蛋白酶稳定化的、peg化的胰岛素类似物的制作方法

专利名称：蛋白酶稳定化的、peg化的胰岛素类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及对蛋白酶显示抗性的新的PEG化的胰岛素类似物，制备这种胰岛素类 似物的方法，包含本发明的胰岛素类似物的胰岛素制剂，和使用这些胰岛素类似物来治疗 糖尿病的方法。

背景技术：
糖尿病是代谢病，在这种病中，使用葡萄糖的能力部分或完全失去。在所有人中大 约5%的人患有糖尿病，并且这种障碍接近流行比例。自从在1920年代引入胰岛素以来，人 们为了改进糖尿病的治疗而进行了连续努力。由于患有糖尿病的人需要进行长期治疗(几 十年)，安全、方便和生活质量得到改进的胰岛素制剂是主要需要。 人胰岛素由两个多肽链组成，所谓的A和B链，其分别包含21和30个氨基酸残基， 并且其通过两个胱氨酸二硫桥相互连接。 到目前为止，口服途径是最广泛使用的药物给予途径，并且通常能够被患者很好 地接受，尤其是长期治疗的患者。然而，由于一些屏障，例如，在胃肠(GI)道和肠粘膜中的 酶催降解、药物射流泵、从肠粘膜中吸收不充分和发生变化、以及在肝中的首过代谢，治疗
肽或蛋白的给予常常局限于肠胃外途径，而不是优选的口服途径。 通常，胰岛素制剂是通过皮下注射给药的。然而，由于患者的依从性、安全性和便 利性，通过其它途径例如口服或肺部给予是有利的。 一些商业上可得到的胰岛素制剂的特 点在于快速起作用，其它制剂起效相对缓慢，但具有或多或少的延长作用。
为口服蛋白/肽递送而设计的最新制剂包括与蛋白酶抑制剂、渗透增强剂、聚合 物基递送系统和胰岛素共轭物的共同制剂。后者包括己基-胰岛素-单共轭物-2(HIM2)，其 是具有与B29连接的PEG 7-己基的人胰岛素类似物。在例如US 7， 030， 082、US 6， 867， 183 和US 6， 770， 625中，已经报道了 口服HM2具有提高的解朊稳定性和生物利用率(与胰岛 素相比)。例如，WO 02/098446涉及共轭物的基本上单分散性混合物，每个共轭物包含与寡 聚物偶合的药物，寡聚物包含聚亚烷基二醇部分，其中所述药物是多肽，例如胰岛素肽。在 WO 02/098446的实施例124中，描述了一些胰岛素-寡聚物共轭物，其中胰岛素肽是人胰岛 素；人胰岛素对酶是不稳定的，即，对糜蛋白酶不稳定。按照权利要求1，US2006/0019874A1 涉及包含下列的复合物(a)胰岛素化合物共轭物，其包含与修饰部分共轭的胰岛素化合 物，和(b)阳离子，其中胰岛素化合物共轭物与阳离子复合。
发明方面 本发明的一个方面涉及提供胰岛素类似物，当口服给药时，其可以产生令人满意 的血糖控制水平。 本发明的另一个方面涉及提供胰岛素类似物，当通过肺部给药时，其可以产生令 人满意的血糖控制水平。 本发明的另一个方面涉及提供胰岛素类似物，当通过肺部给药时，其可以产生令
人满意的血糖控制水平，同时起效相对缓慢，并且或多或少地具有延长作用。 本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代品。
定义 本文中，术语胰岛素包括天然存在的胰岛素，例如人胰岛素，以及其胰岛素类似 物。
本文中，术语氨基酸残基包括从氨基上除去氢原子和/或从羧基上除去羟基和/ 或从巯基上除去氢原子的氨基酸。不严密地说，氨基酸残基可以被称为氨基酸。
本文中，疏水性的氨基酸是天然存在的氨基酸色氨酸(Trp， W)，苯丙氨酸(Phe， F)，缬氨酸(Val，V)，异亮氨酸(Ile，I)，亮氨酸(Leu， L)和酪氨酸(Tyr， Y)(在括号中是三 个字母和一个字母縮写)。 本文中，亲水性的氨基酸要被理解为天然氨基酸，其不是按照上面定义的疏水性
氨基酸。在一个实施方案中，按照本发明的亲水性酸选自谷氨酸(Glu，E)，门冬氨酸(Asp，
D)，组氨酸(His， H)，谷氨酰胺(Gln， Q)，天冬酰胺(Asn， N)，丝氨酸(Ser， S)，苏氨酸(Thr，
T)，脯氨酸(Pro，P)，甘氨酸(Gly，g)，赖氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R)。在进一步实施方
案中，按照本发明的亲水性氨基酸选自谷氨酸(Glu，E)，门冬氨酸(Asp，D)，组氨酸(His，
H)，谷氨酰胺(Gln， Q)，天冬酰胺(Asn， N)，赖氨酸(Lys， K)和精氨酸(Arg， R)。 本文中，术语胰岛素类似物包括多肽，通过除掉和/或替代(置换)天然胰岛素中
存在的一个或多个氨基酸残基和/或通过添加一个或多个氨基酸残基，其具有形式上可以
源自于天然存在胰岛素例如人胰岛素结构的分子结构。添加和/或替代的氨基酸残基可以
是可编码的氨基酸残基或其它天然存在的氨基酸残基或纯粹合成的氨基酸残基。 本文中，术语子胰岛素(daughter insulin)是指没有附加PEG部分的胰岛素。所
述子胰岛素对蛋白酶的降解作用具有改善的稳定性。 本文中，术语母体胰岛素是指没有附加PEG部分和没有突变来改善针对蛋白酶降 解作用的稳定性的胰岛素。相对于人胰岛素，所述母体胰岛素具有任选的突变。由此，母体 胰岛素还是上述胰岛素类似物。 本文中，术语突变包括氨基酸序列的任何变化(用可编码的氨基酸进行替代和嵌 入，以及缺失)。 本文中，术语人胰岛素的A链的类似物和B链的类似物分别包括人胰岛素的A和B 链，分别相对于人胰岛素的A和B链，其分别具有A和B氨基酸链的一个或多个替代、缺失 和/或延长(添加)。 本文的术语例如A1、A2、A3等等分别表明胰岛素A链中的位置1、2和3(从N端计 算)。同样，术语例如Bl、B2、B3等等分别表明胰岛素B链中的位置1 、2和3 (从N端计算)。 使用氨基酸的一个字母代码，术语例如A21A、A21G和A21Q表示在A21位置的氨基酸分别是 A、G和Q。使用氨基酸的三个字母代码，相应的表达分别是AlaA21、GlyA21和GlnA21。
本文中，术语A(O)或B(O)表示分别与Al或Bl位置相邻的N-末端位置(分别 在A或B链中)。术语A(-1)或B(-1)分别表示第一个氨基酸N-末端相对于A(O)或B(O) 的位置。由此，A(-2)和B(-2)分别表示相对于A(-1)和B(-1)的N-末端位置，A(-3)和 B(-3)分别表示相对于A(-2)和B(-2)的N-末端位置，等等。 本文中，术语例如desB29和desB30分别表示缺乏B29或B30氨基酸残基的胰岛 素类似物。 快速起作用的胰岛素是指具有比正常或普通的人胰岛素起效更快的胰岛素。
长效胰岛素是指比正常或普通的人胰岛素作用时间更长的胰岛素。 对胰岛素类似物、胰岛素和A和B链中的位置加以编号，以使母体化合物是人胰岛
素，其具有用于它的编号。 本文使用的术语基本胰岛素是指胰岛素肽，其具有超过8小时的时间作用，特别
地为至少9小时。优选，基本胰岛素具有至少10小时的时间作用。由此，基本胰岛素可以
具有大约8至24小时的作用时间，优选在大约9至大约15小时的范围。 本文中，术语连接基包括将胰岛素的-HN-基团与PEG部分的-0-基团连接的化学
部分。连接基对最终PEG化胰岛素的目标作用没有任何影响，尤其它不具有任何不利的影响。 本文使用的"PEG"或聚乙二醇是指任何水溶性的聚(氧化乙烯)。词语PEG包括 结构-(CH2CH20)n-，其中n是2至大约1000的整数。通常使用的PEG是封端PEG，其中PEG 端的一端是用相对非活性的基团例如烷氧基封端的，而另一端是可以进一步通过连接基部 分修饰的羟基。常常使用的封端基团是甲氧基，而相应的封端PEG常常表示为mPEG。由此， mPEG是CH30(CH^40)n-，其中n是足以产生全部PEG部分所表示的平均分子量的2至大约 1000的整数，例如，如果mPEG的Mw是2，000，那么n是大约44(该数字受批次与批次之间 的变化的影响)。常常使用概念PEG来代替mPEG。 本发明的具体PEG形式是支链、直链、叉状、哑铃状PEGs，等等，并且PEG基团一般 是多分散的、具有小于大约1. 05的低多分散指数。对于给定分子量，存在于胰岛素中的PEG 部分一般由一定量乙二醇(或亚乙氧基)单体组成。例如，分子量2000的PEG部分一般由 44士10个单体组成，平均数大约44个单体。分子量(和单体数目) 一般受批次与批次之间 的变化的影响。 其它具体PEG形式是单分散形式，其同样可以是支链、直链、叉状或哑铃形的。单 分散是指PEG聚合物的长度(或分子量)被具体限定，并且不是各种长度(或分子量)的混 合物。本文中，使用概念mdPEG来表示mPEG部分是单分散的，使用"d"表示"分散的"。在 mdPEG后面的下标数字，例如mdPEG^，表示在单分散聚合物(寡聚物)内的乙二醇单体的数 目，在mdPEG^的情况下是12。 术语PEG化的胰岛素包括将一个或多个PEG部分通过连接基与子胰岛素连接的 胰岛素的改型。PEG部分可以在N端a-氨基上或在赖氨酸残基的Y位置上通过亲核取 代(酰化)连接，例如，用OSu-活化酯，或PEG部分可以通过还原烷基化作用连接-还在存 在于胰岛素分子中的氨基上_使用PEG-醛试剂和还原剂，例如氰基硼氢化钠，或者，使用例 如PEG马来酰亚胺试剂，PEG部分可以在迈克尔加成反应中与未配对的半胱氨酸残基的侧 链相连接。 具有胰岛素活性的PEG化的胰岛素是指适当给药之后(例如，静脉内或皮下给 药)，具有降低温血动物血糖能力(在合适的动物模型中测定，动物模型可以是例如大鼠、 兔子或猪模型)或具有胰岛素受体结合亲合性的PEG化的胰岛素。 本文中，术语烷基包括具有1至12个碳原子的饱和、支链或直链烃基团，优选1至 6个碳原子，更优选1至4个碳原子。 本文中，术语烷氧基包括自由基"烷基-O-"，其中烷基如以上所定义。代表性的 实例是甲氧基，乙氧基，丙氧基(例如，l-丙氧基和2-丙氧基)，丁氧基(例如，l-丁氧基，2- 丁氧基和2-甲基-2-丙氧基)，戊氧基(1-戊氧基和2-戊氧基)，己氧基(1-己氧基和 3_己氧基)，等等。 本文中，术语亚烷基包括具有1至12个碳原子的饱和、支链或直链二价烃基团， 优选1至6个碳原子，更优选1至4个碳原子。代表性的实例包括但不局限于亚甲基，1， 2-亚乙基，l，3-亚丙基，l，2-亚丙基，l，3-亚丁基，l，4-亚丁基，l，4-亚戊基，l，5-亚戊基， 1，5-亚己基，1，6-亚己基，等等。 高物理稳定性是指原纤化倾向小于人胰岛素原纤化倾向的50%。原纤化可以通过 在给定条件下原纤维开始形成之前的滞后时间来描述。 具有胰岛素受体和IGF-1受体亲合性的多肽是在合适结合试验中能够与胰岛素 受体和人IGF-1受体相互作用的多肽。这种受体试验在本领域是众所周知的，并且进一步 在实施例中描述。本发明的PEG化胰岛素不会与IGF-1受体结合，或与所述受体具有相当 低的亲合性。更确切地说，本发明的PEG化胰岛素对IGF-1受体的亲合性基本上与人胰岛 素的亲合性相同或更小。 本文使用的术语治疗和医冶是指为了抵御疾病、障碍或病症而对患者的处理和护 理。该术语包括延迟疾病、障碍或病症的逐渐发展，减轻或缓和症状和并发症，和/或治愈 或消除疾病、障碍或病症。所治疗的患者优选哺乳动物，尤其是人。 本文使用的术语治疗疾病是指处理和护理已经形成疾病、障碍或病症的患者。治 疗的目的是抵御疾病、病症或障碍。治疗包括给予活性化合物，以消除或控制疾病、病症或 障碍，以及减轻与疾病、病症或障碍有关的症状或并发症。
本文使用的术语疾病的预防定义为在疾病的临床发作之前，处理和护理处于形
成疾病危险之中的个体。预防的目的是抵御疾病、病症或障碍的发展，并且包括给予活性化
合物，以预防或延迟症状或并发症的起始，和预防或延迟相关疾病、病症或障碍的发展。 本文使用的术语有效量是指与不治疗相比较，有效治疗患者的充足剂量。 P0T是粟酒裂殖酵母磷酸丙糖异构酶基因，TPI1是酿酒酵母磷酸丙糖异构酶基因。 先导物是指由前肽(信号肽)和肽原组成的氨基酸序列。 术语信号肽是指在蛋白的前体物形式上以N端序列形式存在的前肽。信号肽的功 能是使异源蛋白质便于迁移到内质网中。在该过程期间，信号肽通常断裂掉。信号肽可以 是与制备蛋白的酵母有机体异源或同源的。可以与本发明的DNA结构一起使用的许多信号 肽包括酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽或任何功能性的类似物(Egel-Mitani等人 (1990)YEAST 6:127-137和US 5,726,038)和MFal基因的a -因子信号(Thorner (1981) in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomycescerevisiae， Strathern等人， eds. ，pp 143-180，Cold Spring Harbor Laboratory, NY and US 4,870,00)。
术语肽原是指多肽序列，其功能是使表达的多肽从内质网中直接进到高尔基体 中，并且进一步进入分泌小泡中，分泌到培养基中(即，多肽穿过细胞壁或至少通过细胞膜 输出到酵母细胞的周质间隙中)。肽原可以是酵母a-因子肽原，参阅US 4，546，082和 4， 870， 008。或者，肽原可以是合成肽原，也就是说，在自然界中未发现的肽原。合适的合成 肽原是公开在US 5， 395， 922、5， 795， 746、5， 162， 498和W0 98/32867中的那些肽原。优选， 肽原包含肽链内切酶加工位点(在C端)，例如Lys-Arg序列，或其任何功能性的类似物。
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除非明确表示，否则本文提到的氨基酸是L-氨基酸。进一步的，肽的氨基酸序列 的左和右端分别是N-和C-端，除非另作说明。 在具体说明和实施例中使用下列縮写Da是道尔顿(分子量)，kDa是千道尔顿 (=lOOODa) ， mPEG-SBA是mPEG-CH2CH2CH2-CO_OSu (mPEG- 丁酸的N_羟基琥珀酰亚胺基酯)， mPEG-SMB是mPEG_CH2CH2CH (CH3) -CO-OSu (mPEG- a -甲基丁酸的N_羟基琥珀酰亚胺基酯)， mPEG-SPA是mPEG-CH2CH2-CO-OSu (mPEG-丙酸的N_羟基琥珀酰亚胺基酯)，Mw是分子量， OSu是1-琥珀酰亚胺基氧基=2， 5- 二氧代吡咯烷-1-基氧基，R是室温，SA是芥子酸，Su 是1-琥珀酰亚胺基=2， 5- 二氧代吡咯烷-1-基。
本发明概述 已经发现，对解朊降解作用稳定(通过具体突变)和在B29-赖氨酸处PEG化的胰 岛素是有效的和作用延长的，并且作为可以通过肺部或口服给药的延长的胰岛素具有很高 的潜力。此外，口服之后，与类似的已知PEG化的胰岛素(其针对解朊降解作用不稳定，并 且其中胰岛素骨架针对解朊降解作用不稳定)相比，本发明的PEG化胰岛素具有更高程度 的生物利用率。由此，本发明的这些PEG化的胰岛素类似物具有口服给药价值。同样，肺部 给药之后，与类似的已知PEG化的胰岛素(其针对解朊降解作用不稳定，并且其中胰岛素骨 架针对解朊降解作用不稳定)相比，本发明的这些PEG化蛋白酶稳定的胰岛素显示了更高 的明显效能和/或生物利用率。此外，当通过肺部给予哺乳动物时，本发明的这些PEG化的 蛋白酶稳定的胰岛素显示了延长的时间作用特性。由此，本发明的这些PEG化的胰岛素类 似物具有肺部给药的价值。 对解朊降解作用稳定的上述胰岛素在本文中称为子胰岛素。 在子胰岛素中，当存在N端氨基或与其连接或在两个位置连接时，通过合适连 接基基团，PEG基团可以与赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链相连接。连接基一般是羧酸的 衍生物，其中羧酸官能团用于连接子胰岛素(通过酰胺键)。连接基可以是具有连接基 序-CH2CO-的乙酸部分，具有连接基序_CH2CH2CO-或-CHCH3CO-的丙酸部分，或具有连接基 序-CH2CH2CH2CO-或-CH2CHCH3CO-的丁酸部分。或者，连接基可以是_C0_基团。
在子胰岛素的B链中，存在于B29位置的赖氨酸残基的PEG化是所需要的。此外， 在子胰岛素中，在A链中，在位置1至21 (A1-A21)的任何位置最好不存在Lys，在B链中，在 位置1至28 (B1-B28)的任何位置不存在Lys。优选的子胰岛素是不具有B30氨基酸的胰岛 素。 相对于人胰岛素，子胰岛素分子具有有限数量的天然存在的、被其它氨基酸残基 替代的氨基酸残基(如说明书的详细部分所述)。 在一个实施方案中，本发明涉及PEG化的胰岛素，其中子胰岛素类似物在一个或 多个下列的缺失或替代方面与人胰岛素不同Q在位置A18， A、 G或Q在位置A21， G或Q在 位置Bl或在位置Bl没有氨基酸残基，Q、 S或T在位置B3或在位置B3没有氨基酸残基，Q 在位置B13，在位置B27没有氨基酸残基，D、 E或R在位置B28，和在位置B30没有氨基酸。
正如本领域所众所周知的那样，PEG基团可以在很大范围内在大小方面有差异。然 而，太大的PEG基团可以消极方式干扰PEG化的胰岛素分子的生物活性。
在进一步方面，本发明涉及包含本发明的PEG化胰岛素和合适佐剂和添加剂的药 物制剂，佐剂和添加剂例如一或多种适合于稳定化、保藏或等渗压的试剂，例如，锌离子、苯酚、甲酚、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、丙三醇或甘露糖醇。存在于制剂中的锌含量可以是每个 胰岛素六聚体存在0和大约6个锌原子之间。药物制剂的pH值可以在大约4和大约8. 5 之间，在大约4和大约5之间，或在大约6. 5和大约7. 5之间。 在进一步实施方案中，本发明涉及PEG化胰岛素作为药物的用途，用于降低温血 动物(mammalians)血糖水平，特别用于治疗糖尿病。 在进一步方面中，本发明涉及PEG化胰岛素用于制备药物制剂的用途，该药物制 剂用于降低温血动物血糖水平，特别用于治疗糖尿病。 在进一步方面中，本发明涉及降低温血动物血糖水平的方法，该方法给予需要这 种治疗的患者治疗活性剂量的本发明的PEG化胰岛素。 在本发明的进一步方面，PEG化的胰岛素与一或多种其它活性物质以任何合适比 例组合给予。这种其它活性剂可以选自人胰岛素，快速作用的胰岛素类似物，抗糖尿病药， 抗高血脂药，抗肥胖剂，抗高血压药和用于治疗源于糖尿病或与其有关的并发症的药剂。
在一个实施方案中，两种活性组分以混合药物制剂形式给予。在另一个实施方案 中，两种组份可以同时或顺序地单独给予。 在一个实施方案中，本发明的PEG化胰岛素可以与快速作用的人胰岛素或人胰 岛素类似物一起给予。这种快速作用的胰岛素类似物可以是如下这种其中在位置B28 的氨基酸残基是Asp、 Lys、 Leu、 Val或Ala，和在位置B29的氨基酸残基是Lys或Pro， des(B28-B30)人胰岛素，des(B27)人胰岛素或des (B30)人胰岛素，和其中在位置B3的氨 基酸残基是Lys和在位置B29的氨基酸残基是Glu或Asp的类似物。本发明的PEG化胰岛 素和快速起作用的人胰岛素或人胰岛素类似物可以下列比例混合大约90 %的PEG化胰岛 素与大约10X的快速起作用的人胰岛素或人胰岛素类似物；优选大约70X的PEG化胰岛素 与大约30%的快速起作用的人胰岛素或人胰岛素类似物，且更优选大约50%的PEG化胰岛 素与大约50%的快速起作用的人胰岛素或人胰岛素类似物(％是重量百分数)。
本发明的PEG化胰岛素还可以与抗糖尿病药一起用于组合治疗。
抗糖尿病药包括胰岛素，在WO 98/08871、 WO 99/43706、 US5424286和WO 00/09666中描述的GLP-1 (1-37)(胰高血糖素样肽_1) ， GLP_2， exendin-4 (1-39)，其促胰岛 素分泌片段，其促胰岛素分泌类似物和其促胰岛素分泌衍生物。GLP-1 (1-37)的促胰岛素分 泌片段是促胰岛素分泌肽，其整个序列可以在GLP-1 (1-37)的序列中得到，并且缺失至少 一个端部氨基酸。 本发明的PEG化胰岛素也可以与口服抗糖尿病药例如噻唑烷二酮、二甲双胍及其 它用于口服治疗的II型糖尿病药物制剂一起用于组合治疗。 此外，本发明的PEG化胰岛素可以与一或多种抗肥胖药剂或食欲调节剂组合给予。 在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的PEG化胰岛素和合适佐剂和添加剂
的肺部给予的药物制剂，佐剂和添加剂例如一或多种适合于稳定化、保藏或等渗压的试剂，
例如，锌离子、苯酚、甲酚、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、丙三醇、丙二醇或甘露糖醇。 应该理解，认为PEG化胰岛素与饮食和/或锻炼、一或多种上述化合物和任选一或
多种其它活性物质的任何合适组合在本发明范围之内。 附图的简要说明


图1是与胰岛素阿速帕(aspart)相比较、在大鼠中气管内滴注之后的实施例1的
胰岛素的血糖特性图。该方案描述在实施例10中。每个组使用4-5个动物。 图2是与比较物(B29K(NE (-3-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙
酰)，desB30人胰岛素)相比较的实施例4的胰岛素的血糖特性图(注射到大鼠的中间空
肠中之后)。该方案描述在实施例11中。每个试验组使用7个动物，在赋形剂组中使用3
个动物。给予的剂量体积0. 4ml/kg。 优选实施方案的说明 胰岛素的稳定性和溶解性是现行胰岛素疗法的重要的基础方面。通过提供稳定 的、PEG化的胰岛素类似物，本发明致力于解决这些问题，其中PEG化可以降低分子柔顺性， 和同时降低原纤化倾向和限制或改变PH沉淀区域。 本发明的PEG化胰岛素尤其可用于肺部或口服给药，这是由于它们与例如人胰岛 素和PEG化的人胰岛素相比具有比较高的生物利用率。此外，PEG化的胰岛素具有延长的 胰岛素活性。 如上所述，对解朊降解作用稳定化的上述胰岛素在本文中称为子胰岛素。本发明
的PEG化胰岛素是本文所描述的PEG化的所述子胰岛素。 所述子胰岛素源自于本文称为母体胰岛素的胰岛素化合物。 在一个实施方案中，母体胰岛素选自a)人胰岛素；b)人胰岛素的胰岛素类似物， 其中在B28位的氨基酸残基是Pro、Asp、Lys、Leu、Val或Ala，在B29位的氨基酸残基是Lys 或Pro，和任选地，在B30位的氨基酸残基缺失；c)胰岛素类似物，其是des(B28-B30)人胰 岛素，des(B27)人胰岛素或des(B30)人胰岛素；d)人胰岛素的胰岛素类似物，其中在B3 位的氨基酸残基是Lys，和在B29位的氨基酸残基是Glu或Asp ;e)人胰岛素的胰岛素类似 物，其中在A21位的氨基酸残基是Gly，且其中胰岛素类似物在B链的C端进一步用两个精 氨酸残基延长；和f)其中B30位的氨基酸残基被苏氨酸甲酯替代的胰岛素衍生物。这些中 的每一个是具体实施方案。 在另一个实施方案中，母体胰岛素选自人胰岛素；desB30人胰岛素；AspB28人
胰岛素；AspB28， DesB30人胰岛素；LysB3， GluB29人胰岛素；LysB28， ProB29人胰岛素；
GlyA21、ArgB31、ArgB32人胰岛素；和desB30、 ArgB31、 ArgB32人胰岛素。 更具体地说，子胰岛素是A和/或B链具有两个或多个突变(相对于母体胰岛素)
的胰岛素分子。意外地，已经发现，在胰岛素上的两个或多个蛋白酶位点内或其极近处用亲
水性的氨基酸替代两个或多个疏水性的氨基酸，可以获得针对酶解比母体胰岛素更稳定的
胰岛素类似物(即，子胰岛素)。在一个宽范围的方面，子胰岛素是其中至少两个疏水性的
氨基酸已经被亲水性的氨基酸替代的胰岛素类似物(相对于母体胰岛素)，其中替代在母
体胰岛素的两个或多个蛋白酶裂解位点内或其极近处，且其中这种胰岛素类似物任选进一
步包含一个或多个其它突变。 在另一个实施方案中，子胰岛素是符合下列条件的胰岛素类似物
在A12位的氨基酸是Glu或Asp，和/或在A13位的氨基酸是His、 Asn、 Glu或 Asp，和/或在A14位的氨基酸是Asn、 Gln、 Glu、 Arg、 Asp、 Gly或His，和/或在A15位的氨 基酸是Glu或Asp ;禾口 在B24位的氨基酸是His，和/或在B25位的氨基酸是His，和/或在B26位的氨基酸是His、 Gly、 Asp或Thr，和/或在B27位的氨基酸是His、 Glu、 Lys、 Gly或Arg，和/ 或在B28位的氨基酸是His、 Gly或Asp ;禾口 0086] 其任选进一步包含一个或多个其它突变。
0087] 在另一个实施方案中，子胰岛素是包含式1的A链氨基酸序列
0088] XaaA(—2「XaaA(—D-XaaAo-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaM2
-XaaAi3_XaaAi4_XaaAi5_Leu_Glu_XaaAi8_Ty^Cy s_XaaA2「XaaA22
0089] 式(1) (SEQ ID No :1)
0090] 和式2的B链氨基酸序列的胰岛素类似物
0091] XaaB(—2「XaaB(—D-XaaB。-XaaB「XaaB2-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa脂-Leu-Val_Glu_Ala_Leu_XaaB16_Leu_Val_Cys_Gly_Glu_Arg_Gly_XaaB24_XaaB25_XaaB26_XaaB27_XaaB2 8~XaaB29_)(aaB30_)(aaB31_)(aaB32式(2) (SEQ ID No :2)射XaaA(—2)不存在，或是Gly ;XaaA(—d不存在，或是Pro ;XaaA0不存在，或是Pro ;XaaA8独立地选自Thr禾P His ;XaaA12独立地选自Ser、 Asp和Glu ;XaaA13独立地选自Leu、 Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、Pro 、 Ser禾口 Glu ;XaaA14独立地选自Tyr、 Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、Pro 、 Ser禾口 Glu ;XaaA15独立地选自Gln、 Asp和Glu ;XaaA18独立地选自Asn、 Lys和Gin ;XaaA21独立地选自Asn和Gin ;XaaA22不存在，或是Lys ;XaaB(—2)不存在，或是Gly ;XaaB(—d不存在，或是Pro ;XaaB0不存在，或是Pro ;XaaB1不存在，或独立地选自Phe和Glu ;XaaB2不存在，或是Val ; [o川]XaaB3不存在，或独立地选自Asn和Gin ; XaaB4独立地选自Gin和Glu ;XaaB1。独立地选自His、 Asp、 Pro和Glu ;XaaB16独立地选自Tyr、 Asp、 Gln、 His、 Arg和Glu ;XaaB24独立地选自Phe禾P His ;XaaB25独立地选自Phe和His ;XaaB26不存在，或独立地选自Tyr、 His、 Thr、 Gly和Asp ;XaaB27不存在，或独立地选自Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser和Glu ;XaaB28不存在，或独立地选自Pro、 His、 Gly和Asp ;
XaaB29不存在，或独立地选自Lys和Gin ; XaaB3。不存在，或是Thr ; Xaa咖不存在，或是Leu ; XaaB32不存在，或是Glu ; C端可以任选衍生化为酰胺形式； 其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列在A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱 氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间通过二硫桥连接，和其中 A链的6和11位的半胱氨酸通过二硫桥连接； 其中任选N端A链氨基酸序列通过包含3-7个氨基酸的氨基酸序列与C端B链氨 基酸序列连接，以形成单链胰岛素分子，其中任选B链的N端延长1-10个氨基酸；其中，如果XaaA8是Thr禾口 XaaA12是Ser禾口 XaaA13是Leu禾口 XaaA14是Tyr，那么XaaA15
是Glu或Asp ;禾口
其中如果XaaB24是Phe禾口 XaaB25是Phe禾口 XaaB26是Tyr禾口 XaaB27是Thr禾口 XaaB28是
Pro，那么XaaB29是Gln。
在另一个实施方案中，子胰岛素是包含式3的A链氨基酸序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaM2-XaaM3-XaaM4-XaaM5-L
eu_Glu_XaaA18_Tyr_Cys_XaaA21
式(3) (SEQ ID No :3)和式4的B链氨基酸序列的胰岛素类似物XaaB1_Val_XaaB3_XaaB4_His_Leu_Cys_Gly_Ser_XaaB10_Leu_Val_Glu_Ala_Leu_XaaB1
6_Leu_Val_Cys_Gly_Glu_Arg_Gly_XaaB24_His_XaaB26_XaaB2「XaaB28_XaaB29_XaaB3(l
式(4) (SEQ ID No :4)射XaaA8独立地选自Thr禾P His ;XaaA12独立地选自Ser、 Asp和Glu ;XaaA13独立地选自Leu、 Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser和Glu ;XaaA14独立地选自Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser和Glu ;XaaA15独立地选自Gln、 Asp和Glu ;XaaA18独立地选自Asn、 Lys和Gin ;XaaA21独立地选自Asn和Gin ;XaaB1独立地选自Phe和Glu ;XaaB3独立地选自Asn和Gin ;XaaB4独立地选自Gin和Glu ;XaaB1。独立地选自His、 Asp、 Pro和Glu ;XaaB16独立地选自Tyr、 Asp、 Gln、 His、 Arg和Glu ;XaaB24独立地选自Phe禾P His ;XaaB26不存在，或独立地选自Tyr、 His、 Thr、 Gly和Asp ;XaaB27不存在，或独立地选自Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser和
Glu ;
XaaB28不存在，或独立地选自Pro、 His、 Gly和Asp ;
XaaB29不存在，或独立地选自Lys和Gin ;
XaaB30不存在，或是Thr ; C端可以任选衍生化为酰胺形式；其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列在A链 7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱 氨酸之间通过二硫桥连接，和其中A链的6和11位的半胱氨酸通过二硫桥连接。
在另一个实施方案中，子胰岛素是符合下列条件的胰岛素类似物
其中 XaaA8独立地选自Thr禾P Hi s ;
XaaA12独立地选自Ser和Glu ;XaaA13独立地选自Leu、 Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser和Glu ; XaaA14独立地选自Asp 、 Hi s禾口 Glu ; XaaA15独立地选自Gin和Glu ; XaaA18独立地选自Asn、 Lys和Gin ; XaaA21独立地选自Asn禾P Gin ; XaaB1独立地选自Phe和Glu ; XaaB3独立地选自Asn和Gin ; XaaB4独立地选自Gin和Glu ; XaaB1。独立地选自Hi s 、 Asp 、 Pro和Glu ; Xaa咖独立地选自Tyr、 Asp、 Gln、 His、 Arg和Glu ; XaaB24独立地选自Phe禾P Hi s ; XaaB26独立地选自Tyr、 Thr、 Gly和Asp ;XaaB27独立地选自Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg禾P Glu ; XaaB28独立地选自Pro、 Gly和Asp ; XaaB29独立地选自Lys和Gin ; XaaB30不存在，或是Thr ; C端可以任选衍生化为酰胺形式； 其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列在A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱 氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间通过二硫桥连接，和其中 A链的6和11位的半胱氨酸通过二硫桥连接。 下面讨论子胰岛素的其它实施方案。"蛋白酶(protease)"或"蛋白酶(protease enzyme)"是消化酶，其可以降解蛋白和肽，并且可以在人体的各种组织中发现它，例如胃 (胃蛋白酶)，肠腔(糜蛋白酶，胰蛋白酶，弹性酶，羧肽酶，等等)或胃肠道的粘膜表面(氨 肽酶，羧肽酶，肠肽酶，二肽基肽酶，内肽酶，等等)，肝(胰岛素降解酶，组织蛋白酶D等 等)，和在其它组织中。 酶解稳定的胰岛素类似物(也称为子胰岛素)本文是指相对于人胰岛素而被一或 多种蛋白酶降解较慢的胰岛素类似物。在一个实施方案中，相对于母体胰岛素，一或多种蛋 白酶对子胰岛素的降解更较慢。在进一步实施方案中，使子胰岛素对一或多种选自下列的 酶的降解作用保持稳定胃蛋白酶(例如，异构胃蛋白酶A，胃蛋白酶B，胃蛋白酶C和/或胃蛋白酶F)，糜蛋白酶(例如，异构糜蛋白酶A，糜蛋白酶B和/或糜蛋白酶C)，胰蛋白酶， 胰岛素_降解酶(IDE)，弹性酶(例如，异构胰腺弹性酶I和/或II)，羧肽酶(例如，异构 羧基肽酶A，羧肽酶A2和/或羧肽酶B)，氨肽酶，组织蛋白酶D及存在于得自大鼠、猪或人 的肠内提取物中的其它酶。 在一个实施方案中，使子胰岛素对一或多种选自下列的酶的降解作用保持稳定 糜蛋白酶，胰蛋白酶，胰岛素-降解酶(IDE)，弹性酶，羧肽酶，氨肽酶和组织蛋白酶D。在进 一步实施方案中，使子胰岛素对一或多种选自下列的酶的降解作用保持稳定糜蛋白酶，羧 肽酶和IDE。在进一步实施方案中，使子胰岛素对一或多种选自下列的酶的降解作用保持稳 定糜蛋白酶和羧肽酶。 T72可以按照实施例中描述的方法来测定、作为子胰岛素针对蛋白酶例如糜蛋白 酶、胃蛋白酶和/或羧基肽酶A的解朊稳定性的量度。在本发明的一个实施方案中，相对于 人胰岛素，T72得到提高。在进一步实施方案中，相对于母体胰岛素，T72得到提高。在进 一步实施方案中，相对于母体胰岛素，T72提高了至少2倍。在进一步实施方案中，相对于 母体胰岛素，T1/2提高了至少3倍。在进一步实施方案中，相对于母体胰岛素，T1/2提高了 至少4倍。在进一步实施方案中，相对于母体胰岛素，T72提高了至少5倍。在又进一步实 施方案中，相对于母体胰岛素，T72提高了至少10倍。 蛋白酶裂解位点(本文也称为蛋白酶位点)应该被理解为通过蛋白酶辨别的氨基 酸残基和/或通过蛋白酶将其肽键断裂的氨基酸残基。蛋白酶裂解位点可以通过测定裂 解"热点"来测定，利用HPLC、 MS或LC-MS分析，和/或基于将被测定蛋白酶裂解位点的蛋 白酶的酶特异性来预测。本领域技术人员知道如何测定蛋白酶裂解位点，例如，基于例如在 下列中描述的酶特异性-Handbook of Proteolytical Enzymes, 2nd ed. ， Barrett, A.J.， Rawlings， N. D. ， Woesner， J. F. editors, Elsevier Academic Press 2004。例如，可以予页计 糜蛋白酶将肽键C端裂解为芳香残基(Trp，Tyr，Phe或Leu)，其后面不是Pro。同样，可以 预计胰蛋白酶将肽键C端裂解为碱性残基Lys或Arg，其后面不是Pro,预计弹性酶将残基 C端裂解为Ala、 Val、 Gly或Ser，和羧基肽酶A可以除去任何C端氨基酸，而不是Arg、 Lys 或Pro。预计胰岛素降解酶(IDE)可以裂解人胰岛素的下列位置B9-10， BlO-ll， B13-14, B14-15, B24-25, B25-26, A13-14和A14_15。 术语"在蛋白酶裂解位点内或其极近处的替代性氨基酸"本文用于表示在母体胰 岛素的位置内或其极近处的氨基酸的替代，其中已经确定该(母体胰岛素)的位置是蛋白 酶裂解位点。在一个实施方案中，在胰岛素上的两个或多个蛋白酶位点内或其极近处的两 个或多个疏水性氨基酸被替代，其中所述疏水性的氨基酸被亲水性的氨基酸替代。在进一 步实施方案中，在胰岛素上的两个或多个蛋白酶位点内的两个或多个疏水性氨基酸被亲水 性的氨基酸替代。在进一步实施方案中，在胰岛素上的紧挨着两个或多个蛋白酶位点的两 个或多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸替代。在进一步实施方案中，在胰岛素上的位于 远离两个或多个蛋白酶位点的两个氨基酸的两个或多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸 替代。在进一步实施方案中，在胰岛素上的位于远离两个或多个蛋白酶位点的三个氨基酸 上的两个或多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基酸替代。在更进一步实施方案中，在胰岛素 上的位于远离两个或多个蛋白酶位点的至多四个氨基酸上的两个或多个疏水性氨基酸被 亲水性的氨基酸替代。在又进一步实施方案中，在胰岛素上的位于远离两个或多个蛋白酶
14位点或在该两个或多个蛋白酶位点之内的一个、两个或三个氨基酸上的两个或多个疏水性 氨基酸被亲水性的氨基酸替代。在更进一步实施方案中，在胰岛素上的位于远离两个或多 个蛋白酶位点在该两个或多个蛋白酶位点之内的一或两个氨基酸上的两个或多个疏水性 氨基酸被亲水性氨基酸替代。在再进一步实施方案中，在胰岛素上的紧挨着两个或多个蛋 白酶位点或在该两个或多个蛋白酶位点之内的两个或多个疏水性氨基酸被亲水性的氨基 酸替代。 子胰岛素可以具有净电荷，该净电荷不同于母体胰岛素的净电荷。在一个实施方 案中，子胰岛素的净电荷比母体胰岛素的净电荷更具正性。在一个实施方案中，子胰岛素的 净电荷比母体胰岛素的净电荷更具负性。在一个实施方案中，子胰岛素的平均正净电荷在 0.5和5之间(在含水溶液中测定)。在一个实施方案中，子胰岛素的平均正净电荷在l和 5之间。在一个实施方案中，子胰岛素的平均正净电荷在l和4之间。在一个实施方案中， 子胰岛素的平均正净电荷在1和3之间。在一个实施方案中，子胰岛素的平均正净电荷在2 和3之间。在一个实施方案中，子胰岛素的平均负净电荷在-0.5和-5之间(在含水溶液 中测定)。在一个实施方案中，子胰岛素的平均负净电荷在-l和-5之间。在一个实施方案 中，子胰岛素的平均负净电荷在-l和-4之间。在一个实施方案中，子胰岛素的平均负净电 荷在-1和_3之间。在一个实施方案中，子胰岛素的平均负净电荷在_2和-3之间。
在一个实施方案中，相对于人胰岛素，子胰岛素可以具有提高的溶解性。在进一步 实施方案中，相对于人胰岛素，子胰岛素在pH3-9时具有提高的溶解性。在又进一步实施方 案中，相对于人胰岛素，子胰岛素在pH4-8.5时具有提高的溶解性。在更进一步实施方案 中，相对于人胰岛素，子胰岛素在pH4-8时具有提高的溶解性。在进一步实施方案中，相对 于人胰岛素，子胰岛素在pH4. 5-8时具有提高的溶解性。在还进一步实施方案中，相对于人 胰岛素，子胰岛素在pH5-8时具有提高的溶解性。在进一步实施方案中，相对于人胰岛素， 子胰岛素在pH5. 5-8时具有提高的溶解性。在进一步实施方案中，相对于人胰岛素，子胰岛 素在pH6-8时具有提高的溶解性。 在一个实施方案中，相对于人胰岛素，子胰岛素在pH2-4时具有提高的溶解性。
在一个实施方案中，相对于母体胰岛素，子胰岛素可以具有提高的溶解性。在进一 步实施方案中，相对于母体胰岛素，子胰岛素在pH3-9时具有提高的溶解性。在又进一步实 施方案中，相对于母体胰岛素，子胰岛素在pH4-8. 5时具有提高的溶解性。在更进一步实施 方案中，相对于母体胰岛素，子胰岛素在pH4-8时具有提高的溶解性。在进一步实施方案 中，相对于母体胰岛素，子胰岛素在pH4. 5-8时具有提高的溶解性。在更进一步实施方案 中，相对于母体胰岛素，子胰岛素在pH5-8时具有提高的溶解性。在进一步实施方案中，相 对于母体胰岛素，子胰岛素在pH5. 5-8时具有提高的溶解性。在更进一步实施方案中，相对 于母体胰岛素，子胰岛素在P朋-8时具有提高的溶解性。 在一个实施方案中，相对于母体胰岛素，子胰岛素在pH2-4时具有提高的溶解性。
"在给定pH值下具有提高的溶解性"是指相对于母体胰岛素，在溶液的pH值下，更 大浓度的子胰岛素溶于水溶液或缓冲溶液中。测定包含在溶液中的胰岛素是否溶解的方法 在本领域是已知的。 在一个实施方案中，可以将溶液在30， OOOg下离心20分钟，然后可以通过RP-HPLC 测定上清液中的胰岛素浓度。如果该浓度在实验误差范围内等于制备组合物最初所使用的胰岛素浓度，那么该胰岛素在本发明的组合物中是完全溶解的。在另一个实施方案中，在本 发明组合物中的胰岛素的溶解性可以简单地通过眼睛检验容器来确定，其中组合物包含在 该容器中。如果用眼睛观察时溶液是澄清的并且没有颗粒物质悬浮或沉淀在容器的侧面/ 底部，那么胰岛素是可溶性的。 当依据测定进行比较时，相对于母体胰岛素，子胰岛素可以具有提高的效能和/ 或生物利用率。 本领域技术人员了解测定胰岛素效能或生物利用率的标准试验，并且尤其包括 (1)胰岛素放射性受体测定，其中胰岛素的相对效能定义为置换50% 1251_胰岛素所要求 的胰岛素与胰岛素类似物的比例，其中1251-胰岛素特异性地与细胞膜上存在的胰岛素受体 结合，细胞膜例如大鼠肝脏质膜片段；(2)脂肪形成试验，例如用大鼠脂肪细胞进行，其中 相对胰岛素效能定义为获得[3」H]葡萄糖转化为有机-可萃取物质(即脂质)的最大转 化的50%所要求的胰岛素与胰岛素类似物的比例；(3)在分离脂肪细胞中的葡萄糖氧化试 验中，其中胰岛素类似物的相对效能定义为获得葡萄糖-l-["C]转化为["C02]的最大转 化的50%的胰岛素与胰岛素类似物的比例；(4)胰岛素放射免疫测定，通过测定胰岛素或 胰岛素类似物与1251-胰岛素竞争与具体抗胰岛素抗体结合的效果，其可以测定胰岛素类 似物的免疫原性；和(5)其它试验，其测定胰岛素或胰岛素类似物与动物血浆样品中的抗 体的结合，例如，具有特异性胰岛素抗体的ELISA试验。 可以任选分析子胰岛素的其它蛋白酶位点，该位点可以进行一个或多个疏水性氨 基酸被亲水性氨基酸的进一步替代。子胰岛素可以是胰岛素类似物，与母体胰岛素相比 (第一个改性胰岛素)，其在蛋白酶位点具有至少两个亲水性酸，并且在第一个改性胰岛素 的新蛋白酶位点其进一步具有至少一个氨基酸替代，其中至少一个疏水性氨基酸已经被至 少一个亲水性氨基酸替代。 为了便利性起见，下面是编码的天然氨基酸名称，用常见的三个字母代码和一 个字母代码(在括号中)甘氨酸(Gly&G)，脯氨酸(Pro&P)，丙氨酸(Ala&A)，缬氨酸 (Val&V)，亮氨酸(Leu&L)，异亮氨酸(Ile&I)，甲硫氨酸(Met&M)，半胱氨酸(Cys&C)，苯丙 氨酸(Phe&F)，酪氨酸(Tyr&Y)，色氨酸(Trp&W)，组氨酸(His&H)，赖氨酸(Lys&K)，精氨酸 (Arg&R)，谷氨酰胺(Gln&Q)，天冬酰胺(Asn緒)，谷氨酸(Glu&E)，门冬氨酸(Asp&D)，丝氨酸 (Ser&S)和苏氨酸(Thr&T)。如果由于打字错误而与通常使用的编码不符合，采用通常使用 的编码。优选，存在于本发明的胰岛素中的氨基酸是可以通过核酸编码的氨基酸。在一个实 施方案中，胰岛素或胰岛素类似物用下列代替Gly， Glu， Asp， His， Gln， Asn， Ser， Thr， Lys， Arg和/或Pro和/或Gly， Glu， Asp， His， Gln， Asn， Ser， Thr， Lys， Arg，和/或Pro加到胰 岛素或胰岛素类似物中。在一个实施方案中，胰岛素或胰岛素类似物用下列代替Glu，Asp， His， Gln， Asn， Lys禾口 /或Arg禾口 /或Glu， Asp， His， Gln， Asn， Lys禾口 /或Arg力口至lj月夷岛素 或胰岛素类似物中。 在一个实施方案中，子胰岛素选自下列123个化合物A14E， B25H， desB30人胰岛 素；A14H， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B1E， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B16E， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B28D， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27E， desB30人胰岛 素；A14E， B1E， B25H， B27E， desB30人胰岛素；A14E， B1E， B16E， B25H， B27E， desB30人胰岛 素；A8H， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A8H， A14E， B25H， B27E， desB30人胰岛素；A8H， A14E，B1E， B25H， desB30人胰岛素；A8H， A14E， B1E， B25H， B27E， desB30人胰岛素；A8H， A14E， B1E， B16E， B25H， B27E， desB30人胰岛素；A8H， A14E， B 16E， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B26D， desB30人胰岛素；A14E， B1E， B27E， desB30人胰岛素；A14E， B27E， desB30人胰岛素; A14E， B28D， desB30人胰岛素；A14D， B25H， desB30人胰岛素；A(-1)P， A(O)P， A14E， B25H， desB30人胰岛素;A14E，B(-l)P，B(0)P，B25H，desB30人胰岛素;A(-1)P，A(0)P，A14E，B(-1) P， B (O)P， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B30T， B31L， B32E人胰岛素；A14E， B25H人月夷 岛素；A14E， B16H， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B10P， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B10E， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B4E， B25H， desB30人胰岛素；A14H， B16H， B25H， desB30人月夷 岛素；A14H， B10E， B25H， desB30人胰岛素；A13H， A14E， B10E， B25H， desB30人胰岛素；A13H， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A14E， A18Q， B3Q， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B24H， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B26G， B27G， B28G， desB30人胰岛素；A14E， A18Q， A21Q， B3Q， B25H， desB30人胰岛素；A14E， A18Q， A21Q， B3Q， B25H， B27E， desB30人胰岛素；A14E， A18Q， B3Q， B25H， desB30人胰岛素；A13H， A14E， B1E， B25H， desB30人胰岛素；A13N， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13N， A14E， B1E， B25H， desB30人胰岛素；A (-2) G， A (-1) P， A (0) P， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B(-2)G， B(-1)P， B(O)P， B25H， desB30人胰岛素；A(-2)G， A(-1)P， A(O)P， A14E， B(-2)G， B(-1)P， B(O)P， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B27R， B28D， B29K， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27R， B28D， B29K， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B26T， B27R， B28D， B29K， desB30人胰岛素；A14E， A22K， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27R， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27H， desB30人胰岛素；A14E， A18Q， B3Q， B25H， desB30人月夷 岛素；A13E， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A12E， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A15E， A14E， B25H，desB30人胰岛素;A13E， B25H， desB30人胰岛素;A12E， B25H， desB30人胰岛素；A15E， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B25H， desB27， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B26D， B27E， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27R， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27N， desB30人胰岛素; A14E， B25H， B27D， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27Q， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27E， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27G， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27H， desB30人胰岛素; A14E， B25H， B27K， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27P， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27S， desB30人胰岛素；A14E， B25H， B27T， desB30人胰岛素；A13R， A14E， B25H， desB30人胰岛素; A13N， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13D， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13Q， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13E， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13G， A14E， B25H， desB30人胰岛素; A13H， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13K， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13P， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13S， A14E， B25H， desB30人胰岛素；A13T， A14E， B25H， desB30人胰岛素; A14E， B16R， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B16D， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B16Q， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B16E， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B16H， B25H， desB30人胰岛素; A14R， B25H， desB30人胰岛素；A14N， B25H， desB30人胰岛素；A14D， B25H， desB30人胰岛素; A14Q， B25H， desB30人胰岛素；A14E， B25H， desB30人胰岛素；A14G， B25H， desB30人胰岛素; A14H， B25H， desB30人胰岛素；A8H， B10D， B25H人胰岛素；和A8H， A14E， B10E， B25H， desB30 人胰岛素。因为几乎所有的PEG聚合物是许多大分子的混合物，必须借助于平均值来描述 分子量。在报道平均值的许多可能方式之中，通常使用三个数均、重均和Z-均分子量。重 均可能是三个之中的最有用的方式，因为它清楚地说明了不同尺寸链对聚合物的总体性能
17的贡献，并且最好地与大部分使人感兴趣的物理性能相关。
，
<formula>formula see original document page 18</formula>
重均丽(MJ. Z-均丽(Sz).
飘N) 乖 其中Ni是在聚合物混合物中具有分子量Mi的分子的摩尔-分数(或数量-分 数)。Mw与Mn的比例被称为多分散指数(PDI)，并且可提供分布宽度的近似指标。对于具 有非常窄丽分布的具体聚合物，PDI接近1. 0 (下限)。 尽管为了提高生物利用率可以优选低分子量PEG基团，但高分子量PEG链，例如具 有4000-6000道尔顿或更大的平均分子量，虽然通常发现其可以降低胰岛素分子的生物活 性，但为了提高半衰期可以优选高分子量PEG链。 在本发明中使用的PEG基团一般由许多(_0CH2CH2_)亚单元组成。
对于给定的分子量，在本发明中使用的PEG基团一般由大量乙二醇(或亚乙氧基) 单体组成。例如，分子量2000道尔顿的PEG基团一般包括43±10个单体，平均大约43-44 个单体，或35-50个单体。 本发明的PEG化胰岛素是单取代的，只具有一个与子胰岛素分子中的赖氨酸氨基 酸残基连接的PEG基团。 在本申请中，不管实际的连接基如何，PEG化胰岛素的命名在相当程度上好象连接 部分是丙酸连接基一样。事实上，在蛋白PEG化文献中，很少说明所使用的连接基团。就生 物学特性而论，重要的变量是PEG部分的大小(道尔顿)和形状和在蛋白内PEG连接的位置。 利用例如公开在美国专利US 6，500，645中的众所周知的技术，在合适宿主细胞 中，通过表达编码所述胰岛素的DNA序列来制备子胰岛素。子胰岛素既可以直接表达、也可 以以B链上具有N端延长的前体物分子形式表达。N端延长可以具有提高直接表达产物的 产率的功能，并且可以最高达15个氨基酸残基长度。从培养肉汤中分离之后，N端延长被 体外裂解，并因此具有紧挨着B1的裂解位点。本发明中的合适类型的N端延长公开在美国 专利US 5， 395， 922和欧洲专利765， 395A中。 编码子胰岛素的多核苷酸序列可以利用所建立的标准方法来合成产生，例 如，Beaucage等人(1981) Tetrahedron Letters 22 :1859-1869所描述的磷酰胺化物 (phosphoamidite)方法，或Matthes等人(1984)EMBOJournal 3 :801-805所描述的方法。 按照亚磷酰胺(phosphoamidite)方法合成寡核苷酸，例如，在DNA自动合成仪中，纯化，双 螺旋和连接，形成合成DNA结构。制备DNA结构的目前优选方式是聚合酶链式反应(PCR)。
多核苷酸序列也可以是混合基因组、cDNA和合成源。例如，编码前导肽的基因组 或cDNA序列可以与编码A和B链的基因组或cDNA连接，而后，按照众所周知的方法，通过 插入编码源重组的目标氨基酸序列的合成寡核苷酸，可以在位点处将DNA序列改性，或优 选使用合适寡核苷酸，通过PCR产生目标序列。 重组方法一般使用载体，其能够在所选择的微生物或宿主细胞中复制，并且其带 有编码子胰岛素的多核苷酸序列。重组载体可以是自主复制载体，即，以额外染色体实体形态存在的载体，其中的复制与染色体的复制无关，例如质粒、额外的染色体单元、极微染色 体或人工染色体。载体可以包括保证自我复制的任何手段。或者，载体可以是当被引入到 宿主细胞中时可以整合到基因组中、并且与它所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可 以使用单一载体或质粒或两种或多种载体或质粒，它们一起包含被引入到宿主细胞的基因 组中的全部DNA，或使用转位子。载体可以是线型或接近环形的质粒，并且优选包含可使载 体稳定整合到宿主细胞的基因组中或可使载体在独立于基因组的细胞中自发复制的单元。
重组表达载体能够在酵母中复制。能够使载体在酵母中复制的序列的实例是酵母 质粒2 ii m复制基因REP1-3和复制起点。 载体可以包含一个或多个容易选择转化细胞的选择性标记。选择性标记是基 因，其产物可提供杀菌或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原营养，等等。细菌 选择性标记的实例是来源于枯草杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或可赋予抗菌素耐药 性的标记，例如氨苄西林、卡那霉素、氯霉素或四环素耐药性。用于细丝状霉菌宿主细胞 的选择性标记包括amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)，pyrG(乳清酸核 苷-5'-磷酸盐脱羧酶)和trpC(邻氨基苯甲酸酯合酶)。酵母宿主细胞的合适标记是 ADE2， HIS3， LEU2， LYS2，MET3， TRP1和URA3。对于酵母，较好匹配的选择性标记是裂殖酵母 (Schizosaccharomycespompe) TPI基因(Russell (1985)Gene 40:125-130)。
在载体中，多核苷酸序列操作性地与合适启动子序列连接。启动子可以是任何核 酸序列，其在选择的宿主细胞中显示转录活性，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从 编码胞外或胞内多肽的基因获得，该多肽对于宿主细胞既可以是同源的也可以是异源的。
在细菌宿主细胞中引导转录过程的合适启动子的实例是从下列中获得的启动子 大肠杆菌乳糖操纵子，天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)，枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基 因(sacB)，地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amyL)，嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因 (amyM)，解淀粉芽胞杆菌a -淀粉酶基因(amyQ)，和地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)。在 细丝状霉菌宿主细胞中引导转录过程的合适启动子的实例是从下列的基因获得的启动子 米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性a _淀粉酶，和黑曲霉酸稳定 性a-淀粉酶。在酵母宿主中，有用的启动子是酿酒酵母Mal，TPI，ADH或PGK启动子。
编码子胰岛素的多核苷酸序列一般也会操作性地与合适终止子连接。在酵母中， 合适终止子是TPI终止子(Alber等人(1982) J. Mol. A卯l. Genet. 1 :419-434)。
用于连接分别编码子胰岛素、启动子和终止子的多核苷酸序列的方法、和将它们 插入到合适载体(其包含在所选择宿主中进行复制所必需的信息)中的方法对于本领域技 术人员来说是众所周知的。可以理解，可以如下构成载体首先制备包含编码本发明胰岛素 的整个DNA序列的DNA结构，随后将该片段插入到合适表达载体中，或顺序插入包含个体单 元的遗传信息的DNA片段(例如信号，肽原，连接肽，A和B链)，而后进行连接反应。
将包含编码子胰岛素的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中，以使载体以染色 体要素(integrant)形式或以自我复制的染色体外载体的形式保持载体。术语"宿主细胞" 包括母细胞的任何子代，由于在复制期间存在突变，其与母细胞不相同。宿主细胞可以是单 细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。有用的单细胞细胞是细菌 细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于杆菌细胞，链霉菌属细胞，或革兰氏阴性细菌细 胞，例如，大肠杆菌和假单胞菌属真核生物细胞可以是温血动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。酵母有机体可以是任何合适的酵母有机体，在培育期间，其产生大量的本发明的单链胰岛素。合适酵母有机体的实例是选自下列的菌株酵母物种的酿酒酵母，克鲁维酵母菌，粟酒裂殖酵母，葡萄汁酵母，乳酸克鲁维酵母，汉逊酵母，巴斯德毕赤氏酵母，甲醇毕赤酵母，克鲁维毕赤酵母，解脂耶氏酵母，假丝酵母，产朊假丝酵母，可可假丝酵母，地霉菌，和发酵地霉。 酵母细胞的转化可以例如受到原生质体形成的影B向，而后以本身已知的方式进行转化。用于培育细胞的介质可以是适合于培育酵母有机体的任何常规介质。利用常规方法，包括从介质中离心分离酵母细胞，通过离子交换基质或通过反相吸收基质将胰岛素前体物过滤或汇集，将上清液的蛋白组份沉淀，或利用盐例如硫酸铵进行过滤，而后利用各种色谱方法进行纯化，例如，离子交换色谱、亲和色谱等等，可以从介质中回收分泌的胰岛素(显著比例存在于介质中，以恰当加工的形式)。
本发明化合物的用途 给药途径可以是给身体内的目标位置或合适位置有效输送本发明化合物的任何途径，例如胃肠外，例如皮下、肌肉内或静脉内。或者，本发明的化合物可以通过口服、肺部
或鼻部给药。 对于胃肠外给药，可以用与已知的胰岛素制剂类似方式配制本发明的化合物。此外，对于胃肠外给药，可以用与给予已知胰岛素的类似方式来给予本发明的化合物，并且医生熟悉该方法。 肠胃外给药可以利用注射器进行，任选笔式注射器。或者，肠胃外给药可以借助于输液泵进行。 包含本发明化合物的注射组合物可以使用制药工业的传统方法制备，该方法涉及
将组分溶解和混合(视情况而定)，得到目标最终产物。由此，按照一个方法，将本发明的化
合物溶于适量的水中，水的体积稍微少于所制备组合物的最终体积。根据需要，加入等渗试
剂、防腐剂和缓冲剂，和如果需要的话，使用酸例如盐酸或碱例如氢氧化钠水溶液(按照需
要)调节溶液的PH值。最后，用水调节溶液的体积，得到组分的目标浓度。
更确切地说，本发明的胰岛素制剂，例如溶液剂或混悬剂，可以如下制备将
本发明的化合物溶解在水介质(在略微酸性条件下)中，例如，浓度在大约240至大约
1200nmole/ml的范围。用例如氯化钠或丙三醇使水介质制成等渗的。此外，水介质可以包
含锌离子(浓度最多是每个胰岛素活性单位大约20iig 2!1++)、缓冲液例如乙酸盐和柠檬酸
盐和防腐剂例如间甲酚或苯酚。将溶液的PH值朝着中性方向调节，不要太接近本发明化合
物的等电点，以免沉淀。最终胰岛素制剂的pH值取决于本发明使用的化合物、锌离子的浓
度和本发明化合物的浓度。通过例如无菌过滤使胰岛素制剂变成无菌制剂。 本发明的胰岛素制剂可以以类似于使用已知胰岛素制剂的方式来使用。 所给予的本发明化合物的量、给予本发明化合物的频率的确定、和所给予的本发
明化合物的选择、任选与其它抗糖尿病化合物一起，由熟悉糖尿病治疗的医师的实际建议
来决定。由此，本发明还涉及治疗糖尿病的方法，包括给予需要这种治疗的患者有效数量的
本发明的化合物。 药物组合物 本发明的PEG化胰岛素可以皮下、鼻部、口服或肺部给予。
对于皮下给予，以类似于已知胰岛素制剂的方式来配制本发明的PEG化胰岛素。此外，对于皮下给药，可以用与给予已知胰岛素的类似方式来给予本发明的PEG化胰岛素，并且医生熟悉该方法。 本发明的PEG化胰岛素可以通过吸入给予，其剂量应该可有效提高循环胰岛素水平和/或降低循环葡萄糖水平。这种给药可以有效治疗病症，例如糖尿病或高血糖症。为了获得胰岛素的有效剂量，需要吸入给予超过大约0. 5 g/kg至大约50 g/kg本发明的PEG化胰岛素的剂量。治疗有效量可以由知识丰富的医师确定，医师将考虑许多因素，包括胰岛素水平，血糖水平，患者的实际病症，患者的肺部状态，等等。 本发明的PEG化胰岛素可以通过吸入来递送，从而获得缓慢的吸收和/或降低其系统廓清率。当比较肺沉积的相似颗粒大小和相似水平时，不同的吸入装置一般提供类似的药物动力学。 本发明的PEG化胰岛素可以通过本领域已知的、用于通过吸入方式给予治疗剂的任何种类的吸入装置来递送。这些装置包括定量吸入器、雾化器、干燥粉未发生器、喷雾器，等等。优选，本发明的PEG化胰岛素可以通过干粉吸入器或喷雾器递送。对于给予本发明的PEG化胰岛素的吸入装置，有一些合乎需要的特征。例如，通过吸入装置递送是可靠的、可再现的和精确的。为了良好的呼吸性能，吸入装置应该递送小颗粒或气雾剂，例如小于大约10iim，例如大约l-5iim。适合于本发明实践的可商购吸入装置的一些具体实例是Turbohaler (Astra) ，R0tahaler (Glaxo) ， DiskllS (Glaxo) ， Spiros inhaler (Dura)，由InhaleTherapeutics销售的装置，AERxTM(Aradigm) ， Ult譜ent⑧雾化器(Mai 1 inckrodt) ， Acorn 11⑧雾化器(Marquest Medical Products) ， Ventolin⑧定量吸
入器(Glaxo)，Spinhaler⑧粉剂吸入器(Fisons)，等等。 本领域技术人员可以认识到，本发明的PEG化胰岛素的制剂、递送制剂的数量和单一剂量给药的持续时间取决于所使用的吸入装置的类型。对于一些气雾剂递送系统，例如雾化器，给药频率和系统开动的持续时间主要取决于气雾剂中的PEG化胰岛素的浓度。例如，在高浓度的PEG化胰岛素(在雾化器溶液中)的条件下，可以使用较短周期的给药。装置例如定量吸入器可以产生较高气溶胶浓度，并且可以操作较短的周期，以递送目标数量的PEG化胰岛素。用装置例如粉剂吸入器来递送活性剂，直到药剂的给定装载量从装置中排出为止。在这类吸入器中，本发明的PEG化胰岛素的量(在给定数量的粉剂中)可确定在单一给药中的递送剂量。 在通过吸入装置递送的制剂中，考虑到胰岛素进到肺中的能力，优选进到下呼吸道或肺泡中，本发明的PEG化胰岛素的粒径是关键性的。优选，将本发明的PEG化胰岛素进行配制，以使至少大约10X的所递送的PEG化胰岛素沉积在肺中，优选大约10至大约20% ，或更多。众所周知，对于用口呼吸的人，肺部沉积的最高效率是用大约2 i！ m至大约3ym的颗粒大小获得的。当颗粒大小超过大约5ym时，肺部沉积将实质性地降低。颗粒大小低于大约lym可导致肺部沉积降低，并且变得难以递送足以产生治疗效果的物质。由此，通过吸入递送的PEG化胰岛素的颗粒优选具有小于大约10 i！ m的粒径，更优选在大约1 P m至大约5 ii m范围内。选择PEG化胰岛素的制剂，从而在所选择的吸入装置中产生目标粒径。
优选，对于例如干粉给药，将本发明的PEG化胰岛素制备成具有小于大约10 m粒径的颗粒形式，优选大约l至大约5ym。优选的粒径可有效递送至患者肺的肺泡中。优选，干粉在很大程度上由制备的颗粒组成，以使大部分颗粒具有目标范围的粒径。优选，至少大约50%的干粉由具有小于大约lOym直径的颗粒组成。这种制剂可以如下获得将包含本发明的PEG化胰岛素及其它目标组分的溶液喷雾干燥，碾磨，或进行临界点凝聚。适合于产生本发明中所使用颗粒的其它方法在本领域是已知的。 在容器中，颗粒通常与干粉制剂分离，而后通过载体空气流输送到患者的肺中。典型地，在现行的干粉吸入器中，破碎固体的力仅仅是通过患者的吸入所提供的。在另一个类型的吸入器中，通过患者吸入产生的气流启动叶轮马达，其可以使颗粒解聚。
对于用干粉吸入器给药的本发明的PEG化胰岛素的制剂，典型地包括含有衍生物的细分散干粉，但粉末还可以包括填充剂、载体、赋形剂、另一种添加剂，等等。添加剂可以包括在PEG化胰岛素的干粉制剂中，例如，根据具体粉末吸入器的递送需要来稀释粉末，便于制剂的加工，提供制剂的有利的粉末特性，便于从吸入装置中出来的粉末的分散，使制剂稳定(例如，抗氧化剂或缓冲液)，提供制剂味道，等等。优选，添加剂不会不利地影响患者的呼吸道。可以以分子水平将PEG化的胰岛素与添加剂混合，或固体制剂可以包括PEG化胰岛素的颗粒，其中PEG化的胰岛素与添加剂的颗粒混合，或涂渍在添加剂的颗粒上。典型的添加剂包括单、二和多糖；糖醇及其它多元醇，例如，乳糖，葡糖，棉子糖，松三糖，乳糖醇，麦芽糖醇，海藻糖，蔗糖，甘露糖醇，淀粉，或其组合；表面活化剂，例如山梨糖醇，二磷脂酰胆碱，或卵磷脂；等等。典型地，添加剂，例如填充剂，以有效用于上述目的的数量提供，常常是制剂重量的大约50%至大约90%重量。对于蛋白制剂，例如胰岛素类似物蛋白的制剂，本领域已知的其它试剂还可以包括在制剂中。 包含本发明PEG化胰岛素的喷雾剂可以在压力下强迫该PEG化的胰岛素的悬浮液或溶液通过喷嘴来产生。可以选择喷嘴尺寸和构造、外加压力和液体进料速度，以获得目标产量和粒径。可以产生电喷雾，例如，电场与毛细管或喷嘴进料结合。优选，通过喷雾器递送的胰岛素共轭物的颗粒具有小于大约10 y m的粒径，优选在大约1 y m至大约5 ii m的范围内。 适合使用喷雾器的本发明的PEG化胰岛素的制剂，典型地包含在水溶液中的PEG化的胰岛素，其浓度为每ml溶液大约lmg至大约500mgPEG化的胰岛素。根据所选择的PEG化胰岛素及医学顾问已知的其它因素，上限可以低于，例如，每ml溶液含有450、400、 350、300、250、200、150、120、100或50mg的PEG化胰岛素。制剂可以包含试剂，例如赋形剂、缓冲液、等渗试剂、防腐剂、表面活化剂，和优选锌。制剂还可以包含赋形剂或稳定PEG化胰岛素的试剂，例如缓冲液、还原剂、原液蛋白(bulk protein)或碳水化合物。用于配制胰岛素共轭物的原液蛋白包括白蛋白、精蛋白等等。用于配制PEG化胰岛素的典型碳水化合物包括蔗糖，甘露糖醇，乳糖，海藻糖，葡糖，等等。PEG化胰岛素制剂还可以包括表面活化剂，其可以降低或预防由生成气溶胶时溶液的雾化所引起的表面诱导的胰岛素共轭物的聚集。可以使用各种常规表面活化剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。数量通常介于制剂的大约0. 001和大约4%重量的范围中间。 包含本发明的PEG化胰岛素的药物组合物还可以胃肠外给予需要这种治疗的患者。肠胃外给药可以借助于注射器通过皮下、肌注或静脉注射进行，任选笔类注射器。或者，肠胃外给药可以借助于输液泵进行。 本发明的PEG化胰岛素的注射组合物可以使用制药工业的传统方法制备，该方法 涉及将组分溶解和混合(视情况而定)，得到目标最终产物。由此，按照一个方法，将PEG 化的胰岛素溶于适量的水中，水的体积稍微少于所制备组合物的最终体积。根据需要，加入 锌、等渗试剂、防腐剂和/或缓冲液，和如果需要的话，使用酸例如盐酸或碱例如氢氧化钠 水溶液(按照需要)调节溶液的pH值。最后，用水调节溶液的体积，得到组分的目标浓度。
在本发明的进一步实施方案中，缓冲液选自乙酸钠，碳酸钠，柠檬酸盐，双甘氨肽， 组氨酸，甘氨酸，赖氨酸，精氨酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸钠，和三(羟甲基)-甲胺， N- 二羟乙基甘氨酸，麦黄酮(tricine)，苹果酸，琥珀酸盐，马来酸，富马酸，酒石酸，门冬氨 酸或其混合物。这些具体缓冲液的每个构成了本发明的替代性的实施方案。
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含可药用防腐剂，防腐剂可以选自 苯酚，邻甲酚，间甲酚，对甲酚，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，2-苯氧乙醇，对羟 基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，苯甲醇，氯丁醇，和硫柳汞(thiomerosal)，溴硝丙二醇，苯甲 酸，咪唑啉基脲(imidurea)，双氯苯双胍己烷，脱氢醋酸钠，氯甲酚，对羟苯甲酸乙酯，节索 氯铵，氯酚醚(chlorphenesine) (3-(4-氯苯氧基)-l，2-丙二醇)或其混合物。在本发明 的进一步实施方案中，防腐剂存在的浓度是大约0. lmg/ml至20mg/ml。在本发明的进一步 实施方案中，防腐剂存在的浓度是大约0. lmg/ml至5mg/ml。在本发明的进一步实施方案 中，防腐剂存在的浓度是大约5mg/ml至10mg/ml。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂 存在的浓度是大约10mg/ml至20mg/ml。这些具体防腐剂的每个构成了本发明的替代性的 实施方案。防腐剂在药物组合物中的用途对于技术人员是众所周知的。为方便起见，参考 Remington :The Science andPractice of Pharmacy,19th edition,1995。
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包含等渗药剂，其可以选自盐(例 如，氯化钠)，糖或糖醇，氨基酸(例如，L-甘氨酸，L-组氨酸，精氨酸，赖氨酸，异亮氨酸， 门冬氨酸，色氨酸或苏氨酸)，糖醇(例如丙三醇(甘油)，l，2-丙二醇(丙二醇)，l，3-丙 二醇或1，3-丁二醇)，聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物。可以使用任何糖，例如单、 二或多糖，或水溶性的葡聚糖，包括例如果糖，葡糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗 糖，海藻糖，葡聚糖，支链淀粉，糊精，环糊精，可溶性淀粉，羟乙基淀粉和羧甲纤维素钠。在 一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。将糖醇定义为具有至少一个-0H基团的C4-C8烃，并且 包括，例如，甘露糖醇，山梨糖醇，肌醇，卫矛醇(galacitol)，卫矛醇(dulcitol)，木糖醇和 阿糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上述的糖或糖醇可以单独或组合使 用。对使用数量没有固定限制，只要糖或糖醇可溶于液体药剂并且不会不利地影响使用本 发明方法所获得的稳定效果即可。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度在大约lmg/ml和大 约150mg/ml之间。在本发明的进一步实施方案中，等渗药剂存在的浓度是大约lmg/ml至 50mg/ml。在本发明的进一步实施方案中，等渗药剂存在的浓度是大约lmg/ml至7mg/ml。 在本发明的进一步实施方案中，等渗药剂存在的浓度是大约8mg/ml至24mg/ml。在本发明 的进一步实施方案中，等渗药剂存在的浓度是大约25mg/ml至50mg/ml。这些具体等渗药 剂的每个构成了本发明的替代性的实施方案。等渗试剂在药物组合物中的用途对于技术人 员是众所周知的。为方便起见，参考Remington :The Science and Practiceof Pharmacy, 19th edition, 1995。
典型的等渗试剂是氯化钠，甘露糖醇，二甲砜和丙三醇，和典型的防腐剂是酚，间 甲酚，对羟基苯甲酸甲酯和苯甲醇。 合适缓冲液的例子是乙酸钠，双甘氨肽，HEPES(4_(2-羟乙基)_1_哌嗪乙磺酸)和 磷酸钠。 用于鼻部给予本发明PEG化胰岛素的组合物可以例如按照欧洲专利272， 097中描 述的方法制备。 包含本发明的PEG化胰岛素的组合物可以用于治疗对胰岛素敏感的状态。由此， 它们可以用于治疗I型、II型糖尿病和高血糖症，例如在受到严重伤害的人和进行大手术 的人中有时所看到的症状。对于任何患者，最佳剂量水平取决于各种因素，包括所使用的具 体胰岛素衍生物的效果，患者的年龄、体重、实际活动和饮食，取决于与其它药物的合适组 合，和取决于所治疗状况的严重程度。推荐的是，对于每个个体患者，由本领域技术人员按 照与已知胰岛素组合物类似的方法来确定本发明的PEG化胰岛素的日剂量。
本发明的优选特征
本发明的特征如下 l.PEG化的胰岛素类似物，其中，在子胰岛素中，相对于母体胰岛素，至少两个疏水
性氨基酸被亲水性氨基酸替代，其中替代在母体胰岛素的两个或多个蛋白酶裂解位点内或
其很近处，且其中这种子胰岛素任选进一步包含一个或多个其它突变，并且其中PEG部分
通过连接基与赖氨酸残基的e氨基在所述子胰岛素的B29位置相连接。 2.按照条款1的PEG化的胰岛素类似物，其中相对于母体胰岛素，子胰岛素具有提
高的溶解性。 3.按照前述条款的任一项的PEG化的胰岛素类似物，其中相对于母体胰岛素，胰
岛素类似物的A链包含至少一个突变，且胰岛素类似物的B链包含至少一个突变。 4.按照前述条款的任一项的PEG化的胰岛素类似物，其中胰岛素类似物在第一个
改性胰岛素类似物的蛋白酶位点中进一步包含至少一个氨基酸替代，其中所述至少一个氨
基酸替代是使至少一个疏水性氨基酸被至少一个亲水性氨基酸替代。 5.按照前述条款的任一项的PEG化的胰岛素类似物，其中A12位的氨基酸是Glu 或Asp ;和/或在A13位的氨基酸是His、Asn、Glu或Asp ;和/或在A14位的氨基酸是Asn、 Gln、Glu、Arg、Asp、Gly或His ;和/或在A15位的氨基酸是Glu或Asp ;和在B24位的氨基 酸是His ;和/或在B25位的氨基酸是His ;和/或在B26位的氨基酸是His、 Gly、 Asp或 Thr ;和/或在B27位的氨基酸是His、 Glu、 Lys、 Gly或Arg ;和/或在B28位的氨基酸是 His、Gly或Asp ;并且其任选进一步包含一个或多个其它突变。 6.按照前述条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中在A14位的氨基酸是Glu、 Asp或His,在B25位的氨基酸是His,并且其任选进一步包含一个或多个其它突变。
7.按照前述条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中在A14位的氨基酸是Glu、 Asp或His,在B25位的氨基酸是His,在B30位的氨基酸缺失。 8.按照前述条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中在A14位的氨基酸是Glu、 Asp或Hi s ，在B25位的氨基酸是Hi s 。 9.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中一个或 多个其它突变选自
A (-3) Gly， A (_2) Gly， A Pro, A (0) Pro, A8His， A18Gln， A18Gln， A21Gln， A21Gly， B(—3)Gly， B(—2)Gly， B(—l)Pro， B(0)Pro， BlGlu， BlGln， ro， BlGlu， BlGln， B3Gln， B10Pro， B14Thr， B16Glu， B17Ser， B26Asp， DesB26， DesB27， B27Glu， B27Glu， B28Asp， desB28， desB29， desB30， B31Leu， B32Glu。 10.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中其它突 变是desB30。 11.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中A14是 Glu。 12.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，相对于母体 蛋白，其针对一或多种蛋白酶的稳定性提高。 13.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，相对于母体 蛋白，其针对两种或多种蛋白酶的稳定性提高。 14.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中母体胰 岛素选自a)人胰岛素；b)人胰岛素的胰岛素类似物，其中在B28位的氨基酸残基是Pro、 Asp、Lys、Leu、Val或Ala，在B29位的氨基酸残基是Lys或Pro，且任选，在B30位的氨基酸 残基缺失； c) des (B26-B30)人胰岛素，des(B27-B30)人胰岛素，des(B28-B30)人胰岛素， des(B29-B30)人胰岛素，des(B27)人胰岛素或des(B30)人胰岛素； d)人胰岛素的胰岛素类似物，其中在B3位的氨基酸残基是Lys，和在B29位的氨 基酸残基是Glu或Asp ;e)人胰岛素的胰岛素类似物，其中在A21位的氨基酸残基是Gly， 和其中胰岛素类似物在B链的C端进一步用两个Arg残基延长；和f)其中B30位的氨基酸 残基被苏氨酸甲酯取代的胰岛素衍生物。 15.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中选择一 个或多个其它突变，以便增强胰岛素的化学稳定性。 16.按照前述条款的PEG化胰岛素类似物，其中一个或多个其它突变选自A18Gln、 A21Gln、A21GLy和B3Gln。 17.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，包含式1的 A链氨基酸序列 XaaA(—2「XaaA(—D-XaaAo-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaM2 _XaaA13_XaaA14_XaaA15_Leu_Glu_XaaA18_Tyr_Cys_XaaA21_XaaA22(SEQ ID No :1)禾口式2的Bf连氛 基酸序列XaaB(—2「XaaB(—d-XaaBo-)(aaB「)(aaB2-)(aaB3-)(aaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-)(aa副-Le u_Val_Glu_Ala_Leu_XaaB16_Leu_Val_Cys_Gly_Glu_Arg_Gly_XaaB24_XaaB25_XaaB26_XaaB2「Xa aB28_XaaB29_XaaB3o_XaaB3「XaaB32 (SEQ ID No :2) 其中XaaA(—2)不存在，或是Gly ;XaaA(—d不存在，或是Pro ;XaaA。不存在，或是Pro ; XaaA8独立地选自Thr禾PHis ;Xaa^2独立地选自Ser、Asp和Glu ;XaaA13独立地选自Leu、Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser禾口 Glu ;XaaA14独立地选自Tyr、 Thr、 Asn、 Asp、 Gln、His、Lys、Gly、Arg、Pro、Ser和Glu ;XaaA15独立地选自Gln、Asp和Glu ;XaaA18独立地选 自Asn、 Lys和Gin ;XaaA21独立地选自Asn和Gin ;XaaA22不存在，或是Lys ;XaaB(—2)不存在， 或是Gly ;XaaB(—d不存在，或是Pro ;XaaB。不存在，或是Pro ;XaaB1不存在，或独立地选自Phe和Glu ;XaaB2不存在，或是Val ;XaaB3不存在，或独立地选自Asn和Gin ;XaaB4独立地选自 Gin和Glu ;XaaB1。独立地选自His、 Asp、 Pro和Glu ;XaaB16独立地选自Tyr、 Asp、 Gln、 His、 Arg和Glu ;Xaa咖独立地选自Phe和His ;XaaB25独立地选自Phe和His ;XaaB26不存在，或独 立地选自Tyr、 His、 Thr、 Gly和Asp ;XaaB27不存在，或独立地选自Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、Gly、Arg、Pro、Ser禾P Glu ;XaaB28不存在，或独立地选自Pro、His、Gly和Asp ;XaaB29不 存在，或独立地选自Lys和Gin ;XaaB3。不存在，或是Thr ;XaaB31不存在，或是Leu ;XaaB32不 存在，或是Glu ;C端可以任选衍生化为酰胺形式；其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列 在A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位 的半胱氨酸之间通过二硫桥连接，和其中A链的6和11位的半胱氨酸通过二硫桥连接。其 中任选N端A链氨基酸序列通过包含3-7个氨基酸的氨基酸序列与C端B链氨基酸序列连 接，形成单链胰岛素分子，其中任选B链的N端延长1-10个氨基酸；其中，如果XaaA8是Thr 和XaaA12是Ser和XaaA13是Leu和XaaA14是Tyr，那么XaaA15是Glu或Asp ;并且其中，如果 XaaB24是Phe禾口 XaaB25是Phe禾口 XaaB26是Tyr禾口 XaaB27是Thr禾口 XaaB28是Pro,那么XaaB29是 Gln。 18.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，包含式3的 A链氨基酸序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-XaaA8-Ser-Ile-Cys-XaaA12-XaaA13-XaaA14-XaaA15-Leu-Glu-XaaA18-Tyr-Cys-XaaA21(SEQ ID No :3)和式4的B链氨基酸序列XaaB1-Va 1-XaaB3-XaaB4-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa咖-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa咖-Leu-Val-Cys-G ly_Glu_Arg_Gly_XaaB24_His_XaaB26_XaaB2「XaaB28_XaaB29_XaaB3(l(SEQ ID No :4)其中Xaa旭独 立地选自Thr和His ;XaaA12独立地选自Ser、 Asp和Glu ;XaaA13独立地选自Leu、 Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser禾P Glu ;XaaA14独立地选自Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg、 Pro、 Ser和Glu ;XaaA15独立地选自Gln、 Asp和Glu ;XaaA18独立地选自Asn、 Lys和Gln ;XaaA21独立地选自Asn和Gln ;XaaB1独立地选自Phe和Glu ;XaaB3独立地选自 Asn和Gln ;XaaB4独立地选自Gln和Glu ;XaaB10独立地选自His、 Asp、 Pro和Glu ;XaaB16独 立地选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu ;Xaa鹏独立地选自Phe和His ;XaaB26不存在，或独 立地选自Tyr、 His、 Thr、 Gly和Asp ;XaaB27不存在，或独立地选自Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、Gly、Arg、Pro、Ser禾P Glu ;XaaB28不存在，或独立地选自Pro、His、Gly和Asp ;XaaB29不 存在，或独立地选自Lys和Gln ;XaaB3。不存在，或是Thr ;C端可以任选衍生化为酰胺形式； 其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列在A链7位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间 和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨酸之间通过二硫桥连接，其中A链的6和 11位的半胱氨酸通过二硫桥连接。 19.按照前述条款的PEG化的胰岛素类似物，其中XaaA8独立地选自Thr和His ; Xaaw2独立地选自Ser禾P Glu ;XaaA13独立地选自Leu、Thr、Asn、Asp、Gln、His、Lys、Glt、Arg、 Pro、Ser和Glu ;XaaA14独立地选自Asp、His和Glu ;XaaA15独立地选自Gln和Glu ;XaaA18独 立地选自Asn、Lys和Gln ;XaaA21独立地选自Asn和Gln ;XaaB1独立地选自Phe和Glu ;XaaB3 独立地选自Asn和Gln ;XaaB4独立地选自Gln和Glu ;XaaB1。独立地选自His、 Asp、 Pro和 Glu ;XaaB16独立地选自Tyr、Asp、Gln、His、Arg和Glu ;Xaa咖独立地选自Phe和His ;XaaB26 独立地选自Tyr、Thr、Gly禾PAsp ;乂&&蹈7独立地选自Thr、 Asn、 Asp、 Gln、 His、 Lys、 Gly、 Arg 和Glu ;XaaB28独立地选自Pro、 Gly和Asp ;XaaB29独立地选自Lys和Gln ;XaaB3。不存在，或是Thr ;C端可以任选衍生化为酰胺形式；其中A链氨基酸序列和B链氨基酸序列在A链7
位的半胱氨酸和B链7位的半胱氨酸之间和在A链20位的半胱氨酸和B链19位的半胱氨
酸之间通过二硫桥连接，且其中A链的6和11位的半胱氨酸通过二硫桥连接。 20.PEG化的胰岛素类似物，其中，在子胰岛素中，在A14位的氨基酸是Glu或
His (即，E和H，按照一个字母代码)，在B25位的氨基酸是His,和其任选进一步包含一个或
多个其它突变，且其中PEG部分通过连接基与B29位的赖氨酸残基中的e氨基酸相连接。 21.按照前述条款的PEG化胰岛素类似物，其中子胰岛素包含A14E突变。 22.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中在子胰
岛素中，除了在B25位的突变以外，只在前述条款中提到的A14位有突变。 23.按照条款21的PEG化胰岛素类似物，其中子胰岛素包含A14H突变。 24.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中子胰岛
素类似物包含desB30突变。 25.按照前述条款(至可能的程度)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中在子 胰岛素内的一个或多个其它突变选自:A (-1) P， A (0) P， A8H， A21G， B (-1) P， B (0) P， B1E， BIQ， B16E， B26D， B27E， B28D， desB30， B31L， B32E。 26.按照前述条款的PEG化胰岛素类似物，其中在子胰岛素中，除了在A14位和 B25位的突变以外，只有一个前述条款中提到的突变。 27.按照前述条款(至可能的程度，但除了最后一个(即条款27除外))的任一项 的PEG化胰岛素类似物，其中在子胰岛素中，除A14和B25位的突变以外，恰好具有两个在 前述条款(但一个除外(即在条款25中所提到的))中提到的突变。 28.按照前述条款(至可能的程度，但除了最后两个(即条款26和27除外))的
任一项的PEG化胰岛素类似物，其中在子胰岛素中，除A14和B25位的突变以外，恰好具有
三个在前述条款(两个除外(即在条款25中所提到的))中提到的突变。 29.按照前述条款(至可能的程度，但除了最后两个(即条款27和28除外))的任
一项的PEG化胰岛素类似物，其中除A14和B25位的突变以外，唯一的额外突变是desB30。 30.按照前述条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，包含部分_ (OCH2CH2)n_，其中n
是在2至大约1000范围的整数，优选从2至大约500，优选从2至大约250，优选从2至大
约125，优选从2至大约50，优选从2至大约25，和优选从2至大约12。 31.按照前述合适条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部分具有
大约200至大约40， 000范围的额定分子量，优选从大约200至大约30， 000，优选从大约200
至大约20， OOO，优选从大约200至大约10， OOO，优选从大约200至大约5， OOO，优选从大约
200至大约2， OOO，优选从大约200至大约1， OOO，和优选从大约200至大约750。 32.按照前述合适条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部分是单
分散的。 33.按照前述条款的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部分具有通式-(CH2CH20)
n-，其中n是至少为大约6的整数，优选至少大约IO，并且不超过大约IIO，优选不超过大约
75，更加优选n是在大约6至大约30的范围，优选在大约10至大约48的范围。 34.按照前述合适条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部分是多
分散的。
35.按照前述合适条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部分是直 链、支链、叉形或哑铃形的。 36.按照前述合适条款的任 一 项的PEG化胰岛素类似物，其包含通
式-QL(OCH^H》n-W的基团，其中(^是连接聚乙二醇部分与子胰岛素中氨基酸的-NH-基团 的连接基，优选通过酰胺或氨基甲酸酯键，n是在2至大约1000范围的整数，和R1是烷氧基 或羟基，优选甲氧基。 37.按照前述条款的PEG化胰岛素类似物，其中n是2至大约500的整数，优选从 2至大约500，优选从2至大约250，优选从2至大约125，优选从2至大约50，和优选从2至 大约25。 38.按照前述合适条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中Q1是_亚烷基_C0_， 其通过羰基与胰岛素的-NH-残基连接。 39.按照前述合适条款的PEG化胰岛素类似物，其中Ql是亚乙基羰基 (-(CH2) [CO-)，其通过羰基与-NH-残基连接。 40.按照前述合适条款(除两个最后的条款之外)的任一项的PEG化胰岛素类似 物，其中Q1是_亚烷基-NHCO-亚烷基-CO-，其通过羰基与胰岛素的-NH-残基连接。
41.按照前述合适条款(除最后三个之外)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中 Q1是-CO-亚烷基-CO-。 42.按照前述合适条款(除最后四个之外)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中 Q1是-CO-。 43.按照前述合适条款(除最后五个之外)的任一项的PEG化胰岛素类似物，其 中Q1是(_亚烷基-NHCO-亚烷基-0-亚烷基_) pCHq-NHCO-亚烷基-(OCH2CH2) 「NHCO-亚烷 基-CO-，其中p是l、2或3，q是0、l或2，p+q是3，r是l至大约12的整数，其通过羰基与 胰岛素的-NH-残基连接。 44.按照前述合适条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中Ql是_CH2CO_， _CH2C H2CO-， -CH2CH2CH2CO-， _CH2CH(CH3) CO-， _CH2CH2CH2CH2CO-， _CH2CH2CH (CH3) CO-， _CH2CH2CH2CH2C H2CO-， -CH2CH2NH-COCH2CH2CO-， -CH2CH2NH_COCH2CH2CH2CO-， -CH2CH2CH2NH_COCH2CH2CO-， _CH2CH2C H2NH-COCH2CH2CH2CO-， _COCH2CH2CO-， _COCH2CH2CH2CO-， -CO-， (_CH2CH2NHCOCH2CH2OCH2) 3CNH_C OCH2CH2 (OCH2CH2) 4NHCOCH2CH2CO_或(_CH2CH2NHCOCH2CH2OCH2) 3CNH_COCH2CH2 (OCH2CH2) 4NHCOCH2 CH2CH2CO-。 45.按照前述合适条款的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中R1是烷氧基。 46.按照前述条款的PEG化胰岛素类似物，其中R1是甲氧基。 47.按照前述产物条款的任一项的化合物，其是在上述说明书例如在具体实施例
中具体提到的任一项化合物，尤其是下面实施例1以及以下等等的任一项化合物。 48.按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途，该药物组
合物用于治疗糖尿病。 49.按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途，该药物组 合物可以通过肺部给予，用于治疗糖尿病。 50.按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途，该药物组 合物可以通过肺部给予，用于治疗糖尿病，并且其具有长效效果。
51.按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备粉剂药物组合物的用途，该药 物组合物可以通过肺部给予，用于治疗糖尿病。 52.按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备液体药物组合物的用途，该药 物组合物可以通过肺部给予，用于治疗糖尿病。 53.按照前述产物条款的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途，该药物组 合物可以通过口服给予，用于治疗糖尿病。 54.治疗糖尿病的方法，该方法包括给予需要其的患者治疗有效量的按照前述 产物条款的任一项的化合物。 55. —种组合物，其包含人胰岛素以及按照前述条款的任一项的PEG化胰岛素类 似物。 56. —种组合物，其包含胰岛素阿速帕(aspart)以及按照前述条款的任一项的 PEG化胰岛素类似物。 57. —种组合物，其包含赖脯胰岛素(insulin lispro)以及按照前述条款的任一 项的PEG化胰岛素类似物。 58. —种组合物，其包含胰岛素Glulisine以及按照前述条款的任一项的PEG化胰 岛素类似物。 59.药物组合物，其包含生物学活性 数量的按照上述与胰岛素类似物有关的条款 的任一项的胰岛素类似物和可药用载体。 60.治疗、预防或减轻患者的高血糖症、II型糖尿病、葡糖耐量削弱、I型糖尿病、 肥胖症、综合症X或血脂异常的方法，包括给予患者按照上述与胰岛素类似物有关条款的 任一项的胰岛素类似物或按照上述条款的任一项的药物组合物。 61.治疗有效量的按照上述与胰岛素类似物有关条款的任一项的胰岛素类似物用 于制备药物制剂的用途，该药物制剂用于治疗或预防高血糖症、II型糖尿病、葡糖耐量削 弱、I型糖尿病、肥胖症、综合症X或血脂异常。 62.治疗糖尿病的方法，该方法包括给予需要其的患者治疗有效量的按照前述 产物条款的任一项的PEG化胰岛素。 —项或多项本文所描述条款的组合，任选还与一个或多个下面的权利要求组合，
产生进一步的条款，并且本发明涉及所述条款和权利要求的所有合适的组合。 将本文中引用的所有参考文献(包括出版物，专利申请和专利)以其整体引入本
文作为参考，其程度如同每个参考文献是单独和具体地注明引入作为参考那样，并且本文
以其整体列出(法律所允许的最大程度)。 本文使用所有标题和副标题，仅仅为方便起见，并且不应该将其理解为以任何方 式对本发明进行限制。 本文提供的任何和所有实施例或示范性术语(例如，"例如")仅仅是为了更好地 说明本发明，不造成对本发明范围的限制，除非另外要求。在说明书中没有文辞将被视为指 示对本发明的实践是必需的、任何未要求保护的要素。 本文引用和引入的专利文件仅仅为方便起见，并不反映这种专利文件的有效性、 专利性和/或可实施性的任何观点。本文提到的参考文献不承认它们构成现有技术。
本文中，单词"由...组成"广泛地是指"包括"、"包含"或"涵盖"(EPOguidelinesC 4. 13)。 本发明包括本文所附加权利要求中所列举主题的所有变体和等效内容，其是为适 用的法律所允许的。 下面的列表中，所选择的PEG化试剂是作为活化的N-羟基琥珀酰亚胺酯(0Su)。明
显地，可以使用其它活性酯，例如4-硝基苯氧基酯和本领域技术人员已知的许多其它活性
酯。PEG (或mPEG)部分CH30- (CH2CH20) n-可以是至多Mw 40. OOODa的任何大小，例如750Da，
2000Da，5000Da，20. OOODa和40. OOODa。 mPEG部分可以是多分散的，但也可以是单分散的，
由mPEG组成，具有较好限定链长的例如12或24个重复乙二醇单位表示的mdPEGx (由此限
定了分子量)，其中m:甲基/甲氧基封端，d:分散的，x是重复乙二醇残基的数目，例如12
或24。 PEG部分可以是直链或支链的。在延长胰岛素上的PEG残基的结构/序列可以形式
上用"NH-胰岛素"替代各种PEG化试剂的离去基团(例如"-OSu")来获得，其中在赖氨酸
残基的e位或在A或B链(或两个)的a氨基位置将胰岛素PEG化，例如 mPEG-COCH2CH2CO_OSu， mPEG-COCH2CH2CH2CO_OSu， mPEG-CH2CO_OSu， mPEG-CH2CH2CO_OSu， mPEG-CH2CH2CH2CO_OSu， mPEG-CH2CH2CH2CH2CO_OSu， mPEG-CH2CH2CH2CH2CH2CO_OSu ， mPEG_CH2CH (CH3) CO-OSu ， mPEG_CH2CH2CH (CH3) CO-OSu ， mPEG-CH2CH2NH-COCH2CH2CO-OSu，mPEG-CH2CH2CH2NH-COCH2CH2CH2CO-OSu ，mPEG-CH2CH2CH2NH-COCH2CH2CO-OSu ，mPEG-CH2CH2NH-COCH2CH2CH2CO-OSu ， mPEG-CO- (4_硝基苯氧基)， (mdPEG12-CH2CH2NHCOCH2CH2OCH2) 3CNHCOCH2CH2 (OCH2CH2) 4NHCOCH2CH2CO-OSu (或，简 单地(mdPEG12) 3-dPEG4-OSu)，OndPEG12-CH2CH2NHCOCH2CH2OCH2)
简单地::(mdPEG12) 3-dPEG4-OSu)，
mdPEGx--COCH2CH2CO-OSu，mdPEGx--COCH2CH2CH2CO-OSu，mdPEGx--CH2CO-OSu，mdPEGx--CH2CH2CO-OSu，mdPEGx--CH2CH2CH2CO-OSu，mdPEGx--CH2CH2CH2CH2CO-OSu，mdPEGx--CH2CH2CH2CH2CH2CO-OSu ，mdPEGx--CH2CH(CH3) CO-OSu，mdPEGx--CH2CH2CH(CH3) CO-OSu ，
mdPEGx-CH2CH2NH-C0CH2CH2C0-0Su ，mdPEGx-CH2CH2CH2NH-C0CH2CH2CH2C0-0Su ，mdPEGx-CH2CH2CH2NH-C0CH2CH2C0-0Su ，mdPEGx-CH2CH2NH-C0CH2CH2CH2C0-0Su或 mdPEGx-C0- (4_硝基苯氧基)， 其中x是大约6至大约48的整数，例如12或24。 另外，通过将两个或多个较小的PEG试剂进行组装，可以制备大的PEG化试剂。例 如，象上面任何PEG试剂一样，封端PEG试剂例如N-羟基琥珀酰亚胺酯可以与(任选保护 的)PEG部分(其在一端用氨基和在另一端用羧酸(酯)进行官能化)偶合。羧酸脱保护 之后(如果需要的话)，将羧酸活化，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺酯，提供更长的PEG化试 剂。如果需要的话，通过将该循环重复一或多次，可以将获得的PEG化试剂进一步延长。下 面举例说明了这种原理和方法。 这种方法能够构成大的单分散的(和多分散的)PEG化试剂(设计的大小)。 本发明的PEG残基的实例包括 mPEG750 (其中"750"表示平均分子量，Da)，
























mPEG2000，
mPEG5000，
mPEG10000，
mPEG20000，
mPEG30000，
mPEG40000，
mdPEG12，(其中下标'
12"表示PEG单体的数目-本文定义的，和例
mdPEG2 mdPEG
mdPEG4
mdPEG,厂dPEG,
如由Quanta BioDesign Ltd.定义的)
(其中下标"3xl2"表示PEG是支链的，并且由3个〗 成，每个臂由12个PEG单体组成-本文定义的 (mdPEG^)3—dPEG4—0Su，禾口例如由Quanta BioDesign Ltd 所定义的)，
(其中下标"4x4"表示PEG是支链的，并且由4个臂组成， 每个臂由4个PEG单体组成-如本文所定义(在下面的 "优选胰岛素"中)，和例如由IRIS Biotech GMBH所定 义)，
(其中mdPEG12-dPEG12表示PEG残基是由mdPEG12 残基和氨基_dPEG12-酸残基组装的，如上所指出和下 面的举例说明)，
mdPEGi mdPEG2 mdPEG2 mdPEG,
-dPEG2 -dPEG丄 -dPEG2 -dPEG9
mdPEG3xl2_dPEG12，
mdPEG3xl2-dPEG24-dPEG24， [O383]mdPEG4x4-dPEG12或
mdPEG4x4-dPEG24. 在下文中，命名所有的本发明的PEG化胰岛素，在所有的情况下，好象连接PEG部 分与胰岛素的连接基是(3-)丙酰连接基一样。由上述可明显得知，许多类型的连接基是可 商购的，并且由于并不是连接基的确切结构/组合控制安插在规则的胰岛素序列外部残基 处的PEG部分的有利效果，所以，应该理解，所有类型的连接基(参见上面)都在本发明范 围之内。 本发明的母体蛋白酶稳定的胰岛素包括下列A14E， B25H人胰岛素；A14E， B25H， desB30人胰岛素；A14H， B25H，人胰岛素和A14H， B25H， desB30人胰岛素。
实施例 提供下列实施例作为实例，不作为限制使用。 制备本发明的PEG化的蛋白酶稳定的胰岛素的一般方法(A) 在第一个实施例中举例说明一般方法(A)。 实施例1 :一般方法(A): A14E， B25H， B29K (NE-3_mdPEG24-丙酰)，desB30人胰岛素
将A14E，B25H desB30人胰岛素(1. 5g)溶于0. 1M Na2C03(34mL)中，并用IN NaOH 将pH值调节至lO。加入溶于MeCN(16. 8mL)中的mdPEG24_SPA(0. 45g， Quanta BioDesign Ltd)，并慢慢地搅拌混合物1小时。加入水(25ml)，用IN HC1将pH值调节至5. 5，并将混 合物冷冻干燥。通过制备HPLC纯化，获得标题化合物。柱C18，3cm。 A缓冲液0. 1% TFA/ MiliQ水；B缓冲液0. 1% TFA/乙腈。梯度10-55% B，45min。产率650mg。
MALDI-MS(基质HCCA) ;m/z :6762，计算值6762。
该化合物具有实质上延长的肺部效果。 利用下面实施例10所描述的方法，通过大鼠气管内滴注(instillation)，试验实 施例1的化合物(即A14E， B25H， B29K (NE-3_mdPEG24-丙酰)、desB30人胰岛素)和胰岛 素阿速帕(aspart)。每组中的动物数目是4_5个。气管内给予的实施例1化合物的剂量 是10、20和40nmol/kg，获得的血糖水平(mM)作为时间(分钟)的函数在下面图1中给出。 气管内给予胰岛素阿速帕(aspart)的剂量是5、10和15nmol/kg，获得的血糖水平(mM)作 为时间(分钟)的函数在下面图1中给出。如图l所示，本发明的化合物具有剂量依赖性 的血糖降低效果，肺部给药之后，这种效果得到延长


实施例2 :—般方法(A):
A14E， B25H， B29K (NE-3_mPEG2. 000-丙酰)，desB30人胰岛素
<formula>formula see original document page 33</formula>


MALDI-MS (基质芥子酸)；m/z :7850 (宽峰)。
实施例3 :—般方法(A):
A14E， B25H， B29K (NE-3-{mPEG750}丙酰氨基甲酰基)，desB30人胰岛素
<formula>formula see original document page 33</formula> MALDI-MS (基质芥子酸);m/z :6570 (宽峰)。
实施例4 :一般方法(A):A14E， B25H， B29K(NE-3-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰)
desB30人胰岛素
<formula>formula see original document page 33</formula> 3-{2-「2-(2-甲氣某乙氣某)乙氧,某]乙氣某1丙酸叔丁某酯: 在室温下，将三甘醇 一 甲基醚(1. Og， 6. lmmol)和丙烯酸叔丁基酯(390mg，
3. 05,1)溶于无水THF中，并加入金属钠(0. 7mg，0. 03,1)。搅拌混合物4小时，加入1M
HC1 ，以猝灭反应。用二氯甲烷提取混合物两次，用MgS04干燥有机相，真空浓縮，提供油，将
其用硅胶色谱纯化，使用乙酸乙酯作为洗脱液。产物是油，773mg(44X )。LCMS m = 237. 1 (M-tBu) 3-{2-「2-(2-甲氣某乙氣某)乙氧,某]乙氣某1丙酸琥珀酰亚胺某酯:将3-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁基酯(131mg，0.45mmol)溶于三氟乙酸中，并在室温下保持1小时。真空除去溶剂，用二噁烷蒸发除去残 余三氟乙酸。将脱保护的中间物溶于二氯甲烷中，用N-羟基琥珀酰亚胺(57mg，0.49mmo1) 和乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(86mg，0. 45mmol)处理，并在室温下搅拌 过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，用水洗涤两次。用MgS04干燥有机相，真空浓縮，提 供122mg(82% )。 A14E, B25H, B29K(Ni-3-{2-「2_(2-甲氧某乙氧某)乙氧某]乙氧某}丙酰)， desB30人胰岛素 在室温下，将A14E， B25H desB30胰岛素(500mg，0. 08mmol)溶于0.1M碳酸钠 (6mL) (pH值10.5)中。将3-{2_[2-(2_甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸琥珀酰亚胺 基酯(35mg，0. llmmol)溶于乙腈中，并加入到胰岛素溶液中。pH值现在是10. 3。 30分钟之 后，将反应混合物用0. 1M甲胺(0. 6mL)淬灭。用RP-HPLC(在C4柱上)纯化胰岛素产物， A缓冲液0. 1%三氟乙酸/水，B缓冲液0. 1% TFA/乙腈，提供227mg歸)。
ES-MS ;m/z :5879. 6。(重叠法(deconvoluted)) 使用下面实施例11所描述的方法，在小肠注射胰岛素的大鼠中，将实施例4的化 合物(即，A14E， B25H， B29K(NE-3-{2-[2_(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰)， desB30人胰岛素)与82服(『-3-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰)， desB30人胰岛素(在下面图2中称为"比较物")相比较。将实施例4的胰岛素和比较物 施加到禁食的SPRD大鼠的中间空肠中(平均值士SEM ;给予的剂量体积0. 4ml/kg)。动 物组规模是本发明的胰岛素和比较物，n = 7，赋形剂(Milli-Q水)，n = 3。获得的结果 (血糖(mmo1/1)随着时间(分钟)降低)给出在下面图2中。由图2可看出，给予到禁食 的SPRD大鼠(口服递送模型)的中间空肠中之后，与82服(『-3-{2-[2-(2-甲氧基乙氧 基)乙氧基]乙氧基}丙酰)，desB30人胰岛素相比较，本发明的化合物(S卩，A14E，B25H， B29K(NE-3-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰)，desB30人胰岛素)具有 显著提高的效能和延长作用。由此，3小时以内，B29K(『-3-(2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙 氧基]乙氧基}丙酰)，desB30人胰岛素没有可测量的效果，但4小时之后，本发明的化合 物仍然可最大限度地抑制血糖。
实施例5 :—般方法(A):
B25H， B29K(NE-3-(mdPEG12)丙酰)人胰岛素
O
hG I VEQCCTS I CSLYQLENYCN-。h 」
s s Z
h-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGF;YTP-N^>i~T-°h
H II
o MALDI-MS(基质芥子酸)；m/z :6365。
实施例6: 本发明的胰岛素衍生物的胰岛素受体结合
用SPA试验(闪烁近似测定法)微量滴定平皿抗体捕捉试验，测定本发明的胰岛 素衍生物与人胰岛素受体的亲合性。将SPA-PVT抗体-结合珠粒、抗小鼠试剂(Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017)与25ml结合缓冲液(lOOmM HEPES， pH7. 8 ;100mM氯 化钠，10mM MgS04，0. 025 % Tween-20)混合。对于单一 Packard Optiplate (Packard No. 6005190)，试剂混合物由下列组成2. 4iU的1 : 5000稀释纯化的重组体人胰岛素受 体(有或者没有外显子(exon)ll)，适量的A14Tyr[^I]-人胰岛素的储备溶液(相当于每 100 ii 1试剂混合物5000cpm) ， 12 ill的1 : 1000稀释的F12抗体，3ml的SPA-珠粒和结 合缓冲液，总共12ml 。然后在Packard Optiplate中，将总共100 试剂混合物加入到每 个孔中，在Optiplate中、由合适的样品制备胰岛素衍生物的稀释系列。然后将样品培养 16小时，同时轻轻地晃动。然后离心分离各相1分钟，并在Topcounter中将平皿计数。在 Gr即hPad Prism 2.01(Gr即hPad Software, San Diego， CA)中，使用非线性回归算法来拟 合结合数据。 所选择的本发明化合物的胰岛素受体结合亲合性 实施例 胰岛素受体结合， 编号A-异构型(没有外显子11): (相对于人胰岛素) 1 2.2% 2 l眉 3 3眉 4 17% 5 10% 实施例7 : 胰岛素类似物和人胰岛素针对糜蛋白酶的解朊稳定性(半衰期)的比较
在37°C ，在100 ii L的最终容积条件下，在lOOmM NH4HC03 (pH8. 1)中或5mM NaP、 140mM NaCl、70ppm Tween20 (pH7. 4)中培养之后，测定人胰岛素和胰岛素类似物(0. 6mM， 10iiL)针对糜蛋白酶(0. 34或3.4iig，3.4iiL，0. l或liig/iiL)的解朊稳定性。在不同 的时间(0、5、15、30、60分钟)，将样品用相等体积的0. 2% TFA淬灭，并转变到5°C。用 RP-HPLC(在214nm)立即分析人胰岛素和胰岛素类似物，测定相当于完整蛋白的峰下面积。 由曲线获得半衰期(11/2)，并计算与人胰岛素相比较的倍数增加/降低(稳定性相关的倍 数)。 所选择的本发明化合物针对糜蛋白酶分解的相对稳定性 实施例针对糜蛋白酶分解的稳定性 编号(相对于人胰岛素的倍数) 1 14x 2 16x 4 llx 实施例8 : 在大鼠中静脉内快速浓注本发明的胰岛素衍生物之后的血糖降低效果 使用Hypnorm-Dormicum s. c. (1. 25mg/ml多美康，2. 5mg/ml氟阿尼酮，O. 079mg/ml枸橼酸芬太尼)将雄性Wistar大鼠(200-300g，禁食18小时)麻醉，2ml/kg作为初次剂 量(给予试验物质之前的时点_30min)，每20分钟额外给予lml/kg。 通过静脉注射(尾部静脉，lml/kg)给予动物对照和试验化合物(常用量范围 0. 125-20nmol/kg)。为了测定全血葡萄糖浓度，在时间_20min和0min (给药之前)，和在 给药之后时间10、20、30、40、60、80、120和180min，通过将尾尖的毛细血管进行穿剌，将血 样收集在肝素化10 玻璃管中。在分析缓冲液中稀释之后，通过固定的葡萄糖氧化酶方 法，使用EBIO Plus自动分析器(E卯endorf，Germany)，测定血糖浓度。对于每个剂量和每 个化合物，产生平均血浆葡萄糖浓度(平均值士SEM)。
实施例9 : 相对于人胰岛素的本发明的胰岛素衍生物的效能 将重量238_383g的Sprague Dawley雄性大鼠在实验的当天用于夹钳实验。在可 控的环境条件下，使大鼠自由接触饲料，并且禁食过夜(从3pm)，而后进行夹钳实验。
实验方案: 使大鼠在动物装置中适应至少1周，而后进行手术。在夹钳实验之前大约1周，在 氟烷麻醉下，将Tygon导管插入到颈静脉(用于输液)和颈动脉(用于采血)中，并且外置， 在颈部背后固定。手术后给予大鼠Str印tocilin vet. (Boehringer Ingelheim ;0. 15ml/ 大鼠，i.m.)，并在恢复期间放入动物护理装置(25°C)中。为了镇痛，在麻醉期间给予 Anorphin (0. 06mg/大鼠，s. c.)，从麻醉中完全恢复(2-3小时)之后，给予Rimadyl (1. 5mg/ kg， s. c.)，每日给予一次，给予2天。 在实验当天的7am，将过夜禁食(从先前一天的3pm开始)的大鼠称重，并与取样 注身寸器禾口输 夜系纟充(Harvard 22 Basic栗，Harvard,禾口 Perfectum Hypodermic玻璃注身寸 器，Aldrich)连接，然后放入独立的夹钳笼中，在其中，使它们休息大约45min，而后开始实 验。在整个实验期间，大鼠能够自由地在其常见的寝具上移动，并且可以自由地接触饮用 水。30min基本时间(在此期间，每10min间隔测量一次血浆葡萄糖水平)之后，将试验 的胰岛素衍生物和人胰岛素(每个大鼠一个剂量水平，每剂量水平1! = 6-7)以恒速灌输 (i. v. )300min。为了保持血糖正常(euglyceamia)，每10min间隔测量一次血浆葡萄糖水 平，并且相应地调节20 %葡萄糖水溶液的输注。从每个大鼠中收集再悬浮的红细胞样品，并 且通过颈动脉导管送还大约72ml体积。 在每个实验的当天，在夹钳实验之前和最后，获取所试验的各别胰岛素衍生物溶 液和人胰岛素溶液的样品，并通过HPLC确认肽的浓度。在该研究之前和最后的相应时点，
测量大鼠胰岛素和c-肽以及所试验的胰岛素衍生物和人胰岛素的血浆浓度。在实验的最
后，使用过度剂量的戊巴比妥将大鼠杀死。 实施例10 : 给大鼠肺部递送胰岛素衍生物 通过滴注方法，将试验物质通过肺部给药。简单地说，用大约60ml芬太尼/ dehydrobenzperidol(氟哌利多)/_多美康将雄性Wistar大鼠(大约250g)麻醉，在 时点-10、20、50和95min，以6. 6ml/kg sc作为初次剂量，而后以一个30min的间隔给 予3.3ml/kg sc的3个维持剂量。诱导麻醉之后十分钟，从尾部静脉获得基本样品(t =-20min)，而后在给予试验物质之前立即获得基本样品(t = 0)。在t = 0时，将试验物质通过气管内给予到一个肺中。将带有圆头的特殊导管装配在注射器上，注射器含有200ia 空气和试验物质(lml/kg)。通过管口，将导管引入气管中，并向前进入到一个主支气管 中-刚好通过分岔。在插入期间，从外部摸触颈，以保证气管定位。注入注射器中的内含物， 而后暂停2秒。而后，慢慢地收回管。在试验期间，使大鼠保持麻醉(采血样至多4或8小 时)，并在实验之后将大鼠安乐死。
实施例11 : 注入到Sprague-Dawley大鼠的小肠中的本发明胰岛素类似物的血糖降低效果
使用Hypnorm-Dormicum s. c. (0. 079mg/ml枸橼酸芬太尼，2. 5mg/ml氟阿尼酮，和 1.25mg/ml咪达唑仑)将雄性Sprague-Dawley (SPRD)大鼠(250-350g，禁食18小时)麻醉， 2ml/kg作为初次剂量(给予试验物质之前的时点_60min) ， 20min之后给予lml/kg，而后每 40min给予lml/kg。 将麻醉的大鼠放置在恒温的毯子上(稳定在37°C )。使20cm聚乙烯导管充满 胰岛素溶液，并从盲肠插入到小肠3-4cm处。将导管尖头放置在目标段的内腔大约2cm 处。在0时间时，通过导管给予大鼠0.4ml/kg的试验或对照化合物(常用剂量范围是 240-1440nmol/kg)。为了测定全血葡萄糖浓度，在时间_30和Omin(给药之前)，和在时间 10、20、30、60、100、120、180和240min，通过将尾尖的毛细血管进行穿剌，将血样收集在肝 素化10 iU毛细管中。在分析缓冲液中稀释之后，通过葡萄糖氧化酶方法，使用EBIO Plus 自动分析器(E卯endorf，Germany)，测定血糖浓度。对于每个化合物，产生平均血糖浓度进 程(平均值士SEM)。 可以类似地制备其它优选的蛋白酶稳定的本发明PEG化胰岛素，并且如下所述。
实施例12 可以按照上面实施例所述的、蛋白酶稳定的PEG化胰岛素的制备方法来类似制备 的优选的蛋白酶稳定的本发明PEG化胰岛素包括A14E， B25H， B29K(NEmdPEG12_dPEG24-丙 酰)，desB30人胰岛素 PEG化试剂可以按照下面描述的方法制备"-(甲氣某-PEG二-丙酰某氡某)-PEG^_丙酸(mdPEG，-dPEG，酸)的制备
<formula>formula see original document page 38</formula> 〗f mdPEG12 NHS酉旨(0. 457mmol， Quanta BioDesign Ltd. Product Nol0262)禾口氛 基-dPEG24叔丁酯(0. 416mmol，Quanta BioDesign，Product Nol03H)分别溶解在乙腈(每 个lOmL)中，然后将两个溶液混合，用DIPEA将pH值调节至pH8 (使用潮湿标志条进行pH值 的测量)。将得到的混合物在室温搅拌过夜，随后蒸干，而后在室温用TFA/DCM(1/1) (lOmL) 处理1小时。然后蒸干混合物，并用DCM汽提两次。通过HPLC纯化残余物(2cm， C18柱)， 使用乙腈(AcCN)/0. 1 % TFA和水/0. 1 % TFA作为洗脱液。梯度10-80 % AcCN/TFA，从 5-20min。收集含有目标化合物的馏份，合并，蒸干，产生甲氧基_PEGn-丙酰基氨基) PEG23-丙酸油(249mg，35% )。
LCMS :m/z :1718(M+1)+."-(甲氧基-PEGn_丙酰基氨基)_PEG24-丙酸N_羟基琥珀酰亚胺酯
(mdPEG12-dPEG24-NHS或mdPEG12_dPEG24-丙酸OSu酯)的制备
<formula>formula see original document page 38</formula> 将"-(甲氧基-PEGn-丙酰基氨基)PEG24-丙酸(249mg，0. 145,1)溶于乙月青 (lOmL)中，通过加入DIPEA将pH值调节至8(使用潮湿标志条进行pH值的测量)。加入 TSTU(48mg，0. 16mmol)的乙腈(lOmL)溶液，在室温下搅拌混合物1. 5小时，并蒸干。将残余 物溶于DCM中，用盐酸(0.01M)洗涤，干燥(MgS04)有机相，过滤，蒸干滤液。不用进一步纯 化，使得到的甲氧基-PEGn-丙酰基氨基)PEGM丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯与胰岛素偶 合。 LCMS :m/z 1813. 8(M+1)+.
实施例13-19 同样，可以类似地制备下面优选胰岛素的其它PEG化试剂。A14E， B25H， B29K(NE (mdPEG24_基_dPEG24-基)，desB30人胰岛素:卜G I VEQCCTS I CSLEQLENYCN。h
h-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP—N
H
O A14E， B25H， B29K(NE (mdPEG12) 3_dPEG4-基)，desB30人胰岛素:
H，c
OH
hG I VEQCCTS I CSLEQLENYCN'oh
HfVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFH丫TP—N'
H
OH
A14E， B25H， B29K(NE (mdPEG12) 3_dPEG4-基_dPEG12-基)，desB30人胰岛素
hG I VEQCCTS I CSLEQLENYCN。h
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP—N'
H
A14E， B25H， B29K (NE (mdPEG12) 3-dPEG厂基_dPEG24-基)，desB30人胰岛素:
<formula>formula see original document page 40</formula>
A14E， B25H， B29K (NE-3_mdPEG4x4-丙酰)，desB30人胰岛素:
hGI VEQCCTS I CSLEQLENYCN'oh
h'FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTP—N'
H
A14E， B25H， B29K (NE -3_mdPEG4x4-dPEG12-丙酰)，desB30人胰岛素<formula>formula see original document page 41</formula>
-3-mdPEG4x4-dPEG24-丙酰)，desB30人胰岛素<formula>formula see original document page 41</formula> 序列表 SEQ ID NO :5是实施例1-4和12-19中被研究的A链。SEQ ID NO :6是实施例1-5 和12-19中被研究的B1-B28链。SEQ ID NO :7是实施例5中被研究的A链。
权利要求
PEG化的胰岛素类似物，其中，在子胰岛素中，相对于母体胰岛素，至少两个疏水性氨基酸被亲水性氨基酸替代，其中替代是在母体胰岛素的两个或多个蛋白酶裂解位点内或其很近处，和其中这种子胰岛素任选进一步包含一个或多个其它突变，并且其中PEG部分通过连接基与赖氨酸残基的ε氨基在所述子胰岛素的B29位置相连接。
2. PEG化的胰岛素类似物，其中，在子胰岛素中，在A14位的氨基酸是Glu或His(即，E和H，按照一个字母代码)，在B25位的氨基酸是His,并且其任选进一步包含一个或多个其它突变，和其中PEG部分通过连接基与B29位的赖氨酸残基中的e氨基酸相连接。
3. 按照权利要求1或2的PEG化胰岛素类似物，其中子胰岛素包含A14E突变。
4. 按照前述权利要求的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中子胰岛素类似
5. 按照前述权利要求的任一项的PEG化胰岛素类似物，包含部分-(OCH^ign-，其中n是在2至大约1000范围的整数，优选从2至大约500，优选从2至大约250，优选从2至大约125，优选从2至大约50，优选从2至大约25，和优选从2至大约12。
6. 按照前述可能权利要求的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部分具有大约200至大约40， 000范围的额定分子量，优选从大约200至大约30， OOO，优选从大约200至大约20， OOO，优选从大约200至大约10， OOO，优选从大约200至大约5， OOO，优选从大约200至大约2， OOO，优选从大约200至大约1， OOO，和优选从大约200至大约750。
7. 按照前述可能权利要求的任一项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部分是单分散的。
8. 按照前述可能权利要求的任一项的PEG化胰岛素类似物，其是A14E， B25H，B29K(NE-3-mdPEG24-丙酰)，desB30人胰岛素；A14E， B25H， B29K (NE-3_mPEG2. 000-丙酰)，desB30人胰岛素；A14E，B25H，B29K(NE3-{mPEG750}_丙酰氨基甲酰基)，desB30人胰岛素；A14E，B25H，B29K(NE-3-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰)，desB30人胰岛素；B25H，B29K(NE-3-(mdPEGj-丙酰)人胰岛素；A14E，B25H，B29K(N、dPEGi2-dPEG24-丙酰)，desB30人胰岛素；A14E， B25H， B29K(NE (mdPEG24—基_dPEG24-基)，desB30人胰岛素；A14E， B25H， B29K(NE (mdPEG12) 3_dPEG4-基)，desB30人胰岛素；A14E， B25H， B29K(NE (mdPEG12) 3-dPEG4-基_dPEG12-基)，desB30人胰岛素；A14E， B25H， B29K(NE (mdPEG12) 3_dPEG4-基-dPEG24-基)，desB30人胰岛素；A14E， B25H， B29K (NE-3-mdPEG4x4-丙酰)，desB30人胰岛素；A14E， B25H， B29K(NE-3-mdPEG4x4-dPEG12-丙酰)，desB30人胰岛素，或A14E， B25H，B29K(NE-3-mdPEG4x4-dPEG24-丙酰)，desB30人胰岛素。
9. 按照前述权利要求的任一项的PEG化胰岛素，用作药物或用于药物制剂。
10. 按照前述产物权利要求的任一项的PEG化胰岛素，用于治疗糖尿病，或按照前述产物权利要求的任一项的PEG化胰岛素用于制备药物的用途，该药物用于治疗糖尿病。
11. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途，该药物组合物可以通过肺部给予，用于治疗糖尿病，并且其具有长时作用效果。
12. 按照前述产物权利要求的任一项的化合物用于制备药物组合物的用途，该药物组合物可以通过口服给予，用于治疗糖尿病。
13. 治疗、预防或减轻患者的高血糖症、II型糖尿病、葡糖耐量削弱、I型糖尿病、肥胖症、综合症X或血脂异常的方法，包括给予患者按照上述与胰岛素类似物有关的权利要求的任一项的胰岛素类似物或给予按照上述权利要求的任一项的药物组合物。
14.治疗有效量的按照上述与胰岛素类似物有关的权利要求的任一项胰岛素类似物用于制备药物制剂的用途，该药物制剂用于治疗或预防高血糖症、II型糖尿病、葡糖耐量削弱、I型糖尿病、肥胖症、综合症X或血脂异常。
全文摘要
新的PEG化的胰岛素类似物，其具有对蛋白酶的抗性，可以有效地通过肺部或口服给药。该胰岛素类似物包含B25H和A14E或A14H。PEG化是在B29K处进行的。
文档编号A61K38/28GK101743252SQ200880024805
公开日2010年6月16日 申请日期2008年7月9日 优先权日2007年7月16日
发明者P·马德森, T·B·克杰德森, T·M·塔格莫塞, T·霍格-詹森 申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司