专利名称：治疗血液恶性肿瘤和自身免疫疾病的hvem配体的制作方法
血系统的细胞和组织，包括血液、骨髓和淋巴结。血液恶性肿瘤包括白血病和淋巴瘤两者。术语白血病通常用于限定以白细胞异常增殖为特征的血液或骨髓的血液恶性肿 瘤。白血病的主要亚型根据涉及淋巴样(例如T或B淋巴细胞谱系)或骨髓样(例如粒细 胞、红细胞或巨核细胞谱系)细胞的恶性肿瘤，以及疾病是急性的还是慢性的起始来鉴定 [Freireich, E.J. et al. ,1991]。术语淋巴瘤包括淋巴组织赘生物的异质群。淋巴瘤大致地分类在Hodgkin淋巴 瘤，以及T细胞(T-NHL)和B细胞(B-NHL)非Hodgkin淋巴瘤下。世界卫生组织(WHO)分 级最近已经问世(在本申请随后讨论)，并且已经建立基于该分级的诊断指导方针[Jaffe， E. S. et al.，2004 (参见下文中的表3和4)]。慢性淋巴细胞性白血病(CLL)是以骨髓和血液中淋巴细胞缓慢但是累进的累积 为特征的一种淋巴细胞性白血病。取决于疾病的时期，通常发生淋巴结和脾增大。尽管CLL 可以是T细胞或B细胞来源的，超过85%的情况是B细胞来源的。当前的认识暗示CLL是 起源于在活化和成熟状态以及细胞亚群不同的B淋巴细胞的异质疾病(参见[KupperS，R.， 2005])。该疾病可以产生自白血病的B细胞凋亡减少和增殖增加两者。CLL细胞通常在来 源克隆，并表达下列细胞表面标记⑶19、⑶20、⑶21和⑶24。此外，它们表达更通常在T细 胞上发现的 CD5(参见[Chiorazzi，N, and al.，2005])。CLL被认为是〃非Hodgkin氏淋巴瘤〃(NHL)的亚类并且与主要存在于淋巴结的 紧密相关的疾病"小淋巴细胞淋巴瘤"(SLL) —起，相当于所有NHL情况的大约20%。CLL是美国和大部分西欧成人中最常见的白血病。国家癌症学会(NCI)估计在美 国CLL的发病率是每年大约10. 000新病例。CLL的临床表现主要在55岁之后出现。男人 的发病率比女人更高，男人几乎两倍于女人可能得到该疾病。CLL代表未满足的医学需要因为对于治疗只有有限的选择。对于NHL最常见的治疗是化疗，尤其是称为010 (环磷酰胺、办(11~0巧1~111^(^11[阿 霉素]、安可平[长春新碱]、强的松)的合并用药法，以及放射治疗。有时，还使用手术和 骨髓移植。更近一些，生物药剂学试剂，特别是例如利妥昔单抗(rituximab)和阿仑单抗 (alemtuzumab)的单克隆抗体的使用已有增加。其它组合方法包括例如rituximab的生物 药剂与化疗一起使用。尽管这些治疗已经显著地改进了 B淋巴恶性肿瘤的处理，它们的不 足中包括许多病人对这些服法非应答(一些病人变成对一些或所有这些途径不应的)，以 及由这些治疗的使用产生的副作用和并发症。其中最常见的化疗副作用是恶心和呕吐(其 通常是使用止吐药处理)、脱发(其通常在治疗完成之后随着时间的过去逆转)和白细胞减 少，特别是中性粒细胞减少。中性粒细胞减少通常在第二周显现。在这期间，许多临床医师 推荐预防的使用环丙沙星。如果在中性粒细胞减少周期中显现发烧，需要对中性粒细胞减 少脓毒症的紧急医学鉴定，因为在低中性粒细胞计数的病人中感染会迅速地发展。对于利 妥昔单抗，已经报道了首次输注反应、淋巴细胞减少、传染性并发症例如包括乙型肝炎和进 行性多灶性白质脑病(PML)的病毒再活化、粘膜与皮肤反应和肾并发症。对于阿仑单抗，可 能出现严重的血液毒性，包括各类血细胞减少、骨髓发育不全、自身免疫自发性血小板减少 和自身免疫性溶血性贫血。有时，这些毒性可能加速病态和死亡率。自身免疫疾病免疫系统具有防止它攻击自身组织的控制机制。当这些机制没有适当地行使功能或当它们损坏时，它们可能产生自身免疫或自身免疫疾病的出现。自身免疫代表从器官特 异性到非器官特异性的广谱疾病。在范围的一端，Hashimoto氏甲状腺炎代表高度器官特 异性的疾病，其中破坏性损害仅仅针对一种器官。在范围的另一端，全身性红斑狼疮(SLE) 代表非器官特异性疾病，其中涉及涉及组织广泛遍及身体。随着我们的免疫生物学认识的 增进，以及分子和诊断工具的发展，大多数器官或组织系统可能遭受显示于以下列表的自 身免疫疾病的自动破坏潜能逐渐变得明显。如此其中自身免疫疾病包括艾迪生氏病、强 直性脊柱炎、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫肝炎、腹腔病、克罗恩氏 病、皮肌炎、古德帕斯彻氏综合征、突眼性甲状腺肿、Guillain-Barre综合症、桥本氏病、自 发性白细胞减少、特发性血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)、男性不育 症、混合型结缔组织病、多发性硬化(MS)、重症肌无力、类天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、 phacogenic葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性粘液水肿、瑞特氏综合征、类风湿性关 节炎(RA)、硬皮病、Sjogren氏综合症、stiff man综合症、系统性红斑狼疮(SLE)、甲状腺 毒症、溃疡性结肠炎和韦格纳氏肉芽肿病。没有完全了解自身免疫疾病的病因学。在有些情况下，已经建立了分子模拟机制， 借此产生性的抗细菌或抗病毒反应可能不注意地导致对自身组织的免疫反应的发生。此 外，已知继承或遗传易感促进这些疾病中许多的出现。淋巴和骨髓谱系细胞两者都和自身免疫疾病的发生有牵连。自身反应T和B淋巴 细胞确定每种疾病的主要临床_病理特征和涉及的组织。T淋巴细胞可能直接攻击自身组 织而B细胞分泌自身反应抗体。在SLE中，产生包括对双链DNA的抗体的大量自身反应性 抗体，其被认为引起或加重肾损害。是巨噬细胞骨髓谱系细胞的有助于通过提供细胞因子 和趋化因子反应(例如TNF-a和IL-8)，以及通过充当自动破坏过程的效应细胞，维持、扩 增和延长针对自身组织的免疫攻击。对于现在已知适用抗TNF-a治疗的RA和克罗恩氏 病，TNF-a的作用已经明显地确定。对于RA，骨髓谱系细胞被认为分化为破骨细胞由此引 起骨损害和发炎的关节的滑液衬垫破坏。RA病人还显示适用直接针对B细胞的治疗，例如 抗⑶20抗体治疗。发明简述本发明涉及用于治疗用途的HVEM配体，其中所述HVEM配体选自LIGHT、作为抗 HVEM抗体的LIGHT片段，其中，所述片段在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡，且所 述片段与HVEM结合。尤其本发明涉及用于治疗血液恶性肿瘤或自身免疫疾病的HVEM配体。本发明还涉及血液恶性肿瘤或自身免疫疾病的治疗方法，其包括给需要的受试者 服用治疗有效量的HVEM配体。定义如本文使用的，涉及特异性蛋白质(例如抗体或LIGHT)可以包括具有天然氨基酸 序列的多肽，以及变体和修饰形式，不管它们的来源或制备方式。具有天然氨基酸序列的蛋 白质是具有与从自然界获得的(例如天然存在的LIGHT)相同的氨基酸序列的蛋白质。上 述天然序列蛋白质可以从自然界分离或可以使用标准重组和/或合成方法制备。天然序列 蛋白质特别地包括天然存在的截短或可溶形式、天然存在的变体形式(例如选择性拼接形 式)、天然存在的等位变体和包括翻译后修饰的形式。天然序列蛋白质包括例如糖基化作用、或磷酸化作用、或一些氨基酸残基的其它修饰的翻译后修饰之后的蛋白质。本文使用的术语“HVEM”意欲包括所有异名，包括但不限于“疱疹病毒进入介质 (Herpes Virus Entry Mediator) ”、“HVEA”、“疱疹病毒进入介质 A”、“TNFRSF14”、“肿瘤坏 死因子超家族成员 14”、“TNR14”、“LIGHTR”、“LIGHT 受体”、“TR2”、“类 TNF 受体”、“ATAR，，、 “另一个 TRAF 相关受体(Another TRAF-AssociatedRec印tor) ”。TNFRSF14 是 HUGO(人类 基因组组织)基因命名委员会(HGNC)批准的代号。HVEM的UniProtKB/Swiss-Prot"原始 登录号(Primary Accession Number)"是 Q92956。“后续登录号(SecondaryAccession Number)“是 Q8WXR1、Q96J31 和 Q9UM65。“配体"表示与受体分子结合以形成受体_配体复合物的天然或合成化合物。迄今为止，已经鉴定了 4种与HVEM结合的配体。这些配体中的两种，LIGHT和 LTa 是 TNF 家族成员分子(Morel，Y. et al.，2000 ；Mauri, D. N. et al.，1998 和 Harrop， J. A. et al.，1998)。在结构上，TNF家族成员通常表达为单程2型跨膜，同源三聚体或异源 三聚体，糖蛋白。在表达为跨膜蛋白质之后，它们通过蛋白水解作用裂解以产生可溶形式的 配体。HVEM的第三种配体，BTLA，一种1型跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白(Ig)超家族成员分子 并与CD28密切相关(Gonzalez, L. C. et al.，2005)。第四种配体，糖蛋白D (gD)，是单纯疱 疹病毒(HSV)包膜的结构部件，并对HSV进入宿主细胞是必不可少的(Montgomery，! . I.et al. , 1996 ；Hsu,H. et al. , 1997 ；Kwon,B. S. et al. , 1997 ；Tan,K. B. et al. , 1997 ；Marsters, S. A. et al. , 1997 ；ffallach, D. et al. , 1999 ；Collette, Y. et al. ,2003 ；Harrop, J. A. et al. , 1998 ；Gonzalez, L. C. et al. , 2005and ffhitbeck, J. C. et al. , 1997)。结合研究(Gonzalez,L. C. et al.，2005 和 Sedy, J. R. et al.，2005)表明 BTLA 与 HVEM的大多数膜远端CRD区域相互作用，这随后被结晶学(Compaan，D. M. et al.，2005)支 持。HVEM的膜远端CRD1区域还和与HSV-gD的相互作用有牵连，具有来自CRD2的另外的贡 献(Compaan，D.M. et al.，2005 和 Carfi，A. et al. ,2001) 尽管在 BTLA 和 HSV-gD 之间序 列和结构不相似，晶体结构研究还显示它们在HVEM上的结合位点包括基本上重叠的表面 (Compaan, D. M. et al.，2005 禾口 Carfi，A. et al.，2001)。本文使用的术语“LIGHT”意欲包括所有异名，包括但不限于“T细胞表达的，与单 纯性疱疹病毒(HSV)糖蛋白D竞争HVEM的，可诱导的，淋巴毒素”、“TNFSF14”、“肿瘤坏死因 子配体超家族成员14”、“TNF14_HUMAN”、“HVEM-L”、“HVEML”、“HVEM配体”、“疱疹病毒进入 介质配体”、“疱疹病毒进入介质-配体”、“TL4”、“类TNF-4”、“TN14”、“LT Y ”和“CD258”。 TNFSF14是HGNC批准的代号。⑶258是HLDA (人类白细胞分化抗原)Workshop的簇指定分 配。LIGHT 的UniProtKB/Swiss-Prot"原始登录号〃是043557。〃 后续登录号"是075476、 Q8WVF8 和 Q96LD2。在天然抗体中，两条重链通过二硫键彼此连接并且每条重链通过二硫键与轻链连 接。有两种轻链，X和K。有5种主要的重链类别(或同种型)IgM、IgD、IgG、IgA*IgE， 其确定抗体分子的功能性活动。每条链包含独特的序列结构域。轻链包括两个结构域，可 变区(VL)和恒定区(CL)。重链包括四个结构域，可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和 CH3，共同称为CH)。轻(VL)和重(VH)链两者的可变区确定对抗原的结合识别和特异性。 轻(CL)和重(CH)链的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，例如抗体链缔合、分泌、转胎 盘流动性、互补结合和与Fc受体(FcR)结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体特异性存在于抗体结合部位和抗原决定 簇之间的结构互补性。抗体结合部位由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。 偶而，来自非高变区或框架区(FR)的残基影响总的区域结构由此影响结合部位。互补决定 区或CDR指的是共同限定天然免疫球蛋白结合部位的天然Fv区的结合亲合性和特异性的 氨基酸序列。免疫球蛋白的轻和重链各具有三个⑶R，分别命名为L-⑶R1、L-⑶R2、L-⑶R3 和H-⑶R1、H-⑶R2、H-⑶R3。因此抗原结合部位包括六个⑶R，包括来自一条重链和一条轻 链各自V区的⑶R组。框架区(FR)指的是在⑶R之间插入的氨基酸序列。术语"抗体" 进一步意欲包括抗体、消化片段、其特定部分和变体，包括模拟抗体或其特定片段或部分结 构和/或功能的抗体模拟物或抗体部分，包括单链抗体及其片段。功能性片段包括与哺乳 动物HVEM结合的抗原结合片段。如本文使用的，术语"人类抗体"指的是其中抗体分子的重要部分，在氨基酸序 列或结构上类似来源于人类起端抗体的抗体。术语"人源化抗体"指的是通过基因工程或 其它方式修饰以在结构或氨基酸序列上与天然发生的人类抗体相似的抗体。在需要减少抗 体的免疫原性的情况下，“人类抗体"或"人源化抗体"可能被认为更适合给药至人类用 于治疗、预防或诊断目的。以其多种名称的"单克隆抗体"或"mAb"指的是仅仅包含能够与特定表位免疫 反应的一个物种的抗体结合部位的抗体分子群。因此单克隆抗体通常显示对它与其免疫 反应的任何表位的单一结合亲合性。单克隆抗体还可以限定具有复数抗体结合部位，各自 对不同表位免疫专一的抗体分子。例如，双特异性抗体可以具有两个抗原结合部位，各自 识别不同的相互作用分子、或不同的表位。如本文使用的，术语"抗体片段"、“抗体部 分"、“抗体变体"等包括任何包含包括免疫球蛋白分子至少一部分以致允许在所述分子 和抗原(例如HVEM)之间特异性相互作用的分子的蛋白质或多肽。免疫球蛋白分子的部分 可以包括，但不限于重或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻 链可变区、重链或轻链恒定区、框架区、或其任何部分、或能够并入本发明的抗体以允许与 抗原(例如HVEM)的相互作用的配体或抗受体(例如LIGHT、BTLA或HSV-gD)的至少一部 分。术语"杂交瘤"表示通过呈交用抗原免疫非人哺乳动物制备的B细胞与来源于 小鼠等的骨髓瘤细胞细胞融合获得的细胞，其产生具有抗原特异性的需要的单克隆抗体。如本文使用的，术语"受试者"表示哺乳动物，例如啮齿动物、猫、犬和灵长类。优 选根据本发明的受试者是人。发明详述治疗方法和应用本发明的第一个目的涉及用于治疗用途的HVEM配体，其中所述HVEM配体选自 LIGHT、作为抗HVEM抗体LIGHT片段，其中，所述片段在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱 导凋亡，且所述片段与HVEM结合。通常所述HVEM配体可以和放疗和激素疗法联合使用。通常所述HVEM配体还可以和选自抗癌剂、止吐药、造血集落刺激因子、止痛药和 抗焦虑药的一种或多种试剂联合使用。在优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗血液恶性肿瘤或自身免疫疾病的HVEM配体。本发明还涉及HVEM配体制造治疗血液恶性肿瘤或自身免疫疾病的药剂的用途， 其中所述HVEM配体选自LIGHT、作为抗HVEM抗体的LIGHT片段，其中，所述片段在慢性淋巴 细胞性白血病B细胞中诱导凋亡，且所述片段与HVEM结合。在一个实施方案中，血液恶性肿瘤包括但不限于例如慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)的淋巴样细胞赘生物、非Hodgkin淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)和外套 细胞淋巴瘤(MCL)。更具体地说，非Hodgkin淋巴瘤(NHL)包括B和T非Hodgkin淋巴瘤。 此外，细胞淋巴样赘生物包括B、NK和T细胞淋巴样赘生物。在一个实施方案中，自身免疫疾病包括但不限于艾迪生氏病、强直性脊柱炎、再生 障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫肝炎、腹腔病、克罗恩氏病、皮肌炎、古德帕 斯彻氏综合征、突眼性甲状腺肿、Guillain-Barre综合症、桥本氏病、自发性白细胞减少、 特发性血小板减少性紫癜、胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)、男性不育症、混合型结缔组 织病、多发性硬化(MS)、重症肌无力、类天疱疮、寻常天疱疮、恶性贫血、phacogenic葡萄膜 炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性粘液水肿、瑞特氏综合征、类风湿性关节炎(RA)、硬皮病、 Sj6gren氏综合症、stiff man综合症、系统性红斑狼疮(SLE)、甲状腺毒症、溃疡性结肠炎 和韦格纳氏肉芽肿病。在优选的实施方案中，所述HVEM配体是LIGHT或其片段，其在慢性淋巴细胞性白 血病B细胞中诱导凋亡。特别地，所述配体可以由多肽组成，包括与登录号Q92956的序列具有至少90%同 一性并在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡的序列。在另一个优选的实施方案中， 本发明的配体是可以以可溶形式使用的LIGHT。本发明的多肽可以通过本领域本来已知的任何技术产生，例如，无限制地，任何化 学的、生物的、遗传的或酶的技术，单独或组合。已知需要的序列的氨基酸序列，通过生产多肽的标准技术，本领域技术人员能够 容易地产生所述多肽。例如，它们能够使用众所周知的固相方法合成，优选使用市场上可买 到的肽合成装置(例如AppliedBiosystems，Foster City，California制造的)并且遵循 制造商的指导。可选择地，本发明的多肽能够通过本领域现在众所周知的重组DNA技术合成。例 如，这些片段能够在把编码需要的(多)肽的DNA序列掺入表达载体并把上述载体引入可 以表达需要的多肽的合适的真核或原核宿主之后作为DNA表达产物获得，它们随后能够使 用众所周知的技术从其中分离。本发明的多肽能够以分离的(例如纯化的)形式或包含在载体，例如膜或脂囊泡 (例如脂质体)中使用。在另一个优选的实施方案中，所述HVEM配体是抗HVEM抗体或其与HVEM结合的片 段。所述配体可以通过例如凋亡诱导、抗体依赖的细胞毒性、互补介导的细胞毒性、或 通过产生细胞因子或趋化因子的免疫效应细胞补充和/或活化的机制，诱导表达HVEM的恶 性淋巴细胞死亡和/或消除。在一个优选的实施方案中，所述配体在表达HVEM的恶性淋巴细胞中，尤其是在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡。表达HVEM的恶性淋巴细胞可以从遭受急性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、浆细 胞性白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤或T细胞淋巴瘤的病人获得。在本发明的一个实施方案中所述抗HVEM抗体或其所述片段是不抑制BTLA与HVEM 结合的抗体或其片段。在本发明的一个选择性的实施方案中所述抗HVEM抗体或其所述片段是抑制BTLA 与HVEM结合并且不与包括或由人类HVEM序列CPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEPC (SEQ ID NO 1)组成的30氨基酸序列结合的抗体或其片段。在一个优选的实施方案中所述抗HVEM抗体或所述片段是识别选自组I、II、III、 IV、V或VI的表位的抗体或其片段。在另一个优选的实施方案中所述抗HVEM抗体或所述 片段是识别选自组II、IV或V的表位的抗体或其片段。HVEM mAb识别的表位通过以下特征鉴定i) mAb 抑制 LIGHT、HSV-gD 和 / 或 BTLA 与 HVEM 结合的能力。ii)诱变实验借此测试mAb与HVEM突变体结合的能力。使用的HVEM突变体包括i)两种缺失突变体a. CRD1结构域缺失和b. CRD3 结构域中氨基酸 129_133 缺失(dell29_l33)ii) 一种具有残基131-133取代的丙氨酸取代突变体(mutl31_133)上面一组实验确定了 6个不同的mAb组以及由此6个表位1.组I mAb相应于不与CRD1结合但是受del 129-133缺失突变体的影响并且仅仅 封闭HVEM与LIGHT的结合的那些。2.组II mAb相应于与CRD1缺失结合但不与dell29-133缺失或mutl31-133突变 体结合的那些。3.组III mAb相应于不与CRD 1缺失突变体结合且不受del 129-133缺失影响，并 且不抑制三种HVEM配体结合的那些。4.组IV mAb相应于不受CRD1影响但是受del 129-133缺失突变体影响，并且不抑 制三种HVEM配体结合的那些。5.组V mAb相应于与CRD1缺失但不与dell29-133缺失结合的，不受mutl31-133 突变体影响，并且不能封闭HVEM与三种配体结合的那些。6.组VI mAb相应于与CRD1缺失结合但受del 129-133缺失或mutl31-133突变体 部分影响，并且能够封闭HVEM与全部配体结合的那些。在一个优选的实施方案中所述抗HVEM抗体是可从根据布达佩斯条约于2007年4 月 26 日在 COLLECTION NATIONALE DECULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM)储存的选自 CNCMI-3752、CNCM 1-3753和CNCM 1-3754的杂交瘤获得的单克隆抗体。在进一步的实施方案中，本发明涉及适于获得抗HVEM单克隆抗体的杂交瘤细胞 系，其通过例如凋亡诱导、抗体依赖的细胞毒性、互补介导的细胞毒性、或通过产生细胞因 子或趋化因子的免疫效应细胞补充和/或活化的机制，诱导表达HVEM的恶性淋巴细胞死亡 和/或消除。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及适于获得抗HVEM单克隆抗体的杂交瘤细 胞系，其在表达HVEM的恶性淋巴细胞中，尤其是在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡。在一个优选的实施方案中，本发明涉及适于获得抗HVEM单克隆抗体的杂交瘤细 胞系，其识别选自组I、II、III、IV、V或VI的表位。在一个优选的实施方案中所述杂交瘤细胞系选自CNCM 1-3752、CNCM 1-3753和 CNCM 1-3754。尽管可以使用多克隆抗体，优选单克隆抗体。能够与HVEM特异性结合的抗体可以源自于许多物种包括但不限于啮齿动物(小 鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠等)、猪、牛、马或灵长类等。来自灵长类(猴、狒狒、黑猩猩等)起源 的抗体具有与人类序列最高的相似度并因此期待是较少免疫原性的。来源于多种物种的抗 体能够通过修饰抗体的氨基酸序列"人源化"同时保持它们与需要的抗原结合的能力。抗 体还可以源自于转基因动物，包括小鼠，其已经用人免疫球蛋白基因座遗传修饰以表达人 类抗体。形成"多克隆抗体"的程序为本领域所熟知。例如，多克隆抗体能够从针对HVEM 免疫的动物的血清获得，所述HVEM可以通过基因工程，例如根据本领域技术人员众所周知 的标准方法产生。通常，上述抗体能够通过皮下给药HVEM蛋白质到已经放血以获得预免疫 血清的新西兰白兔(New Zealand white rabbit)形成。可以以每部位100 yl总量在6个 不同的部位注射抗原。每种注射材料可以包含有或者没有磨成粉的SDS聚丙烯酰胺凝胶电 泳之后包含蛋白质或多肽的丙烯酰胺凝胶的佐剂。然后在第一次注射并用相同的抗原以6 星期的间隔周期地加强三次之后2周把兔放血。然后每次加强之后10天收集血清样品。然 后通过使用捕获该抗体的相应抗原的亲和层析法从血清中回收多克隆抗体。形成多克隆抗 体的这个和其它程序被(Harlow et al. , 1988)公开，其在此并入参考文献。尽管历史上单克隆抗体通过克隆纯免疫球蛋白分泌细胞系的永生化产生，单克隆 纯抗体分子群也可以通过本发明的方法制备。制备单克隆抗体的实验室方法为本领域所熟知(参见，例如Harlow et al., 1988)。单克隆抗体(mAb)可以通过用纯化的HVEM蛋白质免疫例如小鼠、大鼠、灵长类等哺 乳动物制备。分离来自免疫的哺乳动物的抗体生产细胞并与骨髓瘤或异骨髓瘤细胞融合以 生产杂交细胞(杂交瘤)。利用生产单克隆抗体的杂交瘤细胞作为需要的单克隆抗体的来 源。该杂交瘤培养标准方法在(Kohler and Milstein, 1975)中描述。可选择地，可以分离 免疫球蛋白基因并用于制备筛选特异反应的反应性抗体的文库。包括重组噬菌体和其它表 达文库地许多这样的技术为本领域技术人员所知。虽然mAb可以通过杂交瘤培养生产本发明不被这样限制。还预期了通过克隆和转 移从本发明的杂交瘤克隆的核酸生产的mAb的用途。也就是说，表达本发明的杂交瘤分泌 的分子的核酸可以被转移进另一个细胞系以生产转化体。转化体基因型上与原始杂交瘤不 同但是也能够生产本发明的抗体分子，包括完整抗体分子的免疫活性片段，与杂交瘤分泌 的那些相当。参见，例如美国专利号4，642，334来读取；PCT公开号；Winter等人的欧洲专 利公开号0239400和Cabilly等人的欧洲专利公开号0125023。在一个特定实施方案中，识别HVEM的mAb可以通过用相应的重组人类Fc_IgGl融 合蛋白免疫Balb-c小鼠产生。把脾细胞与X-63骨髓瘤细胞融合并根据已经描述的程序
11(Olive D，1986)克隆。然后通过转染的细胞染色筛选杂交瘤上清液，因为与未转染的细胞 缺乏反应性。也预期了不涉及免疫接种的抗体产生技术，例如使用噬菌体展示技术来检查自然 的文库(来自未免疫的动物)；参见(Barbas et al.，1992，和Waterhouse et al. 1993)。通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如亲合性、离子交换和/或分子筛层析等适 当地从培养基分离本发明的抗体。在一个特定实施方案中，本发明的抗体可以是人类嵌合抗体。可以通过获得编码 VL和VH结构域的核酸序列，通过把它们插入具有编码人类抗体CH和人类抗体CL的基因 的动物细胞的表达载体构建人类嵌合抗体表达载体，以及通过引入动物细胞表达该表达载 体生产本发明的所述人类嵌合抗体。人类嵌合抗体的CH结构域可以是属于人免疫球蛋白 的任何区域，但是IgG类的那些是合适的并且也可以使用属于IgG类的任何一个亚类，例如 IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。同时，人类嵌合抗体的CL可以是属于Ig的任何区域，并且能够 使用k类或\类的那些。生产嵌合抗体的方法涉及为本领域所熟知的常规重组DNA和基 因转染技术(参见Morrison SL. et al. (1984)和专利文件US5, 202，238 ；和US5，204，244)。在另一个特定实施方案中，所述抗体可以是人源化抗体。可以通过获得编码⑶R 结构域的核酸序列，通过把它们插入具有编码与人类抗体一致的重链恒定区；和与人类抗 体一致的轻链恒定区的基因的动物细胞的表达载体，以及通过引入动物细胞表达该表达载 体生产所述人源化抗体。人源化抗体表达载体可以是其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存 在于分离的载体中的类型或其中两个基因存在于同一个载体中(串联式)的类型。在构 建人源化抗体表达载体的容易，引入动物细胞的容易，和在动物细胞中抗体H和L链表达 水平之间的平衡方面，串联式人源化抗体表达载体更优越(Shitara K et al. 1994)。串 联式人源化抗体表达载体的实例包括？以^^乂93(1097/10354)、？￡￡18等。基于常规重 组DNA和基因转染技术的生产人源化抗体的方法为本领域所熟知(参见，例如Riechmarm L. et al. 1988 ；Neuberger MS. et al. 1985)。可以使用本领域已知的多种技术，包括例 如 CDR 嫁接(EP 239，400 ；PCT 公开 W091/09967 ；U. S.专利号 5，225，539 ；5，530，101 和 5，585，089)、镶盖(veneering)或表面重建(resurfacing) (EP 592，106 ；EP 519，596 ； Padlan EA(1991) ；StudnickaGM et al. (1994) ；Roguska MA. et al. (1994))和链替换(美 国专利号5，565，332)。制备上述抗体的通用重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请 EP 125023和国际专利申请W0 96/02576)。本发明包括，例如，能够与HVEM或其部分结合的抗体片段，包括但不限于Fab (例 如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab'(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab' )2 (例如 通过胃蛋白酶消化)、facb (例如通过纤溶酶消化)、pFc'(例如通过胃蛋白酶或纤溶酶消 化)、Fd (例如通过胃蛋白酶消化，部分还原并重团聚)、Fv或scFv (例如通过分子生物学技 术)片段(参见，例如Colligan，Immunology，上文)。上述片段可以通过酶裂解、合成或重组技术生产，如本领域已知的和/或在此描 述的。也可以使用其中一个或多个终止密码子引入天然终止位点上游的抗体基因以多种截 短形式生产抗体。多种抗体部分可以通过常规技术化学连接，或者使用基因工程技术作为 连续的蛋白质制备。
可以通过用一种蛋白酶papaine处理与人类HVEM特异性反应的抗体获得本发明 的所述Fab片段。同时，Fab可以通过把编码抗体Fab的DNA插入用于原核表达系统或真 核表达系统的载体，并把该载体引入原核生物或真核生物以表达Fab来生产。可以通过用一种蛋白酶p印sin处理与人类HVEM特异性反应的抗体获得本发明的 所述F(ab' )2。同样地，可以通过如下所述经硫醚键或二硫键结合Fab'生产F(ab' )2。可以通过用一种还原剂二硫苏糖醇处理与HVEM特异性反应的F (ab ‘ ) 2获得所述 Fab'。同时，可以通过把编码抗体Fab'片段的DNA插入用于原核生物的表达载体或用于 真核生物的表达载体，并把该载体引入原核生物或真核生物以实现其表达来生产Fab'。所述scFv片段可以通过获得编码如先前描述的VH和VL结构域的cDNA，构建编 码scFv的DNA，把该DNA插入用于原核生物的表达载体或用于真核生物的表达载体，然后把 该表达载体引入原核生物或真核生物以表达scFv来生产。为了产生人源化scFv片段，可 以使用称为CDR嫁接的公知技术，其涉及从供体scFv片段选择互补决定区(CDR)，并且把 它们嫁接到已知三维结构的人类scFv片段骨架上(参见，例如W098/45322 ；W0 87/02671 ； US5, 859，205 ；US5, 585，089 ；US4, 816，567 ；EP0173494)。在一个特定实施方案中，本发明的单克隆抗体是一价的、二价的、多价的、单一特 异性的、双特异性的或多特异性的。在另一个优选的实施方案中，HVEM的抗体是结合片段 或偶联物。例如本发明的抗体可以偶联至发育抑制性试剂、细胞毒素试剂或前体药物活化酶。对于效应子作用可能还需要修饰本发明的抗体，例如以便增强抗体的抗原依赖的 细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的 Fc区域引入一个或多个氨基酸取代实现。可选择地或另外，可以把半胱氨酸残基弓丨入Fc区 域，从而在该区域中允许链间二硫键形成。由此产生的同二聚抗体可能具有改进的内在化 能力和/或增加的补体介导的细胞杀死和/或抗体依赖的细胞毒性(ADCC) (Caron PC. et al. 1992 ；和 Shopes B. 1992)本发明的抗体的另一种氨基酸修饰也许能够用于改变抗体的原始糖基化模式。“改变”指的是删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中 不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的。“N-连接"指的是碳水化物部分连接到天冬酰 胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸 之外的任何氨基酸，是碳水化物部分酶连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中任 何一个该三肽序列的存在产生一个潜在糖基化位点。通过改变氨基酸序列以致它包含一个 或多个上述三肽序列(对于N-连接糖基化位点)方便地完成糖基化位点添加到抗体。另一种共价修饰涉及化学或酶偶联苷到抗体。在不需要在具有N-或0-连接糖基 化的糖基化能力的宿主细胞中生产抗体方面这些程序是有益的。取决于使用的偶联方式， 糖可能附于(a)精氨酸和组氨酸，(b)自由羧基，(c)自由巯基例如半胱氨酸的那些，(d)自 由羟基例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些，(e)芳香族残基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色 氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。例如，上述方法描述于W087/05330中。可以化学或酶完成存在于抗体上的任何碳水化合物部分的除去。化学去糖基化需 要使抗体接触化合物三氟甲磺酸，或相当的化合物。该处理产生除连接的糖(N-乙酰葡萄糖胺或N_乙酰半乳糖胺)之外大多数或全部糖的裂解，而保留抗体完整。化学去糖基化 由Sojahr H.等人.(1987)和Edge，AS.等人.(1981)描述。可以通过使用如Thotakura， NR.等人.(1987)描述的多种内和外糖苷酶实现抗体上碳水化合物部分的酶裂解。抗体的另一种共价修饰包括以美国专利号4，640，835 ；4，496，689 ；4, 301, 144 ； 4，670，417 ；4, 791，192或4，179，337中阐述的方式把抗体连接到多种非蛋白质聚合物的一 种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。本发明进一步的目的涉及治疗血液恶性肿瘤和自身免疫疾病的方法，其包括给需 要的受试者服用治疗有效量的上面定义的HVEM配体。在本发明的背景中，本文使用的术语"治疗(treating)“或"治疗 (treatment)“表示逆转、减轻、抑制发展、或防止上述术语应用的病症或状况、或上述病症 或状况的一种或多种症状。根据本发明，术语"患者"或"需要其的患者"意指受或可能受血液恶性肿瘤或 自身免疫性疾病影响的人或非人哺乳动物。根据本发明的"治疗有效量"的HVEM配体表示以适用于任何治疗的合理效益/ 风险比治疗所述血液恶性肿瘤或自身免疫性疾病的足够量的HVEM配体。然而，可以了解本 发明的HVEM配体和组合物的每日使用总量由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对 于任何特定患者特定的治疗有效剂量水平可能依赖多种因素，包括治疗的病症和该病症的 严重度、使用的特定HVEM配体的活性；使用的特定组合物、年龄、体重、总体健康状态、性别 和患者的日常饮食、给药时间、给药途径、和使用的特异性抗体的排泄速率、治疗的持续时 间；与使用的特定多肽联合或同时使用的药物、和在医学领域公知的类似因素。例如，在本 领域技术人员中公知以低于要求达到需要的治疗效果的化合物剂量开始并逐渐增加剂量 直到达到预期效果。根据本发明的HVEM配体可以与治疗上述病症或状况的任何其它治疗策略(例如 外部放疗、化疗或细胞因子治疗)联合使用。药物组合物本发明进一步的目的涉及包括有效剂量HVEM配体的药物组合物。本发明的上述任何治疗剂可以与药学上可接受的辅料，和任选持续释放基质(例 如可生物降解的聚合物)结合以形成治疗组合物。‘‘药物上〃或〃药学上可接受的〃指的是当给药至哺乳动物，视情况而定特别是 人时不产生不利的、过敏的或其它不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或 辅料指的是无毒的固体、半固体或液体填料、稀释剂、包封材料或任何类型的辅助性成分。药物组合物的形式、给药途径、剂量和服法天然依赖患者要治疗的状况、疾病的严 重度、年龄、体重和性别等。本发明的药物组合物可以配制为局部、口服、鼻内、眼内、静脉内、肌内或皮下给药寸。优选地，药物组合物包含药学上适用于能够注射的剂型的运载工具。这些尤其可 以是等渗的、无菌的盐溶液(磷酸一钠或二钠，氯化钠、钾、钙或镁等或上述盐的混合物)， 或干燥的，特别是冻结干燥的组合物，取决于情况，当其添加无菌水或生理盐水时，允许可 注射的溶液的组成。
可以使用于给药的剂量适应作为多种参数的函数，尤其是作为使用的给药方式、 有关的病状、或者治疗需要的持续时间的函数。为了制备药物组合物，可以在药学上可接受的载体或水介质中溶解或分散有效量 的HVEM配体。适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水 性丙二醇的剂型；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。在任何场合，形式 必须是无菌的并且在易于可注射性存在的程度上必须是液体。在制造和存储条件下它必须 是稳定的并且必须保存以防微生物，例如细菌和真菌的污染作用。可以在水中与表面活性剂，例如羟丙纤维素适当地混合制备活性物质作为游离碱 或药理学可接受的盐的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇，其混合物中和在油类中制备分 散体。根据普通的储存和使用条件，这些制剂包括防腐剂以防止微生物的生长。本发明的HVEM配体可以以中性或盐形式配制为组合物。药学上可接受的盐包括 酸加成盐(由蛋白质的自由氨基形成的)和由无机酸(例如盐酸或磷酸)或由有机酸(诸 如醋酸、草酸、酒石酸、mandelic等)形成的盐。由自由羧基形成的盐也可以源自于无机碱 (例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(诸如异丙胺、三甲 胺、组氨酸、普鲁卡因等)。载体也可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和 液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和蔬菜油类。可以维持适当的流动性，例如通过涂层 (例如卵磷脂)的使用，对于分散体通过需要的颗粒大小的维持和通过表面活性剂的使用。 微生物作用的预防可以通过多种抗细菌和抗真菌药，例如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山 梨酸、硫柳汞等完成。在很多情况下，包括等渗试剂，例如糖或氯化钠是优越的。可注射组 合物延长的吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶完成。通过在适当的溶剂中以需要的量使活性物质根据需要与上面列举的多种其它成 份混合，随后过滤灭菌制备无菌的可注射溶液。通常，通过把多种灭菌活性成分掺入包含基 础分散介质和上面列举的需要的其它成份的无菌运载工具制备分散体。对于用于无菌可注 射溶液制备的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自其先前 无菌过滤的溶液的活性成分加上任何另外需要的成份的粉剂。还预期了用于直接注射的更或高浓度溶液的制备，其中设想DMS0作为溶剂的用 途以产生非常快速的穿透，递送高浓度的活化剂至小的肿瘤区域。依据剂型，可以以与剂量剂型相适合的方式，以及以可以有效预防和/或治疗的 量给药。制剂以多种剂型，例如上述可注射溶液类型容易地给药，但是也可以使用药物释放
胶囊等。对于水溶液中的肠胃外投药，例如，溶液可以适当地缓冲并且液体稀释剂首先用 足够的盐水或葡萄糖使其等渗。这些特定的水溶液尤其适于静脉内、肌内、皮下和腹膜内 给药。在这方面，可以使用的无菌水介质可以按照本公开为本领域技术人员所知。例如， 一剂量可以溶于1ml的等渗NaCl溶液和加入1000ml皮下输液液体或在计划的注入位点注 射，(参见例如，“Remington' s Pharmaceutical Sciences〃第 15 版，第 1035-1038 和 1570-1580页)。取决于治疗的受试者的状况，剂量的一些变化必然发生。无论如何，决定 给药的人对于个别受试者可以确定适当的剂量。
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除用于肠胃外投药，例如静脉内或肌内注射配制的化合物之外，其它药学上可接 受的形式包括，例如片剂或用于口服的其它固相；定时释放胶囊；和当前使用的任何其它 形式。本发明的组合物可以进一步包括治疗性活化剂。本发明还涉及包括如上面定义的 HVEM配体和进一步的治疗性活化剂的试剂盒。在一个实施方案中所述治疗性活化剂是抗癌剂。例如，所述抗癌剂包括但不限于 氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、氨甲喋呤、 紫杉醇、泰索帝(taxotere)、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺、异磷酰胺、亚 硝基脲、钼复合物(例如顺钼、卡钼和奥沙利钼)、丝裂霉素、氮烯咪胺、procarbizine、依 托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、campathecin、博来霉素、阿霉素、伊达比星 (idarubicin)、柔红霉素、放线菌素、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌、L-天冬酰胺酶、 阿霉素、印imbicm、5-氟尿嘧啶、紫杉烷类(例如紫杉萜和紫杉醇)、亚叶酸、左旋咪唑、依 立替康(irinotecan)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、氮芥、BCNU、亚硝基脲(例如 carmustme和环己亚硝脲)、长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱和长春瑞滨)、imatimb 甲磺酸盐、hexamethyhnelamine、托泊替康(topotecan)、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、ATP 酶抑制剂、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)、蛋白酶抑制剂、抑制剂herbimycm A、染料木 黄酮、癌基因抑活药(erbstatin)和薰草菌素A。在一个实施方案中，其它抗癌剂可以选自 但不限于以下类别试剂的一种或组合烷化剂、植物生物碱、DNA拓扑异构酶抑制剂、抗叶 酸盐、嘧啶类似物、嘌呤类似物、DNA抗代谢物、紫杉烷类、鬼白霉素、激素治疗、类视黄醇、光 敏剂或光促治疗、血管发生抑制剂、抗有丝分裂剂、异戊二烯化抑制剂、细胞周期抑制剂、放 线菌素、博来霉素、蒽环类抗生素、MDR抑制剂和Ca2+ATP酶抑制剂。其它抗癌剂可以选自但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、发育抑制因子、激 素、可溶受体、诱饵受体、单克隆或多克隆抗体、单特异性、双特异性或多特异性抗体、单体、 多体。其它抗癌剂可以选自但不限于生长或造血因子，例如促红细胞生成素和血小板生 成素，以及生长因子模拟物。在目前用于治疗癌症的方法中进一步的治疗性活化剂可以是止吐药。合 适的止吐药包括但不限于metoclopromide、多潘立酮(domperidone)、丙氯拉嗪 (prochlorperazine)、异丙嗪(promethazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、曲美节 胺(trimethobenzamide)、昂丹司琼(ondansetron)、格拉司琼(granisetron)、轻 P秦(hydroxyzine) > acethylleucine monoemanolamine> P可 AL 必禾(alizapride) > P可 扎司琼(azasetron)、苯喧胺(benzquinamide)、氛醇醋茶喊(bietanautine)、漠必利 (bromopride)、布克立嗪(buclizine)、氯波必禾丨J (clebopride)、赛克力嗪(cyclizine) > dunenhydrinate> ■^苯喊 F 丁酉享(diphenidol)、多拉司琼(dolasetron)、meclizme、美 沙拉妥(methallatal)、美托哌丙嗪(metopimazine)、大麻隆(nabilone)、奥昔喷地 (oxypemdyl)、匹哌马嗪(pipamazine)、东直菪碱(scopolamine)、舒必利(sulpiride)、四 氧大麻 ) (tetrahydrocannabinol) > thiefhylperazine、硫丙拉嚷(thioproperazine)禾口 托烷司琼(tropisetron)。在一个优选的实施方案中，止吐药是格拉司琼或昂丹司琼。在另一个实施方案中，进一步的治疗性活化剂可以是造血集落刺激因子。合适的造血集落刺激因子包括但不限于非格司亭(filgrastim)、沙格司亭(sargramostim)、莫拉 司亭(molgramostim)禾口 epoietina 。在另一个实施方案中，其它治疗性活化剂可以是阿片样或非阿片样止痛药。合适 的阿片样止痛药包括但不限于吗啡、氢吗啡酮、氢可酮、海洛因、羟吗啡酮、羟考酮、美托酮、 阿扑吗啡、nomioiphineetoipbine、丁丙诺啡、哌替啶、lopermide、阿尼利定(anileddine)、 伊索庚嗪(ethoh印tazine)、匹米诺定(piminidine)、倍他罗定、地芬诺酯、芬太尼 (fentanil)、舒芬太尼(sufentanil)、阿芬太尼(alfentanil)、瑞芬太尼(remifentanil)、 左啡诺(levorphanol)、右美沙芬(dextromethorphan)、安他唑啉(phenazodne)、 pemazocine、环佐辛(cyclazocine)、美沙酮、异美沙酮禾口达尔丰(propoxyphene)。合适的 非阿片样止痛药包括但不限于阿斯匹林、塞来考昔(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、 diclofenac、diflusinal、依托度酸(etodolac)、非诺洛芬、氟比洛芬(flurbiprofen)、布 洛芬、酮洛芬(ketoprofen)、消炎痛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯胺苯酸 (meclofenamate)、mefanamic 酸、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、口比罗昔康 (piroxicam)禾口舒林酸(sulindac)。在另一个实施方案中，进一步的治疗性活化剂可以是抗焦虑药。合适的抗焦 虑药包括但不限于丁螺环酮和苯二氮，例如安定、氯羟去甲安定、去甲羟安定、氯氮卓盐 (chloraz印ate)、氯硝安定、氯氮卓和阿普唑仑。筛选方法可以通过任何本领域公知的筛选方法选择在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱 导凋亡的LIGHT片段、抗HVEM抗体或其与表达HVEM的恶性淋巴细胞(尤其是慢性淋巴细 胞性白血病B细胞)结合并在其中诱导凋亡的片段。例如，用于在表达HVEM的恶性淋巴细胞中(尤其是在慢性淋巴细胞性白血病B细 胞中)诱导凋亡的HVEM配体的体外筛选方法可以包括以下步骤(a)把LIGHT片段、抗HVEM抗体或其片段加到表达HVEM的恶性淋巴细胞(例如慢 性淋巴细胞性白血病B细胞)；(b)选择诱导细胞凋亡的片段或抗体。可以如实验部分公开的，或通过为本领域技术人员所知的任何其它方法测定 LIGHT片段或抗HVEM抗体在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡的能力。本发明将通过以下实施例、附图
和表格进一步说明。附1 在造血恶性肿瘤上HVEM和LTR的表达(A)通过流式细胞术监控在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、外套细胞淋巴瘤(MCL) 和急性髓细胞性白血病(AML)上HVEM和LT 0 R的表面表达。代表的是9个CLL病人中的 2个，2个MCL病人中的1个和2个AML病人中的1个。未填满的直方图代表用特异性不相 关的同种型匹配的对照mAb染色的细胞的荧光。填满的直方图代表用特异性HVEM-FITC或 LT 3 R-PE偶联的mAb染色。(B)条形图代表在9个B-CLL病人上进行的HVEM和LT 0 R阳 性细胞的平均百分数(减去相当于同种型匹配的对照的背景之后)。误差线表示平均值的 标准误(SEM)。图2 通过QRT-PCR检测的在B-CLL细胞中HVEM刺激之后322个基因中显著诱导的基因在用或没有用抗HVEM mAb处理24小时的B-CLL细胞中通过QRT-PCR定量RNA。 使用肌动蛋白作为内源对照标准化RNA表达，通过ACt = Ct目标-Ct内源对照计算 A Ct值。在用或没有用抗HVEM mAb处理24小时的B-CLL细胞上清液中通过CBA或Elisa 确定细胞因子释放(如材料和方法中描述的)。用Wilcoxon signed-ranktest (单尾)检 验HVEM mAb处理的和非处理的条件之间的显著差异，并且p值存在于该表格中(n代表病 人数量；ns 非显著的，nt 没有检验的)。图 3 LIGHT 和 HVEM mAb 诱导 B-CLL 细胞死亡(A)以10个白血病细胞1个转染子的比例把B-CLL细胞与⑶32 (对照)或LIGHT 转染的L-细胞一起孵育。孵育24小时之后，如材料与方法中描述的用膜联蛋白(Armexin) V/PI双重染色法通过流式细胞术分析细胞死亡细胞诱导膜联蛋白V+/PI_ (早期凋亡)和 膜联蛋白V+/PI+(晚期凋亡/坏死)细胞。该图显示进行的15个实验中的一个代表性的实 验。(B)把B-CLL细胞与CD32 (对照)或LIGHT转染的L-细胞一起孵育，或者用30 u g/ml 抗HVEM mAb或10g/ml治疗性抗CD20 (利妥昔单抗)mAb处理，并且用膜联蛋白V/PI染色 分析。条形图描述了观察到的死亡细胞平均百分数士SEM，其中对于HVEM mAb n = 25，对 于 LIGHT 转染的细胞 n = 15，对于利妥昔单抗 n = 5。< 0. 05 ；**p < 0. 01 ；***p < 0. 001。 (C)与HVEM mAb刺激相比HVEM配体的效应。B-CLL细胞与CD32 (对照)、⑶40L_、LIGHT_、 ⑶40L/LIGHT-、GpD或BTLA转染的L-细胞共培养24小时，并用膜联蛋白V/PI染色分析。 用100%值作为使用HVEM mAb得到的细胞死亡水平与用HVEM配体转染的L-细胞杀死的 B-CLL细胞水平相比。用⑶40L-L细胞作为阴性对照。对于6个不同的病人，诱导的凋亡 相对计算为(转染的细胞诱导的凋亡百分数+HVEM mAb的凋亡百分数X 100) 士SEM。
< 0. 05。图4 :HVEM mAb诱导半胱天冬酶(caspase) -3、_8和-9的活化(A)用或者不用20uM pan-半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK在37 °C下预处理B-CLL 细胞30分钟，然后不处理或用抗HVEM mAb刺激。孵育24小时之后，收集细胞，透化处理并 且对活性半胱天冬酶-3染色。并行地，用膜联蛋白V/PI双重染色法分析细胞。数据代表 对于7个独立的实验观察到的活性半胱天冬酶-3阳性细胞平均百分数士SEM(左边)，和 死亡细胞平均百分数士SEM(右边)。、<0.05;、<0.01。(B)把来自两个不同病人的 B-CLL细胞不处理或用抗HVEM mAb刺激。孵育24小时之后，收集细胞，并制备溶胞产物。 对从上述样品制备的免疫印记膜B-CLL用探针检测分裂的半胱天冬酶_3或0 -肌动蛋白 (作为蛋白质上样对照)，指示于每一免疫印记的左边。把未刺激的或用抗Fas mAb CH11 处理的Jurkat细胞用作阳性对照。对于19和17kDa条带，刺激的条件对未刺激的条件的 比值分别为JA16(1. 35-++)，UPN10(0. 76-1. 57)和 UPN11 (1. 2-1. 73)。(C)把 B-CLL 细胞 不处理或用抗HVEM抗体刺激24小时。然后把细胞与特异性半胱天冬酶_8或-9荧光抑制 剂在指定时间点37°C孵育1小时，并且用流式细胞术分析。数据代表对于6个不同的病人 观察到的活性半胱天冬酶-8或_9阳性细胞平均百分数(在减去相当于未处理条件的背景 之后)士 SEM。图5 :HVEM mAb中断线粒体膜电位和增加Bax表达(A)用或者不用20 ii M pan-半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK在37°C下预处理B-CLL
18细胞30min，然后不处理或用抗HVEM mAb刺激。孵育24小时后，收集细胞，与50nM Di0C2(3) 在37°C下孵育30min，并且用流式细胞术分析线粒体膜电位损失(A Vm)。数据代表对于6 个不同的病人Di0C2(3)绿色荧光阳性细胞平均百分数士SEM，以对照条件中的％ Di0C2(3) 绿色荧光设为100%。*p<0. 05。阳性对照是去极化剂CCCP(4士 l%Di0C2(3)阳性细胞，数 据未显示)。⑶不处理或用抗HVEM mAb刺激B-CLL细胞。孵育24小时后，收集细胞，透化 处理并用抗Bax或抗Bcl-2单克隆抗体染色，并且用流式细胞术分析。对于6个不同的病人 观察到的结果以阳性细胞平均百分数(减去相当于同种型匹配的对照的背景之后)士SEM 表示于此。< 0. 05。图6 :HVEM细胞死亡增加FADD表达并部分依赖TRAIL途径(A)不处理或用抗HVEM mAb刺激来自两个不同病人的B-CLL细胞。孵育24小时 后，收集细胞，并且制备蛋白质溶胞产物。对于从上述样品制备的免疫印记膜用探针检测 FADD或肌动蛋白(作为蛋白质上样对照)，指示于每一免疫印记的左边。用TF1红白 血病细胞系作为阳性对照。对于27kDa条带，刺激的条件对未刺激的条件的比值对于UPmO 和UPmi分别为2. 39和5。(B)用FasL或TRAIL瞬时转染Cos细胞24小时，然后在HVEM mAb存在或不存在的情况下加入B-CLL细胞。然后收集细胞并用膜联蛋白V/PI染色用于流 式细胞术分析。对于3个不同的病人数据以((处理的凋亡百分数_未处理细胞的凋亡百分 数)+未处理细胞的凋亡百分数X 100)呈现。(C)在100ng/ml封闭抗TRAIL mAb RIK-2 存在或不存在的情况下不处理或用HVEM mAb刺激B-CLL细胞24小时。然后用膜联蛋白V/ PI双重染色法通过流式细胞术分析细胞。对于8个不同的病人数据代表死亡细胞平均百 分数士SEM，以在HVEM mAb条件下诱导的细胞死亡设为100%。然后在封闭条件下诱导的 细胞死亡相对计算为(在封闭条件下的凋亡百分数+HVEM mAb的凋亡百分数X 100)。
< 0. 01。图7 :HVEM mAb和LIGHT作用机理示意8 在不同细胞类型上HVEM表达的流式细胞术分析图9 正常B细胞对HVEM触发的细胞死亡的敏感性分析表表1 在用HVEM mAb刺激的CLL中上调的趋化因子、细胞因子和受体基因。在RNA提取前不刺激或用抗HVEM mAb刺激B-CLL细胞。如材料与方法部分描述的 用qRT-PCR计算RNA含量。当超过1. 5时RNA表达被认为是阳性的。在4个不同的B-CLL 样品上进行实验。在用HVEM mAb刺激的CLL中上调的趋化因子、细胞因子和受体基因
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总共分析了 180个细胞因子、趋化因子、受体和粘连基因，用肌动蛋白标准化 cDNA浓度。表2 :HVEM mAb克隆的特征概要针对若干方法鉴定了 14个mAb克隆。该列表表示在3个mAb克隆上产生的数据 亚组的概要。该表中的数据包括小鼠重链的Ig同种型、轻链类型、表示通过流式细胞术与 HVEM结合的50%饱和的EC50值、表位簇和mAb诱导CLL细胞凋亡的能力。该组mAb的表 位表示用HVEM突变体结合研究和用LIGHT、BTLA和HSV-gD竞争研究确定的5个中的3个。 表3 :B细胞淋巴样赘生物的WHO分类(Jaffe，E. S. et al. ,2004).前体B细胞赘生物前体B淋巴细胞性白血病/淋巴瘤成熟B细胞赘生物慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤变体具有类浆细胞分化或单克隆丙种球蛋白病B细胞前淋巴细胞性白血病淋巴浆细胞性淋巴瘤(Lymphoplasmacytic lymphoma)脾边缘区B细胞淋巴瘤(士绒毛状淋巴细胞)
毛细胞性白血病变体毛细胞变体浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤MALT型结外边缘区B细胞淋巴瘤结边缘区B细胞淋巴瘤(士单核细胞样B细胞)滤泡性淋巴瘤变体皮肤滤泡中心淋巴瘤(Cutaneous follicle center lymphoma)发散滤泡中心淋巴瘤(Diffuse follicle center lymphoma)外套细胞淋巴瘤变体母细胞样(blastoid)发散大 B 细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma)亚型纵隔大B细胞淋巴瘤血管内大B细胞淋巴瘤原发性渗出性淋巴瘤形态学变体成中心细胞的成免疫细胞的退行发育大B细胞富T细胞/组织细胞成浆细胞的淋巴瘤样肉芽肿型Burkitt氏淋巴瘤/Burkitt氏细胞白血病形态学变体典型的非典型的具有类浆细胞分化(AIDS伴随的)亚型(临床和遗传)地方性散在性免疫缺陷伴随的不确定恶性潜能的B细胞增殖淋巴瘤样肉芽肿(1、2和3级)移植后淋巴增生症表4 :T细胞和NK细胞淋巴样赘生物的WHO分类(Jaffe，E. S. etal.，2004).前体T细胞赘生物前体T成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病成熟的(外周的)T细胞和NK细胞赘生物
T细胞前淋巴细胞性白血病形态学变体小细胞，脑回状细胞T细胞粒状淋巴细胞性白血病侵袭性NK细胞白血病Blastic ‘NK 细胞，白血病成体T细胞白血病/淋巴瘤(HTLV-1+)临床变体急性的淋巴瘤的慢性的SmolderingHodgkin 样的结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型肠病型T细胞淋巴瘤肝脾性T细胞淋巴瘤皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤蕈样肉芽肿病/塞扎里综合症变体佩吉特样网状细胞增多症MF伴随的毛囊皮脂腺粘蛋白沉积症肉芽肿性皮肤松弛症原发性皮肤⑶30+T细胞淋巴增生性障碍变体淋巴瘤样丘疹病(A和B型)原发性皮肤退行发育大细胞淋巴瘤边缘损害(Borderline lesions)外周T细胞淋巴瘤，无其它特征形态学变体淋巴上皮样(Lermert氏)，T区血管免疫母细胞 T 细胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-celllymphoma)间变性大细胞淋巴瘤，(ALK+/ALK-)形态学变体淋巴细胞与组织细胞的，小细胞
实施例实施例1LIGHT和抗HVEM抗体通过与HVEM的相互作用诱导慢性淋巴细胞性白血病B细胞 凋亡和趋化因子释放摘要通过研究LIGHT在淋巴样恶性肿瘤的总转录谱中的效应，我们发现HVEM而不是 LT 3 R刺激诱导趋化因子基因(例如IL-8)的显著增加和出乎意料的凋亡基因上调。该凋亡转录谱与杀死效应有关，因为LIGHT或抗HVEM mAb直到为大家所知共刺激T和B细胞活 化，明显地诱导慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞死亡。该细胞死亡与半胱天冬酶_3、-8 和_9活化，线粒体膜电位下降和前凋亡蛋白质Bax上调有关。此外，HVEM刺激诱导死亡分 子TRAIL和Fas的上调，并且HVEM介导的凋亡机制似乎部分依赖TRAIL途径。HVEM刺激诱 导B-CLL细胞凋亡并通过白血病细胞直接生产趋化因子参与免疫效应器的补充。HVEM功能 主要依赖其一种配体LIGHT因为其它配体如gD HSV1和BTLA大体上是无效的。总之，这些 结果显示淋巴样恶性肿瘤中的新的、至今仍未知的LIGHT或抗HVEM抗体通过HVEM的杀伤 效应，其与趋化因子释放结合，代表癌症免疫治疗的另一种工具。材料和方法细胞本研究由法国马赛Paoli-Calmettes研究院的审查委员会批准。告知根据赫尔 辛基宣言的许可之后，从未处理的根据临床和免疫表型标准诊断为慢性淋巴细胞性白血病 (CLL)的病人获得外周血样。通过密度梯度离心(Lymphopr印)分离单核细胞并在包含10% 二甲亚砜(SIGMA)的胎牛血清(PAN Biotech)中能生存地冷冻。通过用分别编码人CD40L、LIGHT、GpD 或 BTLA 的 pcDNA3. 1 载体(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)电穿孑L 转染(960 u F, 220V, BIO RAD Gene Pulser and Capacitance extender) LTK鼠成纤维细胞获得稳定转染的细胞L-CD40L、L-LIGHT、 L-⑶40L/LIGHT、L-GpD和L-BTLA。通过三轮FACS分选选择由抗生素抗药性选择的稳定转 染细胞。使用藻红蛋白偶联的单克隆抗体(mAb) (R&DSystems)通过流式细胞术验证所关心 的分子的表达。CD32转染的成纤维细胞是来自Schering-Plough (Dardilly，France)的友 好的礼物。通过分别转染猴肾Cos细胞系产生瞬时转染的Cos-FasL细胞和Cos-TRAIL细 胞。B-CLL细胞与转染的L细胞或抗体共培养以10个B-CLL细胞1个转染子的比例把B-CLL细胞与50格雷辐射的用人类 LIGHT、⑶40L、GpD或BTLA转染的L-细胞共培养24小时。还在24孔板中用30 u g/ml抗 HVEM单克隆抗体(mAb)或10 y g/ml治疗性利妥昔单抗处理细胞24小时。在一些实验中， 把B-CLL细胞首先与20 y M pan-半胱天冬酶抑制剂N-苄氧羰基-Val-Ala-Asp荧光酮 (Z-VAD-FMK) (BD Biosciences)，或与封闭抗 TRAIL mAb RIK-2 (BD Biosciences)预孵育。 然后，收集细胞，检查成活力，并在使用前于新鲜培养基中重悬浮。细胞表面抗原的免疫荧光分析借助于FACSCanto 细胞计数器和 FACSDiva 软件(BectonDickinson，Mountain View, CA)通过流式细胞术进行B-CLL细胞的细胞表面分析。使用以下mAb于4°C免疫 染色B-CLL细胞30分钟异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗CD19 (Beckman Coulter)、 FITC偶联的抗HVEM(BD Biosciences)、藻红蛋白(PE)偶联的抗LT 0 R(R&D)、FITC偶联 的抗 Fas (CD95) (Beckman Coulter)、PE 偶联的抗 TRAIL (BD Biosciences)、PE 偶联的抗 FasL(Biolegend)、PE偶联的抗DIM或PE偶联的抗DR5 (R&D)。用FITC或PE标记的同种型 匹配的Ig作为阴性对照。在磷酸缓冲盐溶液(PBS)加上2% FCS中洗涤2次后，通过流式 细胞术分析细胞。膜联蛋白V/PI染色
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刺激之后，通过膜联蛋白V_Cy5 (BD Biosciences)和碘化丙锭(Propidium Iodide, PI)双重染色法(BD Biosciences)分析细胞死亡。膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸 特异性结合，其是在经受凋亡的细胞表面上暴露出的一种磷脂。使用PI的双重染色能够 鉴定还没有丧失膜完整性的早期凋亡细胞。简要地，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)1%FCS洗涤 5 X105细胞一次并于室温下暗处在具有5 yl膜联蛋白V-Cy5的lOOyl IX结合缓冲液 (BD Biosciences)中重悬浮lOmin。然后加入200 yl IX结合缓冲液和3. 5 yl PI，并且 于RT在暗处孵育细胞5min。然后在FACSCanto细胞计数器(Becton-Dickinson)上分析细 胞。使用FACSDiva软件(Becton-Dickinson)进行数据分析。以膜联蛋白V和PI双重阳 性细胞测定死亡细胞。通过流式细胞术确定半胱天冬酶、Bax和Bcl_2活性使用以下细胞渗透性荧光素化半胱天冬酶抑制剂在不同的时期测定半胱天冬酶8 和半胱天冬酶9的活性FAM-LETD-FMK (半胱天冬酶-8抑制剂)和FAM-LEHD-FMK (半胱天 冬酶_9抑制剂)(CaspGLOW试剂盒，Biovision)。于37°C在暗处染色细胞1小时，然后洗 涤，在0. 5mL缓冲液中重悬浮，并立即在FACSCanto细胞计数器(Becton-Dickinson)上通 过流式细胞术分析。为了检测活化的胞内半胱天冬酶-3、Bcl-2和Bax，使用cytofix/cytoperm缓冲 液(BD Biosciences)透化处理细胞，并使用PE偶联的抗活性半胱天冬酶3单克隆抗体(BD Biosciences)、抗 Bax 单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)或抗 Bcl2 单克隆抗 体(BDBiosciences)染色，然后通过流式细胞术分析。确定线粒体膜电位(A Vm)使用阳离子青色素染料Di0C2(3)测定线粒体膜电位的改变。刺激后，洗涤 B-CLL细胞，用lml PBS重悬浮，用5iU 10 u M Di0C2 (3)溶液补充，于37°C在暗处孵育 30min (Molecular Probes)。再次洗涤细胞，用500 yl PBS重悬浮并通过流式细胞术分析。 当细胞经受凋亡时Di0C2 (3)荧光减少。阳性对照是CCCP。细胞因子和趋化因子产生刺激24小时后收获上清液。使用细胞计数小珠阵列(CytometricBead Array, CBA)人类趋化因子试剂盒(BD Biosciences)测定细胞因子，如制造商描述的，其是允许在 相同的样品中定量检测若干细胞因子(IL-8/CXCL8、RANTES/CCL5、MIG/CXCL9、MCP-l/CCL2、 IP-10/CXCL10)的多路免疫测定。还遵循制造商描述的流程使用免疫酶测定定量IL-8，具 有3. 5pg/ml的灵敏度(R&D系统)。蛋白质印迹分析把来自CLL病人的B细胞(107细胞/样品)与或不与抗HVEMmAb孵育24小时。 为了制备细胞溶胞产物，于4°C通过250g离心10分钟收集细胞，在冰冷的磷酸缓冲盐溶液 (PBS)中洗涤一次，然后在 NP-40 裂解缓冲液(50mM HEPES (pH 7.4)、150mM NaCl、lOmMNaF、 lOmM碘乙酰胺、NP-40、lmM苯甲基磺酰氟、lii g/ml蛋白酶抑制剂cocktail)中冰上裂 解15分钟。于4°C 21000g离心lOmin清除溶胞产物中的不溶碎片，上清液存储于_20°C。 在变性条件下SDS-PAGE分离后，把蛋白质转移到用tris缓冲液(TBS)中的5%奶4°C封闭 过夜的硝酸纤维素膜上，然后用抗裂解的半胱天冬酶3(CellSignaling)或抗FADD(我们实 验室产生的)抗体染色。然后用辣根过氧化酶(HRP)偶联的抗小鼠或抗兔IgG，以及蛋白质印迹化学发光试剂(West Pico, Pierce)使条带显影。于60°C用包含2% SDS的缓冲液洗 提30分钟后在相同的印迹上确定肌动蛋白表达。扫描(Powerlook 1000, Umax)每个 条带并使用Phoretix ID Advanced软件(Nonlinear Dynamics)定量。然后把数据转换成 倍数改变比，其通过用肌动蛋白标准化的刺激条件值除以用肌动蛋白标准化的未 刺激细胞确定的值获得。定量RT-PCR在RNA分离之前，针对被HVEM mAb杀伤的能力选择全部细胞。使用Applied Biosystems 7900HT快速实时PCR系统进行QRT-PCR分析。简要地，刺激后一天使用标 准 TRIzol 试剂流程(Invitrogen LifeTechnologies)从 B-CLL 细胞分离总 RNA。使 用oligo(dT)15逆转录RNA。然后，使用下列两种支持物。在第一种方法中，在光学平板 (Microamp Fast Optical 96well, Applied Biosystems)上点滴各自编码粘附、迁移、细 胞因子或凋亡分子的87个基因靶。在各孔中以包含2XSYBR Green试剂、200nM引物和 0. 5 ill cDNA(相当于10ng总RNA)的20 yl反应中进行QRT-PCR。热循环条件为95°C 15s， 60°C 60s,40个循环。在第二种方法中，把各自编码免疫分子的97个基因靶点滴进TaqMan 低密度阵列(Immune Panel Microfluidic Card, Applied Biosystems)中。简要地，把 5ul cDNA(tB^TlOOng^RNA) % 100 u 1 2 X TaqMan universal Mix (Applied Biosystems) M 合并上样进一个样品阀口。热循环条件为97°C30s，59. 7°C60s，40个循环。在ABI Prism 7900HT扫描仪上记录荧光捕获，并使用序列检测系统软件2. 1 (Applied Biosystems)对各 测定计算Ct(阈循环)。使用肌动蛋白作为内源对照实施定量PCR测定的标准化。然 后把数据转换成倍数改变比，其由公式2-Ct描述，其中Ct = Ct目标-Ct内源对照，而Ct =Ct刺激条件-ct未刺激条件。统计分析通过无参数的Wilcoxon signed-rank test比较结果，以评估在HVEM mAb处理的 条件和未处理的条件之间的任何统计显著差异。当p < 0. 05时差异被认为是显著的。P值 标明于附图的图例中。结果造血恶性肿瘤上的HVEM和LT R表达为了研究LIGHT在造血恶性肿瘤中的作用，因此确定其两种受体HVEM和LT 0 R的 表达水平是重要的。我们实验室Costello RT等先前的结果显示HVEM在许多淋巴样恶性 肿瘤中，尤其是在B起源的白血病上表达，在测试的所有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和所 有外套细胞淋巴瘤(MCL)中具有高强度，并往往在急性淋巴母细胞性白血病(ALL)中观察 到。如图la所示，我们证实HVEM在测试的9个CLL和2个MCL中强烈表达，而在2个骨髓 起源的白血病(急性髓细胞性白血病，AML)中HVEM表达较弱。作为鲜明的对照，LT 3 R在 AML中表达，但是在MCL不存在而在CLL中稀少或低。如图lb所示，在测试的9个CLL中， HVEM以一致地高水平表达，而LT 0 R微弱地或没有表达。HVEM刺激诱导测试的322个基因中的12个趋化因子和凋亡基因过表达因此B-CLL是具有突出的HVEM表达和微弱或缺乏LT 0 R表达的研究模型。因此， 为了研究LIGHT在该淋巴样恶性肿瘤上的影响，我们在24小时期间用抗HVEM单克隆抗体 (HVEM mAb)刺激B-CLL细胞RNA制备之后，我们进行了编码趋化因子、趋化因子受体、细胞
25因子和在细胞的基本机制如粘附、迁移或凋亡中涉及的分子的322个基因表达的实时定量 PCR整体分析。如图2所示，测试的这322个基因中，我们的结果显示21个基因在所有测试 的CLL病人中均不表达，80个基因微弱地检测到，而221个基因以正确的转录物水平表达。 所有这些基因都没有用HVEM刺激修饰。实际上，测试的322个基因中，仅仅12个在HVEM刺 激之后显著地过表达，暗示在B-CLL细胞上LIGHT的集中的转录谱。HVEM刺激上调3个编 码趋化因子的基因的表达IL_8(白细胞介素-8)、IP10(IFN诱导蛋白10)和CCR4(趋化因 子(C-C基序)受体4)，各自对免疫效应器的补充都是关键的。使用Wilcoxon signed-rank test, HVEM刺激后这些基因的增加是统计上显著的(p值<0.01)。该原炎性谱不令人惊 讶因为HVEM-LIGHT信号已经在单核细胞性细胞系中与IL-8和TNF-a生产相关。为了完 整，我们还分析了该转录效应是否与蛋白质水平的趋化因子释放有关。我们通过细胞计数 小珠阵列或Elisa测定了刺激的B-CLL细胞中趋化因子的生产，并且我们显示HVEM诱导 了趋化因子IL-8在12个不同的病人中(p < 0. 001)从3到10倍，以及Rantes在9个病 人中(在活化上调节，正常T细胞表达和分泌)(p< 0.01)的较大的显著释放。没有观察 到IP10释放的显著增加。令人惊讶地，HVEM刺激后显著诱导的9个其它基因全部相应于 编码凋亡蛋白质的基因，他们中的大多数是原凋亡蛋白质Bcl-XS、Bid、FasL, p < 0. 01 ； BNIP3、CARD11、细胞色素C、p53，p < 0. 05 ；以及一些属于抗凋亡亚类的其它蛋白质BIRC4 和IEX-1，p < 0. 05。已经描述了 LIGHT在体外诱导腺癌的凋亡，但是这是由于其与LT 3 R 相互作用，并且该原凋亡效应需要IFN-Y的存在。LIGHT和抗HVEM mAb诱导B-CLL细胞死亡我们设法确定该凋亡转录谱是否与在体外功能相关连。首先，把B-CLL细胞与 CD32或LIGHT转染的L-细胞共培养24小时，然后通过膜联蛋白V/PI双重染色法测定凋 亡细胞百分数。凋亡细胞包括膜联蛋白V+/PI-(早期凋亡)和膜联蛋白V+/PI+(晚期凋亡 /坏死)群。我们发现在该典型实验中与CD32对照条件的8% (自发的细胞死亡)相比， 用LIGHT刺激有效地诱导41 %的B-CLL细胞细胞死亡。这些结果在15个B-CLL样品中再 现。然后，我们在24小时期间用HVEMmAb刺激白血病细胞。我们先前已经显示该抗体封闭 HVEM及其配体LIGHT之间的相互作用(数据未显示)。图3b显示LIGHT和抗HVEM mAb都 能够诱导CLL细胞死亡，与⑶32对照条件下的22 士 2 %相比分别具有42 士 3 %和52 士 3 %死 亡细胞，相当于统计上高度显著的(p< 0.001) 1.9和2. 4倍增加。因此，在CLL上由LIGHT 或HVEM触发引起的凋亡转录谱与体外死亡诱导功能有关。尽管描述了 LIGHT的原凋亡效 应在腺癌中由LT0R介导，在我们的研究中该效应应归于"共刺激"分子HVEM。HVEM的一 个作用进一步由另一个LT0R配体rhLT工2的无能推断，是诱导CLL细胞死亡。作为HVEM 介入的进一步确证的证据，不表达LT 0 R的B-CLL细胞(图la)仍然被抗HVEM mAb杀伤。 此外，另一种B细胞淋巴结病，MCL，其LT3 R表达也是阴性的，被LIGHT处理杀伤(数据未 显示)。要指出，LIGHT或抗HVEM mAb诱导的CLL细胞死亡不需要用IFN-Y启动细胞(数 据未显示)。相应于化疗、异源干细胞移植或用单克隆抗体的被动免疫治疗，用CLL对病人实 际处理的选择是相对有限的。比较了抗HVEM mAb和利妥昔单抗诱导CLL细胞死亡的效果 (图3b)。HVEM诱导的CLL细胞死亡与pan-B细胞治疗性mAb利妥昔单抗相比是有利的，分 别具有52士3%和46. 2士6%的死亡细胞。
此外，近年鉴定了若干HVEM配体LIGHT，以及gpD和BTLA。我们把不同HVEM配体 的效应与HVEM mAb的效力相比较，在24小时期间B-CLL细胞与CD32、LIGHT、GpD或BTLA 转染的L-细胞共培养，然后用膜联蛋白V/PI双重染色法测定凋亡细胞百分数。用CD40L 转染的L-细胞作为"无配体"阴性对照。把HVEM mAb细胞死亡设为100%。如图3c所 示，与HVEM mAb相比，L-LIGHT细胞具有更显著接近的效应(70士 15%，p < 0. 05)，L-GpD 细胞具有弱的效应(41 士 6%of HVEM mAb，p<0. 05)，而L-BTLA细胞相比HVEMmAb没有显 著的效应(32士 10% )。用作阴性对照的L-⑶40L在B-CLL细胞死亡上没有效应(HVEM mAb 的24士9% )。我们还测试了 L-⑶40L/LIGHT因为我们先前已经显示这两种分子对于B淋 巴细胞增殖协同作用。这里，L-⑶40L/LIGHT细胞不影响B-CLL细胞的L-LIGHT杀伤，因此 ⑶40L和LIGHT在细胞死亡上似乎没有协同作用。HVEM介导的凋亡涉及半胱天冬酶_3、_8和_9活化已经描述了由TNFR家族成员(例如Fas、TNFRl以及TRAIL受体DR4和DR5)诱导 的凋亡依赖胞质内的死亡结构域的存在。然而在HVEM中不存在死亡结构域。为了确定HVEM 介导的凋亡机制，我们首先分析了半胱天冬酶活化。通过胞质内染色，我们在图4a中显示 用抗HVEM mAb刺激B-CLL细胞产生统计上显著的半胱天冬酶-3活化(HVEM mAb条件的 16. 5士2%对对照条件的5. 2士 l%，p < 0. 01)。该观察结果被蛋白质印迹法分析证实，具有 19和17kDa活化形式的增加(图4b)。图4a还显示HVEM mAb诱导的半胱天冬酶_3活化被 pan-半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK预处理完全撤销(4士 1 %阳性细胞，左侧画面)。相反， 用Z-VAD-FMK预处理仅仅部分封闭HVEM刺激后观察到的膜联蛋白V/PI染色(分别38 士 4 % 和45士5%细胞死亡，右侧画面)。此外，我们用流式细胞术(图3c)分析了效应器半胱天 冬酶8和9的活化。半胱天冬酶_8和半胱天冬酶-9都响应抗HVEM mAb的CLL细胞处理 而被活化。有趣地，半胱天冬酶_8和半胱天冬酶-9以相似的动力学被活化，对于半胱天冬 酶-8 为 0士 1. 5% (t = 3h)、5. 4士2. 5% (t = 6h)、16士3. 2% (t = 12h)、24. 8士3. 1 (t = 24h)，而对于半胱天冬酶-9 为 0. 88士2. 1% (t = 3h)、4. 7士2. 6% (t = 6h)、18. 4士4. 1% (t = 12h)、31. 4 士 5. 1 (t = 24h)。HVEM介导的凋亡中断线粒体膜电位(A Vm)并增加Bax表达线粒体膜去极化是凋亡机制“内在”途径的一部分。图5a显示用抗HVEM mAb处 理B-CLL细胞产生线粒体膜电位损失，通过Di0C2(3)绿色荧光的显著减少评价(在活化的 细胞中为70士8%，静止细胞设为100%，p < 0. 05)有趣地，HVEM介导的线粒体去极化不 被pan-半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK抑制(71 士5% Di0C2 (3)阳性细胞)，暗示该步骤不 依赖半胱天冬酶活化。Bax和Bcl_2之间的平衡对于线粒体活性的维持是重要的。Bax原凋亡效应被 Bcl-2的抗凋亡功能反作用。使用流式细胞术分析，我们显示在静止状态，Bcl-2在B-CLL 细胞中如先前的研究描述的那样高度表达。HVEM刺激不改变Bcl-2表达，但是相反，诱导 Bax细胞溶质水平的统计学上显著的增加(图5b)(在活化条件下39士4%阳性细胞对静止 条件下22士2% )。该增加可能与上述线粒体膜去极化相关。HVEM细胞死亡增加FADD表达并部分依赖TRAIL途径因为HVEM缺乏死亡结构域，在HVEM介导的细胞死亡中涉及的途径是不清楚的。基 于已知的凋亡机制，我们分析了 FADD的表达，其是在Fas和TNFR介导的细胞死亡中涉及的主要衔接分子。有趣地，用抗HVEM mAb处理B-CLL细胞引起通过蛋白质印迹法分析的FADD 表达的较大增加(图6)。对于出现的两个病人该刺激引起27kDa条带重要的倍增诱导(对 于upmo为2. 39而对于UPmi为5)。然后我们检查了 HVEM连接反应诱导的细胞死亡是否可以通过其它TNF受体或配 体活化迂回。我们分析了在HVEM刺激前后B-CLL细胞的死亡受体及其配体(Fas和FasL， DR4-DR5和TRAIL)的表达(图6b)。在刺激之前各样品(n = 5)上的各分子的表达水平可 以忽略。HVEM刺激后DR4、DR5和FasL的表达不改变。相反，HVEM连接反应诱导TRAIL表 达的显著增加(P<0. 05)，处理后预处理平均MFI值179 士 58至375 士81 ；而没有Fas的显 著增加，预处理平均MFI70士22至104士24。要指出，在我们通过QRT-PCR测试的322个基 因中TRAIL mRNA出现并且尽管TRAIL基因在CLL中表达，它在HVEM刺激之后不被修饰，暗 示转录后的修饰。为了论述HVEM细胞死亡是否可能受FasL或TRAIL的影响，我们从表达FasL、 TRAIL或FasL和TRAIL两者的Cos细胞生成了人造细胞毒素效应细胞。通过流式细胞术 验证瞬时转染之后FasL和TRAIL两者的表达(数据未显示)。此外，检查转染的效应细胞 诱导表达Fas和DR5两者的Jurkat T细胞凋亡的能力。我们把每种Cos效应细胞群在存 在或没有HVEM mAb的情况下与B-CLL细胞共培养24小时。我们发现在24小时的共培养 中，与对照条件相比，Cos-FasL、Cos-TRAIL、Cos-FasL/TRAIL 分别诱导 47 士 10 %、25 士 7 %、 45士 17%的B-CLL细胞凋亡。HVEM mAb与Cos-FasL效应细胞联合诱导的B-CLL细胞杀伤 似乎比单独用HVEM mAb观察到的高(分别为80士20%和55士5% )。相反，加入HVEM mAb 的Cos-TRAIL效应细胞不比单独的HVEM mAb诱导更多的凋亡(分别是53士 16%与55士5% 相比)。这些数据暗示HVEM和FasL通过可能协同增强的不同途径诱导B-CLL细胞杀伤，尽 管HVEM和TRAIL途径可能涉及共有的介质。此外，我们检查了在HVEM诱导的细胞死亡上封闭抗TRAILmAb的效应。把B-CLL 细胞与该封闭mAb预孵育或不进行预孵育，然后在24小时中用HVEM mAb处理并评估膜联 蛋白V/PI染色。我们发现CLL的HVEM杀伤被抗TRAIL mAb显著地封闭，对测试的7个病 人是部分地而对1个病人是完全地(在封闭条件下52士9%的死亡细胞对在HVEM mAb条件 下100% ；p < 0.01),暗示HVEM细胞死亡途径可能至少部分地涉及TRAIL活化。讨论在本研究中我们强调HVEM和LIGHT在抗肿瘤反应上的新作用。在本研究中我们研 究了 LIGHT在造血恶性肿瘤中的效应并且考虑到我们在B淋巴细胞生理学中LIGHT的重要 性上先前的结果，我们决定集中于B-CLL。LIGHT受体的表面表达分析显示在B-CLL细胞中 HVEM以高水平表达。作为鲜明的对照，LT0R表达是微弱的或稀少的；结果我们可以把CLL 作为具有突出的HVEM表达的模型。因此，为了研究LIGHT在该淋巴样恶性肿瘤中的影响，我 们用抗HVEMmAb处理B-CLL细胞并且我们进行了大组编码趋化因子、细胞因子和在粘附、迁 移或凋亡中涉及的关键分子的基因的QRT-PCR整体表达分析。在测试的322个基因中，仅仅 12个在HVEM刺激之后显著地过表达，暗示在B-CLL细胞上HVEM的集中的转录谱。HVEM连接 反应上调3个编码趋化因子的基因的表达IL-8 (白细胞介素-8)、IP10 (IFN诱导蛋白10) 和CCR4(趋化因子(C-C基序)受体4)，各自对免疫效应器的补充都是关键的。IL-8是炎性 反应的一种主要介质，它起化学引诱物的作用，而且也是有效的生血管(aniwenic)因子；IPlO与单核细胞(monocytes)和T细胞(T cell)的化学引诱,T细胞(T cell)的促进与 内皮细胞(endothelial)的粘附以及抗癌活性有牵连；而CCR4是在二级淋巴器官中产生的 TARC (胸腺和活化调节趋化因子)和MDC (巨噬细胞衍生的趋化因子)受体。我们通过测定 响应HVEM的趋化因子产生完成了这些结果，并且我们证实HVEM诱导IL-8和Rantes (对T 细胞(T cell)、嗜酸件粒细胞(eosinophils)和嗜碱件粒细胞(basophils)趋化性的，并且 在补充白细胞(leukocytes)讲入炎件位点中扮演积极作用)两者的显著释放。IL_8的产牛 似乎是HVEM反应中的关键元件，因为它在若干细胞系中描述，包括单核细胞、嗜中性粒细 胞和这里在白血病细胞中。在分析对HVEM刺激的这个大的转录反应之前，考虑到LIGHT及 其受体HVEM在共刺激反应中确定的功能，我们可以预期与免疫活化相关基因的上调。但是 令人惊讶地，HVEM刺激后显著诱导的9个其它基因都相应于编码凋亡蛋白质的基因，他们 中的大多数是原凋亡蛋白质Bcl-XS、Bid、BNIP3，Bcl-2家族的所有成员，以及FasL、CARD 11、细胞色素c、p53 ；以及属于抗凋亡亚类的一些其它蛋白质BIRC4和IEX-1。这个清楚的 凋亡转录谱是出乎意外的因为HVEM至今仍被描述为共刺激受体而LIGHT的原凋亡效应已 知仅仅由LT β R介导。为了论述该凋亡转录谱是否与体外功能性效应相关连，我们用LIGHT转染的细胞 或用HVEM mAb培养B-CLL细胞，两者都有效地增加膜联蛋白V+细胞。此外，在实验室中的 其它观察结果证实B-CLL细胞上的LIGHT原凋亡效应通过其与HVEM的相互作用介导，通过 以下证据证明1)另一个！ 2对诱导CLL细胞死亡无能，2)不表达LT β R 的B-CLL细胞仍然被抗HVEM mAb杀伤，以及3)另一种B细胞淋巴结病，外套细胞淋巴瘤， 其对LTiiR表达也是阴性的，被LIGHT处理杀伤(数据未显示)。从来没有描述过淋巴样恶 性肿瘤上的这种HVEM直接杀伤效应。HVEM属于TNFR分子(例如CD40和CD30)亚类，其不包含死亡结构域(DD)并且 主要在细胞存活和共刺激反应中涉及。实际上，与凋亡有牵连的大部分TNFR家族成员，例 如Fas、DR4、DR5，通过它们胞质内的DD诱导半胱天冬酶信号。然而，现在似乎清楚了不包 含死亡结构域的TNFR成员也可以诱导细胞死亡。例如，CD27诱导伯基特氏淋巴瘤细胞系 的凋亡，CD30与胸腺负选择的细胞死亡信号有关，CD40连接反应引起间充质细胞和上皮起 源的转化细胞中的凋亡性细胞死亡，而LIGHT在一些腺癌中通过与LT β R相互作用诱导细 胞死亡。我们的结果包括该亚类中的HVEM。不过，缺少死亡结构域使了解与HVEM有牵连的 途径复杂化。然后我们进行了不同的分析以鉴定在CLL中通过HVEM诱导的死亡机制。已经鉴定了两种主要的凋亡途径内在和外在途径，其可以通过前者中对线粒体 的显著作用以及后者途径中死亡受体和半胱天冬酶-8的活化来鉴别。我们发现HVEM刺激 诱导半胱天冬酶_3、-8和-9的活化。B-CLL细胞与pan-半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK的 预孵育完全撤销了半胱天冬酶_3活化，而不是细胞死亡，暗示牵涉独立于半胱天冬酶的机 制。此外，HVEM刺激减少线粒体膜电位并诱导原凋亡Bax蛋白质表达的上调。相反，抗凋亡 Bcl-2蛋白质未改变。线粒体活性已经被证明是被这些Bcl-2家族成员之间的平衡严格控 制的。此外，膜电位的损失不被pan-半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK封闭，暗示该步骤不依 赖半胱天冬酶活化。Bax的上调可能与观察到的线粒体电位损失有关并且这些结果共同暗 示内在凋亡途径的牵连。因此HVEM介导的凋亡显然包含在死亡受体途径(半胱天冬酶-8 活化)和线粒体途径(线粒体膜电位减少和Bax上调)两者中。此外，因为半胱天冬酶-8
29和半胱天冬酶_9在大约相同的时间活化，在经HVEM刺激的B-CLL细胞中死亡受体途径和 线粒体途径也许是并行的途径。总而言之，这些数据暗示HVEM诱导的细胞死亡一方面涉及 一种凋亡机制中半胱天冬酶的活化；和另一方面一种独立于半胱天冬酶的途径。LIGHT的两种受体显然通过不同的机制诱导细胞死亡。当与LIGHT结合时，LT β R 补充若干TNFR相关因子(TRAF)，其是触发多重信号级联放大的偶联适配器。进一步的研究 已经表明TRAF3偶联主要在调节LT β R诱导的细胞死亡中涉及；而TRAF2和TRAF5缔合在 NF-B的活化中起重要作用。通过LT β R的原凋亡特征不同于我们在HVEM上的观察结果，因 为LT β R细胞死亡不在ΗΤ29结肠癌细胞中引起半胱天冬酶活化。此外，甚至在MDA-MB-231 乳腺癌细胞上观察到广泛的半胱天冬酶活化，LIGHT介导的凋亡似乎是半胱天冬酶独立的。 在两种情况下都观察到减少的线粒体膜电位。LIGHT诱导的肿瘤细胞死亡需要被IFNy致 敏，其在我们在B-CLL细胞上进行的实验中不是必须的，因此暗示对于两种受体的原凋亡 途径有不同的机制。值得注意的，HVEM诱导的CLL细胞死亡与pan-B细胞治疗性mAb利妥昔单抗相比 较是有利的。因此HVEM可能增强治疗剂，例如氟达拉滨的效力，如同它被证明对于利妥昔 单抗和阿仑单抗那样。其它研究发现用CD40L预活化可能使B-CLL细胞对FasL和TRAIL介导的凋亡敏 感。此外，对于树突细胞成熟、B淋巴细胞表面的LIGHT蛋白质诱导或B细胞增殖已经观察 到⑶40L和LIGHT之间的协作。这些数据提示我们分析⑶40L是否可能增加或封闭HVEM 介导的细胞死亡，但是我们没能检测到CD40L预活化的任何效应(数据未显示)。有趣地， 这些观察结果暗示活化的B-CLL存在于二级淋巴器官，其是活化的细胞，也可以被HVEM处 理杀伤。这里，我们的数据显示LIGHT或抗HVEM抗体可以直接通过HVEM诱导B淋巴样恶性 肿瘤的细胞死亡，部分通过凋亡途径而部分通过坏死机制。这影响半胱天冬酶活化、线粒体 膜电位和原凋亡蛋白质上调。我们的结果强烈暗示TRAIL介入HVEM诱导的细胞死亡。在 HVEM新鉴定的作用之外，LIGHT也通过HVEM诱导白血病细胞直接释放趋化因子。这后面的 事件将被期望在先天(NK细胞、单核细胞)和适应性(T细胞)免疫系统的细胞补充中扮演 关键角色，其随后可以被期望在B-CLL细胞上发挥另外的控制(cf.图7)。LIGHT-HVEi^f 号代表癌症治疗的新治疗靶。可溶的LIGHT或抗HVEM mAb呈现把表达HVEM的恶性淋巴细 胞通过例如凋亡诱导机制的直接杀伤与免疫效应细胞通过趋化因子产生的补充相结合的 吸引人的优点。实施例2抗HVEM mAb克隆的鉴定mAbs 通过IP注射人类HVEM-Ig融合蛋白免疫BALB/c小鼠，最后一次注射后根据标准 程序把脾细胞与X63Ag8骨髓瘤细胞融合。通过人类HVEM细胞系的细胞表面染色筛选杂交 瘤上清液。针对若干方法鉴定了 14个mAb克隆，包括i)小鼠免疫球蛋白重和轻链类型的分 型，ii)流式细胞术分析结合细胞表面HVEM并测定平均荧光强度(MFI)值、最大结合饱和度 和50%结合饱和度(EC50值)，iii)使用LIGHT、BTLA和HSV-gD的竞争封闭研究，iv)通
30过把mAb结合至一组HVEM突变体的诱变分析，和ν) mAb诱导CLL细胞凋亡的能力。基于竞 争性封闭和诱变实验的标准，鉴定了 6个表位簇为表位I、II、III、IV、V和VI。表2中显示 的数据是3种mAb的概要亚组。实施例3HVEM在造血恶性肿瘤中的表达流式细胞术分析显示HVEM如确定的在B细胞淋巴样赘生物(参见图8)和T细胞 淋巴样赘生物、非Hodgkin淋巴瘤(NHL)、B-NHL、T_NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋 巴细胞性淋巴瘤(SLL)、外套细胞淋巴瘤(MCL)、NK细胞淋巴样赘生物和骨髓细胞谱系赘生 物(数据未显示)上表达。冷冻不同的白血病骨髓瘤和骨髓瘤样本并用流式细胞术测试HVEM的细胞表面表 达。数据表示为与阴性对照相比的倍数平均荧光强度。CLL相应于慢性B细胞白血病，ALL 相应于急性淋巴细胞性白血病，MM相应于多发性骨髓瘤细胞，MCL相应于外套细胞淋巴瘤， FL相应于滤泡性淋巴瘤而发散LBCL相应于发散大B细胞淋巴瘤。实施例4 HVEM触发诱导B细胞死亡HVEM信号与多种B细胞血液恶性肿瘤的细胞死亡相联系(cf.实施例3)。我们测 试了 HVEM刺激是否也可以诱导正常B细胞死亡。在聚蔗糖-泛景i钠(Ficoll-Hypaque)梯度(Amersham Biosciences, Saclay, France)上分离来自健康供体的PBMC。遵循制造商的推荐使用MACS⑶19小珠分离试剂盒 (Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)把 B 淋巴细胞分离为 CD19+PBMC 群。通 过流式细胞术分析检查制剂纯度，在所有实验中都> 98% (数据未显示)。用30 μ g/ml 抗 HVEM 单克隆抗体(mAb) (SmithKline Beecham)处理 B 淋巴细胞 24小时或不处理。然后，收集细胞并且通过膜联蛋白V_Cy5 (BD Biosciences)和碘化丙锭 (PI)双重染色法(BDBiosciences)分析细胞死亡。简要地，用磷酸缓冲盐溶液(PBS) 1 % FCS洗涤5 X IO5细胞一次并且室温下于暗处在具有5 μ 1膜联蛋白V-Cy5的100 μ 11 X结 合缓冲液(BD Biosciences)中重悬浮10分钟。然后加入200 μ IlX结合缓冲液和3. 5 μ 1 PI，于RT在暗处孵育细胞5min。然后在FACSCanto细胞计数器(Becton Dickinson)上分 析细胞。使用FACS Diva软件(Becton Dickinson)进行数据分析。以膜联蛋白V和PI双 重阳性细胞测定死亡细胞。如图9所示，正常B细胞对HVEM触发敏感，其引起正常B细胞死亡。这个观察结果是有趣的因为现在B细胞已知为自身免疫疾病(AID)治疗的重 要靶，以⑶20mAb在例如类风湿性关节炎的疾病中证明的治疗应用证明。有趣地，尽管 ⑶20mAb是B细胞死亡的弱诱导物，它们仍然已经有效地用于治疗自身免疫疾病。因此，我 们已经在正常B细胞中鉴定的HVEM性质使HVEM成为治疗AID用途的吸引人的靶。因此， 选自LIGHT或在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡的LIGHT片段、抗HVEM抗体及其 与HVEM结合的片段的HVEM配体可以用于治疗自身免疫疾病。参考文献Throughout this application,various references describe the state ofthe art to which this invention pertains. 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<120>治疗血液恶性肿瘤和自身免疫疾病的HVEM配体
<130>BCT080098 QT
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1 <211>25 <212>PRT <213>Artificial
<220>
<223>epitope
<400>1 Cys Pro Lys 1
Leu Thr Gly
Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu
51015
Thr Val Cys Glu Pro Cys 202权利要求
一种用于治疗用途的HVEM配体，其特征在于，所述HVEM配体选自LIGHT或作为抗HVEM抗体的LIGHT片断组成的组，其中，所述片断在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡，且所述LIGHT的片段与HVEM结合。
2.根据权利要求l所述的HVEM配体，其用于治疗血液恶性肿瘤。
3.根据权利要求l所述的HVEM配体，其用于治疗自身免疫性疾病。
4.HVEM配体用于制备治疗血液恶性肿瘤或自身免疫性疾病的药剂，其特征在于，所述HVEM配体选自L工GHT、作为抗HVEM抗体的L工GHT片段组成的组，其中，所述片断在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡，且所述L工GHT片断与HVEM结合。
5.根据权利要求2所述的HVEM配体或根据权利要求4所述的用途，其特征在于，血液恶性肿瘤选自B细胞淋巴样赘生物、T细胞淋巴样赘生物、非H。dgkin淋巴瘤(NHL)、B—NHL、T—NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、外套细胞淋巴瘤(MCL)、NK细胞淋巴样赘生物和骨髓样细胞谱系赘生物组成的组。
6.根据权利要求l、2、3和5中任一项所述的HVEM配体或权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述HVEM配体是L工GHT或其片断，其中，所述片断在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡。
7.根据权利要求6的HVEM配体或用途，其特征在于，所述HVEM配体是可溶形式的L工GHT。
8.根据权利要求l、2、3和5中任一项所述的HVEM配体或根据权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述HVEM配体是抗HVEM抗体或与HVEM结合的片段。
9.根据权利要求8所述的HVEM配体或用途，其特征在于，所述抗HVEM抗体或所述L工GHT的片段通过凋亡诱导、抗体依赖的细胞的细胞毒性、补体介导的细胞毒性和／或经由细胞因子和／或趋化因子产生的免疫效应器细胞的激活来诱导表达HVEM的恶性淋巴细胞死亡和／或消除。
10.根据权利要求8所述的HVEM配体或用途，其特征在于，所述抗HVEM抗体或所述L工GHT的片段在恶性淋巴细胞中诱导凋亡。
11.根据权利要求lo所述的HVEM配体或用途，其特征在于，所述恶性淋巴细胞是慢性淋巴细胞性白血病B细胞。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的HVEM配体或用途，其特征在于，所述HVEM抗体是识别选自组工、II、II工、IV、V或V工的表位的抗体。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的HVEM配体或用途，其特征在于，所述HVEM抗体是单克隆抗体。
14.根据权利要求13所述HVEM配体或用途，其特征在于，所述单克隆抗体获得自保藏在C。LLECT工。N NAT工。NALE DE CULTURES DEM工CR。。RGAN工SMES(CNCM)、选臼CNCM 工一3752、CNCM I一3753和CNCMI一3754组成的组的杂交瘤。
15.一种适于获得抗HVEM单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述抗HVEM单克隆抗体通过凋亡诱导、抗体依赖的细胞的细胞毒性、补体介导的细胞毒性和／或经由细胞因子和／或趋化因子产生的免疫效应器细胞激活来诱导表达HVEM的恶性淋巴细胞死亡和／或消除。
16.一种适于获得抗HVEM单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述抗HVEM单克隆抗体诱导表达HVEM的恶性淋巴细胞凋亡。
17.—种适于获得抗HVEM单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述抗HVEM单克隆抗体在慢性 淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述抗HVEM单 克隆抗体识别选自组I、II、III、IV、V或VI的表位。
19.一种选自CNCM 1-3752、CNCM 1-3753和CNCM 1-3754组成的组的杂交瘤细胞系。
20.一种抗HVEM抗体或与HVEM结合的LIGHT的片段，其特征在于，所述抗体或所述 LIGHT的片段通过凋亡诱导、抗体依赖的细胞的细胞毒性、补体介导的细胞毒性和/或经由 细胞因子和/或趋化因子产生的免疫效应器细胞的激活来诱导表达HVEM的恶性淋巴细胞 死亡和/或消除。
21.一种抗HVEM抗体或与HVEM结合的LIGHT的片段，其特征在于，所述抗体或所述 LIGHT的片段在恶性淋巴细胞中诱导凋亡。
22.—种抗HVEM抗体或与HVEM结合的LIGHT的片段，其特征在于，所述抗体或所述 LIGHT的片段在慢性淋巴细胞性白血病B细胞中诱导凋亡。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的抗HVEM抗体或所述LIGHT的片段，其特征 在于，所述抗体识别选自组I、II、III、IV、V或VI的表位。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的抗HVEM抗体，其特征在于，所述抗体是单克 隆抗体。
25.一种单克隆抗体，其可从保藏在COLLECTION NAT IONALE DECULTURES DE MICR00RGANISMES (CNCM)、选自 CNCM 1-3752,CNCM 1-3753 和 CNCM 1-3754 组成的组的杂交瘤获得。
全文摘要
本发明涉及治疗血液恶性肿瘤，尤其是慢性淋巴细胞性白血病，以及治疗自身免疫性疾病的HVEM配体。
文档编号A61P35/02GK101896198SQ200880101907
公开日2010年11月24日 申请日期2008年6月2日 优先权日2007年6月1日
发明者丹尼尔·奥丽芙, 克里斯廷·帕撒洛, 阿莱姆塞吉德·特恩 申请人:法国国家健康和医学研究院;马赛第二大学(地中海岸大学)