纯化组分。粗提取物和纯化组分的目标是浓縮AloeEx 和/或与库拉索芦荟相关的微生物和微生物碎片/组分的量。
AloeEx中的单核细胞活化组分在洗涤剂中是可提取和可溶的
为开发各种产品(如化妆品)，可能需要增溶AloeEx材料中的免疫增强组分。免 疫增强组分包括Aloeride多糖、源于与库拉索芦荟相关的微生物的ALP和ALPS。如前文所 述，AloeEx材料的免疫增强组分的显著部分可以被分成水层部分和苯酚层部分。苯酚层部 分(ALP)中存在的免疫增强活性可以用4% SDS在10(TC下完全提取/增溶。水层(ALP和 Aloeride多糖)中存在的免疫增强活性是水溶性的，也是SDS可溶解性的。
用SDS提取AloeEx代表增溶该材料中存在的免疫增强组分的显著部分的潜在方 法。数据表明，其他已知的洗涤剂(包括与产品配制更兼容的那些)也可以潜在地用于 AloeEx材料中的免疫增强组分的提取/增溶。这种洗涤剂提取的方法也可以用来增溶源于 原料如全叶、外皮、芦荟幼体等的单核细胞活化组分(即，Aloeride多糖和与库拉索芦荟相 关的微生物组分)。 通过分离与库拉索芦荟相关的微生物和微生物组分/碎片来制备提取物的方法
经证实，来自与库拉索芦荟相关的微生物的细菌产品对AloeEx的免疫增强性能 的显著部分负责。已经表明，AloeEx占据库拉索芦荟体外单核细胞/巨噬细胞活化潜力的 大部分。因此，据认为，来自微生物的细菌产品对库拉索芦荟的免疫增强性能的显著部分负责。 浓縮与库拉索芦荟相关的微生物和/或微生物组分/碎片的量的提取物可以从粗 芦荟材料和/或库拉索芦荟原料制备，包括废料(例如剩余的外皮、芦荟幼体等)。粗提取 物可被加工，以通过用溶剂提取细菌脂蛋白和/或其他细菌组分而产生纯化部分。这些部 分含有更高水平的与库拉索芦荟相关的细菌组分。可以用于制备纯化部分的溶剂包括洗涤 剂，如SDS、水、水可混溶剂如醇，以及这些溶剂或本领域中公知的其他溶剂的组合。
以下程序可用于制备浓縮与库拉索芦荟相关的微生物和/或微生物组分/碎片的提取物。库拉索芦荟原料(凝胶、全叶、外皮、芦荟幼体等)可以使用本领域已知的方法液 化。液体可以经过粗过滤，以去除纤维材料。食品级絮凝剂(净水剂或类似物质)可以加 到液化的芦荟中，以产生颗粒(细菌、其他微生物、微生物碎片/组分)的聚集体。然后，这 些聚集的颗粒可以使用本领域已知的方法与其余的液体分离。这些方法包括离心、过滤、沉 降后倾倒、采用网从液体过滤聚集体等。最终收集的材料也可以被加工，以除去蒽醌(如果 存在)，其使用诸如洗涤/用醇提取等技术。如果需要，可以干燥由此产生的材料。
制备标准化库拉索芦荟产品的方法 生物和化学标准化代表了可用于标准化本发明所述的含有免疫增强剂的库拉索 芦荟产品的两种方法。这两种方法均可用于标准化提取物材料或原料。标准化的目的是确 保每一批产品材料都含有相同水平的活性成分。 在一个方法中，制备含有有效量的免疫剌激活性的生物活性标准化的库拉索芦荟
产品。在此方法中，体外测试库拉索芦荟产品材料对免疫细胞的活化，然后将生物活性与标
准制品的免疫剌激性值比较，以确定该产品的标准化的活性值。体外测试系统的实例是前
面描述的单核细胞活化分析。当活性组分的化学含量由于不明的构效关系和/或多种活性
物质之间复杂的相互作用而与生物活性无关时，产品材料的生物活性基标准化是重要的。
在这种情况下，活性物质的量不足以反映产品材料的效力，通过使用生物分析来标准化是
所期望的。生物活性标准化已应用于生物制药如胰岛素和细胞因子的制药业。 在另一种方法中，制备含有有效量的源于与库拉索芦荟相关的微生物的免疫剌激
性脂蛋白的化学标准化的库拉索芦荟产品。可以用于标准化的化学标志物是2，3_ 二羟基
丙基半胱氨酸。这种经修饰的半胱氨酸氨基酸被认为对于得自原核生物的免疫剌激性脂蛋
白是独特的。在此方法中，库拉索芦荟产品材料被测试2，3-二羟基丙基半胱氨酸的量，然
后与标准制品的2，3_ 二羟基丙基半胱氨酸的量相比，以确定该产品的标准化值。 在某些实施方案中，食品级絮凝剂、净水剂或凝结剂可用于形成微生物聚集体。实
例包括但不限于例如明矾、聚合氯化铝、硫酸铝、氧化钙、氯化铁(ni)、硫酸铁(n)、聚丙
烯酰胺、铝酸钠、硅酸钠及其组合。也可作为絮凝剂的天然产品包括壳聚糖、辣木(Moringa oleifera)种子、木瓜蛋白酶、马钱子物种(种子)鱼胶及其组合。其他的这类材料是本领 域技术人员众所周知的。 虽然已经参照特定实施方案描述了本发明，但应该理解，这些实施方案只是用于 说明本发明的原理和应用。因此，应该理解，在不背离所附权利要求书限定的本发明精神和 范围下，可以对示例性实施方案作出多种修改和设计其它配置。
权利要求
免疫刺激性组合物，包括以下中至少任意两种的混合物(1)衍生于芦荟的多糖，(2)衍生于芦荟的脂蛋白，和(3)衍生于芦荟的脂多糖，所述混合物表现为通过浓度约10μg/mL的细菌脂多糖实现的最大NF-κB指导的荧光素酶表达的至少约50％的免疫刺激活性，其中通过在浓度约250μg/mL以下，THP-1单核细胞中NF-κB指导的荧光素酶表达测量所述免疫刺激活性。
2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述混合物包括衍生于芦荟的多糖、衍生于芦荟的脂蛋白和衍生于芦荟的脂多糖。
3. 如权利要求1所述的组合物，其中所述混合物包括约0. 01 % 约50%的衍生于芦荟的多糖和总量约0. 0001% 约10%的衍生于芦荟的脂蛋白和衍生于芦荟的脂多糖。
4. 如权利要求3所述的组合物，其中所述混合物包括约1% 约20%的衍生于芦荟的多糖。
5. 如权利要求1所述的组合物，其中所述衍生于芦荟的多糖的表观分子量大于约200万道尔顿并包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。
6. 如权利要求1所述的组合物，其中所述混合物从芦荟外皮、芦荟粘液、芦荟凝胶、全叶芦荟或其组合得到。
7. 如权利要求1所述的组合物，还包括与所述混合物混合的药物载体或赋形剂。
8. 如权利要求7所述的组合物，其中所述混合物包括约0. 01% 约50%的衍生于芦荟的多糖和总量约0. 0001% 约10%的衍生于芦荟的脂蛋白和衍生于芦荟的脂多糖。
9. 免疫剌激性组合物，包括衍生于芦荟的脂蛋白，其中所述衍生于芦荟的脂蛋白表现为通过浓度约10 ii g/mL的细菌脂多糖实现的最大NF- k B指导的荧光素酶表达的至少约50%的免疫剌激活性，其中通过在浓度约250ii g/mL以下，THP-1单核细胞中NF-k B指导的荧光素酶表达测量所述免疫剌激活性。
10. 治疗关节和/或肌肉疼痛的方法，包括给予有需要的受试者有效量的衍生于库拉索芦荟(Aloe vera)的材料，所述衍生于库拉索芦荟的材料表现为通过浓度约10 y g/mL的细菌脂多糖实现的最大NF-KB指导的荧光素酶表达的至少约50X的免疫剌激活性，其中通过在浓度约250 ii g/mL以下，THP-1单核细胞中NF- k B指导的荧光素酶表达测量所述免疫剌激活性。
11. 如权利要求io所述的方法，其中所述受试者是人类。
12. 如权利要求IO所述的方法，其中所述受试者是动物。
13. 治疗关节和/或肌肉疼痛的方法，包括给予有需要的受试者治疗剂量为每天约0. 2毫克(mg)至约1克(g)的至少一种衍生于库拉索芦荟(Aloe vera)的免疫剌激性组合物。
14. 增强皮肤的外观、肌理、硬度和/或弹性的方法，包括给予有需要的受试者有效量的衍生于库拉索芦荟(Aloe vera)的材料，所述衍生于库拉索芦荟的材料表现为通过浓度约lOii g/mL的细菌脂多糖实现的最大NF-k B指导的荧光素酶表达的至少约50X的免疫剌激活性，其中通过在浓度约250ii g/mL以下，THP-1单核细胞中NF-k B指导的荧光素酶表达测量所述免疫剌激活性。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述受试者是人类。
16. 如权利要求14所述的方法，其中所述受试者是动物。
17. 增强皮肤的外观、肌理、硬度和/或弹性的方法，包括给予有需要的个体治疗剂量为每天约0. 0005毫克(mg)至约1克(g)的至少一种衍生于库拉索芦荟(Aloe vera)的免疫剌激性组合物。
18. 治疗疾病或状态的方法，包括给予有需要的受试者有效量的衍生于库拉索芦荟(Aloe vera)的材料，所述衍生于库拉索芦荟的材料表现为通过浓度约10 y g/mL的细菌脂多糖实现的最大NF- k B指导的荧光素酶表达的至少约50%的免疫剌激活性，其中通过在浓度约250 g/mL以下，THP-1单核细胞中NF- k B指导的荧光素酶表达测量所述免疫剌激活性，和其中所述疾病或状态选自免疫缺陷、癌症、细菌感染、病毒感染、真菌感染和伤口 。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述受试者是人类。
20. 衍生于库拉索戸荟(Aloe vera)的组合物，包括第一衍生于库拉索芦荟的免疫剌激性组合物；禾口第二衍生于库拉索芦荟的材料，选自第二衍生于库拉索芦荟的免疫剌激性组合物和衍生于库拉索芦荟的非免疫剌激性材料；禾口其中所述第二衍生于库拉索芦荟的材料的量等于或大于所述第一衍生于库拉索芦荟的免疫剌激性组合物的量，和其中所述组合物是基本上均质的溶液、悬浮液、分散液或乳液。
21. 如权利要求20所述的组合物，其中所述第二衍生于库拉索芦荟的材料选自MagnAloe AG、库拉索戸荟凝胶1 X 、库拉索戸荟凝胶10X 、库拉索戸荟凝胶200X 、库拉索芦荟全叶喷雾干燥的粉末100X，库拉索芦荟全叶脱色的液体、乙酰化甘露聚糖、库拉索芦荼粘多糖(mucilaginous polysaccharide)禾口蜜露宝(Manapol)。
22. 制备用于治疗疼痛或增强皮肤的外观、肌理、硬度和/或弹性的衍生于库拉索芦荟(Aloe vera)的组合物的方法，包括a) 组合第一衍生于库拉索芦荟的免疫剌激性组合物与第二衍生于库拉索芦荟的材料；b) 形成所述第一衍生于库拉索芦荟的免疫剌激性组合物、所述第二衍生于库拉索芦荟的材料和溶剂的混合物；禾口c) 使所述混合物均质化，其中所述第二衍生于库拉索芦荟的材料的量等于或大于所述第一衍生于库拉索芦荟的免疫剌激性组合物的量，和所述组合物是基本上均质的溶液、悬浮液、分散液或乳液。
全文摘要
本发明涉及通过向有治疗需要的个体给予有效量的衍生于库拉索芦荟(Aloe vera)的免疫刺激性组合物，为该个体提供皮肤增强和疼痛减轻的方法。提供了口服和局部方法和组合物。还提供了衍生于库拉索芦荟的免疫刺激性组合物和制备所述组合物的方法。
文档编号A61K36/886GK101720226SQ200880023047
公开日2010年6月2日 申请日期2008年5月9日 优先权日2007年5月11日
发明者埃尔文·尼德曼, 埃里克斯·帕施沃斯基, 大卫·斯坦利·帕斯科, 尼尔莫·德里克·瑟里·普格, 迪奈斯·蒂保恩 申请人:芦荟研究实验室公司;密西西比大学