肿瘤细胞所导致的免疫抑制的解除剂及使用该解除剂的抗肿瘤剂的制作方法

专利名称：肿瘤细胞所导致的免疫抑制的解除剂及使用该解除剂的抗肿瘤剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤细胞所导致的免疫抑制的解除剂及使用该解除剂的抗肿瘤剂。
背景技术：
已知调节T细胞在病理学上和生理学上都能抑制免疫反应，参与自身耐受和免疫 自稳的维持(参照非专利文献1)。例如，最初为⑶4+⑶25-的细胞受到各种因子的刺激而活化，其结果是⑶4+⑶25+ 调节T细胞在外周血的⑶4+T细胞中占到约5-10%。该⑶4+⑶25+调节T细胞在⑶4+T 细胞分化的同时表达FoxP3蛋白(参照非专利文献2、3)。该过程中，细胞间相互作用及 TGF-β (本说明书中也记作TGF-b)和IL-10这样的体液因子有着重要的作用(参照非专利 文献4)。该FoxP3蛋白不仅在⑶4+⑶25+T细胞中可见表达，在⑶8+⑶25+T细胞中也可见 表达，因此被认为是调节T细胞活化的特异性标记物(参照非专利文献5)。另外，如果在 幼稚T细胞中强制表达FoxP3，则显示出调节T细胞样表型，这就表示FoxP3对于调节T细 胞的功能发挥具有重要的作用(参照非专利文献6)。由此可以认为，FoxP3基因是对调节 T细胞的分化和功能进行控制的主基因(参照非专利文献1)。作为这些调节T细胞的功能，已知例外地通过抑制其它细胞的功能(参照非专利 文献7)来抑制免疫反应这一功能(参照非专利文献1)。其机制不明，但提示了该功能依赖 于细胞间相互作用，且有CTLA-4的参与(参照非专利文献8)。尤其是显示CTLA-4也参与 调节T细胞的分化(参照非专利文献8)。另一方面，已知虽然在癌症患者的体内存在有攻击癌以将其排除的宿主免疫，但 在癌细胞一边也具有逃避宿主免疫的监视的系统，例如，在体外和体内揭示了如果在癌细 胞的存在下除去调节T细胞，则针对癌细胞的免疫反应会变化(参照非专利文献17)。此 夕卜，由于在胃癌(参照非专利文献9、10)、直肠癌(参照非专利文献11)、胰腺癌(参照非专 利文献12、13)、肺癌(参照非专利文献14)、神经胶质瘤(参照非专利文献17)中调节T细 胞增加，因此可以认为调节T细胞参与了癌细胞的免疫逃避系统。但是其机制不明，对于来 源于调节T细胞的细胞因子作出了何种贡献尚存在争议(参照非专利文献17)。而且，由于调节T细胞的缺陷会引发严重的自身免疫疾病(参照非专利文献15)， 因此可以认为自身免疫和癌症免疫存在共通的机制(参照非专利文献16)。由此可知，调节 T细胞通过免疫反应的抑制，不仅参与针对癌细胞的免疫抑制，还参与自身免疫或变态反应 之类的过度免疫反应(参照非专利文献1)。非专利文献1 :Miyara 禾口 Sakaguchi Trends Mol. Med. 13，108-116，2007非专利文献2 =Fontenot 等 Nat. Immunol. 4，330-336，2003非专利文献3 :Fontenot 等 Immunity 22，329-341，2005非专利文献4 :Zheng 等 J. Immunol. 172，5213-5221，2004
非专利文献5 :Bisikirska 等 J. Clin. Invest. 115，2904-2913，2005非专利文献6 :Hori 等 Science 299，1057-1061，2003非专利文献7 Jiang 和 Chess J. Clin. Invest. 114，1198-1208，2004非专利文献8 =Atabani 等 Eur. J. Immunol. 35，2157-2162，2005非专利文献9 :Ichihara 等 Clin. Cancer Res. 9，4404-4408，2003非专利文献10 :Wolf 等 Clin. Cancer Res. 9，606-612，2003非专利文献11 =Hicky 等 Semin. Immunol. 11，125-137，1999非专利文献12 =Liyanage 等 J. Immunol. 169，2756-2761，2002非专利文献13 =Sasada 等 Cancer 98,1098-1099, 2003非专利文献14 =Woo 等 Cancer Res. 61，4766-4772，2001非专利文献15 =Sakaguchi 等 Immunol. Rev. 182，18-32，2001非专利文献16 =Turk 等 Immunol. Rev. 188，122-135，2002非专利文献 17 =Andaloussi 和 Lesniak Neuro-Oncology 8，234—243，2006发明的揭示通过在分子水平上阐明调节T细胞所导致的免疫抑制的作用机理，将其作为有调 节T细胞参与的疾病的治疗靶点，可以期待开发出针对有调节T细胞参与的疾病的有效的 治疗方法。于是，本发明的目的在于提供增强细胞中的FoxP3基因表达的基因表达增强剂、 将细胞向调节T细胞分化诱导的细胞分化诱导剂、由它们的作用来抑制免疫的免疫抑制剂 和过度免疫疾病治疗剂、拮抗细胞中的FoxP3基因的表达增强的基因表达增强拮抗剂、拮 抗细胞向调节T细胞的分化诱导的细胞分化诱导拮抗剂、由它们的作用来解除免疫抑制的 免疫抑制解除剂、肿瘤免疫激活剂及抗肿瘤剂等。已知锌指转录因子Snail是癌症的恶性化因子，Snail的表达越高，癌症就越是恶 性化(Nature Rev Cancer 7，415-428，2007)。认为其原因之一是因为=Snail通过抑制E-钙粘着蛋白等细胞间粘附分子 的表达，从而对个体发育中的原肠胚内陷或者组织及器官的发育过程、失去正常组织 或细胞时的修复过程、癌细胞转移的转移过程等发生时的上皮-间充质转换(EMT : Epithelial-mesenchymal transition) ii^f^fj^J (Nature Rev Cancer 7，415—428，2007)。于是，本发明人认真努力地尝试在培养细胞中强制表达Snail，阐明Snail导致癌症恶性化的机理，结果发现，在癌细胞中，Snail蛋白增强MCPl (单核细胞趋化 蛋白-1, monocyte chemoattractant protein-l)基因、TSPl (血小板反应蛋白-1, thrombospondin-1)基因、FSTLl (促滤泡素抑制素样因子1，Follistatin-like 1)基因或 IL-13Ra2(白细胞介素 13 受体 α 2，interleukin 13 alpha 2 receptor)基因的表达，对 于⑶4+T细胞和⑶8+T细胞，它们的基因产物增强调节T细胞的活化标记物FoxP3的表达， 从而完成了本发明。由此，本发明的实施方式如下所述。(1) 一种基因表达增强剂，该基因表达增强剂增强细胞中的FoxP3基因的表达，其特征在于，激活所述细胞的MCPl信号。(2) 一种基因表达增强剂，该基因表达增强剂增强细胞中的FoxP3基因的表达，其特征在于，含有表达Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的细胞。(3) 一种基因表达增强剂，该基因表达增强剂增强细胞中的FoxP3基因的表达，其 特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。(4) (3)所述的基因表达增强剂，其特征在于，含有表达Snail蛋白的细胞或者分 泌MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的细胞的培养上清。(5)⑵或(4)所述的基因表达增强剂，其特征在于，所述细胞为肿瘤细胞。(6) 一种细胞分化诱导剂，该细胞分化诱导剂将细胞向调节T细胞分化诱导，其特 征在于，激活所述细胞的MCPl信号。(7) 一种细胞分化诱导剂，该细胞分化诱导剂将细胞向调节T细胞分化诱导，其特 征在于，含有表达Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白或分泌型 IL-13Ra2蛋白的细胞。(8) 一种细胞分化诱导剂，该细胞分化诱导剂将细胞向调节T细胞分化诱导，其特 征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。(9) 一种免疫抑制剂，其特征在于，激活MCPl信号。(10) 一种免疫抑制剂，其特征在于，含有表达Snail蛋白的细胞或者表达MCPl蛋 白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的细胞。(11) 一种免疫抑制剂，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白。(12) 一种过度免疫疾病治疗剂，其特征在于，激活MCPl信号。(13) 一种过度免疫疾病治疗剂，其特征在于，含有表达Snail蛋白、MCPl蛋白、 FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的细胞。(14) 一种过度免疫疾病治疗剂，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型 IL-13Ra2 蛋白。(15) 一种基因表达增强拮抗剂，该基因表达增强拮抗剂拮抗细胞中的FoxP3基因 的表达增强，其特征在于，抑制所述细胞的MCPl信号。(16) 一种基因表达增强拮抗剂，该基因表达增强拮抗剂拮抗细胞中的FoxP3基因 的表达增强，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型 IL-13Ra2蛋白的功能。(17) (15)或(16)所述的基因表达增强拮抗剂，其特征在于，含有具有MCPl拮抗活 性的抗MCPl抗体。(18) (16)所述的基因表达增强拮抗剂，其特征在于，含有具有FSTLl蛋白拮抗活 性的抗FSTLl抗体、具有膜结合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜结合型IL_13Ra2抗体或 具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗体。(19) 一种细胞分化诱导拮抗剂，该细胞分化诱导拮抗剂拮抗细胞向调节T细胞的 分化诱导，其特征在于，抑制所述细胞的MCPl信号。(20) 一种细胞分化诱导拮抗剂，该细胞分化诱导拮抗剂拮抗细胞向调节T细胞 的分化诱导，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型 IL-13Ra2蛋白的功能。
(21) (19)或(20)所述的细胞分化诱导拮抗剂，其特征在于，含有具有MCPl拮抗活 性的抗MCPl抗体。(22) (20)所述的细胞分化诱导拮抗剂，其特征在于，含有具有FSTLl蛋白拮抗活 性的抗FSTLl抗体、具有膜结合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜结合型IL_13Ra2抗体或 具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗体。(23) 一种免疫抑制解除剂，其抑制MCPl信号。(24) 一种免疫抑制解除剂，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋 白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(25) 一种肿瘤免疫激活剂，其抑制MCPl信号。(26) 一种肿瘤免疫激活剂，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋 白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(27) 一种抗肿瘤剂，其抑制MCPl信号。(28) 一种抗肿瘤剂，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白或分 泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(29) 一种肿瘤增殖抑制剂，其抑制MCPl信号或TSPl蛋白的功能。(30) 一种肿瘤细胞浸润抑制剂，其抑制MCPl信号或FSTLl蛋白的功能。(31) 一种肿瘤转移抑制剂，其抑制MCPl信号或FSTLl蛋白的功能。(32) 一种基因表达增强剂，该基因表达增强剂是细胞中的FoxP3基因、 MCPl (monocyte chemoattractant protein-1)基 |3> TSPl (thrombospondin-1)基因、 FSTLl (Follistatin-like 1)基因或 IL_13Ra2 (interleukin 13 alpha 2 receptor)基因 的基因表达增强剂，其特征在于，含有Snail蛋白活性增强物质。(33) (32)所述的基因表达增强剂，其特征在于，Snail蛋白活性增强物质是snail 基因表达载体。(34) (32)所述的基因表达增强剂，其特征在于，所述细胞是Panc-I细胞。(35) 一种抗癌剂，该抗癌剂是血液癌症的抗癌剂，其特征在于，含有拮抗Snail蛋 白的功能的拮抗物质。(36) (35)所述的抗癌剂，其特征在于，所述拮抗物质拮抗snail基因的表达。(37) (35)或(36)所述的抗癌剂，其特征在于，血液癌症是白血病。(38) 一种基因表达增强方法，该方法增强细胞中的FoxP3基因的表达，其特征在于，包括激活所述细胞的MCPl信号的工序。(39) 一种基因表达增强方法，该方法增强细胞中的FoxP3基因的表达，其特征在于，包括使所述细胞与表达选自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋 白和分泌型IL-13Ra2蛋白的一种以上的蛋白的细胞接触的工序。(40) (39)所述的基因表达增强方法，其特征在于，所述细胞是肿瘤细胞。(41) 一种基因表达增强方法，该方法增强细胞中的FoxP3基因的表达，其特征在于，包括使所述细胞与选自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白和 分泌型IL-13Ra2蛋白的一种以上的蛋白接触的工序。(42) (40)所述的基因表达增强方法，该方法增强细胞中的FoxP3基因的表达， 其特征在于，包括使所述细胞与表达选自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白和分泌型IL_13Ra2蛋白的一种以上的蛋白的细胞的培养上清接触的工序。(43) (42)所述的基因表达增强方法，其特征在于，所述细胞是肿瘤细胞。
(44) 一种细胞分化诱导方法，该方法将细胞向调节T细胞分化诱导，其特征在于， 包括激活所述细胞的MCPl信号的工序。(45) 一种细胞分化诱导方法，该方法将细胞向调节T细胞分化诱导，其特征在于， 包括使所述细胞与表达Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白或分泌 型IL-13Ra2蛋白的细胞接触的工序。(46) 一种细胞分化诱导方法，该方法将细胞向调节T细胞分化诱导，其特征在于， 包括使所述细胞与MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白接触的工序。(47) 一种发生了过度免疫的患者的治疗方法，其特征在于，包括对所述患者给与 激活MCPl信号的活化剂的工序。(48) 一种发生了过度免疫的患者的治疗方法，其特征在于，包括对所述患者给与 表达Snail蛋白的细胞或者表达MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白或分泌型 IL-13Ra2蛋白的细胞的工序。(49) 一种发生了过度免疫的患者的治疗方法，其特征在于，包括对所述患者给与 MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的工序。(50) 一种过度免疫疾病治疗剂，其特征在于，激活MCPl信号。(51) 一种基因表达增强拮抗方法，该基因表达增强拮抗方法拮抗细胞中的FoxP3 基因的表达增强，其特征在于，包括抑制所述细胞的MCPl信号的工序。(52) 一种基因表达增强拮抗方法，该基因表达增强拮抗方法拮抗细胞中的FoxP3 基因的表达增强，其特征在于，包括抑制所述细胞中的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型 IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能的工序。(53) (51)所述的基因表达增强拮抗方法，其特征在于，使所述细胞与具有MCPl拮 抗活性的抗MCPl抗体接触。(54) (52)所述的基因表达增强拮抗方法，其特征在于，使所述细胞与具有FSTLl 蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗体、具有膜结合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜结合型 IL-13Ra2抗体或具有分泌型IL_13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗体接触。(55) 一种细胞分化诱导拮抗方法，该细胞分化诱导拮抗方法拮抗细胞向调节T细 胞的分化诱导，其特征在于，包括抑制所述细胞的MCPl信号的工序。(56) 一种细胞分化诱导拮抗方法，该细胞分化诱导拮抗方法拮抗细胞向调节T 细胞的分化诱导，其特征在于，包括抑制所述细胞中的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型 IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能的工序。(57) (55)所述的细胞分化诱导拮抗方法，其特征在于，使所述细胞与具有MCPl拮 抗活性的抗MCPl抗体接触。(58) (56)所述的细胞分化诱导拮抗方法，其特征在于，使所述细胞与具有FSTLl 蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗体、具有膜结合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜结合型 IL-13Ra2蛋白抗体或具有分泌型IL_13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2蛋白抗体接 触。(59) 一种解除免疫受到了抑制的患者的免疫抑制的免疫抑制解除方法，其特征在于，包括抑制所述患者体内的MCPl信号的工序。(60) 一种解除免疫受到了抑制的患者的免疫抑制的免疫抑制解除方法，其特征在于，包括抑制所述患者体内的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型 IL-13Ra2蛋白的功能的工序。(61) 一种肿瘤免疫激活方法，该方法是激活肿瘤免疫受到了抑制的患者体内的肿 瘤免疫的方法，其特征在于，包括抑制所述患者体内的MCPl信号的工序。(62) 一种肿瘤免疫激活方法，该方法是激活肿瘤免疫受到了抑制的患者体内的肿 瘤免疫的方法，其特征在于，包括抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分 泌型IL-13Ra2蛋白的功能的工序。(63) 一种肿瘤患者的治疗方法，其特征在于，包括抑制所述患者体内的MCPl信号 的工序。(64) 一种肿瘤患者的治疗方法，其特征在于，抑制所述患者体内的MCPl蛋白、 FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能。(65) 一种肿瘤患者的治疗方法，其特征在于，抑制所述患者体内的TSPl蛋白的功 能。(66) 一种基因表达增强方法，该方法是细胞中的FoxP3基因、 MCPl (monocyte chemoattractant protein-1)基 |3> TSPl (thrombospondin-1)基因、 FSTLl (Follistatin-like 1)基因或 IL_13Ra2 (interleukin 13 alpha 2 receptor)基因 的基因表达增强方法，其特征在于，包括使所述细胞与Snail蛋白活性增强物质接触的工序。(67) (66)所述的基因表达增强方法，其特征在于，Snail蛋白活性增强物质是 snail基因表达载体。(68) (66)所述的基因表达增强方法，其特征在于，所述细胞是Panc-I细胞。(69) 一种治疗方法，该方法是患有血液癌症的患者的治疗方法，其特征在于，包括 对所述患者给与拮抗Snail蛋白功能的拮抗物质的工序。(70) (69)所述的治疗方法，其特征在于，所述拮抗物质拮抗snail基因的表达。(71) (69)所述的治疗方法，其特征在于，血液癌症是白血病。附图的简单说明

图1是表示本发明的一个实施例中强制表达了 snail基因的Panc-I细胞的表型 的表格。图2A是表示本发明的一个实施例中通过与经TGF-β处理的Hs294T细胞的共培 养来诱导⑶4+细胞中的FoxP3表达的图。图2B是表示本发明的一个实施例中通过与Panc-I细胞及F3细胞的共培养来诱 导⑶4+细胞中的FoxP3表达的图。图2C是表示本发明的一个实施例中利用与Panc-I细胞、F3细胞及DlO细胞共培 养后CD4+细胞来抑制T细胞增殖的图。图3是表示本发明的一个实施例中通过与HCT116细胞的共培养来诱导CD4+细胞 中的FoxP3表达的图。图4是表示本发明的一个实施例中利用snail基因强制表达克隆的细胞上清来诱导⑶4+细胞中的FoxP3表达的图。图5是表示本发明的一个实施例中Panc-1、HCT116、Hs294T各细胞株中因Snail 蛋白强制表达而发生表达亢进的基因的图。图6是表示本发明的一个实施例中利用抗MCPl抗体、抗TSPl抗体、抗FSTLl抗体 和抗IL-13Ra2抗体来抑制F3克隆的⑶4+细胞中的FoxP3蛋白表达增强的图。
图7A是表示本发明的一个实施例中利用抗MCPl抗体或抗TSPl抗体来抑制F3克 隆的⑶4+细胞、⑶4+⑶25+细胞和⑶4+⑶25-细胞中的FoxP3蛋白表达增强的图。图7B是表示本发明的一个实施例中利用抗FSTLl抗体来抑制F3克隆的CD4+细 胞、⑶4+⑶25+细胞和⑶4+⑶25-细胞中的FoxP3蛋白表达增强的图。图8是表示本发明的一个实施例中利用抗IL_13Ra2抗体来抑制FoxP3蛋白表达 增强的图。图9是表示本发明的一个实施例中利用抗MCPl抗体和抗IL_13Ra2抗体来抑制小 鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表达增强的图。图10是表示本发明的一个实施例中MCP1、TSPU FSTLl或分泌型IL_13Ra2的 FoxP3蛋白表达增强作用的图。图11是表示本发明的一个实施例中由表达Snail的细胞产生的FoxP3蛋白的直 接表达增强作用和间接表达增强作用的图。图12是表示本发明的一个实施例中利用snail基因强制表达克隆的细胞上清来 诱导⑶8+细胞中的FoxP3表达的图。图13是表示本发明的一个实施例中利用抗MCPl抗体和抗TSPl抗体来抑制由F3 细胞产生的CD8+细胞中的FoxP3蛋白表达增强作用的图。图14是表示本发明的一个实施例中利用抗IL_13Ra2抗体来抑制由Bll细胞产生 的⑶8+细胞中的FoxP3蛋白表达增强作用的图。图15是表示本发明的一个实施例中利用抗MCPl抗体和抗TSPl抗体来抑制表达 Snail的肿瘤细胞的增殖的图。图16是表示本发明的一个实施例中利用抗MCPl抗体和抗FSTLl抗体来抑制表达 Snai 1的肿瘤细胞的浸润的图。图17A是表示本发明的一个实施例中通过RT-PCR来考察白血病细胞株中的snail 表达的结果的图。图17B是表示本发明的一个实施例中利用snail基因特异性siRNA来抑制白血病 细胞的浸润的图。图18是表示本发明的一个实施例中，抗MCPl抗体、抗IL_13Ra2抗体、抗IL-13抗 体、抗IL-4抗体、抗CCR2抗体和抗IL-10抗体抑制由表达Snail的肿瘤细胞所导致的肿瘤 免疫抑制的图。图19是表示使用对snail基因或MCPl基因具有特异性的siRNA的体内治疗实验 的结果(A 测得的肿瘤体积，B 肺转移结节数，C 肿瘤内浸润细胞的流式细胞仪分析)的 图。图20是表示使用抗TSPl抗体的体内治疗实验的结果(A 测得的肿瘤体积，B 肺 转移结节数，C 肿瘤内浸润细胞的流式细胞仪分析)的图。
实施发明的最佳方式下面，例举实施例对基于上述发现而完成的本发明的实施方式进行详细说 明。实施方式和实施例中，没有特别说明的情况下，采用J. Sambrook，Ε. F. Fritsch和 Τ· Maniatis(编)，《分子克隆实验指南(第三版)(Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition))》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港 (Cold SpringHarbor),纽约(2001) ；F. Μ. Ausubel, R. Brent, R. Ε. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (编)，《现 代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》，约翰威立出版有限公司(John ffiley&Sons Ltd.)等标准试验方 案集中记载的方法，或采用对其进行了修饰或变形的方法。此外，使用市售的试剂盒或测定 装置时，没有特别说明的情况下，采用它们所附的试验方案。还有，根据本说明书的记载，本发明的目的、特征、优点及其设想对本领域技术人 员而言是显而易见的，根据本说明书的记载，只要是本领域技术人员即可容易地再现本发 明。以下记载的发明的实施方式及具体的实施例等是表示本发明的优选实施方式的例子， 是为了举例或说明而示出的。因此，本发明不受所记载的实施例的限定，本领域技术人员能 够显而易见地掌握的所有形态均包含在本发明内。此外，在本说明书中揭示的本发明的意 图及范围内，可基于本说明书的记载进行各种变形和修饰，这对本领域技术人员而言是显 而易见的，这些变形形态和修饰形态也包含在本发明内。==基因表达增强剂 I. MCP1、TSPl、FSTLl 和 IL_13Ra2 各基因==本发明的增强作为对象的细胞中的MCPl (monocyte chemoattractantprotein-1) 基因、TSPl (thrombospondin-1)基因、FSTLl (Follistatin-Iikel)基因禾口 IL-13Ra2 (inter 1 eukin 13 alpha 2 receptor)基因的表达的基因表达增强剂的特征在 于，含有Snail蛋白活性增强物质。Snail蛋白活性增强物质是不仅增强Snail蛋白分子的固有活性、还在细胞内整 体上增强Snail蛋白活性的物质即可，可以是任意物质，作为一例，可例举可实现Snail蛋 白的表达增强的NBSl强制表达载体(Yang等Oncogene，26，1459-1467，2007)、snail基因 的强制表达载体等。该基因表达增强剂的使用方法根据作为有效成分的Snai 1蛋白活性增强物质的 性质来决定即可，如果是作用于作为对象的细胞的细胞膜的物质，则对细胞给药即可，如果 是通过细胞内的表达来起作用的物质，则需要导入细胞内。这里，作为基因表达增强的对象的细胞没有特别限定，优选肿瘤细胞，特别优选 Panc-I 细胞。==基因表达增强剂II.FoxP3基因==本发明的增强作为对象的细胞中的FoxP3基因的表达的基因表达增强剂的特征 在于，含有Snail蛋白活性增强物质。Snail蛋白活性增强物质是不仅增强Snail蛋白分子的固有活性、还在细胞内整 体增强Snail蛋白活性的物质即可，无特别限定，作为一例，可例举可实现Snail蛋白的表 达增强的NBSl强制表达载体(Yang等Oncogene，26，1459-1467，2007)、snail基因的强制 表达载体等。该基因表达增强剂的使用方法是将用Snail蛋白活性增强物质增强了 Snail蛋白活性的细胞或该细胞的培养上清给与作为要增强FoxP3基因的表达的对象的细胞。例如， 可以将这些细胞在体内或体外共培养，在作为对象的细胞位于生物体内的情况下，将增强 了 Snail蛋白活性的细胞或该细胞的培养上清注入至作为对象的细胞附近即可。这里，作为对象的细胞没有特别限定，优选T细胞，更优选幼稚T细胞、CD4+T细胞 或⑶8+T细胞。==基因表达增强剂III.FoxP3基因==
本发明的增强作为对象的细胞中的FoxP3基因的表达的基因表达增强剂的特征 在于，激活作为对象的细胞和/或与作为对象的细胞共存的其它细胞中的MCPl信号。作为基因表达增强剂所含的有效成分，考虑例如表达Snai 1蛋白的细胞、表达 MCPl的细胞、MCPl蛋白、MCPl受体活化物质等，具体可例举分泌MCPl的肿瘤细胞、导入了 MCPl基因的强制表达载体的细胞、分泌MCPl蛋白的细胞的培养上清、高纯度MCPl蛋白、激 活MCPl受体的抗MCPl受体抗体等。此外，本发明的增强作为对象的细胞中的FoxP3基因的表达的基因表达增强剂也 可含有表达Snail蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的细 胞，或者含有FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。此时，作为基因表达增强剂，具体可使用表达Snail蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型 IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的肿瘤细胞，导入了编码Snail、FSTL1、膜结合型 IL-13Ra2或分泌型IL-13Ra2的基因的强制表达载体的细胞，表达Snail蛋白的细胞的培养 上清，分泌FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的细胞的培养上清，高纯度的FSTLl蛋白或 分泌型IL-13Ra2蛋白。还有，基因表达增强剂可以含有上述物质中的一种，也可以含有多种。作为这些基因表达增强剂的使用方法，例如向作为对象的细胞直接给与基因表达 增强剂即可。此时，可以使该细胞与其它细胞共存，作为共存的细胞，优选具有向T细胞递 呈抗原而使其增殖的作用的树突状细胞或巨噬细胞等抗原递呈细胞。此外，也可以向除作 为对象的细胞以外的其它细胞给与基因表达增强剂，将该细胞的培养上清给与作为对象的 细胞。作为这里所用的细胞，优选树突状细胞或巨噬细胞等抗原递呈细胞。这里，作为对象的细胞没有特别限定，优选T细胞，更优选幼稚T细胞、CD4+T细胞 或⑶8+T细胞。==细胞分化促进剂、免疫抑制剂==FoxP3蛋白是对具有免疫抑制功能的调节T细胞的分化和功能进行控制的主 基因(Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol. Med. 13，108-116，2007 ；Hori 等 Science 299， 1057-1061，2003 Jiang和 Chess J. Clin. Invest. 114，1198-1208，2004 ；)。因此，上述的增 强FoxP3基因的表达的基因表达增强剂可作为用于将作为对象的细胞向调节T细胞分化诱 导的细胞分化诱导剂和免疫抑制剂使用。实际上，含有表达snail基因的细胞的FoxP3基 因表达增强剂使共培养的⑶4+细胞获得T细胞的增殖抑制能力，这也表明FoxP3基因表达 增强剂可用作细胞分化诱导剂和免疫抑制剂。还有，作为对象的细胞没有特别限定，优选T细胞，更优选幼稚T细胞、CD4+T细胞 或⑶8+T细胞。还有，这些细胞分化促进剂和免疫抑制剂可以在体内使用，也可以在体外使 用。此外，免疫抑制剂可以抑制过度免疫，也可以抑制正常免疫。
==过度免疫疾病治疗剂==调节T细胞的功能下降会引发自身免疫或变应性疾病等过度免疫疾病(Miyara和 Sakaguchi Trends Mol. Med. 13，108—116，2007 ；Turk等 Immunol. Rev. 188，122—135，2002)。 因此，通过将作为对象的T细胞向调节T细胞分化诱导，藉此抑制免疫，从而可治疗这些过 度免疫疾病。因此，上述细胞分化诱导剂和免疫抑制剂可用作自身免疫或变应性疾病等的 过度免疫疾病治疗剂。这里，过度免疫疾病是因调节T细胞的功能下降而引发的疾病即可， 不限于自身免疫或变应性疾病。还有，作为对象的细胞没有特别限定，优选T细胞，更优选 幼稚T细胞、⑶4+T细胞或⑶8+T细胞。过度免疫疾病治疗剂的使用方法可适当决定，对于患者，较好是全身 给药或在发 生过度免疫的部位直接给药。= = FoxP3基因表达增强拮抗剂==本发明的拮抗作为对象的细胞中的FoxP3基因的表达增强的FoxP3基因表达增强 拮抗剂的特征在于，抑制作为对象的细胞和/或与作为对象的细胞共存的细胞的MCPl信号。作为该基因表达增强拮抗剂所含的有效成分，抑制例如MCPl蛋白或MCPl受体的 功能即可，具体可例举拮抗它们的功能的拮抗抗体、分泌该拮抗抗体的杂交瘤、表现出拮抗 活性的低分子化合物等。此外，本发明的FoxP3基因表达增强拮抗剂的特征也可以在于，抑制FSTLl蛋白、 膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能。该基因表达增强拮抗剂所含的有效成分可例举例如具有FSTLl蛋白拮抗活性的 抗FSTLl抗体、具有膜结合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜结合型IL_13Ra2抗体或具有 分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗体等。作为这些基因表达增强拮抗剂的使用方法，只要在体内或体外对作为对象的细胞 或其附近给药即可。但是，在FoxP3基因表达增强拮抗剂通过抑制与作为FoxP3基因表达 增强拮抗的对象的细胞共存的细胞的MCPl信号来显现效果的情况下，基因表达增强拮抗 剂以作用于该共存细胞的方式给药。这里，该共存细胞可考虑树突状细胞或巨噬细胞等抗 原递呈细胞等。这里，作为对象的细胞没有特别限定，优选T细胞，更优选幼稚T细胞、CD4+T细胞 或⑶8+T细胞。==细胞分化诱导拮抗剂、免疫抑制解除剂==如上所述，FoxP3蛋白是对具有免疫抑制功能的调节T细胞的分化和功能进行控 制的主基因(Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol. Med. 13，108-116，2007 ;Hori 等 Science 299，1057-1061，2003 Jiang和 Chess J. Clin. Invest. 114，1198-1208，2004 ；)。因此，如果 抑制FoxP3蛋白的表达增强，则可拮抗作为对象的细胞向调节T细胞的分化诱导，进而可解 除调节T细胞所导致的免疫抑制。由此，上述的抑制FoxP3基因的表达增强的基因表达增 强拮抗剂可用作拮抗作为对象的细胞向调节T细胞的分化诱导的细胞分化诱导拮抗剂和 免疫抑制解除剂。作为细胞分化诱导拮抗剂和免疫抑制解除剂的使用方法，只要在体内或体外对作 为拮抗向调节T细胞的分化诱导的对象的细胞或其附近给药即可。但是，细胞分化诱导拮抗剂和免疫抑制解除剂通过抑制与作为对象的细胞共存的细胞的MCPl信号来显现效果的 情况下，以作用于该共存细胞的方式给药。这里，该共存细胞可考虑树突状细胞或巨噬细胞 等抗原递呈细胞等。还有，作为对象的细胞没有特别限定，优选T细胞，更优选幼稚T细胞、CD4+T细胞 或⑶8+T细胞。还有，这些细胞分化诱导拮抗剂和免疫抑制解除剂可以在体内使用，也可以 在体外使用。==肿瘤免疫激活剂、抗肿瘤剂==本发明人发现，在肿瘤细胞中，Snail蛋白增强MCPl基因、TSPl基因、FSTLl基因 和IL-13Ra2基因的表达，它们的基因产物直接和间接地作用于⑶4+T细胞和⑶8+T细胞， 增强调节T细胞的活化标记物FoxP3的表达。即，发现肿瘤细胞通过MCPl蛋白、TSPl蛋白、 FSTLl蛋白、IL-13Ra2蛋白、IL-13蛋白、IL-4蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋白等肿瘤免疫抑制 中间蛋白影响周围的免疫细胞，使该免疫细胞分化成调节T细胞，藉此抑制宿主的癌症免 疫。基于该事实，拮抗这些中间蛋白的作用的本发明的FoxP3基因表达增强拮抗剂可解除 肿瘤细胞所导致的肿瘤免疫抑制，激活肿瘤免疫。如果激活患者本身的肿瘤免疫，则患者可 获得肿瘤的治疗效果。因此，本发明的FoxP3基因表达增强拮抗剂可用作肿瘤免疫激活剂 和抗肿瘤剂。这里，作为拮抗肿瘤免疫抑制中间蛋白的功能的拮抗物质，可例举肿瘤免疫抑 制中间蛋白的抗体或竞争性抑制分子(显性负相突变体)等。实际上，如果是普通的肿瘤细胞，则会被包括树突状细胞等抗原递呈细胞在内的 吞噬细胞吞噬而被消化排除，虽然表达Snail的肿瘤细胞拮抗该吞噬作用，但拮抗中间蛋 白的作用的拮抗物质可抑制表达Snail的肿瘤细胞所导致的吞噬作用拮抗。肿瘤免疫激活剂和抗肿瘤剂的使用方法可适当决定，对于患者，较好是在肿瘤部 位或其附近直接给药。==肿瘤增殖抑制剂==本发明的肿瘤增殖抑制剂通过抑制MCPl信号或TSPl蛋白的功能来抑制该肿瘤细 胞的增殖。肿瘤增殖抑制剂含有例如MCPl蛋白、MCPl受体、或者拮抗TSPl蛋白的功能的 拮抗抗体或分泌该拮抗抗体的杂交瘤作为有效成分。肿瘤增殖抑制剂的使用方法可适当决定，对于患者，较好是全身给药或者在肿瘤 部位或其附近直接给药。==肿瘤细胞浸润抑制剂、肿瘤转移抑制剂==本发明的肿瘤细胞浸润抑制剂通过抑制MCPl信号或FSTLl蛋白的功能来抑制该 肿瘤细胞的浸润。肿瘤细胞发生转移时会浸润于正常细胞间或形成血管壁的细胞间。因此，通过抑 制肿瘤细胞的浸润，可抑制肿瘤的转移。因此，肿瘤细胞浸润抑制剂可用作肿瘤转移抑制 剂。本发明的肿瘤细胞浸润抑制剂和肿瘤转移抑制剂含有例如MCPl蛋白、MCPl受体、 或者拮抗FSTLl蛋白的功能的拮抗抗体或分泌该拮抗抗体的杂交瘤、MCPl的显性负相突变 体(7ND)作为有效成分。肿瘤转移抑制剂的使用方法可适当决定，对于患者，较好是全身给药或者在肿瘤 部位或其附近直接给药。
还有，对于上述本发明的所有药剂，作为治疗对象的肿瘤没有特别限定，可以是实 体癌，也可以是血液癌症，还可以是上皮性的癌或除此以外的恶性肿瘤。==针对血液癌症的抗癌剂==本发明的针对血液癌症的抗癌剂是含有拮抗Snai 1蛋白的功能的拮抗物质的抗 癌剂。这里，拮抗Snai 1蛋白的功能的拮抗物质不仅是拮抗Snail蛋白分子的固有活性的 低分子化合物和蛋白质(显性负相突变体)等，只要是在细胞内整体上拮抗Snail蛋白的 功能的物质即可，无特别限定，作为一例，可例举拮抗Snail蛋白的表达的核酸(反义RNA、 siRNA, shRNA等)、这些核酸的强制表达载体、竞争性抑制蛋白等。该抗癌剂较好是通过拮 抗癌化血液细胞的浸润来发挥其功能。还有，至今为止，完全不知道血液癌症和Snai 1的关系。即使认为Snail的表达与肿瘤的转移相关，这也是因为其对实体癌等中可见的E-钙粘着蛋白等细胞间粘附分子 进行控制，关于悬浮类的血细胞的癌，Snail的参与是本领域技术人员所无法预见的。这里，作为血液癌症没有特别限定，可例举例如白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤。实施例[l]Panc-l细胞中的snail基因的强制表达〈目的〉在人胰腺癌细胞株Panc-I细胞中强制表达snail基因，对于Snail的表达得到了 增强的细胞克隆D6、D10、F3、F5，考察与细胞的形状、Snail和E-钙粘着蛋白的mRNA和蛋 白质的表达水平、细胞增殖能力、细胞粘附能力、细胞迁移能力、细胞浸润能力相关的表型。〈实验方法〉(l)snail基因的强制表达载体的制作及其导入由经已知为EMT诱导剂之一的TGF-β刺激后的Panc-I细胞通过PCR扩增snail cDNA(CDS 71-865，795bp)，插入具有G418抗性基因的pcDNA3. 1(+)质粒载体(英杰公司 (Invi trogen社))的限制酶EcoR I-Xho I位点。通过电穿孔将其导入肿瘤细胞株，培养 2周后用G418(2mg/mL)筛选抗药性细胞，对细胞进行克隆。(2)利用RT-PCR进行的导入snail基因的细胞株的基因表达分析用RNeasy (凯杰公司(QIAGEN社))从人肿瘤细胞株中提取RNA，用AMV逆转录 (420C-50 分一700C · 15 分)，采用所得 cDNA 进行 PCR(iCycler，伯乐公司(BI0-RAD 社))。 针对snail cDNA的引物的序列如下。正向(Forward)5，-CAGATGAGGACAGTGGGAAAGG-3，(序列编号 1)反向(Reverse)5，-ACTCTTGGTGCTTGTGGAGCAG-3，(序列编号 2)(3)利用免疫组化染色进行的导入snail基因的细胞株的蛋白质表达分析为考察肿瘤细胞中的蛋白质的表达水平，将肿瘤细胞(5X104个)在载玻片室 (slide chamber)内培养过夜(37°C，5% CO2)，用4%低聚甲醛固定。采用正常山羊血清的 非特异性染色的封闭处理后，为进行细胞内染色而用Cytofix/CytopernKBD制药公司(BD Phermingen社))处理(4°C、20分钟)，然后用各种抗体(例如抗Snail抗体(圣克鲁兹公 司(SANTA CRUZ 社))+Alexa488 标记抗山羊 IgG(分子探针公司(Molecular Probes 社))、 或抗E-钙粘着蛋白抗体(BD生命科学公司(BD Bioscience社))+Alexa568标记抗小鼠IgG(分子探针公司))于4°C染色1小时。然后用Vecter Shi eld(载体实验室公司(Vector Laboratories社))将细胞封入，用荧光显微镜(LSM 5PASCAL，卡尔蔡司公司(Carl Zei ss 社))观察、摄像。〈结果〉图IA中，将导入snail基因的细胞株的表型汇总于表中。虽然在作为亲细胞株的Panc-I细胞中也可见Snail蛋白的固有的表达，但通过导入snail基因的强制表达载体，表中所示的克隆中的Snail蛋白的表达水平亢进。其结 果是，各克隆中，细胞形状均从球状(round)变成了扁平的纺锤形(spindle/spreading)， 在体外和体内细胞增殖能力(proliferation)均下降，E-钙粘着蛋白(E-cadherin)的蛋 白水平和细胞粘附能力(Adhesion)均下降，细胞迁移能力(migration)和细胞浸润能力 (Invasion)均亢进。特别是在克隆F3中，由于观察到了与上皮-间充质转换(EMT)相关的 显著效果，因此在以下实施例中使用F3。[2]通过与Hs294T细胞的共培养来诱导CD4+细胞中的FoxP3表达〈目的〉揭示通过将经TGF-β处理的人黑色素瘤Hs294T细胞与PBMC共培养，在PBMC 中的⑶4+细胞中发生FoxP3蛋白的表达增强，FoxP3蛋白的表达因snail基因的下调 (knockdown)而消失。<实验方法>(1)肿瘤细胞的TGF-β处理采用6孔板，在人黑色素瘤Hs294T细胞的培养基中以2 μ g/3 X IO5个/2mL的量 添加下述的snail基因特异性siRNA(英杰公司)或者作为阴性对照的其无义序列的寡核 苷酸，然后进行培养。2天后，洗涤这些细胞后，添加TGF-β (5ng/mL)，再培养3天。Snail基因特异性siRNA#l的序列正向5，-GCGAGCUGCAGGACUCUAA-3，(序列编号 3)反向5，-UUAGA⑶CCUGCAGCUCGC-3，(序列编号 4)snai 1基因特异性siRNA#2的序列正向5，-CCCACUCAGAU⑶CAAGAA-3，(序列编号 5)反向5，-UUCUUGACAUCUGA⑶GGG-3，(序列编号 6)siRNA对照的序列正向5，-GCGC⑶CAGGACUCGAUAA-3，(序列编号 7)反向5，-UUAUCGAGUCCUGACGCGC-3，(序列编号 8)(2)利用RT-PCR进行的肿瘤细胞的基因表达分析回收肿瘤细胞，与[1]中同样地通过RT-PCR测定snail基因的表达。同时，用下 述引物测定作为用于进行表达定量的对照的GAPDI I基因的表达。正向5，-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3‘(序列编号 9)反向5，-ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3，(序列编号 10)(3)人外周血细胞(PBMC)的分离采集健康人的血液并添加1/10量的4%柠檬酸钠后，使其在菲可(Ficoll)(比重 1. 090)中分层，离心分离(1500rpm、20分钟、室温)，将存在于中间层的细胞组分用作“(成团(bulk))PBMC”。(4) PBMC和肿瘤细胞(Hs294T细胞)的共培养预先通过用MMC(100 μ g/mL、2小时、37°C )处理或照射X射线(20K rad)来使所 得肿瘤细胞失活。PBMC和肿瘤细胞以1 10的比例(例如，96孔板的情况下为IX IO5个 PBMC和IXlO4个肿瘤细胞，24孔板的情况下为5 X IO5个PBMC和5 X IO4个肿瘤细胞)接 种于板，在37°C、5% CO2的条件下共培养，3 5天后回收PBMC。
(5) FoxP3蛋白的表达分析首先使所得PBMC与市售的抗CD4抗体(BD制药公司)和抗CD25抗体(BD制药 公司)反应1小时。接着，为进行细胞内染色而用Cytofix/CytopernKBD制药公司)处理 (4°C、20分钟)，用抗FoxP3抗体(电子生命科学公司(eBiosci ence社))于4°C反应1小 时，然后用流式细胞仪FACScan(碧迪公司(Becton Dickinsor^i))对⑶4+或⑶4+⑶25+ 细胞组分进行门选(gating)，考察FoxP3的表达水平。< 结果 >图2A所示为snail基因的表达和FoxP3的表达的考察结果。如果对人黑色素 瘤Hs294T细胞进行TGF-β处理，则snail基因的表达亢进(图中的对照)，利用snail基 因特异性siRNA可抑制其表达。此时，⑶4+细胞组分中表达FoxP3的细胞的比例与未经 TGF-β处理时(25% )相比，在处理后有所增加(31% )，如果用snail基因特异性siRNA 抑制snail基因的表达，则无论是否有TGF-β处理，⑶4+细胞组分中表达FoxP3的细胞的 比例均有所减少(无处理25%— 17%，有处理— 20% )。这就表示⑶4+细胞中的 FoxP3的表达亢进是由Hs294T细胞中的snai 1基因的表达亢进导致的。[3]通过Panc-I细胞和F3细胞或DlO细胞的共培养来诱导CD4+细胞中的FoxP3 表达并获得T细胞增殖抑制活性〈目的〉揭示通过将PBMC与F3细胞或DlO细胞共培养，PBMC中的CD4+细胞中发生FoxP3 蛋白的表达增强，且CD4+细胞获得抑制T细胞增殖的活性。<实验方法>(1) PBMC和肿瘤细胞(Panc-I细胞或F3细胞)的共培养采用Pacn-I细胞或F3细胞，通过与[2]相同的方法进行与PBMC的共培养。(2)⑶4+细胞和新鲜T细胞的共培养使与肿瘤细胞共培养了 3 5天后的PBMC在菲可(比重1.090)中分层，离心分离 (1500rpm、20分钟、室温)采集存在于中间层的细胞组分并洗涤后，加入磁珠结合抗⑶4抗 体(MACS抗体，美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec社))，于4°C反应30分钟，用MACS 细胞自动分离机(美天旎生物技术公司)分离CD4+细胞。另一方面，作为用于观察T细胞增殖反应的材料，通过与[2]相同的方法从同一健 康人中重新制备PBMC，通过与上述相同的方法用MACS抗体(抗⑶4抗体或抗⑶8抗体)分 离T细胞(⑶4+细胞或⑶8+细胞)。在该新鲜T细胞(2 X IO5个)中加入抗⑶3抗体(终 浓度1 μ g/mL)以及从事先与肿瘤细胞一起培养的PBMC中分离的⑶4+细胞(2 X IO5个)， 在96孔板中培养4天。加入1/10量的Premi χ WST-I溶液(宝生物公司(夕力，A 4才 社))，再培养24小时，然后用酶标仪测定吸光度(450-655nm)，将该数值作为T细胞的增殖量(3) FoxP3蛋白的表达分析与[2]中记载的方法同样地考察FoxP3蛋白的表达。< 结果 >(l)FoxP3蛋白的表达分析图2B所示为FACS分析的结果。上部(淋巴细胞中的⑶4+⑶25+)是根据⑶4和⑶25的表达来划分细胞的结果， 图中的数字表示淋巴球组分中的⑶4+⑶25-(左)或⑶4+⑶25+(右)的细胞所占的比例 (%)。下部(⑶4+组分中的FoxP3+)表示⑶4+细胞组分中的FoxP3+蛋白的表达水平(各 图中FoxP3蛋白的表达水平沿着χ轴升高)，图中的数字表示存在于根据与所使用的FoxP3 抗体的同种型对照(Isotypecontrol)(大鼠IgG2a)的比较分析被判断为表达阳性的范围 内的⑶4+细胞组分中的FoxP3+细胞所占的比例(％ )。对于⑶4+细胞，和未与肿瘤细胞共培养的情况(图中的无肿瘤(Notumor) :FoxP3 的表达水平为14. 56)相比，通过与未强制表达snail的Panc-I细胞共培养(图中的亲代 (Parent) :30. 83)，可见FoxP3的表达增强。但是，如果与强制表达snail基因的F3细胞共 培养(图中的F3 43. 44)，FoxP3的表达进一步增强。该结果表明，snail基因的表达水平 与FoxP3的表达增强能力相关。如上所述，表达snail基因的细胞使共培养的⑶4+细胞的FoxP3蛋白的表达增 强。此外，如果强制表达snail基因，使Snail蛋白的表达水平亢进，则FoxP3蛋白的表达 增强能力也亢进。还有，如果向F3细胞导入对snail基因具有特异性的si RNA来抑制snail基因 的表达，则FoxP3的表达增强能力下降，由此可以确认，FoxP3的表达增强能力不是因克隆 间的差异等而产生的人为偏差，实际上是snail基因的强制表达的结果。(2) CD4+细胞与T细胞的共培养图2C所示为各T细胞的增殖测定的结果(左图为⑶4+T细胞，右图为⑶8+T细 胞)。还有，无(None)表示未添加抗CD3抗体也未添加CD4+细胞的T细胞增殖的单纯的背 景值。此外，作为阳性对照，未添加CD4+细胞而只添加抗CD3抗体的T细胞的增殖在CD4+ 细胞和⑶8+细胞中均显示出2. O以上的值(图中未表示)。即使与Panc-I细胞共培养，T细胞的增殖也受到强烈抑制(图中的亲代(Prt)或 模拟物(Mock)为1 1. 5)，但将T细胞与DlO细胞及F3细胞共培养时受到更强烈的抑制， 可见显著的抑制效果(P < 0. 001)。如上所述，表达snail基因的细胞使共培养的CD4+细胞获得T细胞的增殖抑制能 力，即，可使其向调节T细胞分化诱导。[4]通过与HCTl 16细胞的共培养来诱导CD4+细胞中的FoxP3表达〈目的〉用人结肠癌细胞株HCT116代替Panc-I细胞，进行与[1] [2]相同的实验。实验方 法与[1][2]相同。〈结果〉图3所示为FACS分析的结果。
和未与肿瘤细胞共培养的情况(图中的无肿瘤FoxP3的表达水平为20. 42)相 比，即使与未强制表达Snail的HCT116细胞共培养，FoxP3的表达也不增强(图中的亲代 18.30)。但是，如果与强制表达snail基因的Bll克隆共培养，则FoxP3的表达增强(图中 的Bll 44. 79)。如上所述，在多种癌症中观察到snail基因的表达水平与FoxP3的表达增 强能力的相关性。[5]利用snail基因强制表达克隆的细胞培养上清来诱导⑶4+细胞中的FoxP3表达〈目的〉揭示不仅是F3细胞，F3细胞的细胞培养上清也能增强⑶4+细胞的FoxP3蛋白表达。< 方法 >(1)培养上清的制备方法将1 X IO5个肿瘤细胞在25cm2的烧瓶中培养3 4天，将其培养上清转移至另一 试管，高速离心(3000rpm、20分钟、4°C)分离后，将其上清作为培养上清。4°C保存至用于 实验。(2)使用培养上清的处理方法使用24孔板，将等容量比的5 X IO5个PBMC (或其中的一组分)的悬浮液和肿瘤 细胞的培养上清、即2倍稀释的肿瘤细胞的培养上清于37°C、5% CO2的条件下培养3 4 天，然后回收该PBMC。还有，作为阴性对照，用未进行培养的培养基代替肿瘤细胞的培养上 清进行同样的实验。(3)其它与[2]同样地进行FoxP3蛋白的表达分析。< 结果 >图4所示为FACS分析的结果。对于⑶4+细胞(图A上部)、⑶4+⑶25-细胞(图A下部)、⑶4+⑶25+细胞(图 B)，亲细胞株(图A中的亲代-上清(Prt-sup)，图B中的亲代)和导入Snail的细胞(图 A中的D6-snail+等、图B中的Snail-Tr)的培养上清与单纯使用培养基的情况(图A中的 培养基(Medium)，图B中的无刺激物(No stimulant))相比，均能增强FoxP3蛋白的表达。 这就表明由Snail蛋白的表达产生的FoxP3蛋白表达的增强作用是体液因子介导的。如上所述，表达Snail蛋白的细胞的培养上清也可用作FoxP3蛋白表达的增强剂。还有，⑶4+⑶25+细胞有时也会进行向调节T细胞的分化而具有最大限度的FoxP3 蛋白表达，因此有时无法获得表达Snail的细胞的上清的效果(参照后述图6)。[6]因Panc-1、HCT116、Hs294T各细胞株中的Snail蛋白强制表达而发生表达亢 进的基因〈目的〉揭示在Panc-1、HCT116和Hs294T中，通过Snail蛋白的强制表达，MCPU TSPU FSTLl或分泌型IL-13Ra2的表达亢进。< 方法 >(I)MCPU TSPU FSTLl或分泌型IL_13Ra2的表达水平的测定方法
对于MCPl (ELISA 试剂盒内生公司(END0GEN 社)制 #EHMCP1)、TSPl (ELISA 试剂 盒贵弥功公司(CHEMIC0N社)制#CYT168)、分泌型IL_13Ra2 (ELISA试剂盒艾碧康公司 (ABCAi^i)制#ab46112)的蛋白的表达，用市售的ELISA试剂盒按照所附的试验方案进行 检测。还有，作为阴性对照，用未进行细胞培养的培养基进行同样的实验。此外，FSTLl的基因表达按照[1]所示的RT-PCR法测定。引物采用以下的寡核苷 酸。还有，作为阴性对照(NC)，在不添加mRNA的条件下进行同样的实验。正向25，-GCACAGGCAACTGTGAGAAA-3，(序列编号 11)反向25，-CATAGTGTCCAAGGGCTGGT-3，(序列编号 12)(2)IL-13Ra2蛋白的细胞内局部分布的检测方法肿瘤细胞中的膜结合型以及存在于细胞内/核内的IL_13Ra2的表达与Snail蛋 白的表达同样地按照[1] (3)所示的免疫染色法进行。< 结果 >结果示于图5。(A)所示为MCP1、TSP1和sIL_13Ra2 (分泌型)的蛋白表达水平的 比较结果，(B)所示为FSTLl的mRNA表达水平的比较结果。此外，(C)所示为各肿瘤细胞中 的IL-13Ra2的局部分布。在各强制表达Snail的克隆(D6、D10、F3、F5)中，上述细胞因子的表达与亲代 (Prt)相比均有所亢进。此外，不仅是分泌型(图5A)IL-13Ra2的表达亢进，如图5C所示， 在各克隆中，在细胞膜或细胞质内以及核内，IL-13Ra2的表达均亢进。如上所述，通过增强Snail蛋白的活性，可增强MCPl、TSPl、IL_13Ra2、FSTLl的表达。[7]利用针对MCPl、TSPl、FSTLl、IL_13Ra2各蛋白的抗体来抑制F3克隆所导致的 FoxP3蛋白表达增强〈目的〉揭示针对MCPl、TSPl、FSTLl、IL_13Ra2各蛋白的抗体可拮抗F3克隆的FoxP3蛋 白表达增强作用。< 方法 >(1)本实施例中所用的抗体采用市售的抗MCPl抗体(BD制药公司制#551226)、抗TSPl抗体(艾碧康公司制#ab3131)、抗FSTLl抗体(安迪公司(R&D社)制#MAB1694)、抗TGF-β 1抗体(安迪公司制 #ΜΑΒ246)、抗IL-10抗体(安迪公司制#ΜΑΒ2171)、抗IL_13Ra2抗体(安迪公司制#AF146)、 小鼠IgG抗体(BD制药#557273)。(2)添加有抗体的培养上清的回收以1 5μ g/mL的终浓度在失活的肿瘤细胞中直接添加或在其培养基中添加抗MCPl抗体、抗TSPl抗体、抗FSTLl抗体、抗IL13Ra2抗体，与PBMC —起培养3天，回收该 PBMC。作为阳性对照，采用抗TGF-β 1抗体、抗IL-10抗体，作为阴性对照，采用小鼠IgG抗 体。(3)其它肿瘤细胞的培养上清的制备方法和FoxP3蛋白的表达分析与[5]同样地进行。< 结果 >
图6所示为使用各抗体时的CD4+细胞中的FoxP3蛋白的表达水平的测定结果。此 外，图7所示为使用各抗体时的⑶4+细胞、⑶4+⑶25+细胞、⑶4+⑶25-细胞中的FoxP3蛋 白的表达水平的测定结果。已知TGF-b和IL-10参与FoxP3蛋白的表达诱导，这里，对于⑶4+细胞、 CD4+CD25+细胞、CD4+CD25-细胞中的任一种，抗TGF_b抗体和抗IL-10抗体也均抑制F3 克隆的培养上清的FoxP3蛋白的表达增强能力。例如，通过给与抗TGF-b抗体(图中的抗 TGF-b (Anti-TGF-b))，对于CD4+细胞，FoxP3蛋白的表达水平从35. 34降至23. 43 (图6)或 者从38. 39降至30. 63 (图7)，对于⑶4+⑶25+细胞，FoxP3蛋白的表达水平从38. 39降至 28. 86，对于CD4+CD25-细胞，FoxP3蛋白的表达水平从35. 66降至28. 41。此外，抗IL-10 抗体的情况(图中的抗IL-lO(Anti-IL-lO))也同样，分别降至11.42 (图6)或30. 88 (图 7) (CD4+ 细胞)、29. 89 (CD4+CD25+ 细胞)、28. 05 (CD4+CD25-细胞)。另一方面，给与抗MCP1抗体的情况下(图中的抗MCPl(Anti-MCPl))，也分别降至 16. 27 (图 6)或 22. 89 (图 7) (CD4+ 细胞)、22. 08 (CD4+CD25+ 细胞)、19. 02 (CD4+CD25-细 胞)，抗TSP1抗体(图中的抗TSPl(Anti-TSPl))也同样，分别降至9. 26 (图6)或21.35(图 7) (CD4+ 细胞)、27. 78 (CD4+CD25+ 细胞)、16. 56 (CD4+CD25-细胞)。给与抗 FSTL1 抗体的 情况下(图中的抗FSTL1 (Anti-FSTLl))，其效果较弱，但即使如此，也分别降至14. 86 (图 6)或 34.67 (图 7) (CD4+细胞)、29.85 (CD4+CD25+细胞)、32.64 (CD4+CD25-细胞)。给与 抗IL13Ra2抗体的情况下(图中的抗IL13Ra2(Anti-IL13Ra2))，从35. 34降至11. 86 (图 6)(⑶4+细胞)。这就表明抗MCP1抗体、抗TSP1抗体、抗FSTL1抗体和抗IL13Ra2抗体抑 制培养上清的FoxP3蛋白表达增强能力。此外，同时使用了抗MCP1抗体、抗TSP1抗体、抗FSTL1抗体和抗IL13Ra2抗体，结 果表明⑶4+细胞中的抑制效果最强(35. 34降至8. 54)(图6)，这些细胞因子均对F3克隆 的培养上清中的FoxP3蛋白的表达增强作用作出过剩(redundant)的贡献。因此，拮抗MCP1、TSP1、FSTL1的功能的物质可拮抗表达Snail的细胞所具有的 FoxP3蛋白表达增强能力。[8]利用抗IL_13Ra2抗体来抑制FoxP3蛋白表达增强〈目的〉揭示抗IL_13Ra2抗体可拮抗由B11克隆产生的FoxP3蛋白表达增强活性< 方法 >除抗体使用抗MCP1抗体和抗IL_13Ra2抗体、肿瘤细胞使用B11克隆以外，与[7] 同样地进行实验。这里，使用抗IL-13抗体作为拮抗FoxP3表达增强活性的阳性对照。< 结果 >图8所示为使用抗MCP1抗体和抗IL_13Ra2抗体的结果。抗MCP1抗体使经B11克隆的培养上清增强的FoxP3蛋白表达从23. 69 (无抗体； 图中的无抗体(No mAbs))降至4. 69(给与抗体；图中的抗MCT(Anti-MCT))，抗IL-13Ra2抗 体使其降至7. 60 (给与抗体；图中的抗IL-13Ra2 (Anti-IL13Ra2))。如上所述，这些抗体可 拮抗B11克隆的培养上清的表达增强活性。还有，之所以未见抗IL-13Ra2抗体针对亲代细 胞HCT116细胞的效果，是因为HCT116细胞不表达Snai 1。如上所述，不仅是拮抗MCP1的功能的物质，拮抗IL13Ra2的功能的物质也可拮抗表达Snail的细胞所具有的FoxP3蛋白表达增强能力。[9]利用抗MCP1抗体和抗IL_13Ra2抗体来抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3 蛋白表达增强〈目的〉揭示抗MCP1抗体和抗IL-13Ra2抗体拮抗小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表 达增强活性。〈方法〉(1)脾脏细胞的制备方法作为免疫细胞，用小鼠脾脏细胞代替成团PBMC。首先，从小鼠体内取出脾脏，勻浆 后与成团PBMC同样地用菲可分离细胞悬浮液，使用位于中间层的细胞组分。(2)其它基本上与人培养细胞同样地进行，但对于人细胞，共培养或培养上清存在下的培 养进行3 4天，而对于小鼠黑色素瘤，共培养或培养上清存在下的培养进行5 6天。〈结果〉图9(上部)所示为使用抗MCP1抗体、抗TSP1抗体和抗IL_13Ra2抗体的结果。作 为阴性对照，采用小鼠IgG，作为阳性对照，采用抗TGF-b抗体和抗IL-10抗体。用抗TSP1抗体未能抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表达增强作用，但如 图所示，抗MCP1抗体和抗IL-13Ra2抗体抑制了 28 45%左右的FoxP3蛋白表达增强作用。如上所述，FoxP3蛋白表达增强作用的抑制不仅在人肿瘤细胞中可见其效果，在小 鼠肿瘤细胞中也可见其效果。[10JMCPU TSP1、FSTL1或分泌型IL_13Ra2各细胞因子的FoxP3蛋白的表达增强 作用〈目的〉揭示MCP1、TSP1、FSTL1或分泌型IL_13Ra2各细胞因子使CD4+细胞的FoxP3蛋白 的表达增强。< 方法 >除使用以Ing/mL的浓度添加有各细胞因子的培养基代替培养上清以外，与[5] 同样地进行实验。作为阳性对照，采用Panc-1细胞和F3克隆的培养上清、TGF-b和IL-10 细胞因子。各细胞因子使用市售的细胞因子(MCP1 安迪公司#279-MC，TSP1 安迪公司 #3074-TH, FSTL1 安迪公司 #669_F0，分泌型 IL_13Ra2 艾碧康公司 #ab46112，TGF_b 安迪 公司#100-B，IL-10 电子生命科学公司#34-8109)。< 结果 >图10所示为FoxP3蛋白的表达的测定结果。与未添加任何物质的培养基(图中用培养基(Medium)表示；表达水平为2. 55)相 比，MCP1蛋白(表达水平为17. 35)、TSP1蛋白(表达水平为18. 40)、FSTL1蛋白(表达水 平为16. 00)、分泌型IL-13Ra2蛋白(表达水平为20. 21)均显示出与F3克隆的培养上清 (表达水平为17. 08)相同程度的FoxP3蛋白表达增强作用。如上所述，MCP1、TSP1、FSTL1和分泌型IL_13Ra2各细胞因子可用作FoxP3蛋白表达增强剂。[11]由表达Snail的细胞产生的FoxP3蛋白的直接表达增强作用和间接表达增强 作用〈目的〉揭示由表达Snail的细胞产生的FoxP3蛋白的表达增强作用包括直接作用和间接 作用，间接作用中至少有树突状细胞参与。< 方法 >作为免疫细胞，用分离的CD4+细胞代替成团PBMC，在(1)在单独的CD4+细胞中加 入F3细胞的情况、(2)在⑶4+细胞+树突状细胞(DC)中加入F3细胞的情况、(3)在⑶4+ 细胞+其它细胞(其它(others)=从成团PBMC中除去CD4+细胞和树突状细胞后留下的 细胞)中加入F3细胞的情况、(4)在单独的CD4+细胞中加入F3细胞培养上清的情况、(5) 在单独的CD4+细胞中加入F3细胞/DC的共培养上清的情况、(6)在单独的CD4+细胞中加 入F3细胞/其它细胞的共培养上清的情况、(7)在单独的CD4+细胞中加入F3细胞/DC/其 它细胞的共培养上清的情况下，分别考察CD4+细胞中的FoxP3蛋白的表达水平。⑶4+细胞和⑶llc+细胞(树突状细胞)通过与⑵相同的方法用MACS抗体(美 天旎生物技术公司)从成团PBMC中分离。其它实验方法也如上所述。< 结果 >图11所示为FoxP3蛋白的表达的测定结果。图中，中部所示为添加有细胞时的实 验结果，下部所示为添加有培养上清时的实验结果。如果将成团PBMC换成单独的⑶4+细胞并加入F3细胞，则FoxP3蛋白表达水平 下降(成团+ 3细胞为35.34丄04+ 3细胞为10.93)。如果向其中加入DC或其它细胞，则 FoxP3蛋白表达水平上升(CD4+DC+F3细胞为25. 72、CD4+其它+F3细胞为16. 15)，这就表 示成团PBMC细胞内的CD4+细胞中的FoxP3蛋白表达水平的上升有CD4+细胞以外的细胞 (DC或DC以外的细胞)参与。但是，如果在单独的⑶4+细胞中加入F3细胞(⑶4+F3为10. 93)，则与不对成团 PBMC进行任何刺激的情况(成团(无刺激(no stim))为2. 55)相比，FoxP3蛋白表达水平 上升，这就表示也存在F3细胞或其培养上清中的体液因子直接作用于CD4+细胞的机制。此外，将添加细胞的情况与添加上清的情况进行比较时，添加细胞的情况下FoxP3 蛋白表达水平都要高2倍左右。例如，⑶4+F3细胞为10. 93，相对地⑶4+F3上清为5. 48 ； CD4+DC+F3 细胞为 25. 72，相对地 CD4+ 上清(Tu+DC)为 14. 98 ；CD4+ 其它 +F3 细胞为 16. 15， 相对地⑶4+上清(Tu+其它)为6. 37。因此可以认为，不仅体液因子的作用对FoxP3蛋白 表达增强有贡献，细胞间的直接的相互作用也对FoxP3蛋白表达增强有贡献。[12]利用snail基因强制表达克隆的细胞上清来诱导⑶8+细胞中的FoxP3表达〈目的〉揭示与⑶4+细胞同样，利用snail基因强制表达克隆F3的细胞上清也能诱导 ⑶8+细胞中的FoxP3蛋白表达。< 方法 >除将作为对象的细胞从CD4+细胞换成CD8+细胞以外，通过与[5]相同的方法进 行实验。
< 结果 >图12所示为FoxP3蛋白的表达的测定结果。与CD4+细胞所得的结果同样，与未添加肿瘤细胞的上清的情况(图中的无肿瘤) 相比，在亲细胞株Panc-1的细胞上清(图中的亲代(Snail-))中，FoxP3蛋白表达仅有少 量上升，但如果添加F3的细胞上清(图中的F3(Snail+))，则在⑶8+细胞中也可见FoxP3 蛋白表达的增强。如上所述，表达Snail的细胞的培养上清也能使⑶8+细胞的FoxP3蛋白表达增 强。[13]利用抗TSP1抗体和抗IL_13Ra2抗体来抑制CD8+细胞的FoxP3蛋白表达增 强〈目的〉揭示与⑶4+细胞同样，利用抗TSP1抗体和抗IL_13Ra2抗体也能抑制⑶8+细胞 中的FoxP3蛋白表达增强。< 方法 >除将作为对象的细胞从CD4+细胞换成CD8+细胞以外，通过与[7]相同的方法进 行实验。还有，对F3细胞使用抗MCP1抗体和抗TSP1抗体，对B11细胞使用抗IL-13Ra2抗 体。使用小鼠IgG抗体作为阴性对照进行同样的实验。< 结果 >图13所示为对F3细胞使用抗MCP1抗体和抗TSP1抗体的情况下的FoxP3蛋白的 表达的测定结果，图14所示为对B11细胞使用抗IL-13Ra2抗体的情况下的FoxP3蛋白的 表达的测定结果。使用抗MCP1抗体(图13 ；仅用培养上清(mlgG)时为14. 71、用抗MCP1抗体(抗 MCP1)时为II.97)、抗TSP1抗体(图I3 ；仅用培养上清(mlgG)时为14.71、用抗13 1抗体 (抗TSP1)时为5. 28)和抗IL-13Ra2抗体(图14;用B11培养上清(无抗体)时为14.87、 用抗IL-13Ra2抗体(抗IL-13Ra2)时为10. 21)的情况下，由培养细胞上清产生的FoxP3 蛋白表达增强作用受到了拮抗。这就表明对于由培养细胞上清产生的FoxP3蛋白表达增强 作用，至少MCP1、TSP1和IL-13Ra2是主要的原因分子。如上所述，对于CD8+细胞，至少MCP1、TSP1和IL_13Ra2也具有FoxP3蛋白表达增 强作用。[14]利用抗MCP1抗体和抗TSP1抗体来抑制表达Snail的肿瘤细胞的增殖〈目的〉揭示如果对表达snail基因的肿瘤细胞添加抗MCP1抗体和抗TSP1抗体，则可抑 制肿瘤细胞的增殖。< 方法 >(1)细胞增殖测定方法以2 u g/mL的浓度在Panc-1细胞和F3细胞的培养基中添加抗MCP1抗体、抗TSP1 抗体或作为对照的抗TGF-b抗体，培养3天后，加入1/10量的PremixWST-1溶液(宝生物 公司)，再培养24小时，然后用酶标仪测定吸光度(450-655nm)，将其数值作为T细胞的增 殖量。测定结果还表示了将对照mlgG所得的值设为100%时的增殖拮抗率。
< 结果 >结果示于图15。对于Panc-1细胞(图中的亲代-snail (-) (Parent-snail㈠)) 和F3细胞(图中的F3-Snail (+))这两者，抗MCP1抗体和抗TSP1抗体都能将增殖拮抗至 34% 77%。如上所述，通过拮抗MCP1或TSP1的功能，可降低肿瘤细胞的增殖能力。[15]利用抗MCP1抗体和抗FSTL1抗体来抑制表达Snail的肿瘤细胞的浸润〈目的〉揭示如果对表达snail基因的肿瘤细胞添加抗MCP1抗体和抗FSTL1抗体，则可抑 制肿瘤细胞的浸润。< 方法 >将5X104个F3细胞加入至用matrigel涂膜的Transwell小室(孔径8iig，BD生 命科学公司)的上层，培养过夜(37°C，5% C02)。以IP g/mL的浓度在上层和下层中添加 抗MCP1抗体或抗FSTL1抗体进行培养。将膜上的细胞完全除去后，用结晶紫溶液对浸润至 下层的细胞进行固定和染色，在显微镜下计数，从而测定细胞浸润能力。也示出了将阴性对 照(mlgG)所得的结果设为100%时的浸润细胞的个数的比例。还有，作为阳性对照，采用抗 IL-10抗体和抗TGF-b抗体。< 结果 >细胞浸润能力的测定结果示于图16。与亲株Panc-1细胞(图中用亲代表示)相比，F3细胞(图中用mlgG表示)的细 胞浸润能力增强。对该F3细胞给与抗TSP1抗体的情况下，细胞的浸润能力无变化，但在使 用抗MCP1抗体或抗FSTL1抗体时，细胞的浸润能力降至约45%。如上所述，抗MCP1抗体和 抗FSTL1抗体具有降低表达Snail的肿瘤细胞的细胞浸润能力的作用。[16]通过白血病细胞中的snail表达抑制来抑制浸润〈目的〉揭示白血病细胞中，通过抑制Snail表达，可降低白血病细胞的浸润能力。< 方法 >首先，通过RT-PCR 来考察白血病细胞株(Molt-3、Molt_4、UFl、KTl、K562、MC3)中 的Snail、MCP1、FSTL1的表达。方法如[1] [2] [6]所述，但对于MCP1，使用具有以下序列的 引物。正向5，-GTGTTTGACATCTTTGAACTC-3，(序列编号 13)反向5，-CCAAAGACAAACCTCACATTC-3，(序列编号 14)接着，使用6孔板，在白血病细胞株(Molt-4、EL4、Daudi、KT1)的培养基中分别 添加与[2] (1)中使用的siRNA相同的snial基因特异性siRNA或siRNA对照进行培养 (2 u g/1 X 106 个 /2mL，英杰公司)。培养2天后，用涂有matrigel的Transwell小室(孔径8 y m，BD生命科学公司) 培养4小时，计数浸润至滤器的细胞。< 结果 >根据图17A所示的RT-PCR的结果，在考察的范围内，所有的白血病细胞株中均检 测到Snail的高表达。此外，图17B所示为对各白血病细胞株进行测定而得的浸润细胞数。在各白血病
25细胞株中，与未经对snail基因具有特异性的siRNA处理的白血病细胞(图中的无或对照 (Control))相比，用snail基因特异性siRNA进行处理的情况下，浸润能力均受到显著抑制 (P < 0. 001 0. 05)。如上所述，在白血病细胞中，通过抑制Snail表达，可降低白血病细胞的浸润能 力。因此，抑制Snail的功能的物质作为抗白血病药物有用。[17]通过拮抗表达Snail的肿瘤细胞所生成的中间蛋白的作用来抑制肿瘤细胞 所导致的肿瘤免疫抑制〈目的〉揭示肿瘤细胞被吞噬细胞吞噬而被消化排除，但表达Snail的肿瘤细胞拮抗该吞 噬作用，而且针对MCP1蛋白、IL-13Ra2蛋白、IL-13蛋白、IL-4蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋 白的抗体抑制表达Snail的肿瘤细胞所导致的吞噬拮抗作用。〈所用抗体〉抗MCP1抗体BD制药公司、抗CCR2抗体艾碧康公司、抗IL-13抗体艾碧康公 司、抗IL-13Ra2抗体安迪公司、抗IL-4抗体BD生命科学公司、抗IL-10抗体安迪公司< 方法 >将人结肠癌HCT116细胞或强制表达snail基因的B11克隆与人PBMC在各抗体 (lPg/mL)的存在下共培养3天使其接触，将该PBMC用PKH26红色荧光标记。以1 1的 比例在该PBMC中加入用CSFE绿色荧光标记的HCT116细胞，37°C培养2小时后，用流式细 胞仪(FCM)分析同时被红色和绿色两种荧光标记的细胞(即吞噬了癌细胞的PBMC中的细 胞)的比例。还有，为了观察自然发生的吞噬(背景)，在低温(4°C)下培养2小时。< 结果 >经不表达snail基因的HCT116细胞处理的PBMC(图18中的经模拟物处理的 PBMC (Mock-treated PBMCs))中，约25%的细胞同时被两种荧光标记。但是，经B11克隆处 理的PBMC(图18中的经B11处理的PBMC(Bll-treated PBMCs))中，仅约10%的细胞同时 被两种荧光标记。如上所述，表达Snail的肿瘤细胞具有抑制PBMC所包含的吞噬细胞的作 用的功能。但是，如果在PBMC与B11克隆接触时预先添加各抗体，则同时被两种荧光标记的 细胞的比例上升至15 % 35 %，因与表达Snai 1的肿瘤细胞接触而导致的同时被两种荧光 标记的细胞的比例的下降被拮抗。如上所述，通过拮抗肿瘤免疫抑制中间蛋白的功能，可解 除肿瘤细胞所导致的肿瘤免疫抑制，激活肿瘤免疫。[18]利用对snail基因或MCP1基因具有特异性的siRNA的体内治疗实验〈目的〉揭示通过在体内抑制Snail蛋白的功能或MCP1信号，可解除肿瘤细胞所导致的肿 瘤免疫抑制。〈方法〉对于小鼠黑色素瘤B16-F10，与[1]同样地制作强制表达snail基因的细胞 (H6-snail+)，移植至C57BL/6N小鼠(在1只个体内同时进行1 X 106个的皮下接种和2 X 105 个的静胍内接种)。7天后，用PEI (多转染公司(PolyplusTransfection社))将形成脂质 复合体的对Snail或MCP1基因具有特异性的siRNA或对照siRNA(5 u g/只，英杰公司)分别注入该皮下移植的肿瘤内。小鼠snail基因特异性siRNA的序列正义5，-GGAAGAUCUUCAACUGCAA-3，(序列编号 15)反义5，-UUGCAGUUGAAGAUCUUCC-3，(序列编号 16)小鼠MCPl基因特异性siRNA的序列正义5，-CCAGCAAGAUGAUCCCAAU-3，(序列编号 17)反义5，-AUUGGGAUCAUCUUGCUGG-3，(序列编号 18)小鼠siRNA用对照的序列正义5，-CCAGAAGUACUACCGCAAU-3，(序列编号 19)反义5，-AUUGCGGUAGUACUUCUGG-3，(序列编号 20)1周后，从移植小鼠体内摘出肿瘤和肺，测定肿瘤体积和肺转移结节数，用流式细 胞仪FACScan对肿瘤内浸润细胞进行分析。将实体瘤在培养液内勻浆后采集肿瘤内浸润细 胞，与针对小鼠抗原的各种抗体(抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CDllc抗体和抗I-A(b)抗体 是BD制药公司的产品、抗FoxP3抗体是电子生命科学公司的产品)或H-2K(b)约束性gp70 四聚体(肽序列KSPWFTTL，MBL公司、序列编号21)于4V反应1小时后进行分析。〈结果〉图19所示为测得的肿瘤体积(A)、肺转移结节数(B)和肿瘤内浸润细胞的流式细 胞仪分析(C)的结果。如图19A和图19B所示，移植了 B16-F10的小鼠(图中的模拟物)中，肿瘤的增殖 显著，而向肺的转移少。相对地，移植了 H6-Snai 1+的小鼠(图中的Cont)中，肿瘤的增殖 程度不如模拟物，而向肺的转移得到显著促进。但是，如果注入对snai 1基因或MCPl基因 具有特异性的siRNA(图中分别为Snai 1和MCP1)，细胞增殖和向肺的转移均受到抑制。此外，如图19C所示，与B16-F10 (图中的模拟物)相比，强制表达snail基因的 H6-snail+中，浸润至肿瘤内的细胞数显著减少，而如果注入对snail基因或MCPl基因具有 特异性的siRNA，则浸润至肿瘤内的细胞数增加至多于B16-F10。如上所述，通过利用对snail基因或MCPl基因具有特异性的siRNA在体内抑制Snail蛋白的功能或MCPl信号，可解除肿瘤细胞所导致的肿瘤免疫抑制，产生抑制肿瘤体 积增加、抑制肿瘤转移、增强向肿瘤内的细胞浸润等抗肿瘤效果。[19]利用抗TSPl抗体的体内治疗实验〈目的〉揭示通过在体内抑制TSPl蛋白的功能，可解除肿瘤细胞所导致的肿瘤免疫抑制。〈方法〉将1 X IO6个小鼠黑色素瘤B16-F10和H6_snail+皮下接种于C57BL/6N小鼠，7天 后向该皮下接种肿瘤内注入抗TSPl抗体(5 μ g/只、卡尔生物化学公司(Calbiochem社))， 1周后进行以下测定。(1)测定肿瘤体积。(2)为检测出各脏器(LG肺；SP脾脏；PB外周血；BM骨髓)中的肿瘤细胞的微量 转移，通过RT-PCR考察B16-F10细胞特异性表达的癌抗原gplOO的基因表达。还有，除使 用下述引物以外，与[1]同样地进行RT-PCR。
对gplOO具有特异性的引物序列正向5，-ACAGCCAGTGTATCCACAGG-3，(序列编号 22)反向5，-ACTTCCATTGTGTGTGTGCC-3‘(序列编号 23)对作为对照的GAPDH具有特异性的引物序列正向5，-TTGACCTCAACTACATGGTCTA-3，(序列编号 24)反向5，-ACCAGTAGACTCCACGACATAC-3，(序列编号 25)(3)与[18]同样地用流式细胞仪FACScan分析肿瘤内浸润细胞。< 结果 >图20所示为测得的肿瘤体积(A)、肺转移结节数(B)和肿瘤内浸润细胞的流式细 胞仪分析(C)的结果。(1)如图20A所示，不论是在移植B16-F10的情况下(图中的模拟物)还是在移 植H6-Snail+的情况下(图中的H6-Snail+)，通过给与抗TSPl抗体(图中的抗TSP1)，肿 瘤体积显著减少。(2)如图20B所示，移植H6-Snail+、给与小鼠IgG作为抗体的对照的情况下(图 中的H6+对照mIgG(H6+Control mlgG))，与移植B16-F10的情况(图中的模拟物)相比，各 组织中检测出高水平的gplOO表达，肿瘤转移得到促进，而通过给与抗TSPl抗体(图中的 H6+抗TSPl (H6+Anti-TSPl))，各组织中gplOO表达降低，向组织的转移被显著抑制。(3)如图20C所示，与B16_F10(图中的模拟物；mlgG)相比，强制表达snail基因 的H6-Snail+(图中的H6-Snail+ ；mlgG)中，向肿瘤细胞内浸润的细胞数显著减少，而通过 给与抗TSPl抗体(图中的H6+抗TSP1)，向肿瘤内浸润的细胞数增加至多于B16-F10 (图中 的模拟物；mlgG)。如上所述，通过利用抗TSPl抗体来拮抗TSPl的作用，可解除肿瘤细胞所导致的肿 瘤免疫抑制，产生抑制肿瘤体积增力Π、抑制肿瘤转移、增强向肿瘤内的细胞浸润等抗肿瘤效果。产业上利用的可能性通过本发明，可提供增强细胞中的FoxP3基因表达的基因表达增强方法、将细胞 向调节T细胞分化诱导的细胞分化诱导剂、由它们的作用来抑制免疫的免疫抑制剂和过度 免疫疾病治疗剂、拮抗细胞中的FoxP3基因的表达增强的基因表达增强拮抗剂、拮抗细胞 向调节T细胞的分化诱导的细胞分化诱导拮抗剂、由它们的作用来解除免疫抑制的免疫抑 制解除剂、肿瘤免疫激活剂及抗肿瘤剂等。
权利要求
一种基因表达增强剂，该基因表达增强剂增强细胞中的FoxP3基因的表达，其特征在于，激活所述细胞的MCP1信号。
2.一种基因表达增强剂，该基因表达增强剂增强细胞中的FoxP3基因的表达，其特 征在于，含有表达Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白或分泌型 IL-13Ra2蛋白的细胞。
3.一种基因表达增强剂，该基因表达增强剂增强细胞中的FoxP3基因的表达，其特征 在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。
4.如权利要求3所述的基因表达增强剂，其特征在于，含有表达Snail蛋白的细胞或者 分泌MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的细胞的培养上清。
5.如权利要求2或4所述的基因表达增强剂，其特征在于，所述细胞为肿瘤细胞。
6.一种细胞分化诱导剂，该细胞分化诱导剂将细胞向调节T细胞分化诱导，其特征在 于，激活所述细胞的MCPl信号。
7.一种细胞分化诱导剂，该细胞分化诱导剂将细胞向调节T细胞分化诱导，其特征 在于，含有表达Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白或分泌型 IL-13Ra2蛋白的细胞。
8.一种细胞分化诱导剂，该细胞分化诱导剂将细胞向调节T细胞分化诱导，其特征在 于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。
9.一种免疫抑制剂，其特征在于，激活MCPl信号。
10.一种免疫抑制剂，其特征在于，含有表达Snail蛋白的细胞或者表达MCPl蛋白、 FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的细胞。
11.一种免疫抑制剂，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白。
12.一种过度免疫疾病治疗剂，其特征在于，激活MCPl信号。
13.—种过度免疫疾病治疗剂，其特征在于，含有表达Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋 白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的细胞。
14.一种过度免疫疾病治疗剂，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型 IL-13Ra2 蛋白。
15.一种基因表达增强拮抗剂，该基因表达增强拮抗剂拮抗细胞中的FoxP3基因的表 达增强，其特征在于，抑制所述细胞的MCPl信号。
16.一种基因表达增强拮抗剂，该基因表达增强拮抗剂拮抗细胞中的FoxP3基因的 表达增强，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型 IL-13Ra2蛋白的功能。
17.如权利要求15或16所述的基因表达增强拮抗剂，其特征在于，含有具有MCPl拮抗 活性的抗MCPl抗体。
18.如权利要求16所述的基因表达增强拮抗剂，其特征在于，含有具有FSTLl蛋白拮抗 活性的抗FSTLl抗体、具有膜结合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜结合型IL_13Ra2抗体 或具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗体。
19.一种细胞分化诱导拮抗剂，该细胞分化诱导拮抗剂拮抗细胞向调节T细胞的分化 诱导，其特征在于，抑制所述细胞的MCPl信号。
20.一种细胞分化诱导拮抗剂，该细胞分化诱导拮抗剂拮抗细胞向调节T细胞的分化 诱导，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2 蛋白的功能。
21.如权利要求19或20所述的细胞分化诱导拮抗剂，其特征在于，含有具有MCPl拮抗 活性的抗MCPl抗体。
22.如权利要求20所述的细胞分化诱导拮抗剂，其特征在于，含有具有FSTLl蛋白拮抗 活性的抗FSTLl抗体、具有膜结合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜结合型IL_13Ra2抗体 或具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗体。
23.一种免疫抑制解除剂，其特征在于，抑制MCPl信号。
24.一种免疫抑制解除剂，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTL1蛋白、膜结合型IL_13Ra2 蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。
25.一种免疫抑制解除剂，其特征在于，抑制IL-13蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋白的功能。
26.一种肿瘤免疫激活剂，其特征在于，抑制MCPl信号。
27.一种肿瘤免疫激活剂，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL-13Ra2 蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。
28.一种肿瘤免疫激活剂，其特征在于，抑制IL-13蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋白的功能。
29.一种抗肿瘤剂，其特征在于，抑制MCPl信号。
30.一种抗肿瘤剂，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜结合型IL_13Ra2蛋白 或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。
31.一种抗肿瘤剂，其特征在于，抑制IL-13蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋白的功能。
32.—种肿瘤增殖抑制剂，其特征在于，抑制MCPl信号或TSPl蛋白的功能。
33.一种肿瘤细胞浸润抑制剂，其特征在于，抑制MCPl信号或FSTLl蛋白的功能。
34.一种肿瘤转移抑制剂，其特征在于，抑制MCPl信号或FSTLl蛋白的功能。
35.一种基因表达增强剂，其特征在于，该基因表达增强剂是细胞中的FoxP3基因、 MCPl (monocyte chemoattractant protein-1)基 |3> TSPl (thrombospondin-1)基因、 FSTLl (Follistatin-like 1)基因或 IL_13Ra2 (interleukin 13 alpha 2 receptor)基因 的基因表达增强剂，其特征在于，含有Snail蛋白活性增强物质。
36.如权利要求35所述的基因表达增强剂，其特征在于，Snail蛋白活性增强物质是 snail基因表达载体。
37.如权利要求35所述的基因表达增强剂，其特征在于，所述细胞是Panc-I细胞。
38.一种抗癌剂，该抗癌剂是针对血液癌症的抗癌剂，其特征在于，含有拮抗Snail蛋 白的功能的拮抗物质。
39.如权利要求38所述的抗癌剂，其特征在于，所述拮抗物质拮抗snail基因的表达。
40.如权利要求38或39所述的抗癌剂，其特征在于，血液癌症是白血病。
全文摘要
本发明提供增强细胞中的FoxP3基因表达的FoxP3基因表达增强剂、将细胞向调节T细胞分化诱导的细胞分化诱导剂、由它们的作用来抑制免疫的免疫抑制剂和过度免疫疾病治疗剂、拮抗细胞中的FoxP3基因的表达增强的基因表达增强拮抗剂、拮抗细胞向调节T细胞的分化诱导的细胞分化诱导拮抗剂、由它们的作用来解除免疫抑制的免疫抑制解除剂、肿瘤免疫激活剂及抗肿瘤剂等。例如，将含有表达Snail蛋白、MCP1蛋白、FSTL1蛋白、膜结合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的细胞或者MCP1蛋白、FSTL1蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白中的至少一种的药剂用作FoxP3基因表达增强剂、调节T细胞分化诱导剂、免疫抑制剂和过度免疫疾病治疗剂，将含有抗MCP1、抗FSTL1抗体、抗IL-13Ra2抗体的药剂用作FoxP3基因表达增强拮抗剂、免疫抑制解除剂、肿瘤免疫激活剂及抗肿瘤剂等。
文档编号A61P35/04GK101808664SQ20088011004
公开日2010年8月18日 申请日期2008年8月22日 优先权日2007年8月24日
发明者工藤千惠, 河上裕 申请人:学校法人庆应义墪