专利名称：：经口组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及经口组合物，其包含胶原或明胶或者其降解产物、以及羟脯氨酸或其
背景技术：
：胶原是细胞外基质的主要蛋白质成分，所述细胞外基质填充生物组织的细胞之间或细胞群之间的间隙，据说有时胶原构成哺乳动物体内总蛋白质的近30%(见非专利文件1)。胶原形成纤维或膜结构，具有对组织结构进行维持、支持、连接、增强等的主要功能，且大量存在于皮肤、骨骼、腱、韧带、角膜、血管等之中。组织胶原的减少、变性等被认为是引起由组织老化而产生的皱纹、下垂、骨质疏松等的主要因素。事实上，还有报道记载了长时间的日光暴露会使组织胶原锐减(见非专利文件2)，并且胶原代谢低下引发了与年龄有关的生物物质代谢低下的向前进展(见非专利文件3)。此外，已知在构成胶原或明胶的氨基酸当中，丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为i:1.3(见非专利文件4)。作为增进胶原代谢的方法，通过胶原降解产物进行胶原合成促进作用是已知的(见专利文件14)。此外，已知羟脯氨酸对培养的人成纤维细胞具有胶原合成促进作用，并且局部应用时具有抑制或改善皱纹形成的效果(见专利文件5)。此外，含有构成胶原的氨基酸如甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸等的含氨基酸化妆品(见专利文件6)以及含羟脯氨酸的这类化妆品(见专利文件7)是已知的。然而，据认为含胶原的食品或饮料的效果几乎感受不到，除非其摄入的量级达到几克，另外，某些摄取形式的气味或味道使得不容易被摄入。考虑到这类问题，需要一种能够减少胶原摄取量的新方法。再者，胶原或明胶或者其降解产物与羟脯氨酸的组合效果是未知的。非专利文件l:"SeikagakuJiten(生化学词典)第1版"，东京化学同人，1984年，■页。非专利文件2:"KareitoHihu(老化与皮肤)"，清至書院，1986年，35页。非专利文件3:"衰老的机理与控制"，IPC，1993年，151页。非专利文件4:"生化数据手册1"，日本生化学学会，1981年，1667页。专利文件1:JP-A-7-278012。专利文件2:JP-A-2000-201649。专利文件3:JP-A-2001-131084。专利文件4:JP-A-2003-137807。专利文件5:JP-A-7-278012。专利文件6:JP-A-2001-224334。专利文件7:JP-A-2006-79921。
发明内容技术问题本发明的目的是提供一种经口组合物，其包含胶原或明胶或者其降解产物，以及羟脯氨酸或其盐。技术手段本发明涉及以下(1)(5)。(1)—种经口组合物，其包含含有胶原或明胶或者其降解产物的组合物，以及羟脯氨酸或其盐。(2)—种经口组合物，其包含含有胶原或明胶或者其降解产物的组合物，以及羟脯氨酸，其中所述经口组合物水解得到的氨基酸中所包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:1.5150。(3)—种经口组合物，其包含含有胶原或明胶或者其降解产物的组合物，以及羟脯氨酸或其盐，其中所述经口组合物水解得到的氨基酸中所包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:i.5150。(4)—种经口组合物的制造方法，包含向含有胶原或明胶或者其降解产物的组合物中添加羟脯氨酸。(5)上述(4)的制造方法，其中添加羟脯氨酸使得所述经口组合物水解得到的氨基酸中所包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:1.5150。技术效果本发明能够提供一种经口组合物，其包含胶原或明胶或者其降解产物，以及羟脯氨酸或其盐。该经口组合物可以用作胶原合成促进剂、面部干燥减轻剂等。具体实施例方式本发明可以使用任何来源于动物的胶原或明胶，例如来源于家畜(猪、牛、鸡等)的，来源于鱼、贝类等的。作为胶原，也可以使用市售的产品，如胶原P和MaringenS_06(PF)(新田明胶株式会社制造)等。作为明胶，也可以使用市售的产品，如鱼明胶(ixos系列)、猪源明胶(Ara系列)(新田明胶株式会社制造)等。胶原或明胶的降解产物可以是通过水解酶或者用酸或碱进行水解得到的降解产物。水解酶的例子包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等。作为水解酶，也可以使用市售产品，如"蛋白酶p-3"(天野酶株式会社制造，碱性蛋白酶)等。作为胶原降解产物，也可以使用市售产品，如胶原肽800F、IXOSHDL系列(新田明胶株式会社制造)等。此外，作为明胶降解产物，也可以使用市售产品，如水溶性胶原肽DS、水溶性胶原肽SS(协和健康株式会社出售)等。胶原或明胶或者其降解产物的分子量通常为400300，000，优选为500100，OOO，优选使用分子量为50015，000的那些。根据羟脯氨酸的脯氨酸是D型还是L型、羟基的位置是3-位还是4-位以及其立体异构体是顺式还是反式的，本发明中使用的羟脯氨酸包括8种类型的立体异构体。羟脯氨酸的具体例子包括顺式-4-羟基-L-脯氨酸、顺式-4-羟基-D-脯氨酸、顺式_3-羟基-L-脯氨酸、顺式-3-羟基-D-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、反式-4-羟基-D-脯氨酸、反式_3-羟基-L-脯氨酸和反式_3-羟基-D-脯氨酸，优选反式_4-羟基-L-脯氨酸。作为胶原中主要的构成氨基酸成分或弹性蛋白的构成氨基酸，羟脯氨酸是自然界中广泛存在的一种氨基酸。例如，它可以用酸水解动物源性胶原并按常规方法进行纯化而制备。可以通过使用分离自拟无枝酸菌属(GenusAmycolatopsis)或指孢囊菌属(Dactylosporangium)的脯氨酸4_位脱氢酶(JP-A-7-313179)制备反式_4_羟基_L_脯氨酸。此外，也可以通过使用分离自链霉菌属(ge皿sStr印tomyces)的脯氨酸3_位脱氢酶(JP-A-7-322885)制备顺式+羟基_L_脯氨酸(BIOINDUSTRY,第14巻，第31期，1997)。羟脯氨酸的盐的例子包括酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等。酸加成盐的例子包括无机酸盐，如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等；有机酸盐，如醋酸盐、马来酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、a_酮戊二酸盐、葡萄糖酸盐、辛酸盐、乳清酸等。金属盐的例子包括碱金属盐如钠盐、钾盐等，碱土金属盐如镁盐、f丐盐等，铝盐，锌盐等。铵盐的例子包括铵、四甲基铵等的盐。有机胺加成盐的例子包括吗啉、哌啶等的盐。氨基酸加成盐的例子包括甘氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸等的盐。当本发明的经口组合物水解释出氨基酸时，对丙氨酸与羟脯氨酸的重量比没有特别的限制。其优选为l:1.5150，更优选为1:2.5IOO，特别优选为1:3.560。作为将经口组合物水解的方法，可以提到的一种方法包括向0.1克经口组合物中添加7毫升612M的盐酸，并将混合物在ll(TC下处理12小时24小时，优选18小时24小时。当经口组合物是诸如饮料等的溶液时，优选使经口组合物经受诸如减压、加热等处理，从而得到干燥的固体产物，然后将其水解。经口组合物水解得到的丙氨酸及羟脯氨酸的重量可以如下测量，例如按上述方法将经口组合物水解，从而在减压下得到干燥的固体产物，把该产物溶解在例如全自动氨基酸洗脱液中，并把溶液放入全自动氨基酸分析仪(日本电子社制造，几C-500/V)。在本发明的经口组合物中，胶原或明胶或者其降解产物和羟脯氨酸的含量是使得在经口组合物水解释出的游离氨基酸中所含的羟脯氨酸的比例调成优选为经口组合物的50.00195重量％、更优选为0.0185重量％这样的量。制备本发明的经口组合物可以通过，例如，向包含胶原或明胶或者其降解产物的组合物中添加羟脯氨酸或其盐，使得当经口组合物水解释出氨基酸时，游离丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:1.5150，优选为1:2.5IOO，更优选为1:3.560。本发明的经口组合物也优选用作胶原合成促进剂、面部干燥减轻剂等。在这种情况下，经口组合物优选包含抗坏血酸或其衍生物或其盐。本发明的经口组合物优选包含比例为0.0001重量％30重量％、更优选0.001重量％10重量％的抗坏血酸或其衍生物或其盐。只要在药理上可以接受，抗坏血酸或其衍生物或其盐可以是任意的。作为抗坏血酸衍生物，例如，使用磷酸酯形式、硫酸酯形式等等。作为抗坏血酸盐，使用钠盐、钙盐等。本发明的经口组合物可以用作例如药物、食品或饮料或食品添加剂(以下也称为本发明的药物、食品或饮料、或食品添加剂)。当本发明的经口组合物用作药物时，通常理想的是提供为经口制剂。制剂的制备可以按照制剂学
技术领域：
中熟知的任何方法，在必要时，除上述成分以外，还与载体混合。为了把本发明的经口组合物配制成制剂，可以使用添加剂，如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、稀释剂、缓冲剂、抗氧化剂、微生物抑制剂等。作为制剂的剂型，可以提到的有片剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、糖浆剂、胶囊剂等。当制剂的剂型是诸如糖浆剂等的液体制剂时，可以添加水、糖如蔗糖、山梨醇、果糖等、二醇如聚乙二醇、丙二醇等、油如芝麻油、橄榄油、豆油等、防腐剂如对羟基苯甲酸酯等、香料如草莓香料、薄荷等、等等，来制备所述制剂。此外，在例如适合经口给药的片剂、粉剂、颗粒剂等情况下，制备制剂时可以添加赋形剂，例如糖(如乳糖、白糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等)、淀粉(如马铃薯、小麦、玉米等)、无机材料(如碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钠、氯化钠等)、植物粉(如甘草、黄龙胆粉等)，等等；崩解剂，例如淀粉、琼脂、明胶粉、结晶纤维素、羧甲纤维素钠、羧甲纤维素钙、碳酸钙、碳酸氢钠、藻酸钠等；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、硅油等；粘合剂，例如聚乙烯醇、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲纤维素、胶液等；表面活性剂，例如脂肪酸酯等；增塑剂，例如甘油等；等等。本发明的经口组合物的剂量接受服用人的服用形式、年龄和体重等而变化。按经口组合物水解释出的羟脯氨酸的重量计，成人的日剂量通常为0.15g，优选为0.12g，更优选为O.1lg，一天当中分一至几部分服用。虽然对服用期限没有特别的限制，但通常为一天到一年，优选为1周到3个月。可以通过与上述制剂同样的方法制备本发明的食品添加剂。制备本发明的食品添加剂是根据需要混合或溶解其它食品添加剂，将其加工成例如粉末、颗粒、球丸、片剂或各种液剂的形式。除了要添加本发明的食品添加剂以外，本发明的食品或饮料可以按食品和饮料的一般生产方法加工和制备。也可以通过例如下述的方法制备本发明的食品或饮料造粒法，如流化床造粒、搅拌造粒、挤出造粒、辊压造粒、气流造粒、压縮成型造粒、块料破碎造粒、喷雾造粒、喷射造粒等；包衣法，如锅包衣、流化床包衣、干包衣等；膨胀法，如膨化干燥、过度水蒸汽法、泡沫垫6法、微波加热法等；挤出法，如挤出造粒机、挤出机等；等等。本发明的食品或饮料可以为任意的形式，其例子包括果汁，软饮，茶，乳制品如乳酸菌饮料、发酵奶、冰冻甜点、黄油、奶酪、酸奶、加工奶、脱脂奶等，肉制品如火腿、香肠、汉堡等，鱼类加工的海鲜酱产品如鱼饼、管状鱼肠、炸鱼肉饼等，蛋制品如日式蛋巻、蒸鸡蛋羹等，甜点如饼干、果冻、口香糖、糖果、点心等，面包，面条，日本腌菜，熏制食品，干食品，酱油煮的食品，盐腌制品，汤，调味品等。此外，本发明的食品或饮料的形式可以是例如粉状食品、片状食品、瓶装食品、罐头食品、蒸食、胶囊食品、片剂样食品、液体饮食、保健饮料等。本发明的食品和饮料可以用作促进胶原合成的食品和饮料，如保健食品、功能性食品、补品、用于特定保健用途的食品等。本发明的食品和饮料以及食品添加剂可以含有常用于食品和饮料的添加剂，例如甜味剂、着色剂、防腐剂、增稠剂和稳定剂、抗氧化剂、显色剂、漂白剂、杀真菌剂、口香糖胶基、苦味剂、酶、光泽剂、酸味剂、调味剂、乳化剂、强化剂、制造用剂、香料、香辛料提取物等。本发明的经口组合物不仅可用于人类，还可用于人类以外的动物(以下縮写为非人类的动物)。非人类动物的例子包括人类以外的动物，如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类等。给非人类动物服用的剂量根据动物的年龄、种类等而不同。按经口组合物水解释出的羟脯氨酸的重量计，每kg体重的日剂量通常为2600mg，优选为2360mg，更优选为2180mg，每天分一至若干次服用。虽然对服药时限没有特别的限制，但通常是一天至一年，优选为l周至3个月。以下所示为涉及本发明经口组合物的胶原合成促进效果、面部干燥减轻效果及感官评价的实验例。实验例1使用F344/DuCrlCrlj大鼠(雄性，8周龄，购自CharlesRiverLaboratoriesJapanInc.)。它们饲养在温度23。C和湿度55%的环境下，使用CE-2(CLEAJapan,Inc.)为饲料，饮水自由供给。一组包括六只大鼠，按体重不产生差异对大鼠进行分组。每个服用组的大鼠每天一次口服以下的组合物或纯化水作为样品液体，连续12天。具体而言，服用组15的大鼠各以10mL/kg服用组合物15，所述组合物的获得是把水溶性胶原肽SS(协和发酵工业株式会社制造，以下縮写为胶原肽)和反式-4-羟基-L-脯氨酸(协和发酵工业株式会社制造，以下縮写为L-羟脯氨酸)溶解在纯化水中达到表1中所示的含量。对照服用组6的大鼠服用纯化水10mL/kg。每个样品液体中胶原肽和L-羟脯氨酸的含量，以及每个样品液体中L-丙氨酸与L-羟脯氨酸的重量比示于表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>将组合物15水解得到的氨基酸中所包含的L-丙氨酸和L-羟脯氨酸的重量分别计算为，各组合物中所含胶原肽经水解得到的氨基酸中包含的L-丙氨酸的重量，以及包含在该氨基酸中的L-羟脯氨酸的重量与包含在各组合物中的L-羟脯氨酸的重量的总量。其中，获得胶原肽经水解所得氨基酸中包含的L-丙氨酸和L-羟脯氨酸的重量是通过将12M盐酸(7ml)加入胶原肽(lOOmg)中，该混合物在ll(TC下水解18小时，并由全自动氨基酸分析仪(日本电子社制造，几C-500/V)测量重量。结果是，胶原肽(lOOmg)中包含8.7mg的L-丙氨酸和11.9mg的L-羟脯氨酸。在从服用试验开始的第13天，在通过腹腔内施用戊巴比妥麻醉的情况下给腹部剃毛，收集腹部皮肤，冻结粉碎之后用0.45M氯化钠提取可溶性胶原。把等量的6M盐酸加到提取物中，混合物在ll(TC下处理18小时。仲氨基用NBD-C1(4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑，東京化成工業社制造)进行标记，并使用ODS柱(4.6cm小X15cm，GLScienceslnc.制造)，通过高效液相色谱法分析可溶性胶原中的L-羟脯氨酸量。其值以平均值±标准偏差表示，并通过student-t-检验进行统计学的显著差异的检验。结果示于表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>如表2所示，将只包含胶原肽或L-羟脯氨酸的组合物作为样品液体服用的服用组35没有显示出皮肤中L-羟脯氨酸量、即可溶性胶原量的增加。相反，服用包含胶原肽和L-羟脯氨酸的组合物的服用组1和2则显示出可溶性胶原量显著增加。实验例2使用F344/DuCrlCrlj大鼠(雄性，7周龄，购自CharlesRiverLaboratoriesJapanInc.)，每组4只大鼠，进行与实验例1中同样的服用试验。服用组711的大鼠各服用10mL/kg的组合物711，所述组合物是把胶原肽和L-羟脯氨酸溶解在纯化水中达到表3中所示的含量而获得的。对照服用组12的大鼠服用纯化水10mL/kg。每个样品液体中胶原肽和L-羟脯氨酸的含量，以及每个试验溶液中L-丙氨酸与L-羟脯氨酸的重量比示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>按与实验例1中同样的方法，计算将组合物7ll水解得到的氨基酸中所包含的L-丙氨酸和L-羟脯氨酸的重量。在从服用试验开始的第13天，在通过腹腔内施用戊巴比妥麻醉的情况下给腹部剃毛，收集腹部皮肤。在ll(TC下用6M盐酸处理腹部皮肤18小时，按与实验例1中同样的方法测定可溶性胶原和不溶性胶原中的L-羟脯氨酸量，并用作胶原可合成性的指标。其值以平均值±标准偏差表示。结果示于表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>如表4所示，将只包含胶原肽或L-羟脯氨酸的组合物作为样品液体服用的服用组911没有显示出皮肤中L-羟脯氨酸的量、即可溶性胶原和不溶性胶原的总量增加。相反，同时服用胶原肽和L-羟脯氨酸的服用组7和8则显示出可溶性胶原和不溶性胶原总量显著增加。实验例3把11个健康人(年龄2560岁)分成试验组(6人)和对照组(5人)两个组，进行为期4周的双盲摄取试验。每天晚餐后用水摄入装在两个硬胶囊中的试验物质。试验物质的组成示于表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1:旭化成化学株式会社制造，CeolusFD301摄取试验物质4周后，进行一项涉及改善面部干燥的问巻调查。在对照组中，40%的受试者承认得到改善，试验组中83.3%承认面部状况改善。因此，胶原肽和L-羟脯氨酸的摄取产生了显著的效果。实验例4由两个人对实施例5和比较例1中得到的饮料进行感官评价。实施例5中得到的饮料被评为"容易喝"，而比较例1中得到的饮料被评为"由于胶原的独特气味而有点难喝"。本发明的实施例如下所示。[实施例l]将水溶性胶原肽SS(协和发酵工业株式会社制造，100g)和反式-4-羟基-L-脯氨酸(协和发酵工业株式会社制造，500g)混合，以得到经口组合物。经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:58.84。[实施例2]将水溶性胶原肽SS(协和发酵工业株式会社制造，500g)和反式-4-羟基-L-脯氨酸(协和发酵工业株式会社制造，500g)混合，以得到经口组合物。经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:12.86。[实施例3]将水溶性胶原肽SS(协和发酵工业株式会社制造，500g)和反式-4-羟基-L-脯氨酸(协和发酵工业株式会社制造，100g)混合，以得到经口组合物。经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:3.67。[实施例4]将水溶性胶原肽SS(协和发酵工业株式会社制造，500g)和反式-4-羟基-L-脯氨酸(协和发酵工业株式会社制造，300g)混合，以得到经口组合物。经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:8.26。[实施例5]在蒸馏水中溶解以下成分至总量为100ml，由此制备出含胶原和L-羟脯氨酸的饮料。经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:3.67。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>比较例1在蒸馏水中溶解下面各成分至总量为100ml，由此制备出含胶原的饮料。表7成分量(g)水溶性胶原肽ss(协和发酵工业株式会社)5.0High-CraftM75(果糖含量55重量％，日本玉米淀粉株式会社制造)5.45柠檬酸0.15在蒸馏水中溶解上述成分至总量为100ml。[实施例6]包含羟脯氨酸和胶原肽的片剂均匀混合下面的各成分，用单冲头压片机对混合物进行压片，得到直径5mm的重量15mg的片剂。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[实施例7]包含羟脯氨酸和胶原肽的颗粒剂对实施例2中得到的片剂进行粉碎、制粒并过筛，得到2050目颗粒剂。[实施例8]包含羟脯氨酸和胶原肽的饮料(2)通过搅拌均匀地溶解下面各组分，并加入纯化水至总量为1000ml，由此制备出含反式_4-羟基-L-脯氨酸的饮料。以下成分中，适量的香料和色素是指饮料常规生产中的用量，适量的纯化水是指除了其它成分外使总量达到1000ml所需的量。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>包含羟脯氨酸和胶原肽的糖果按常规方法制备以如下成分制作且包含反式_4-羟基-L-脯氨酸的糖果。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>[实施例IO]包含羟脯氨酸和胶原肽的胶囊剂称量出下面各成分，送入混合机中并充分混合直至均匀。按常规方法把混合物装入硬型明胶胶囊中，得到硬胶囊剂，每1个胶囊含约500mg反式-4-羟基-L-脯氨酸。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>工业实用性本发明可以提供一种经口组合物，其包含胶原或明胶或者其降解产物、以及羟脯氨酸或其盐，其能有效促进胶原合成等。权利要求一种经口组合物，其包含含有胶原或明胶或者其降解产物的组合物，以及羟脯氨酸或其盐。2.—种经口组合物，其包含含有胶原或明胶或者其降解产物的组合物，以及羟脯氨酸，其中所述经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:1.5150。3.—种经口组合物，其包含含有胶原或明胶或者其降解产物的组合物，以及羟脯氨酸或其盐，其中所述经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:1.5150。4.一种经口组合物的制造方法，包含向含有胶原或明胶或者其降解产物的组合物中添加羟脯氨酸。5.根据权利要求4所述的制造方法，其中添加羟脯氨酸使得所述经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比为1:1.5150。全文摘要本发明的目的是提供一种适用于促进胶原合成等的经口组合物。本发明可以提供包含胶原或明胶或者其降解产物以及羟脯氨酸或其盐的经口组合物。该经口组合物水解得到的氨基酸中包含的丙氨酸与羟脯氨酸的重量比优选为1∶1.5～150。文档编号A61P43/00GK101795704SQ200880100419公开日2010年8月4日申请日期2008年5月30日优先权日2007年6月1日发明者池田武史,神村彩子,酒井康申请人:协和发酵生化株式会社