用于治疗脊柱的组合物和方法

专利名称：用于治疗脊柱的组合物和方法
相关申请资料
本申请依据PCT第I章条款8和35U.S.C.§119(e)，在此要求获得于2007年6月4日提交的美国临时专利顺序号60/933,202和于2008年2月7日提交的美国临时专利顺序号61/026,835的优先权，二者都在此引作参考。
发明领域 本发明涉及用于治疗包括椎体在内的脊柱结构的组合物和方法。

背景技术：
肌骨骼问题遍布所有年龄组及两性人群。根据美国矫形外科医师协会(American Academy of Orthopedic Surgeons，AAOS)2003年年会提出的大量公开的文章，一半美国人在其一生的某个时间需要骨折服务。根据该报告，美国每年超过一百亿美元花费在与骨折治疗有关的住院护理上。
椎骨压缩性骨折(Vertebral compression fracture，VCF)是最常见的骨质疏松性骨折，在约20％的绝经后妇女中发生(Eastell等，J BoneMiner Res 1991；6207-215)。估计每年发生700,000例VCF，而这些病例中仅250,000受到诊断和治疗。由于这些骨折未得到治疗，因而骨质疏松症可能也未得到治疗并迅速发展。绝经后妇女在未来一年内继续发生另一次椎骨骨折的风险增加5倍，包括髋骨折在内的其它脆弱性骨折的风险增加2倍(Klotzbuecher等，J Bone Miner Res，2000；15721-739)。
当椎体终板之一或两者破裂时则发生VCF，终板破裂通常由创伤引起，导致前柱故障并使椎骨对在日常生活活动中的身体的支撑变弱。由骨质疏松症引起的椎骨压缩性骨折可导致虚弱性背痛、脊柱畸形和身高缩减。表现症状的椎骨骨折和无症状的椎骨骨折二者都与高发病率和死亡率有关。随着预期骨质疏松症风险的老年人人数在未来十年急剧增加，需要准确鉴定VCF和治疗介入以降低该疾病对患者和健康护理系统的巨大的潜在影响。
传统上一直用卧床休息、麻醉性镇痛药、支具(brace)和物理疗法来治疗由骨质疏松症引起的VCF。然而，卧床休息导致骨丢失加速和身体去适应作用(physical deconditioning)，使患者进一步恶化以及促进骨质疏松症问题。此外，麻醉药的使用可使在老年人中可能本已普遍存在的情绪和心理问题更恶化。另外，支具的穿戴不能为老年人所耐受。尽管目前骨质疏松症的治疗(例如激素替代、二膦酸盐、降钙素和甲状旁腺激素(PTH)类似物)能解决长期的问题，但除降钙素外，一旦发生骨折在镇痛方面它们都不能提供立即的益处(Kapuscinski等，Master Med.Pol.1996；2883-86)。
目前业已开发了用于椎骨压缩性骨折的微创疗法椎体成形术(vertebroplasty)和椎体后凸成形术(kyphoplasty)，以解决疼痛和骨折稳定化问题。椎体成形术是为了稳定骨骼的目的填充骨折的椎体，防止进一步塌陷并消除急性骨折疼痛。然而，椎体成形术并不企图恢复椎骨高度和/或矢状位排列(sagittal alignment)。另外，因为在骨骼中没有空隙，用粘性较小的粘固剂进行椎骨填充较难操控，因此填充物往往会渗漏。
椎体后凸成形术是具有安全目的的微创手术方法，其改善脊椎高度并稳定VCF。在X射线图像引导下，在骨折的椎体中使可扩张的骨球囊(bone tamp)膨胀。这使内部的松质骨紧密，因为其将破裂的皮层推回其正常位置。然后可通过用控制体积下的生物材料与更具粘性的粘固剂填充空隙来进行固定。尽管椎体后凸成形术被认为是椎骨压缩性骨折的安全有效的治疗，但生物力学研究证明粘固剂的增加对相邻节段(level)产生了额外压力。事实上，这种硬度增加可使邻近椎骨失效(failure)的极限负荷降低8-30％，并引起随后的骨折(Berlemann等.，J Bone Joint Surgery BR，2002；84748-52)。本文将椎体成形术或椎体后凸成形术后的一处或多处椎体压缩性骨折称为“二次椎骨压缩性骨折”。
在最近的临床研究中，与未治疗的骨折的历史数据相比，在椎体后凸成形术后观察到二次椎骨压缩性骨折较高的发生率。这些病例中的大部分在所述方法后2个月内发生在相邻节段。在这两个月时间之后，仅有偶然的二次椎骨压缩性骨折发生在远处节段。该研究确证了显示的粘固剂增加对相邻节段产生了额外压力的生物力学研究(Fribourg等.，Incidence of subsequent vertebral fracture after kyphoplasty(椎体后凸成形术后并发的椎骨骨折的发生率)，Spine，2004；20；2270-76)。
既然用于治疗椎骨压缩性骨折的微创手术技术的使用增加了发病率，并且相邻椎骨易于经受二次压缩性骨折，那么对于预防性治疗和防止二次VCF存在未满足的临床需要。
发明简述 本发明提供用于治疗包括椎体在内的脊柱结构的组合物和方法。在本发明某些实施方案中，提供用于促进在椎体中的骨形成的组合物。在其它实施方案中，提供用于预防或降低椎骨压缩性骨折的可能性的组合物和方法。在另一实施方案中，提供用于预防或降低与椎体成形术和/或椎体后凸成形术相联的二次椎骨压缩性骨折的可能性的方法和组合物。本发明组合物和方法可用于治疗易患病患者(compromised patient)(例如患有骨质疏松症、糖尿病或其它疾病或病症的患者)的椎体。
在一个方面，用于促进椎体中的骨形成的组合物包含含血小板源生长因子(PDGF)的溶液和生物相容性基质，其中所述溶液被配置或被掺入到所述生物相容性基质中。在一些实施方案中，PDGF被生物相容性基质吸附。在其它实施方案中，PDGF被吸附到生物相容性基质的一个或多个表面。本发明再一实施方案中，PDGF被生物相容性基质吸附，并被吸附到生物相容性基质的一个或多个表面。
在一些实施方案中，PDGF以介于以下的浓度范围存在于溶液中约0.01mg/ml-约10mg/ml、约0.05mg/ml-约5mg/ml、约0.1mg/ml-约1.0mg/ml或约0.2mg/ml-约0.4mg/ml。溶液内的PDGF浓度可在上述任何浓度范围内。
在本发明某些实施方案中，PDGF包含PDGF同二聚体和杂二聚体，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DD及其混合物和衍生物。在一个实施方案中，PDGF包含PDGF-BB。在另一实施方案中，PDGF包含重组人(rh)PDGF，例如重组人PDGF-BB(rhPDGF-BB)。
在本发明某些实施方案中，PDGF包含PDGF片段。在一个实施方案中，rhPDGF-B包含以下片段完整B链的1-31、1-32、33-108、33-109和/或1-108位的氨基酸序列。在美国专利第5,516,896号的

图15中提供了PDGF B链的全部氨基酸序列(1-109)。应该理解，本发明rhPDGF组合物可包含完整rhPDGF-B(1-109)及其片段的组合。可采用PDGF的其它片段，例如在美国专利第5,516,896号中公开的片段。在一些实施方案中，rhPDGF-BB包含完整rhPDGF-B(1-109)的至少65％。
按照本发明某些实施方案，生物相容性基质包含骨代替剂(bonesubstituting agent)(本文中也称为支架材料(scaffolding material))和任选生物相容性粘合剂。在一些实施方案中，骨代替剂包括磷酸钙，其包括非结晶性磷酸钙、一水磷酸一钙(MCPM)、无水磷酸一钙(MCPA)、二水磷酸二钙(DCPD)、无水磷酸二钙(DCPA)、磷酸八钙(OCP)、α-磷酸三钙、β-TCP、羟基磷灰石(OHAp)、结晶性低的羟基磷灰石、磷酸四钙(TTCP)、十磷酸七钙(heptacalcium decaphosphate)、偏磷酸钙、二水焦磷酸钙、焦磷酸钙、碳磷酸钙、羟基磷灰石或它们的衍生物或混合物。在一些实施方案中，骨代替剂包括硫酸钙或脱矿骨(deminerialized bone)，例如干密质骨或松质骨。
在另一方面，本发明提供用于促进椎体中的骨形成的组合物，所述组合物包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液，其中生物相容性基质包含骨支架材料和生物相容性粘合剂。PDGF溶液可具有如上所述的PDGF浓度。在一些实施方案中，骨支架材料包括磷酸钙。在一个实施方案中，磷酸钙包括β-TCP。在一个方面，生物相容性基质可包括磷酸钙微粒(含或不含生物相容性粘合剂)或骨同种异体移植物(bone allograft)，例如冷冻干燥脱矿骨同种异体物(demineralized freezedried bone allograft，DFDBA)、冷冻干燥矿化骨同种异体物(mineralizedfreeze dried bone allograft，FDBA)或脱矿骨基质颗粒(particulartedemineralized bone matrix，DBM)。在另一方面，生物相容性基质可包括骨同种异体移植物(例如DFDBA、DBM)或其它骨同种异体移植物材料，包括各种形状(例如块状、楔形、圆柱体或颗粒)的密质骨或各种形状和大小的松质骨颗粒。
此外，根据本发明某些实施方案，生物相容性粘合剂包括蛋白质、多糖、核酸、碳水化合物、合成聚合物或其混合物。在一个实施方案中，生物相容性粘合剂包括胶原蛋白。在另一实施方案中，生物相容性粘合剂包括透明质酸。
本发明另一方面提供用于预防或降低椎骨压缩性骨折可能性的组合物，所述椎骨压缩性骨折包括二次椎骨压缩性骨折。在一些实施方案中，用于预防或降低椎骨压缩性骨折可能性的组合物包含含PDGF的溶液和生物相容性基质，其中将所述溶液配置在所述生物相容性基质中。在其它实施方案中，用于预防或降低椎骨压缩性骨折可能性的组合物包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液，其中生物相容性基质包含骨支架材料和生物相容性粘合剂。在用于预防或降低椎骨压缩性骨折可能性的组合物实施方案中，PDGF溶液可具有如上所述的PDGF浓度。此外，在一些实施方案中，骨支架材料包括磷酸钙。在实施方案中，磷酸钙包括β-磷酸三钙。根据本发明某些实施方案，生物相容性粘合剂包含蛋白质、多糖、核酸、碳水化合物、合成聚合物或其混合物。在一个实施方案中，生物相容性粘合剂包含胶原蛋白。在另一实施方案中，生物相容性粘合剂包含胶原蛋白，例如牛胶原蛋白。
在本发明某些实施方案中，用于促进椎体中的骨形成的组合物和用于预防或降低椎骨压缩性骨折可能性的组合物进一步包含至少一种造影剂。按照本发明实施方案，造影剂为可操作以在成像时至少部分地提供两个或更多个身体组织差异的物质。按照某些实施方案，造影剂包括阳离子造影剂、阴离子造影剂、非离子造影剂或它们的混合物。在一些实施方案中，造影剂包括不透射线造影剂(radiopaquecontrast agent)。在一些实施方案中，不透射线造影剂包括含碘化合物，其包括(S)-N，N′-双[2-羟基-1-(羟甲基)-乙基]-2，4，6-三碘-5-乳酰胺基间苯二甲酰胺(lactamidoisophthalamide)(碘帕醇(Iopamidol))及其衍生物。
在另一方面，本发明提供药剂盒，所述药剂盒包含在第一包装中的生物相容性基质和在第二包装中的含PDGF溶液。在一些实施方案中，生物相容性基质包含支架材料、支架材料和生物相容性粘合剂、和/或骨同种异体移植物如DFDBA或微粒DBM。在一个实施方案中，支架材料包括磷酸钙如β-TCP。此外，在一些实施方案中，所述溶液包含预定浓度的PDGF。可根据待实施的外科手术预定PDGF浓度，例如根据促进或加速椎体骨生长或预防或降低二次椎骨压缩性骨折的可能性来预定。此外，在一些实施方案中，生物相容性基质可以以预定量存在于药剂盒中。由药剂盒提供的生物相容性基质的量可视待实施的外科手术而定。在一些实施方案中，含有PDGF溶液的第二包装包含注射器。注射器可有助于PDGF溶液在生物相容性基质中的配置。在一些实施方案中，可将PDGF溶液配置到生物相容性基质中后，马上将得到的组合物置于第二注射器和/或套管中并递送到椎体。
本发明还提供制备用于促进椎体中的骨形成和预防或降低椎体压缩性骨折(包括二次椎骨压缩性骨折)的可能性的组合物的方法。在一个实施方案中，用于制备所述组合物的方法包括提供包含PDGF的溶液，提供生物相容性基质并将所述溶液配置到所述生物相容性基质中。在一些实施方案中，制备用于促进椎体中的骨形成和预防或降低椎体压缩性骨折可能性的组合物的方法进一步包括提供造影剂和将造影剂配置在生物相容性基质中。
在另一方面，本发明提供用于促进或加速椎体中的骨形成的方法，所述方法包括提供包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物和将有效量的组合物施用到至少一个椎体。在一些实施方案中，将所述组合物施用到至少一个椎体包括将组合物注射到至少一个椎体中。
在另一方面，本发明提供包括预防或降低椎骨压缩性骨折(包括二次椎骨压缩性骨折)的可能性的方法。按照本发明实施方案，预防或降低椎骨压缩性骨折可能性包括提供包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物和将有效量的组合物施用到至少一个椎体中。在一些实施方案中，将所述组合物施用到至少一个椎体包括将组合物注射到至少一个椎体中。在一个实施方案中，在对第一个椎体进行椎体成形术或椎体后凸成形术后，将组合物施用到第二个椎体，在某些情况下所述第二个椎体为相邻椎体。在一些实施方案中，将包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物施用到至少一个高危椎体。本文所用“高危椎体”(high risk vertebral body，HVB)指椎骨T5到T12以及L1到L4的椎体，它们处于经受二次椎骨压缩性骨折的最高风险中。
在本发明方法的某些实施方案中，生物相容性基质包含骨支架材料。在一些实施方案中，生物相容性基质包含骨支架材料和生物相容性粘合剂。
在一些实施方案中，用于促进椎体中的骨形成和预防或降低椎体压缩性骨折的可能性的方法，进一步包括除包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物外，还提供至少一种药物组合物，以及经局部和/或全身给予所述至少一种药物组合物。在一些实施方案中，所述至少一种药物组合物包含维生素、钙补充剂或本领域技术人员已知的任何破骨细胞抑制剂，包括二膦酸盐。在一些实施方案中，所述至少一种药物组合物经口给予。在这样的实施方案中，可将所述至少一种药物组合物掺入到生物相容性基质中，或另外配置到椎体内及其周围。在其它实施方案中，将所述至少一种药物组合物全身给予患者。例如，在一个实施方案中，将所述至少一种药物组合物经口给予患者。在另一实施方案中，将所述至少一种药物组合物静脉内给予患者。
因此，本发明目标是提供用于促进椎体中的骨形成的含PDGF组合物。
本发明另一目标是提供用于加固椎体的含PDGF组合物。
本发明另一目标是提供用于加固骨质疏松症患者椎体的含PDGF组合物。
本发明另一目标是提供用于预防或降低椎骨压缩性骨折(包括二次椎骨压缩性骨折)可能性的含PDGF组合物。
本发明另一目标是提供用于用含PDGF组合物促进椎体中的骨形成的方法。
本发明再一目标是提供用含PDGF组合物预防或降低椎骨压缩性骨折(包括二次椎骨压缩性骨折)可能性的方法。
本发明这些和其它实施方案更详细地阐述于以下的发明详述中。在纵览以下发明详述所公开的实施方案和权利要求后，本发明的这些目标、特征和优点将显而易见。
附图简述 图1阐明注射器及相关器械，其根据本发明实施方案刺入覆盖椎体的组织以将本发明组合物递送到椎体。
图2为阐明根据本发明实施方案将组合物注入椎体的X光照片。
图3阐明根据本发明一个实施方案接受本发明组合物的椎骨。
图4阐明根据本发明一个实施方案，接受包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的1.0mg/ml的rhPDGF-BB的组合物的椎体，与接受包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的20mM乙酸钠缓冲液的组合物的椎体比较，其体积骨无机质密度百分比的变化。
图5阐明根据本发明一个实施方案，接受包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的1.0mg/ml的rhPDGF-BB的组合物的椎体，与接受包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的20mM乙酸钠缓冲液的组合物的椎体比较，其体积骨无机质密度百分比的变化。
发明详述 本发明提供用于治疗包括椎体在内的脊柱结构的组合物和方法。根据本文所述实施方案，本发明提供用于促进椎体中的骨形成的组合物和用于预防或降低椎骨压缩性骨折(包括二次椎骨压缩性骨折)可能性的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包含含PDGF溶液和生物相容性基质，其中将所述溶液配置在所述生物相容性基质中。在另一实施方案中，所述组合物包含配置在生物相容性基质中的含PDGF溶液，其中所述生物相容性基质包含骨支架材料和生物相容性粘合剂。在一个方面，生物相容性基质包括磷酸钙颗粒(含或不含生物相容性粘合剂)或骨同种异体移植物例如DFDBA或颗粒DBM。在另一方面，生物相容性基质可包括DFDBA或DBM。
现在转向可包括在本发明各种实施方案中的组分，本发明组合物包含含PDGF溶液。
PDGF溶液 PDGF在调节细胞生长和迁移中起重要作用。PDGF如其它生长因子一样与受体酪氨酸激酶的胞外结构域结合。PDGF与这些跨膜蛋白的结合激活其位于膜的细胞质侧的催化结构域的激酶活性。所述激酶通过使靶标蛋白的酪氨酸残基磷酸化，诱导多种细胞过程，包括细胞生长和胞外基质形成。
在一个方面，本发明提供的组合物包含含PDGF溶液和生物相容性基质，其中将所述溶液配置在或掺入到所述生物相容性基质中。在一些实施方案中，PDGF以介于约0.01mg/ml-约10mg/ml、约0.05mg/ml-约5mg/ml或约0.1mg/ml-约1.0mg/ml的浓度存在于溶液中。PDGF可以以所述这些范围内的任何浓度存在于溶液中，包括每一范围的上限和下限。在其它实施方案中，PDGF以以下任何一个浓度存在于溶液中约0.05mg/ml；约0.1mg/ml；约0.15mg/ml；约0.2mg/ml；约0.25mg/ml；约0.3mg/ml；约0.35mg/ml；约0.4mg/ml；约0.45mg/ml；约0.5mg/ml；约0.55mg/ml；约0.6mg/ml；约0.65mg/ml；约0.7mg/ml；约0.75mg/ml；约0.8mg/ml；约0.85mg/ml；约0.9mg/ml；约0.95mg/ml；或约1.0mg/ml。在一些实施方案中，PDGF以介于以下的浓度范围存在于溶液中约0.2mg/ml-约2mg/ml；约0.3mg/ml-约3mg/ml；约0.4mg/ml-约4mg/ml或约0.5mg/ml-约5mg/ml。应该理解，这些浓度仅为具体实施方案的实例，PDGF浓度可在上述任何浓度范围内，包括每一范围的上限和下限。
各种PDGF量可用于本发明组合物中。可使用的PDGF量包括以下范围的量约1ug-约50mg、约10ug-约25mg、约100ug-约10mg和约250ug-约5mg。
可通过用如美国专利第6,221,625号、第5,747,273号和第5,290,708号所述的酶联免疫测定法或本领域已知的用于测定PDGF浓度的任何其它测定法，来测定本发明实施方案的PDGF或其它生长因子的浓度。当在本文中提供时，PDGF的摩尔浓度基于PDGF二聚体的分子量(MW)(例如PDGF-BB；MW为约25kDa)来测定。
在本发明某些实施方案中，PDGF包括PDGF同二聚体和杂二聚体，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DD及其混合物和衍生物。例如，在一个实施方案中，PDGF包括PDGF-BB。在另一实施方案中，PDGF包括重组人PDGF，例如rhPDGF-BB。在一些实施方案中，PDGF包括各种同二聚体和/或杂二聚体的混合物。本发明实施方案涵盖PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和/或PDGF-DD的任何组合。
在一些实施方案中，可从天然来源获得PDGF。在其它实施方案中，可通过重组DNA技术制备PDGF。在其它实施方案中，可用本领域一般技术人员已知的肽合成技术(例如固相肽合成)来制备PDGF或其片段。当PDGF从天然来源获得时，其可来源于生物液。根据某些实施方案，生物液可包括与活生物体有关的任何经处理或未处理的液体，包括血液。
在另一实施方案中，生物液还可包括血液组分，所述血液组分包括血小板浓缩液(PC)、机采血小板(apheresed platelet)、富血小板血浆(PRP)、血浆、血清、新鲜冷冻血浆(FFP)和暗黄覆盖层(BC)。在另一实施方案中，生物液可包括自血浆分离并重新悬浮于生理流液中的血小板。
在一些实施方案中，当由重组DNA技术制备PDGF时，可将编码单个单体(例如PDGF B-链或A-链)的DNA序列插入用于表达的培养的原核细胞或真核细胞中，以随后产生同二聚体(例如PDGF-BB或PDGF-AA)。在其它实施方案中，可通过以下方法来制备PDGF杂二聚体将编码杂二聚体的两个单体单元的DNA序列都插入到培养的原核细胞或真核细胞中，并使细胞加工已翻译的单体单元以产生杂二聚体(例如PDGF-AB)。市售GMP重组PDGF-BB可从NovartisCorporation(Emeryville，CA)购得。研究级的rhPDGF-BB可自多个来源获得，包括R&D Systems，Inc.(Minneapolis，MN)、BD Biosciences(San Jose，CA)和Chemicon，International(Temecula，CA)。在一些实施方案中，可以以变性形式在原核细胞中制备单体单元，其中随后让变性形式重新折叠成活性分子。
在本发明实施方案中，PDGF包括PDGF片段。在一个实施方案中，rhPDGF-B包括以下片段完整B链的1-31、1-32、33-108、33-109和/或1-108位的氨基酸序列。美国专利第5,516,896号的图15中提供了PDGF B链的全部氨基酸序列(1-109)。应该理解，本发明rhPDGF组合物可包含完整rhPDGF-B(1-109)及其片段的组合。可采用PDGF的其它片段，例如美国专利第5,516,896号中所述的片段。根据一个实施方案，rhPDGF-BB包含完整rhPDGF-B(1-109)的至少60％。在另一实施方案中，rhPDGF-BB包含完整rhPDGF-B(1-109)的至少65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在本发明某些实施方案中，可纯化PDGF。本文所用纯化的PDGF包括在加入到本发明溶液中之前具有大于约95％重量的PDGF的组合物。所述溶液可为任何药用溶液。在其它实施方案中，可基本上纯化PDGF。本文所用基本上纯化的PDGF包括在加入到本发明溶液中之前具有约5％-约95％重量的PDGF的组合物。在一个实施方案中，基本上纯化的PDGF包括在加入到本发明溶液中之前具有约65％-约95％重量的PDGF的组合物。在其它实施方案中，基本上纯化的PDGF包括在加入到本发明溶液中之前具有以下含量的PDGF的组合物约70％-约95％、约75％-约95％、约80％-约95％、约85％-约95％或约90％-约95％重量。可将纯化的PDGF和基本上纯化的PDGF掺入到支架和粘合剂中。
在另一实施方案中，可部分纯化PDGF。本文所用部分纯化的PDGF包括在以下情况下的具有PDGF的组合物富血小板血浆(PRP)、新鲜冷冻血浆(FFP)或需要采集并分离以制备PDGF的任何其它血液制品。本发明实施方案涵盖本文提供的任何PDGF同种型，包括同二聚体和杂二聚体，它们可被纯化或部分地纯化。含有PDGF混合物的本发明组合物可含有呈部分纯化比例的PDGF同种型或PDGF片段。在一些实施方案中，可如美国临时专利顺序号11/159,533(公布号20060084602)所述制备部分纯化和纯化的PDGF。
在一些实施方案中，通过让PDGF溶于一种或多种缓冲液中来形成含PDGF溶液。适用于本发明PDGF溶液的缓冲液可包括但不限于碳酸盐、磷酸盐(例如磷酸盐缓冲盐水)、组氨酸、乙酸盐(例如乙酸钠)、酸性缓冲液(例如乙酸和HCl)和有机缓冲液(例如赖氨酸、Tris缓冲液(例如三(羟甲基)氨基乙烷)、N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(FIEPES)和3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS))。可基于与PDGF的生物相容性和缓冲液阻止不合乎需要的蛋白修饰的缓冲能力来选择缓冲液。可基于与宿主组织的相容性另外选择缓冲液。在一个实施方案中，可使用乙酸钠缓冲液。可采用不同的摩尔浓度的缓冲液，例如约0.1mM-约100mM、约1mM-约50mM、约5mM-约40mM、约10mM-约30mM或约15mM-约25mM或这些范围内的任何摩尔浓度。在一些实施方案中，采用约20mM摩尔浓度的乙酸盐缓冲液。
在另一实施方案中，通过将冷冻的PDGF溶解在水中来形成含PDGF溶液，其中在溶解之前让PDGF从适当的缓冲液中冻干。
按照本发明实施方案，含PDGF溶液可具有介于约3.0-约8.0之间的pH。在一个实施方案中，含PDGF溶液具有以下范围的pH约5.0-约8.0、约5.5-约7.0或约5.5-约6.5之间或这些范围内的任何值。在一些实施方案中，含PDGF溶液的pH可与PDGF或任何其它所期需的生物学活性剂的长期稳定性及功效相容。PDGF在酸性环境中更稳定。因此，本发明一个实施方案包括PDGF溶液的酸性储存制剂。根据该实施方案，PDGF溶液优选具有约3.0-约7.0或约4.0-约6.5的pH。然而，在具有中性pH范围的溶液中PDGF的生物学活性最佳。因此，在又一实施方案中，本发明包括PDGF溶液的中性pH制剂。根据该实施方案，PDGF溶液优选具有约5.0-约8.0、约5.5-约7.0或约5.5-约6.5的pH。根据本发明方法，将酸性PDGF溶液重新调配为中性pH组合物，其中随后将所述组合物用于治疗骨骼并促进骨生长和/或愈合。根据本发明某些实施方案，在所述溶液中使用的PDGF为rh-PDGF-BB。在本发明又一实施方案中，可改变含PDGF溶液的pH以使PDGF与基质底物或连接物的结合动力学最优化。若需要，使所述物质的pH与相邻物质平衡，否则已结合的PDGF可能易发生变化。
在一些实施方案中，含PDGF溶液的pH可由本文所述缓冲液来控制。不同的蛋白质具有不同的保持稳定的pH范围。蛋白质的稳定性主要由等电点和蛋白质上的电荷来反映。pH范围可影响蛋白质的构象结构和蛋白质对蛋白酶解、水解、氧化及导致蛋白质的结构和/或生物学活性改变的其它过程的敏感性。
在一些实施方案中，含PDGF溶液可进一步包含另外组分，例如其它生物活性剂。在其它实施方案中，含PDGF溶液可进一步包含细胞培养基、诸如白蛋白等其它助稳定蛋白、抗菌剂、蛋白酶抑制剂[例如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、抑蛋白酶肽、ε-氨基己酸(EACA)等]和/或其它生长因子，例如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、骨形成蛋白(BMP)或其它PDGF，包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和/或PDGF-DD的组合物。
除含PDGF溶液外，本发明组合物还包含在其中配置PDGF溶液的生物相容性基质，并也可在加入或不加入生物相容性基质下包含生物相容性粘合剂。
生物相容性基质 骨支架材料 按照本发明实施方案，生物相容性基质包含骨支架材料。应该理解的是，术语骨支架材料和骨代替剂在本申请中可互换使用。骨支架材料为新骨及组织的生长提供框架或支架。在一些实施方案中，骨支架材料具有多方向且互联的各种直径的孔。在一些实施方案中，骨支架材料除互相连接的孔外还包含多个凹孔以及非互联的孔。在一些实施方案中，骨支架材料可永久性或暂时性取代骨。骨支架材料经植入后可保留在身体中，或其可被身体吸收并被骨取代。
在一些实施方案中，骨支架材料包括至少一种磷酸钙。在其它实施方案中，骨支架材料可包括多种磷酸钙。在本发明实施方案中，适于用作骨支架材料的磷酸钙具有介于0.5-2.0之间的钙磷原子比。在一些实施方案中，骨支架材料包含同种异体移植物，例如DFDBA、FDBA或微粒DBM。在一些实施方案中，骨支架材料包括矿化骨同种异体移植物、矿化骨、矿化去蛋白异种移植物或脱矿骨。
适于用作骨支架材料的磷酸钙的非限制性实例包括无定形磷酸钙、一水磷酸一钙(MCPM)、无水磷酸一钙(MCPA)、二水磷酸二钙(DCPD)、无水磷酸二钙(DCPA)、磷酸八钙(OCP)、α-磷酸三钙、β-TCP、羟基磷灰石(OHAp)、结晶性低的羟基磷灰石、磷酸四钙(TTCP)、十磷酸七钙、偏磷酸钙、二水焦磷酸钙、焦磷酸钙、碳磷酸钙、羟基磷灰石或它们的衍生物或混合物。
在一些实施方案中，骨支架材料包含聚合材料。在一些实施方案中，聚合支架包括胶原蛋白、聚乳酸、聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)、聚乙醇酸、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)、聚(L-丙交酯-共-D，L-丙交酯)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、壳聚糖或它们的组合或衍生物。
在一些实施方案中，骨支架材料包含多孔结构。多孔性是所期需的特性，因为其促进细胞迁移并渗透到支架材料中，以便该渗入的细胞可分泌胞外骨基质。多孔性还为血管化作用提供通道。多孔性还提供用于增强再吸收和活性物质释放以及增加细胞与基质间相互作用的高表面积。在一些实施方案中，骨支架材料可在使用前形成一定大小和形状。在一些实施方案中，骨支架材料可以以适于植入的形状来提供。
根据某些实施方案，多孔性骨支架材料可包含具有介于约1μm-约1mm的直径的孔。在一个实施方案中，骨支架材料包含具有介于约1μm-约1mm或更大直径的大孔。在又一实施方案中，骨支架材料包含具有介于约10μm-约100μm的直径的中孔。在再一实施方案中，骨支架材料包含具有小于约10μm的直径的微孔。本发明实施方案涵盖包含大孔、中孔和微孔或其任何组合的骨支架材料。
在一个实施方案中，多孔性骨支架材料具有高于约25％或高于约40％的孔隙率(porosity)。在另一实施方案中，多孔性骨支架材料具有高于约50％、高于约60％、高于约65％、高于约70％、高于约80％或高于约85％的孔隙率。在又一实施方案中，多孔性骨支架材料具有高于约90％的孔隙率。在一些实施方案中，多孔性骨支架材料包含促进细胞迁移入支架材料的孔隙率。
在一些实施方案中，骨支架材料包含多种颗粒。例如，骨支架材料可包含多种磷酸钙颗粒。在一些实施方案中，骨支架材料颗粒可单独地显示本文提供用于骨支架材料的任何孔径和孔隙率。在其它实施方案中，骨支架材料颗粒可形成关联(association)以产生具有本文提供用于骨支架材料的任何孔径或孔隙率的基质。
骨支架颗粒可为mm、μm或亚微米(nm)尺寸。在一个实施方案中，骨支架颗粒具有介于约1μm-约5mm的平均直径。在其它实施方案中，颗粒具有介于约1mm-约2mm、约1mm-约3mm或约250μm-约750μm的平均直径。在另一实施方案中，骨支架颗粒具有介于约100μm-约300μm的平均直径。在又一实施方案中，骨支架颗粒具有介于约75μm-约300μm的平均直径。在另外的实施方案中，骨支架颗粒具有小于约25μm、小于约1μm或小于约1mm的平均直径。在一些实施方案中，支架颗粒具有介于约100μm-约5mm或约100μm-约3mm的平均直径。在其它实施方案中，骨支架颗粒具有介于约250μm-约2mm、约250μm-约1mm或约200μm-约3mm的平均直径。颗粒还可为约1nm-约1μm、小于约500nm或小于约250nm的范围。
根据某些实施方案，可以以适于植入的形状(例如球体、圆柱体或块状)来提供骨支架材料。在其它实施方案中，骨支架材料为可模压、可挤出和/或可注射。可模压、可挤出和可注射的骨支架材料可促进将本发明组合物有效安置于椎体内及其周围。在一些实施方案中，骨支架材料易流动。在一些实施方案中，可通过注射器和针或套管将易流动的骨支架材料施用给椎体。在一些实施方案中，骨支架材料在体内变硬。
在一些实施方案中，骨支架材料可生物再吸收。在一个实施方案中，骨支架材料可在体内植入后一年内被再吸收至少30％、40％、50％、60％、70％、75％或90％。在另一实施方案中，骨支架材料可在体内植入1、3、6、9、12或18个月内被再吸收至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％或90％。在一些实施方案中，骨支架材料在体内植入1、3、6、9、12或18个月内被再吸收超过90％。可生物再吸收性视以下因素而定(1)基质材料的特性(即其化学组成、物理结构和尺寸)；(2)基质所安置的身体内的位置；(3)所使用的基质材料的量；(4)患者的代谢状态(糖尿病/非糖尿病、骨质疏松、吸烟、老龄、使用类固醇等等)；(5)所治疗的损伤程度和/或类型；和(6)除基质外的其它物质的使用，例如其它骨合成代谢因子、分解代谢因子和抗分解代谢因子。
包含β-磷酸三钙(β-TCP)的骨支架 用作生物相容性基质的骨支架材料可包含β-TCP。根据某些实施方案，β-TCP可包含具有多方向且互联的不同直径的孔的多孔结构。在一些实施方案中，β-TCP除互联的孔外还包含多个不同直径的凹孔和非互联的孔。在一个实施方案中，β-TCP的多孔结构包含具有介于约100μm-约1mm或更大直径的大孔、具有介于约10μm-约100μm直径的中孔和具有小于约10μm直径的微孔。β-TCP的大孔和微孔可促进骨诱导(osteoinduction)和骨传导(osteoconduction)，而大孔、中孔和微孔使得流液可连通和营养可运输，以在β-TCP生物相容性基质各处支持骨再生长。
在一些实施方案中，在包含多孔结构下，β-TCP可具有高于25％或高于约40％的孔隙率。在其它实施方案中，β-TCP可具有高于50％、高于约60％、高于约65％、高于约70％、高于约75％、高于约80％或高于约85％的孔隙率。在又一实施方案中，β-TCP可具有高于90％的孔隙率。在一些实施方案中，β-TCP可具有促进细胞迁移入β-TCP的孔隙率。
在一些实施方案中，β-TCP骨支架材料包含β-TCP颗粒。在一些实施方案中，β-TCP颗粒可单独地显示本文提供用于支架材料的任何孔径、孔结构和多孔性。
在一个实施方案中，β-TCP颗粒具有介于约1μm-约5mm的平均直径。在其它实施方案中，β-TCP颗粒具有介于以下的平均直径约1mm-约2mm、约1mm-约3mm、约100μm-约5mm、约100μm-约3mm、约250μm-约2mm、约250μm-约750μm、约250μm-约1mm、约250μm-约2mm或约200μm-约3mm。在另一实施方案中，β-TCP颗粒具有介于约100μm-约300μm的平均直径。在一些实施方案中，β-TCP颗粒具有介于约75μm-约300μm的平均直径。在一些实施方案中，β-TCP颗粒具有小于约25μm、小于约1μm或小于约1mm的平均直径。在一些实施方案中，β-TCP颗粒具有介于约1nm-约1μm的平均直径。在又一实施方案中，β-TCP颗粒具有小于约500nm或小于约250nm的平均直径。
在一些实施方案中，可以以适于植入的形状(例如球体、圆柱体或块状)来提供骨包含β-TCP骨支架材料的生物相容性基质。在其它实施方案中，β-TCP骨支架材料可为可模压、可挤出和/或可流动，由此有助于将基质施用给椎体。可通过注射器、管(tube)、套管或刮铲(spatula)施用易流动的基质。
根据某些实施方案中，β-TCP骨支架材料可生物再吸收。在一个实施方案中，β-TCP骨支架材料可在体内植入后一年内被再吸收至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％或85％。在另一实施方案中，β-TCP骨支架材料可在体内植入后一年内被再吸收超过90％。
骨支架材料和生物相容性粘合剂 在另一实施方案中，生物相容性基质包括骨支架材料和生物相容性粘合剂。在生物相容性基质实施方案中的骨支架材料进一步包含符合上文提供的生物相容性粘合剂。
根据某些实施方案，生物相容性粘合剂可包括可操作以有助于组合的物质之间粘附的材料。例如，生物相容性粘合剂在形成生物相容性基质过程中可促进骨支架材料颗粒之间的粘合。在一些实施方案中，相同材料可用作支架材料。例如，在一些实施方案中，本文所述聚合材料(例如胶原蛋白和壳聚糖)可同时用作支架材料和粘合剂两者。
在一些实施方案中，生物相容性粘合剂可包含胶原蛋白、多糖、核酸、碳水化合物、蛋白质、多肽、聚(α-羟基酸)、聚(内酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚氨酯、聚(原酸酯)、聚(酸酐-共-亚胺)、聚(原碳酸酯)、聚(α-羟基烷酸酯)、聚(二氧杂环己酮)、聚(磷酸酯)、聚乳酸、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚(L-丙交酯-共-D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-碳酸1，3-亚丙酯)、聚乙醇酸、聚羟基丁酸酯(PHB)、聚(ε-己内酯)、聚(δ-戊内酯)、聚(γ-丁内酯)、聚(己内酯)、聚丙烯酸、聚羧酸、聚(烯丙胺盐酸盐)、聚(二烯丙基二甲基铵氯化物)、聚(乙烯亚胺)、聚富马酸丙二酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、碳素纤维、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙基噁唑啉)、聚(环氧乙烷)-共-聚(环氧丙烷)嵌段共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)聚酰胺和它们的共聚物及混合物。
在其它实施方案中，生物相容性粘合剂可包括藻酸、阿拉伯树胶、瓜尔胶、黄原胶、明胶、甲壳素、壳聚糖、壳聚糖乙酸盐(chitosanacetate)、壳聚糖乳酸盐(chitosan lactate)、硫酸软骨素、N，O-羧甲基壳聚糖、葡聚糖(例如α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或硫酸葡聚糖钠)、纤维蛋白胶、卵磷脂、卵磷酰胆碱衍生物、甘油、透明质酸、透明质酸钠、纤维素(例如甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羟基乙基纤维素)、葡糖胺、蛋白聚糖、淀粉(例如羟乙基淀粉或可溶性淀粉)、乳酸、pluronic酸、甘油磷酸钠、肝糖、角蛋白、丝蛋白(silk)和它们的衍生物及混合物。
在一些实施方案中，生物相容性粘合剂为水溶性的。水溶性粘合剂可在其被植入后不久从生物相容性基质中溶解，从而在生物相容性基质中引入大孔性(macroporosity)。本文所述大孔性可通过增加通道来增加植入材料的骨传导性，从而改变了植入位点的破骨细胞和成骨细胞的活性。
在一些实施方案中，生物相容性粘合剂可以以介于基质的约5％重量-约50％重量的量存在于生物相容性基质中。在其它实施方案中，生物相容性粘合剂可以以介于生物相容性基质的约10％重量-约40％重量的量存在。在另一实施方案中，生物相容性粘合剂可以以介于生物相容性基质的约15％重量-约35％重量的量存在。在在又一实施方案中，生物相容性粘合剂可以以生物相容性基质的约20％重量的量存在。在另一实施方案中，生物相容性粘合剂可以以大于基质的约50％重量或60％重量的量存在于生物相容性基质中。在一个实施方案中，生物相容性粘合剂可以以至多占基质的约99％重量的量存在于生物相容性基质中。
根据某些实施方案，包含骨支架材料和生物相容性粘合剂的生物相容性基质可为可流动、可模压和/或可挤出。在所述实施方案中，生物相容性基质可以呈糊状或泥状形式。在一个实施方案中，呈糊状或泥状形式的生物相容性基质可包含由生物相容性粘合剂使之相互粘合的骨支架材料颗粒。
可将呈糊状或泥状形式的生物相容性基质压模成所需的植入形状，或可将其压模成植入位点的轮廓。在一个实施方案中，可用注射器或套管将呈糊状或泥状形式的生物相容性基质注射到植入位点中。
在一些实施方案中，呈糊状或泥状形式的生物相容性基质不变硬，在植入后仍易流动并可模压。在其它实施方案中，糊或泥植入后可变硬，从而降低基质的流动性和可模压性。
在一些实施方案中，还可以以预定形状提供包含骨支架材料和生物相容性粘合剂的生物相容性基质，所述预定形状包括块状、球体或圆柱体或任何所期需的形状，例如由模或施用位点来限定的形状。
在一些实施方案中，包含骨支架材料和生物相容性粘合剂的生物相容性基质是可生物再吸收的。在所述实施方案中，在体内植入一年内，生物相容性基质被可再吸收。在另一实施方案中，在体内植入1、3、6或9个月内，包含骨支架材料和生物相容性粘合剂的生物相容性基质可被再吸收。在一些实施方案中，在体内植入1、3或6年内，包含骨支架材料和生物相容性粘合剂的生物相容性基质可被再吸收。可生物再吸收性视以下因素而定(1)基质材料的特性(即其化学组成、物理结构和尺寸)；(2)基质所安置的身体内的位置；(3)所使用的基质材料的量；(4)患者的代谢状态(糖尿病/非糖尿病、骨质疏松、吸烟、老龄、使用类固醇等等)；(5)所治疗的损伤程度和/或类型；和(6)除基质外的其它物质的使用，例如其它骨合成代谢因子、分解代谢因子和抗分解代谢因子。
包含β-TCP和胶原蛋白的生物相容性基质 在一些实施方案中，生物相容性基质可包含β-TCP骨支架材料和生物相容性胶原蛋白粘合剂。适用于与胶原蛋白粘合剂组合的β-TCP骨支架材料符合上文所提供的那些。
在一些实施方案中，胶原蛋白粘合剂可包括任何类型的胶原蛋白，包括I型、II型和III型胶原蛋白。在一个实施方案中，胶原蛋白粘合剂包括胶原蛋白混合物，例如I型、II型和III型胶原蛋白的混合物。在其它实施方案中，胶原蛋白粘合剂在生理条件下可溶。可采用存在于骨组织或肌骨骼组织中的其它类型的胶原蛋白。本发明可使用重组的、合成的和天然存在的胶原蛋白形式。
根据某些实施方案，生物相容性基质可包含用胶原蛋白粘合剂使之相互粘合的多个β-TCP颗粒。在一些实施方案中，与胶原蛋白粘合剂组合的β-TCP颗粒具有介于约1μm-约5mm的平均直径。在其它实施方案中，β-TCP颗粒具有介于以下的平均直径约1mm-约2mm、约1mm-约3mm、约100μm-约5mm、约100μm-约3mm、约250μm-约2mm、约250μm-约750μm、约250μm-约1mm、约250μm-约2mm或约200μm-约3mm。在另一实施方案中，β-TCP颗粒具有介于约100μm-约300μm的平均直径。在一些实施方案中，β-TCP颗粒具有介于约75μm-约300μm的平均直径。在一些实施方案中，β-TCP颗粒具有小于约25μm、小于约1μm或小于约1mm的平均直径。在一些实施方案中，β-TCP颗粒具有介于约1nm-约1μm的平均直径。在又一实施方案中，β-TCP颗粒具有小于约500nm或小于约250nm的平均直径。
在一些实施方案中，β-TCP颗粒可由胶原蛋白粘合剂使之彼此粘合，以便产生具有多孔结构的生物相容性基质。在一些实施方案中，包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质的多孔结构显示多方向并互联的不同直径的孔。在一些实施方案中，生物相容性基质除互联的孔外还包含多个不同直径的凹孔和非互联的孔。
在一些实施方案中，包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质可包含具有介于约1μm-约1mm直径的孔。包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质可包含具有介于约100μm-约1mm或更大直径的大孔、具有介于约10μm-100μm直径的中孔和具有小于约10μm直径的微孔。
包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质可具有高于约25％或高于约40％的孔隙率。在另一实施方案中，生物相容性基质可具有高于约50％、高于约65％、高于约70％、高于约75％、高于约80％或高于约85％的孔隙率。在又一实施方案中，生物相容性基质可具有高于约90％的孔隙率。在一些实施方案中，生物相容性基质可具有促进细胞迁移入基质中的孔隙率。
在一些实施方案中，β-TCP颗粒可单独地显示本文提供的包含β-TCP和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质的任何孔径、孔结构和孔隙率。
在一些实施方案中，包含β-TCP颗粒的生物相容性基质可以以介于基质的约5％重量-约50％重量的量包含胶原蛋白粘合剂。在其它实施方案中，胶原蛋白粘合剂可以以介于生物相容性基质的约10％重量-约40％重量的量存在。在另一实施方案中，胶原蛋白粘合剂可以以介于生物相容性基质的约15％重量-约35％重量的量存在。在又一实施方案中，胶原蛋白粘合剂可以以占生物相容性基质的约20％重量的量存在。
根据某些实施方案，包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质可为可流动、可模压和/或可挤出。在所述实施方案中，生物相容性基质可以呈糊状或泥状形式。可将糊或泥压模成所需的植入形状，或可将其压模为植入位点的轮廓。在一个实施方案中，可用注射器或套管将呈糊状或泥状形式的包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质注射到植入位点中。
在一些实施方案中，呈糊状或泥状形式的包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质可在植入时保留易流动并可模压形式。在其它实施方案中，糊或泥可在植入后变硬，从而降低基质的流动性和可模压性。
在一些实施方案中，可以以预定形状(例如块状、球体或圆柱体)提供包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质。
包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质可被再吸收。在一个实施方案中，在体内植入后一年，包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质可被再吸收至少75％。在另一实施方案中，在体内植入一年后，包含β-TCP颗粒和胶原蛋白粘合剂的生物相容性基质可被再吸收超过90％。
根据本文所述实施方案，含PDGF溶液可被配置在生物相容性基质中以产生用于治疗脊柱结构的组合物。
在一些实施方案中，如本文所述用于促进椎体中的骨形成和预防或降低椎骨压缩性骨折可能性的包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物，进一步包含至少一种造影剂。按照某些实施方案，造影剂包含阳离子造影剂、阴离子造影剂、非离子造影剂或其混合物。在一些实施方案中，造影剂包含不透射线造影剂。在一些实施方案中，不透射线造影剂包括含碘化合物，其包括(S)-N，N′-双[2-羟基-1-(羟甲基)-乙基]-2，4，6-三碘-5-乳酰胺基间苯二甲酰胺(碘帕醇)及其衍生物。
PDGF溶液在生物相容性基质中的配置 本发明提供用于促进椎体中的骨形成和预防或降低椎体压缩性骨折(包括二次椎骨骨折)可能性的组合物的制备方法。在一个实施方案中，用于制备所述组合物的方法包括提供含PDGF溶液，提供生物相容性基质和将所述溶液配置在所述生物相容性基质中。适用于组合的PDGF溶液和生物相容性基质符合上文所述的那些PDGF溶液和生物相容性基质。
在一些实施方案中，可通过让生物相容性基质浸湿在PDGF溶液中来将PDGF溶液配置在生物相容性基质中。在另一个实施方案中，可通过用PDGF溶液注射入生物相容性基质中来将PDGF溶液配置在生物相容性基质中。在一些实施方案中，注射PDGF溶液可包括将PDGF溶液配置在注射器中并将PDGF溶液注射到生物相容性基质中以浸透生物相容性基质。
在一些实施方案中，PDGF被吸附到生物相容性基质的孔中。在一些实施方案中，PDGF被吸附到生物相容性基质的一个或多个表面上，包括生物相容性基质的孔内的表面。
根据某些实施方案，在接受PDGF溶液之前，生物相容性基质可呈预定形状，例如块状或圆柱形。在接受PDGF溶液后，生物相容性基质可为易流动、可挤出和/或可注射的糊状或泥状形式。在其它实施方案中，在接受含PDGF溶液之前，生物相容性基质可已经显示易流动的糊状或泥状形式。包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物的易流动、可挤出和/或可注射的糊状或泥状形式，在本发明应用的方法中使用是有利的，因为可用注射器和/或套管将其施用到椎体。
在一些实施方案中，制备用于促进椎体中的骨形成和预防或降低椎体压缩性骨折可能性的组合物的方法进一步包括提供至少一种造影剂，并将所述至少一种造影剂配置在生物相容性基质中。在一些实施方案中，将至少一种造影剂配置在生物相容性基质中包括让所述至少一种造影剂与PDGF溶液结合并且用PDGF/造影剂溶液注射入所述生物相容性基质。
在另一实施方案中，将至少一种造影剂配置在生物相容性基质中包括让所述至少一种造影剂与PDGF溶液结合，并将生物相容性基质浸湿在PDGF/造影剂溶液中。或者，在一些实施方案中，造影剂独立于PDGF溶液被配置在生物相容性基质中。
根据本发明某些实施方案，造影剂有助于将本发明组合物安置或施用在椎体中及其周围。按照某些实施方案，造影剂包括阳离子造影剂、阴离子造影剂、非离子造影剂或其混合物。在一些实施方案中，造影剂包括不透射线造影剂。在一些实施方案中，不透射线造影剂包括含碘化合物，其包括(S)-N，N′-双[2-羟基-1-(羟甲基)-乙基]-2，4，6-三碘-5-乳酰胺基间苯二甲酰胺(碘帕醇)及其衍生物。
进一步包含生物活性剂的组合物 根据某些实施方案，本发明组合物除PDGF外还可进一步包含一种或多种生物活性剂。可被掺入到本发明组合物中的生物活性剂除PDGF外还可包括有机分子、无机材料、蛋白质、肽、核酸(例如基因、基因片段、小分子干扰核糖核酸[si-RNA]、基因调控序列、核转录因子和反义分子)、核蛋白、多糖(例如肝素)、糖蛋白和脂蛋白。可被掺入到本发明组合物中的生物活性化合物的非限制性实例包括例如抗癌药、抗生素、止痛剂、抗炎药、免疫抑制剂、酶抑制剂、抗组胺剂、激素、肌肉松弛药、前列腺素、营养因子、骨诱导蛋白、生长因子和疫苗，它们公开于美国临时专利申请顺序号11/159,533(公布号20060084602)中。在一些实施方案中，可被掺入到本发明组合物中的生物学活性化合物包括骨刺激因子(例如胰岛素样生长因子)、成纤维细胞生长因子或其它PDGF。根据其它实施方案，可被掺入到本发明组合物中的生物学活性化合物优选包括骨诱导因子和骨刺激因子(例如骨形成蛋白(BMP)、BMP模拟物、降钙素或降钙素模拟物)、抑制素、抑制素衍生物、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、生长分化因子、小分子或Wnt阻断剂的抗体拮抗剂(例如硬骨素(sclerostin)、DKK、可溶性Wnt受体)和/或甲状旁腺激素。在一些实施方案中，因子还包括蛋白酶抑制剂以及降低骨再吸收的骨质疏松治疗，包括二膦酸盐、特立帕肽(teriparadide)和NF-kB配体(RANK)配体激活剂受体的抗体。
递送另外的生物活性剂的标准方案和计划为本领域所知。可以以允许递送适当剂量的药剂到植入位点的量将另外的生物活性剂引入到本发明组合物中。在大部分情况下，用专业人员已知并适用于具体讨论的药剂的指导方针来确定剂量。包括在本发明组合物中的另外的生物活性剂的量可取决于以下变量病症的类型和程度、特定患者的总体健康状态、生物活性剂的剂型、释放动力学和生物相容性基质的可生物再吸收性。对于任何特定的另外的生物活性剂，可用标准临床试验来优化剂量和给药频率。
根据某些实施方案，本发明组合物可进一步包含与PDGF一起加入的另外的骨移植材料，包括自体骨髓、自体血小板提取物、同种异体移植物、合成的骨基质材料、异种移植物及它们的衍生物。
治疗椎体的方法 在一些实施方案中，本发明提供用于促进椎体中的骨形成的方法，该方法包括提供包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物，和将所述组合物施用给至少一个椎体。在一些实施方案中，可将所述组合物施用给多个椎体。在一些实施方案中，施用所述组合物包括用所述组合物注射入至少一个椎体。在一些实施方案中，将本发明组合物注射入椎体的松质骨中。在一些实施方案中，椎体包括胸椎体、腰椎体或其组合。在一些实施方案中，椎体包括颈椎体、尾骨椎体、骶骨或其组合。
在另一方面，本发明提供用于预防或降低由加固椎骨引起的椎骨压缩性骨折(包括二次椎骨压缩性骨折)的可能性的方法。按照本发明实施方案，预防或降低椎骨压缩性骨折可能性包括提供配置在生物相容性基质中的包含PDGF溶液的组合物，并将该组合物施用给至少一个椎体。在一些实施方案中，将所述组合物施用给至少一个椎体包括将所述组合物注射到至少一个椎体中。
在一些实施方案中，在对第一椎体实施椎体成形术或椎体后凸成形术后，将本发明组合物施用给第二椎体。在一些实施方案中，所述第二椎体与所述第一椎体相邻。在其它实施方案中，所述第二椎体不与所述第一椎体相邻。在又一实施方案中，在对第一椎体实施椎体成形术或椎体后凸成形术后，将本发明组合物施用给第三椎体。在一些实施方案中，所述第三椎体与所述第一椎体相邻。在其它实施方案中，所述第三椎体不与所述第一椎体相邻。本发明实施方案另外涵盖在对第一椎体实施椎体成形术或椎体后凸成形术后，将本文所提供的组合物施用给多个椎体，包括高危椎体。应该理解的是，本文所用第一、第二和第三椎体不是指脊柱的任何特定位置，因为用于抑制椎骨压缩性骨折(包括二次压缩性骨折)的方法可施用到所有类型的椎体，包括胸椎体、腰椎体、颈椎体、尾骨椎体和骶骨。
在一些实施方案中，用于促进椎体中的骨形成和预防或降低椎体压缩性骨折的可能性的方法进一步包括提供除了包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物外的另外的至少一种药物组合物，以及局部和/或全身给予所述至少一种药物组合物。在一些实施方案中，所述至少一种药物组合物包括维生素(例如维生素D3)、钙补充剂或本领域技术人员已知的任何破骨细胞抑制剂(包括二膦酸盐)。在一些实施方案中，局部给予所述至少一种药物组合物。在所述实施方案中，可将所述至少一种药物组合物掺入到生物相容性基质中，或另外配置在椎体内及其周围。在其它实施方案中，将所述至少一种药物组合物全身给予患者。例如，在一个实施方案中，将所述至少一种药物组合物经口给予患者。在另一实施方案中，将所述至少一种药物组合物静脉内给予患者。
以下实施例用于进一步阐明本发明，然而，其同时并不构成对本发明的任何限制。与此相反，应该清楚地理解，在阅读了本文说明之后，本领域技术人员可自己提出不偏离本发明精神的不同实施方案、修改及它们的等同内容。
实施例1 包含PDGF溶液和生物相容性基质的组合物的制备 按照以下方法制备包含PDGF溶液和生物相容性基质的组合物。
获得一批预称重的包含β-TCP和胶原蛋白的生物相容性基质。所述β-TCP包含具有介于约100μm-约300μm平均直径的β-TCP颗粒。用约20％重量百分比的可溶性牛I型胶原蛋白粘合剂调配所述β-TCP颗粒。所述β-TCP/胶原蛋白生物相容性基质可购自Kensey Nash(Exton，Pennsylvania)。
获得包含rhPDGF-BB的溶液。浓度为10mg/ml的乙酸钠缓冲液中的rhPDGF-BB储液(即批号QA2217)购自Novartis Corporation。所述rhPDGF-BB由Chiron Corporation在酵母表达系统中生产，与用于产品REGRANEX(Johnson & Johnson)和GEM 21S(BioMimeticTherapeutics)中的rhPDGF-BB来源于同一个生产厂，REGRANEX和GEM 21S都已经被美国食品药品管理局核准用于人。该rhPDGF-BB也被欧盟和加拿大核准用于人。将所述rhPDGF-BB溶液在乙酸盐缓冲液中稀释到0.3mg/ml。按照本发明实施方案，rhPDGF-BB溶液可被稀释到任何需要的浓度，包括1.0mg/ml。
使用约3ml的rhPDGF-BB溶液和约1g干重的β-TCP/胶原蛋白生物相容性基质比例来制备组合物。在制备组合物过程中，用注射器将rhPDGF-BB溶液注射生物相容性基质上，让得到的组合物混合为糊状，置于注射器中用于随后注射到椎体中。
实施例2 抑制二次椎骨压缩性骨折的方法 实验设计和概述 该预期的随机、对照、单中心临床试验是用来评估包含配置在磷酸三钙基质中PDGF溶液的组合物用于抑制在椎骨压缩性骨折椎体后凸成形术时的高危椎体(FFVB)中的二次压缩性骨折的功效。在用β-磷酸三钙+rhPDGF-BB组合物治疗的椎体和未治疗的椎体之间进行比较。本研究为初步临床试验(pilot clinical trial)，以支持β-TCP+rh-PDGF-BB通过提高HVB骨形成来防止或降低二次椎骨压缩性骨折可能性的证据或原理。
本研究在总共达10名在椎体后凸成形术时需要预防性治疗HVB的患者中进行。筛选潜在患者以确定他们是否满足入组标准和排除标准。如果达到了所有的入组标准，则邀请该潜在患者参与临床试验。在筛查记录表上记录所有被考虑编入本研究的患者，并记录排除的原因。
所有患者都接受过椎体后凸成形术，并且没有与在本研究中被治疗的两个椎体相邻的VCF症状。若外科医生在手术时确定骨折未满足骨折入组标准或存在不在该治疗方案中治疗的其它骨折，则受治疗对象将不会被编入本研究。
在本研究中共登记并治疗10名患者。用按本文实施例1制备的3.0mlβ-TCP+0.3mg/ml rhPDGF-BB组合物注射与各患者椎体后凸成形术椎体相邻的第一椎体。不治疗与椎体后凸成形术椎体相邻的第二椎体并作为对照。被治疗的椎体可位于椎体后凸成形术椎体的头部或尾部，其随机确定。
按标准方案治疗患者，并随访其椎体后凸成形术/椎体成形术情况。由外科医生在7-14天和在6、12、24和52周对各患者进行临床、X射线成像和定量计算体层摄影术(QCT)检查。记录所有非处方药和处方药的使用。由不知道患者治疗分组安排的独立的放疗师进行QCT分析以评定骨密度。记录并分析这些测量结果。
所有术后并发症和与器械有关的不良事件(device-related adverseevent)都记录在合适的病例报告表格中。若受治疗者在研究期间随后罹患VCF，或因严重不良事件而接受另外的手术，或去除研究器械(investigational device)，则监测该受治疗者的安全直到研究结束。对重新接受手术和/或去除骨折固定器械(fracture fixation hardware)的受治疗者要求同意为组织学目的检查外植体。在12个月的试验期间，监测所有患者，对任何要求退出研究或被研究者要求退出研究的受治疗者要求提供中止研究的理由。表1提供本研究的时间表概要。
表1-研究时间表调查 第一终点是在手术后12周由QCT扫描测量的骨密度。第二终点包括受治疗者疼痛和生活质量评估。
手术方案 在满足入组和排除标准的患者被编入研究后，对其进行以下手术方案。
以标准方式将患者送入手术室(OR)，使用标准方法用丙烯酸甲酯粘固剂实施椎体后凸成形术来增强骨折的椎体。对用椎体后凸成形术和用预防性骨增强治疗来治疗的椎体拍摄标准X光照片。
在椎体后凸成形术治疗后，研究人员界定并确定预防性骨增强治疗的两个节段。如果根据在手术时确定的两个(2)椎体被界定为不适合用于治疗，则该患者被认作筛查失败并且不编入该研究中。
一旦鉴定了两个HVB，研究人员就请求打开随机选择代码(randomization code)确定给予的研究治疗。随机选择代码指定相对于用椎体后凸成形术治疗的节段近端或远端的用β-TCP+rhPDGF组合物的治疗。其它HVB仍不治疗。
按照实施例1提供的方法混合β-TCP+rhPDGF组合物。混合后马上将糊状物装入注射器用于无菌技术注射。在β-TCP+rhPDGF组合物混合后，临床医生等待约10分钟后开始植入。每次混合使用新的无菌混合器械(刮铲)。研究人员指挥实施混合的助手记录植入的组合物的累积的量以及未植入的组合物的残留量。用定性相对测量值(1/3、2/3、全部)计算组合物的量并记录。
将自Cardinal Health of Dublin，Ohio获得的8-16规

针通过椎弓根外入路(extrapedicular approach)插入到需要预防性治疗的椎体。金属丝穿过

针，而

针穿过金属丝上的管心针(stylet)。将合适的混合制剂注射到受治疗者的椎体中。应该小心操作以使渗漏到椎体外的糊状物最少。
按照本发明实施方案，造影剂可有助于鉴定渗漏到椎体外的糊状物。图1阐明注射器和相关器械，它们刺入到覆盖在椎体外面的组织以递送本发明组合物到椎体。图2为阐明根据一个实施方案将本发明组合物注射到L3椎骨的椎体的X光照片。
移走器械。使用彻底冲洗和标准伤口缝合技术。
随访评价 在手术后7-14天和第6(±3天)、12(±7天)、24(±7天)和52(±14天)周观察患者进行术后评价。在随访期内实施常规评价和程序，如下表2中的研究流程图所示。
表2-研究流程图和随访评估
1.在任何研究特定程序之前必须进行 2.按照标准方案实施定量计算机体层摄影术(QCT)以获得BMD数据，由指定的肌骨骼放疗师进行测定。
功效评估 从本研究收集关于来源于X光照片、QCT和直接功能检查的研究结果的结果数据。这些测量结果的时间表在表3中提供。
表3-X光照片和功能评估频率
与未治疗的椎体相比，用β-TCP+rhPDGF组合物注射的椎体预期显示骨无机质密度(BMD)增加。椎体中骨无机质密度的增加可使得椎体对由椎体后凸成形术/椎体成形术手术后诱导的骨折(包括二次骨折)较不易感。
实施例3 抑制骨质疏松个体中的椎骨压缩性骨折的方法 抑制骨质疏松个体中的椎骨压缩性骨折的方法包括通过用包含配置在生物相容性基质(例如β-磷酸三钙)中的PDGF溶液的组合物治疗来促进椎体中的骨形成 按照实施例1提供的方法混合本发明组合物。在PDGF溶液中的PDGF浓度介于0.3mg/ml-1.0mg/ml之间。混合后立即将组合物装入到注射器中用于无菌技术注射。外科医生等待约10分钟后进行植入。每次混合使用新的无菌混合器械(刮铲)。
将

针通过椎弓根外入路插入到需要预防性治疗的椎体。在一些实施方案中，需要预防性治疗的椎体包括含椎体T5到T12和L1到L4在内的高危椎体。金属丝穿过

针，而

针穿过金属丝上的管心针。将混合好的组合物注射到受治疗者的椎体中。小心操作以使渗漏到椎体外的糊状物最少。按照本实施例来治疗多个椎体。接受该治疗的骨质疏松患者比未治疗的骨质疏松患者具有更低的椎骨压缩性骨折发生率。
实施例4 rh-PDGF-BB联合胶原蛋白/β-磷酸三钙基质在兔脊柱旁植入模型中的长期安全性评价 实验设计和概述 本研究评价在与兔脊骨相邻的脊柱旁肌内位点植入可注射rhPDGF-BB/胶原蛋白/β-TCP材料的安全性。观察动物的神经毒性病征情况，对植入位点连同相邻的椎体和脊髓进行组织学检查，以记录组织对所述材料所起的特异性反应。
研究方案和动物饲养经过当地IACUC批准，并且按照AAALAC指南进行。将重量≥2.5kg的十二只(12)首次用于试验的雌性白化变种新西兰兔分为4组0.3mg/ml PDGF；1.0mg/ml PDGF；橡胶；或乙酸盐缓冲液。PDGF治疗的兔接受0.2cc适当浓缩的基质中的rhPDGF-BB植入物，该植入物被注射到与L4-L5椎体相邻的1cm的右脊柱旁肌肉袋(pocket)中，同时在同一动物的靠近L2-L3的左脊柱旁肌肉内以类似的切口植入高密度聚乙烯(HDPE)。乙酸钠缓冲液组中的兔接受代替PDGF+基质植入物的乙酸钠缓冲液，而橡胶组的兔仅在右脊柱旁肌肉接受橡胶。在手术后29、90和180天处死每一组中的一只兔。
在研究期间于手术前和手术后每2周一次测量体重。在手术前、手术后立即和临处死前拍摄X光照片。在手术期间和研究结束时对手术位点进行数码照相。每周一次记录植入位点的临床观察结果，观察内容为红斑、水肿和发炎病征及神经毒性病征，例如行走变化。在尸体剖检时，一起收获各植入位点连同相邻的椎体和脊髓，用福尔马林固定，并制备用于脱钙石蜡包埋组织学分析。
材料 在本研究中试验的rhPDGF-BB剂量包括在20mM乙酸钠缓冲液(pH 6.0+/-0.5)中的0.3mg/ml和1.0mg/ml rhPDGF-BB。基质材料由20％冷冻的牛I型胶原蛋白和80％含100-300μm粒径的β-TCP(KenseyNash Corporation)组成。阴性对照材料由高密度聚乙烯(HDPE)组成，阳性对照材料由黑橡胶组成。在临手术前以3∶1的液体/团块比让rhPDGF-BB和对照溶液与基质材料混合。
简言之，让PDGF溶液浸透所述材料约2分钟，然后手工混合约3分钟以产糊状稠度。通过从质量相近的样品洗脱PDGF然后由ELISA(R&D Systems)定量测定PDGF，来证实用该混合技术使rhPDGF-BB在整个混合材料中均匀分布情况。
结果 在手动混合0.3mg/ml rhPDGF-BB与胶原蛋白/β-TCP基质后，证实在各样品之间rhPDGF-BB在整个混合材料中的均匀性的误差在+/-4％内。
所有动物都从手术中恢复，在记录过程中所有临床观察结果都报告为正常，在手术位点无神经毒性或异常伤口愈合病征。用乙酸钠缓冲液和基质对照治疗的两种动物在完全愈合的手术伤口处结了小痂。一只接受0.3mg/ml rhPDGF-BB的动物在手术后3-4天在手术位点处显示轻微红斑，随后恢复正常外貌。手术后29天在试验物植入位点处的组织学分析表明适量的组织生长到植入的试验材料中并有轻微的炎症反应。在与植入位点相邻的椎体处未观察到异位骨或异常骨的形成。这些发现概述在表4中，并与阴性对照HDPE植入位点的评级进行了比较。
表4-手术后29天植入位点处组织学检查结果概述 NC＝阴性对照；MGC＝多核巨噬细胞；生物反应性等级0＝无，1＝微量/轻微，2＝适度，3＝中等，4＝显著/严重 从本研究中得到的基于临床观察结果的初步证据提示，胶原蛋白/β-磷酸三钙与1.0mg/ml、0.3mg/ml rhPDGF-BB或乙酸钠缓冲液联合不引起任何急性或慢性神经毒性作用。手术后29天对植入位点的组织学评估表明，有正常且预期适量的组织生长到植入的材料中，并有轻微的炎症反应。在任何植入位点未观察到异位骨形成、外生骨疣或异常骨再吸收。基于对在本研究中治疗的动物的观察结果，胶原蛋白/β-磷酸三钙联合1.0mg/ml、0.3mg/ml rhPDGF-BB在接近脊柱处注射时是使用安全的。
实施例5 PDGF-BB联合牛I型胶原蛋白/β-TCP基质对椎骨治疗的安全性评价 本研究评价用于骨增强的包含与生物相容性基质(包含β-磷酸三钙和I型胶原蛋白)联合的rhPDGF-BB的组合物在注射到狒狒椎体后的安全性。
实验设计 研究了总共6只18-21岁的雌性狒狒(猎神狒狒(Papio anubis))，将每只狒狒分配到表5提供的2个治疗组中。研究期间用X光照相术、定量计算机体层摄影术(QCT)、磁共振成像(MRI)技术、末端组织学(terminal histology)和非GLP微计算体层摄影术(显微CT)给动物成像并分析。
在每只动物中研究了四个椎骨节段(T12、L2、L4和L6)。I组的每只动物接受注射约0.5cc的1.0mg/ml rhPDGF-BB+胶原蛋白/β-TCP(基质)组合物到T12、L2和L4椎体的每一个中。1.0mg/mlrhPDGF-BB+胶原蛋白/β-TCP(基质)组合物如上文实施例1中所示来制备。II组的每只动物接受注射约0.5cc的乙酸钠缓冲液+胶原蛋白/β-TCP(基质)组合物到T12、L2和L4椎体的每一个中。I组和II组动物各另外接受注射约0.5cc的乙酸钠缓冲液到L6椎体中。因此，每只动物共有四(4)个椎体接受了注射。图3概述本研究的注射策略。每只动物的治疗情况记录在研究表格中。
用经皮荧光镜透视检查指导的方法进行手术。除了注射可注射的1.0mg/ml rhPDGF-BB+胶原蛋白/β-TCP基质或适当的对照治疗外，该程序与椎体成形术相似地进行。将约0.5cc的rhPDGF-BB+胶原蛋白/β-TCP材料、对照材料或缓冲液如上所述注射到每个椎体。手术期间为每只动物提供麻醉。
表5-在狒狒椎体中注射rhPDGF-BB+胶原蛋白/β-TCP基质的治疗概述 A.分配给药组 通过经设计的手册计划将三只动物分配到治疗组以达到相近的组平均体重。
B.分配手术日期 将动物分配到两个手术日期之一(第I日期或第II日期)。对每一只动物通过掷硬币决定分配在第I日期组还是第II日期组。继续该分组直到各日期排满了3只动物。记录动物数量、其给药分组和手术日期。研究监控者和研究指导者知道动物治疗组。放疗师和组织病理学家不知道治疗组。
C.体内观察和测量 临床观察 在整个研究期间每天观察处于其笼内的动物。在确定预选标准后开始记录笼边观察结果，一直到研究结束。观察每只动物的总体外观和行为变化，包括行走变化。在整个研究期间观察每只动物的月经周期迹象。进行非GLP的周期评估(cycling reading)并记录在美国西南生物医药研究基金会(Southwest Foundation for Biomedical Research，SFBR)动物数据库中。
按照SFBR标准操作规程(SOP)处理动物，该操作规程符合美国农业部动物福利法(9CFR，第1、2和3部分)中概述的规章和实验动物饲养和使用指南(ILAR publication，1996，National Academy Press)中指定的条件。观察研究动物并对疾病或困扰病征(包括行走变化)每天记录至少一次，将任何这样的观察结果报告给可信赖的兽医和研究指导者。
体重 在开始的健康检查、手术前和进行随访X光照相术前测量体重。在其镇静之前停止喂食，随后测量体重。
食物消耗 除了在研究过程中禁食外，每天评定每只动物食物消耗的质量(作为笼边观察结果的一部分)，在手术前至少7天开始。每天一次(在非镇静日期中)为每只动物提供丰富的食物供给，按SFBR SOP来记录消耗量。在镇静日期中，当动物从麻醉中恢复时每天饲喂一次。
D.荧光镜透视检查、照相术、X光照相术、MRI和QCT成像 在手术前、手术后立即和手术后的1、3、6和9个月对注射位点拍摄非GLP数码照片。
在治疗前和手术后以及手术后的约1、3、6和9个月拍摄前后位及侧面X光照片。对于前后位X光照片，让动物背朝上，支撑其四肢。对于侧面X光照片，让动物左侧面卧下，支撑其四肢。记录对各位置和动物的能量(kV)和明暗度(mA)设置。
在将试验品和对照品注射到动物椎骨之前、期间和之后的手术期间拍摄非GLP荧光X线照片。荧光X线照片不能作为本研究的结果来评估，但能使外科医生在手术期间准确将引导针插入到椎体。
进行磁共振成像(MRI)以在手术前和手术后4-10天内给每只动物的脊骨成像。可另外在手术后约1、3、6和9个月时进行MRI给每只动物的脊骨成像。MRI段(session)由T1和T2加权扫描组成。
可进行定量计算机体层摄影术(QCT)以在手术前和手术后4-10天内给每只动物的脊骨成像。可另外在手术后约1、3、6和9个月时进行QCT给每只动物的脊骨成像。扫描由从第11节胸椎骨的尾部终板到骶骨的颅终板的躯干的一系列邻近的横截面薄片组成。
还在手术前1周(手术前)及手术后1、4和12周时，用QCT获得每只狒狒的被注射的椎体和中间的未治疗椎体的3mm厚横截面图像。对每一椎体完全成像需要总共5-8个薄片。改变由QCT产生的DICOM(医学数字成像和通信标准)格式图像，用由Scanco AG(Bassersdorf，Switzerland)开发的软件转换为三维体积分析的文件格式。通过在每一薄片中手动选择将皮质骨壳(cortical shell)排除在外的目标区域(ROI)，来测定每一椎体的前室(anterior compartment)的体积骨无机质密度(vBMD)。评估软件创建各个切片和ROI的z-stack，随后求体积ROI的根并计算来自图像中灰度的任意单位的体积密度，并且计算相对于基线扫描的百分比变化。使用用Tukey事后检验(Tukey′s post-hoc test)的单向重复测量ANOVA，来测定I组和II组动物从手术前或手术后1周到研究结束时的vBMD的任何统计学显著性变化的存在情况。
由合资格的临床放疗师和一名胜任的合作人评估X光照片、MRI和QCT图像，以提供关于由所述椎骨治疗产生的神经病理学、骨病理学和周围软组织病理学结果的一致性评估。该评价由对关于骨异常、神经组织异常和相邻周围软组织异常的每一图像的定性检查组成。放疗师遵循放疗学评估方案以评估放射学数据。
E.临床病理学评价 血清化学 在手术前和手术后将约3ml全血收集到无抗凝血剂的容器中。此外，在手术后约1、3、6和9个月将约3ml全血收集到无抗凝血剂的容器中。在采集用于血清化学的血液之前让动物过夜禁食。根据表6中所示的参数对血清进行分析。
表6-血清分析 血液学 在手术前和手术后将约3ml血液收集到含有EDTA的试管中。此外，在手术后约1、3、6和9个月将约3ml血液收集到含有EDTA的试管中。根据表7中所示的参数对全血样品进行分析。
表7-血液分析 *包括多区段嗜中性粒细胞(polysegmented neutrophil)、杆状核嗜中性细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。
由主持者或SFBR采集用于分析的血清 在手术前和手术后从所有动物各采集一次约14ml血液到无添加剂(即“凝血”)的试管中。此外，在手术后约1、3、6和9个月从所有动物采集约14ml血液到无添加剂(即“凝血”)的试管中。将血液离心得到血清并分为两等份。将血清储存在-70℃或更低温度。
解剖病理学 在研究结束时将所有动物人道处死。对濒死状态或患病状态下处死的每只动物进行粗略的尸体剖检，以确定濒死或患病状态的起因和/或特性。
尸体剖检 研究期间在研究病理学家的监督下对濒死状态或患病状态下处死的动物进行全面的尸体剖检，以确定濒死或患病状态的起因和/或特性。标准尸体剖检包括检查外表面和口、四肢、体腔和内部器官/组织。收集所有经治疗的椎骨，并检查异常情况。在单独的尸体剖检表格中记录所有肉眼可见异常的形态学简述。
组织采集和保存 获得处死动物的以下组织和器官，保存在10％的中性缓冲福尔马林中(除眼睛外，为了最佳固定将眼睛保存在Bouin液中)。然后为了保存目的将各组织或器官样品包埋在石蜡中，存档在主持者同意的地点，或用于帮助确定死亡原因。
对于所有狒狒，单独地收获所有经治疗的和相邻未治疗的椎骨(T12到L6)，包括脊髓和脊椎管，并根据所接受的治疗进行适当的鉴定。通过留下2cm最少量的与骨连接的肋骨来鉴别T12椎体。将所有骨样品置于福尔马林固定制剂中用于塑胶包埋。
为了保存目的将每个软组织或器官样品包埋在石蜡中并存档。表8中提供了对收集的组织样品的概述。
表8-在尸体剖检时收集的组织样品的概述 *在常规组织切片中偶尔没有甲状旁腺将无需重新切片。
用包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的rhPDGF-BB溶液的组合物注射的椎体，显示形成正常骨而不存在有害的神经毒作用。此外，相邻于接受包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的rhPDGF-BB溶液组合物的椎体的软组织并没有因给予rh-PDGF/基质组合物而显示异常。
此外，用包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的rhPDGF-BB溶液的组合物注射的椎体，还显示增加的体积骨无机质密度。图4阐明I组和II组动物椎体的体积骨无机质密度(vBMD)的百分比变化。图4中的每个数值点代表各组内所有被治疗的椎体的平均值。例如，图4中I组的第一数值点为在将rhPDGF-BB基质组合物注射到椎体后测量的9个椎体(I组中每三只动物的T12、L2和L4)的平均值。同样地，图4中2组的第一数值点为在将胶原蛋白/B-TCP基质注射到椎体后测量的9个椎体(II组中每三只动物的T12、L2和L4)的平均值。
如图4所示，用包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的rhPDGF-BB溶液的组合物治疗的椎体(I组)，显示在研究过程中稳定的vBMD增加，vBMD的增加在手术后第三个月的水平相对于手术后1周时间的水平为统计学上显著的[2.64％+/-1.16(第1周)对比5.93％+/-1.33(第12周)；p＝0.023]。vBMD继续增加直到研究的第6个月，随后在第9个月达到稳定水平。然而，用包含配置在β-TCP/胶原蛋白基质中的20mM乙酸钠缓冲液的组合物治疗的椎体(组II)，在研究期间并没有显示vBMD显著增加。
另外，图5阐明I组和II组动物椎体的vBMD百分比变化，其中从体积骨无机质密度分析中减除注射的β-TCP/胶原蛋白基质。图5如图4一样每个数值点代表各组内所有被治疗的椎体的平均值。
如图5所示，用rhPDGF-BB基质组合物(I组)治疗的椎体显示vBMD增加。从体积骨无机质密度分析减除β-TCP/胶原蛋白基质清楚地表明，与rhPDGF-BB基质组合物注射位点的局部区域相比，I组椎体的所有区域的vBMD均增加。
以上引用的所有专利、出版物和文摘都在此以其整体引作参考。应该理解，前述仅涉及本发明优选实施方案，其中在不偏离以上附加权利要求所限定的本发明精神和范围下可进行众多修改或改变。
权利要求
1.预防或抑制椎骨压缩性骨折的方法，所述方法包括
提供包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物；和将所述组合物施用给至少一个椎体。
2.权利要求1的方法，其中施用包括将所述组合物注射给所述至少一个椎体。
3.权利要求1的方法，其中所述至少一个椎体包括高危椎体。
4.用于促进或加快椎体中的骨形成的方法，所述方法包括
提供包含配置在生物相容性基质中的PDGF溶液的组合物；和
施用所述组合物到至少一个椎体。
5.权利要求4的方法，所述方法进一步包括
提供至少一种药物组合物；和
将所述药物组合物局部给予患者。
6.权利要求5的方法，其中局部给予所述药物组合物包括将所述药物组合物安置在所述至少一个椎体中或其周围。
7.权利要求4的方法，所述方法进一步包括
提供至少一种药物组合物；和
将所述药物组合物全身给予患者。
8.权利要求7的方法，其中全身给予所述药物组合物包括经口给予、静脉内给予或其组合。
9.权利要求5的方法，其中所述患者为患有骨质疏松症的个体。
10.权利要求5的方法，其中所述患者为已经接受椎体后凸成形术或椎体成形术的个体。
11.用于促进椎体中的骨形成的组合物，所述组合物包含
包含来源于血小板的生长因子(PDGF)的溶液；
生物相容性基质；和
至少一种造影剂，
其中将所述溶液和所述造影剂配置在生物相容性基质中。
12.权利要求11的组合物，其中所述至少一种造影剂包括阳离子造影剂、阴离子造影剂、非离子造影剂或其组合。
13.权利要求11的组合物，其中所述造影剂包括含碘化合物。
14.权利要求13的组合物，其中所述含碘化合物包括(S)-N，N′-双[2-羟基-1-(羟甲基)-乙基]-2，4，6-三碘-5-乳酰胺基间苯二甲酰胺或其衍生物。
15.权利要求11-14中任一项的组合物在制备用于促进至少一个椎体中的骨形成的药物中的用途。
16.包含含PDGF的溶液和生物相容性基质的组合物在制备用于促进至少一个椎体中的骨形成的药物中的用途，其中所述溶液被配置在生物相容性基质中。
全文摘要
本发明涉及用于治疗包括椎体在内的脊柱结构的组合物和方法。在一个实施方案中，用于促进椎体中的骨形成的方法包括提供包含PDGF溶液和生物相容性基质的组合物，并包括将所述组合物施用给至少一个椎体。按照某些实施方案，促进椎体中的骨形成可增加骨体积、质量和/或密度，导致用本发明组合物治疗的椎体的机械强度增加。
文档编号A61L24/00GK101820895SQ200880101796
公开日2010年9月1日 申请日期2008年6月3日 优先权日2007年6月4日
发明者C·E·哈特, S·E·林奇, C·S·杨, D·佩里恩 申请人:生物模拟治疗公司