苯基-氧杂环丁烷基衍生物的制作方法

专利名称：苯基-氧杂环丁烷基衍生物的制作方法
苯基-氧杂环丁烷基衍生物
本发明涉及多环化合物、其制备方法、其作为药物的用途以及包含其的药物组合
物。
更具体地讲，本发明在第一方面提供了式I的化合物和/或其可药用的盐 其中X是氨基、烷基氨基、羟基、烷氧基或卤素；Rl、R2、R3和R4彼此独立地是H或低级烷基；R5是任选地被卤素取代的烷氧基、任选地被卤素取代的C3_6环烷氧基；R6是氰基、酰基、任选地被商素取代的烷基或被烷氧基取代的烷基；且R7是H、任选地被卤素取代的低级烷基、任选地被卤素取代的低级烷氧基或卤素。卤素可以是氟、氯或溴，优选氟或氯，更优选地是氟。作为一种基团或存在于一种基团中的烷基可以是直链或支链的并且可包含最多8 个碳原子。出现在烷基的上下文中的低级表示具有最多4个碳原子的基团。烷基的实例有 甲基、乙基、丙基、异_丙基、丁基、仲_ 丁基、异_ 丁基、叔_ 丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。作为一种基团或存在于一种基团中的烷氧基可以是直链或支链的并且可包含最 多8个碳原子。出现在烷氧基的上下文中的低级表示具有最多四个碳原子的基团。烷氧基 的实例有甲氧基、乙氧基、丙氧基、异_丙氧基、丁氧基、仲_ 丁氧基、异_ 丁氧基、叔_ 丁氧 基、戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基等。被卤素取代的烷基或烷氧基可以是被1至5个卤素取代的(V8烷基或Ci_8烷氧基， 例如cf3或CF3-CH2-O-。Ci_8烷基-卤代(V8烷氧基可以是被Ci_8烷基进一步取代、例如在 1位上被进一步取代的卤代(V8烷氧基。这同样适用于其它基团。本文所用的酰基是RdC0基团，其中Rd是H、Cm烷基、C3_6环烷基、C3_6环烷氧基、 (V6烷氧基、苄基或苄氧基。酰基优选地是(V6烷基-co、(V6烷氧基-co、苄氧基-co或苄基-co，更优选地是 (V6烷基-co或Ci_4烷氧基-C0，特别是Ci_4烷基-CCKCh烷氧基-co、叔-丁氧基羰基或乙酰基。本文所用的烷基氨基表示其中胺的一或两个氢被具有1至8个并包括1和8个 碳原子的直链或支链烷基代替的胺。优选的烷基氨基是低级烷基氨基。烷基氨基的实例 包括N-甲基氨基、N, N- 二甲基氨基、N-乙基氨基、N, N- 二乙基氨基、N-正-丙基氨基、N， N- 二-正-丙基氨基、N-异-丙基氨基、N，N- 二-异-丙基氨基、N- 丁基氨基等。
独立地、集合性地或以任何组合或亚组合的形式优选下面的含义i)Rl是H或甲基；ii)R2 是 H 或甲基;iii)R3 是 H 或甲基；iv)R4 是 H 或甲基；v) R1具有与R2相同的含义；vi) R1具有与R3相同的含义；vii)Rl、R2、R3 和 R4 都是氢;viii)R5是任选地被卤素取代的烷氧基或任选地被卤素取代的C3_6环烷氧基，更 优选地是烷氧基或C3_6环烷氧基，甚至更优选地是低级烷氧基；ix) R6是氰基或酰基，更优选地是氰基；x) R7 是氢；xi)X 是氨基；xii)X 是羟基；xiii)X是氨基烷基；xiv)X 是氟；式I的化合物可以以游离形式或盐形式例如可药用盐的形式存在。将意识到本文 所述化合物，特别是式I的化合物，可以以异构体例如旋光异构体的形式存在。例如，R4可 以包含一个不对称碳原子，例如当R4是支链烷基时。或者在另一个实例中，就式(I)化合 物中基团X与之相连的碳原子而言，该碳原子还可包含3个不同的配体并因此本身可表示 一个不对称中心。本文所用的术语“异构体”是指具有相同分子式，但是原子的排列和构型不同的不 同化合物。同样，本文使用的术语“光学异构体”或“立体异构体”是指给定的本发明化合物 可以存在的各种立体异构构型的任何一种并且包括几何异构体。应当理解的是，在碳原子 的手性中心上可以连接取代基。因此，本发明包括该化合物的对映异构体、非对映异构体或 外消旋体。“对映异构体”是一对彼此是不可重叠的镜像的立体异构体。一对对映异构体的 1 1的混合物是一种“外消旋”混合物。在适宜的情况中用该术语来命名一种外消旋混合 物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子，但是不是彼此的镜像的立体异构体。绝 对立体化学是根据Cahn-Ingold-Prelog R-S系统来进行指定的。当一种化合物是纯的对 映异构体时，可用R或S来指定各手性碳的立体化学。可以根据它们在钠D线波长下旋转 平面偏振光的方向(右旋或左旋)来将绝对构型未知的拆分化合物命名为(+)或(_)。本 文所述的某些化合物包含一个或多个不对称中心，并且因此可产生对映体、非对映异构体、 以及可以根据绝对立体化学被定义为(R)_或(S)_形式的其它立体异构形式。本发明包括 所有该类可能的异构体，包括外消旋混合物、光学纯形式和中间体混合物。(R)_和(S)_旋 光异构体可以用手性合成子或手性试剂来进行制备，或者可以用常规技术来进行拆分。如 果该化合物包含双键，则其取代基可以为E或Z构型。如果该化合物包含二取代的环烷基， 则该环烷基取代基可具有顺式_或反式_构型。本发明还包括所有的互变异构形式。本文所用的术语“可药用的盐”是指保留了本发明化合物的生物有效性和性质、 在生物学或其它方面没有不利作用的盐。在许多情况中，本发明的化合物能凭借存在的氨基和/或羧基或与其类似的基团形成酸和/或碱盐。可以用无机酸和有机酸来形成可药 用的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢 盐/硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡 庚酸盐(glue印tate)、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、六氟磷酸盐、羟苯酰苯甲酸盐、盐酸盐/ 氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘化物/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸 盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐(naphthylate)、2-萘磺酸盐(napsylate)、 烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、蔗 糖盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。可由其形成盐的无机酸 包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可由其形成盐的无机酸包括例如乙酸、丙酸、 羟乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、 扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、水杨酸等。可以用无机和有机碱形成可药用的碱 加成盐。可由其形成盐的无机碱包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝；特别优 选的是铵、钾、钠、钙和镁盐。可由其形成盐的有机碱包括例如伯、仲和叔胺、包括天然存 在的被取代的胺在内的被取代的胺、环状胺、碱性离子交换树脂等，特别是如异丙胺、三甲 胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。本发明可药用的盐可以由母体化合物、碱性或酸性 部分，通过常规化学方法来进行合成。该类盐通常可通过将这些化合物的游离酸形式与化 学计量量的适宜碱(如Na、Ca、Mg或K氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应或者将这些化 合物的游离碱形式与化学计量量的适宜酸反应来进行制备。该类反应典型地是在水或有 机溶剂或水和有机溶剂的混合物中进行的。在适宜的情况中，通常优选非水性介质如醚、 乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。在例如“Remington' s Pharmaceutical Sciences”，第 20 版，Mack Publishing Company, Easton, Pa.，(1985)；和“药用盐手册性质，选择和应 用(Handbook of Pharmaceutical Salts Properties, Selection, and Use)，，，Stahl 禾口 ffermuth (ffiley-VCH, ffeinheim, Germany, 2002)中可以找到另一些适宜盐的列表。本发明包括本发明化合物即式(I)化合物的所有可药用的同位素标记的化合物， 其中(1) 一个或多个原子被具有相同原子序数但是具有与天然发现的原子质量或质量数 不同的原子质量或质量数的原子代替，和/或(2) —个或多个原子的同位素比与天然存在 的比例不同。适宜被包括在本发明化合物中的同位素的实例包括氢的同位素，如2H和3H、碳的 同位素，如"C、13C和14C、氯的同位素，如36C1、氟的同位素，如18F、碘的同位素，如1231和1251、 氮的同位素，如13N和15N、氧的同位素，如150、170和180，磷的同位素，如32P，和硫的同位素，如
35s。某些同位素标记的式(I)化合物，例如混有放射性同位素的那些化合物可用于药 物和/或底物组织分布研究中。由于易于混入和易于检测，放射性同位素氚，即3H和碳-14， 即14c特别可用于这一目的。用重同位素如氘，即2H进行取代可提供某些由更高的代谢稳定性例如体内半衰期 增加或所需剂量降低产生的一些治疗优点，并且因此在一些情况中可能是优选的。用正电子发射同位素如"C、18F、150和13N进行取代在用于检查底物受体占位的正 电子发射断层扫描(Positron Emission Topography) (PET)研究中可能是有用的。同位素标记的式(I)化合物可以用本领域技术人员已知的常规技术或与所附实施例和制备例所述的那些方法类似的方法，用适宜的同位素标记的试剂代替之前所用的未 被标记的试剂来进行制备。根据本发明，可药用的溶剂化物包括其中结晶的溶剂可以是被同位素取代的溶 齐U，例如D20、d6-丙酮、d6-DMS0的那些溶剂化物。包含能作为氢键供体和/或受体的基团的本发明化合物即式I的化合物可能能与 适宜的共结晶形成剂形成共结晶。这些共结晶可以通过已知的形成共结晶的操作由式I的 化合物来进行制备。该类操作包括研磨、加热、共升华、共熔化或在式I化合物的溶液中与 共结晶形成剂在结晶条件下进行接触并分离由此形成的共结晶。适宜的共结晶形成剂包括 在TO2004/078163中所述的那些物质。因此，本发明进一步提供了包含式I化合物的共结晶°合成
本发明进一步涉及制备其中的变量如上所定义的通式(I)的化合物的方法(见所
附流程图)。 OTf=三氟甲磺酸酯反应通常是在溶剂如甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N-甲 基吡咯烷酮、二甲苯、乙酸乙酯、乙醚、己烷、环己烷、二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜、 叔-丁基甲基醚中进行的。可以用本领域技术人员已知的方法(例如结晶、硅胶色谱、HPLC) 分离上面的化合物。通式(I)的化合物通常是通过1，2，4_噁二唑合成来制备的，即通过将式(i)的羧 酸和式(ii)的偕胺肟在存在碱(例如Et3N)和偶合剂(例如EDC/HOBt)的情况下并典型地 在加热下进行反应来合成。所述式(i)的羧酸可商业获得或者可以用如文献中所建议和/或描述的方法来进行制备。偶合伴侣，即式(ii)的偕胺肟可由式(iii)的腈获得，例如通 过将其与羟基胺反应例如在溶剂如水中反应来获得。在其中X = 0H或0-烷基的式⑴化合物中，式(iii)的腈试剂可以通过将适宜 的式(v)的芳基卤或芳基三氟甲磺酸酯与例如n-BuLi或镁反应从而引起卤素交换(例如 通过原位产生锂或镁中间体)，然后将其与相应的式(iv)的酮基氧杂环丁烷反应来获得。在其中X = NH2或NH-烷基的式⑴化合物中，式(iii)的腈试剂可以通过将适宜 的式(v)的芳基卤或芳基三氟甲磺酸酯与例如n-BuLi或镁反应从而引起卤素交换(例如 通过原位产生锂或镁中间体)，然后将其与相应的式(vi)的亚磺酰胺(其中R表示烷基) 反应来获得。式(vi)的化合物代表了一种关键的构建块，其优选用于本发明化合物、即式(I) 化合物的合成中； 其中的锯齿形键(welded bond)表示R_或S_对映异构体或一种外消旋物质，Rl、 R2、R3、R4如上面所定义且R表示烷基。式(vi)的化合物例如可以通过将通式(iv)的酮基氧杂环丁烷和相应的亚磺酰胺 (例如烷基亚磺酰胺)(其中可以利用R-或S-对映异构体或外消旋物质)在存在脱水剂如 Ti (0Et)4的情况下反应来获得。上述式(ii)、(iii)、(iv)和(vi)的中间体可以是手性的，例如S-对映异构体或 R-对映异构体，或者可以是外消旋的，并且特别是可用于制备通式(I)的化合物。该手性中 间体通常适用于控制终产物的手性，例如当式(I)、(ii)、(iii)、(iv)和/或(vi)化合物 中的氧杂环丁烷部分不对称时，例如当R1、R2、R3和/或R4中的至少一个但并非全部不是氢时。用下面的实施例对本发明进行非限制性说明。溶液的浓缩通常是在旋转蒸发器上在减压下进行的。常规的快速柱色谱通常是在 硅胶上进行的。快速柱色谱通常还用Biotage快速柱色谱装置或Flashmaster仪器进行。本发明另一方面还涉及权利要求书和/或实施例所独立、共同公开和描述的任何 方面或其任何选择和/或任何组合。本文所用缩写有TBME =叔-丁基甲基醚B0C=叔-丁氧基羰基B0C20 =叔-丁氧基羰基酐DMAP = N, N- 二甲基氨基吡啶DMF= 二甲基甲酰胺LiOH =氢氧化锂
HC1 =盐酸THF=四氢呋喃CH2C12= 二氯甲烷RT =室温NaOH =氢氧化钠HPLC=高压液相色谱HOBt =羟基苯并三唑EDC. HC1 = 1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐MS =质谱ES =电子喷射m/z=质量/电荷数实施例1 :5-{3-「4-(3_氨基-氧杂环丁烷_3_基)-苯基1_「1,2,41噁 唑-5-基} -2-异-丙氧基-苄腈 a) 2-甲基-丙烷-2-亚磺酸氧杂环丁烷_3_亚基酰胺 将20 %的氧杂环丁烷-3-酮(leq)在二氯甲烷中的溶液用THF稀释。其后，在氩气 氛下、在用冰/水冷却的情况下加入叔丁基亚磺酰胺(1. leq ；外消旋物或光学纯的(R)_或 (S)_类似物)和原钛酸四乙酯(1.9eq)。在室温下16小时后，将该反应混合物倾倒到乙 酸乙酯和盐水的混合物中。在用Hyflo过滤和将滤饼用乙酸乙酯充分洗涤后，将有机相用 Na2S04干燥，过滤，浓缩。将所得残余物在硅胶上纯化，用二氯甲烷/甲醇97. 5/2. 5作为洗 脱剂，从而得到2-甲基-丙烷-2-亚磺酸氧杂环丁烷-3-亚基酰胺。b) 2-甲基-丙烷-2-亚磺酸[3- (4-氰基-苯基)-氧杂环丁烷_3_基]-酰胺 将对-溴苄腈(leq)在THF中的溶液冷却至_78°C，随后在氩气下向其中加入正丁 基锂(1.6M己烷溶液；1. leq)。向该反应混合物中滴加2_甲基-丙烷_2_亚磺酸氧杂环丁 烷-3-亚基酰胺(1. leq)在THF中的溶液。在_78°C下1小时后，使该反应混合物加温至室温，在1小时后，将其倾倒到饱和NaHC03水溶液中。将水相用乙酸乙酯萃取3次，将有机相 用Na2S04干燥，过滤并浓缩。将所得残余物在硅胶上纯化，用二氯甲烷/甲醇97. 5/2. 5作为 洗脱剂，从而得到2-甲基-丙烷-2-亚磺酸[3- (4-氰基-苯基)-氧杂环丁烷-3-基]-酰 胺。c) [3- (4-氰基-苯基)-氧杂环丁烷-3-基]-氨基甲酸叔-丁酯 向2-甲基-丙烷-2-亚磺酸[3- (4-氰基-苯基)-氧杂环丁烷_3_基]-酰胺在 二氯甲烷中的溶液中加入2M HC1溶液(乙醚溶液；2eq)。将所得的反应混合物(形成沉 淀)用环己烷稀释并将其在室温下保持40分钟。在完全转化后，将沉淀滤出，洗涤，干燥。将所得滤饼溶解于二恶烷中，然后加入1M的NaOH水溶液(3eq)、B0C20 (3. leq)和 催化量的DMAP。将该反应混合物在室温下搅拌16小时，在该反应结束时，将混合物用水稀 释并用乙酸乙酯萃取，将有机相用Na2S04干燥，过滤，浓缩。将所得残余物在硅胶上纯化，用 二氯甲烷/甲醇9/1作为洗脱剂，从而得到[3- (4-氰基-苯基)-氧杂环丁烷-3-基]-氨 基甲酸叔-丁酯。d) {3- [4- (N-羟基甲脒基(carbamimidoyl)) _苯基]_氧杂环丁烷_3_基}-氨基
甲酸叔-丁酯 在室温下，向[3- (4-氰基-苯基)_氧杂环丁烷-3-基]-氨基甲酸叔_ 丁酯在 THF中的溶液中加入50%的羟胺水溶液(20eq)。将该反应混合物在室温下搅拌48小时。 在除去THF后，将该反应混合物用盐水稀释并用乙酸乙酯萃取。将有机相用妝2504干燥，过 滤，浓缩。将所得残余物混悬于少量乙醚中，将所得沉淀滤出，从而得到{3-[4-(N-羟基甲 脒基)-苯基]-氧杂环丁烷-3-基}-氨基甲酸叔-丁酯。e) (3-{4-[5-(3-氰基-4-异丙氧基-苯基)_[1，2，4]噁二唑_3_基]-苯基}-氧
杂环丁烷-3-基)-氨基甲酸叔-丁酯 在惰性气氛下，向3-氰基-4-异丙氧基-苯甲酸(leq)在DMF中的溶液中加入 EDC. HC1 (1. leq)和H0BT(1. 5eq)。然后，将该反应混合物在室温下搅拌30分钟。然后， 向该反应混合物中加入{3- [4- (N-羟基甲脒基)-苯基]-氧杂环丁烷-3-基}-氨基甲酸 叔-丁酯(1.3eq)，将其在室温下搅拌30分钟，然后将其在95°C下加热6小时。然后，将该 反应混合物浓缩至干燥，用乙酸乙酯/饱和NaHC03水溶液萃取。将有机相用Na2S04干燥， 过滤，浓缩，所有这些均通过常规操作步骤进行，然后用快速柱色谱进行纯化(二氯甲烷/ MeOH 9/1)，从而得到(3-{4-[5-(3_氰基-4-异丙氧基-苯基)-[1，2，4]噁二唑-3-基]-苯 基}“氧杂环丁烷-3-基)-氨基甲酸叔-丁酯。f) 5-{3-[4-(3_氨基-氧杂环丁烷-3-基)_苯基]_[1，2，4]噁二唑-5-基}-2_异 丙氧基-苄腈(实施例1)将(3-{4-[5-(3-氰基-4-异丙氧基-苯基)_[1，2，4]噁二唑_3_基]-苯基}-氧 杂环丁烷-3-基)_氨基甲酸叔-丁酯在5°C下用纯TFA进行处理。在10分钟(澄清溶液) 后，将该反应混合物倾倒到0. 02M HC1的乙醚溶液中。将所得沉淀滤出，将所得滤饼用乙醚 洗涤并将其混悬于乙酸乙酯中。将所得混悬液在搅拌下回流，然后将其冷却至5°C。在过 滤、用乙醚洗涤和干燥后，得到盐酸盐形式的5- {3-[4- (3-氨基-氧杂环丁烷-3-基)-苯 基]-[1，2，4]噁二唑-5-基} -2-异丙氧基-苄腈。实施例6 :5-{3-r4~(3-羟基-氧杂环丁烷_3_基)-苯基1_「1,2,41噁二 唑-5-基}-2_乙氧基-苄腈 实施例6是与实施例1所述的操作类似地获得的。然而，仅需要下面的反应步骤 和化合物反应步骤b)是用对-溴苄腈和氧杂环丁烷-3-酮代替2-甲基-丙烷-2-亚磺酸 氧杂环丁烷-3-亚基酰胺来进行的，然后用3-氰基-4-乙氧基-苯甲酸代替3-氰基-4-异 丙氧基-苯甲酸进行步骤d)和e)。实施例7 5-{3-[4-(3-氟-氧杂环丁烷_3_基)-苯基]_[1，2，4]噁二 唑-5-基}-2_乙氧基-苄腈 将5- {3- [4- (3-羟基-氧杂环丁烷-3-基)-苯基]-[1，2，4]噁二唑_5_基} _2_乙 氧基-苄腈(leq)溶解于二氯甲烷中并将其冷却至_78°C (用干冰丙酮混合物)。然后，加 入DAST溶液(1.5eq)并将该反应混合物在_78°C下搅拌10分钟小时，然后使其加温至室 温。将该反应用饱和NaHC03水溶液淬熄。将有机相用妝2304干燥，过滤，浓缩和在硅胶上 进行纯化(用乙酸乙酯/环己烷1/2作为流动相)，从而得到5-{3-[4-(3-氟-氧杂环丁 烷-3-基)-苯基]_[1，2，4]噁二唑-5-基}-2-乙氧基-苄腈。^！^包含可用上述方法获得的许多实施例。该表进一步包含相应的分子量(MS ES+)。 变量R5、R6和X如下面所定义。表 1 牛物学/药理学游离或可药用盐形式的式I化合物表现出有价值的药理学性质，例如可作为S1P1 受体激动剂，例如如体外和体内试验所表明的那样，并且因此可用于治疗。A.体夕卜式I的化合物对人S1P受体具有激动活性并且可以在下面的试验中对其进行测 定A.体外测量GTP「Y-MS1与由表汰人EDG警体的CHO细胞制得的膜的结合的gpcr 活化试验SlP^EDG-DGTPty-^S]试验经过勻化处理的膜是由稳定表达人EDG-1 N-末端 c-myc标记的CH0细胞克隆制得的。使细胞在大的培养皿(500cm2)中生长至80至90%的 融合。除去培养基并加入20mL冰冷的缓冲液A(10mM HEPES，pH 7. 4,10mM EDTA，完全蛋白 酶抑制剂合剂[1片/50mL])。用刮除术收集细胞，并将细胞混悬液在4°C下在750xg下离 心10分钟。将该小丸重新混悬于10mL冰冷的缓冲液B(20mM HEPES，pH 7. 4,100mM NaCl, lOmM MgCl2, ImM EDTA)中。将该细胞混悬液在冰上用Polytron勻化器在25000rpm下进行 勻化，每次勻化20秒，勻化三次。然后，将该勻浆在26900xg下在4°C下离心30min，通过涡 旋将该膜蛋白沉积物重新混悬于冰冷的缓冲液B中。用Bio Rad Protein Assay测定蛋白 浓度，用人IgG作为标准品。将该膜蛋白混悬液的体积调至2mg蛋白/mL的终浓度。然后， 将该溶液在冰上在25000rpm下再次勻化(Polytron) 20秒，然后将其等分并储存在_80°C 下。通过首先用DMS0稀释所述化合物(1 10)，然后以1 20的比例用试验缓冲液 (50mM HEPES，pH 7. 4,5mM MgCl2, ImM CaCl2，1 %无脂肪酸的BSA)稀释来制备化合物(在 10mM DMS0中的储备液)的系列稀释物。将SIP (ImM，位于DMS0/HC1中)直接用试验缓冲液 稀释。将所需数量的膜(1-5 P g/孔)用含有10 uM GDP、25 u g/mL皂苷和5mg/mL WGA-SPA 小珠的试验缓冲液稀释。向96-孔深孔板的底部加入9 yL预稀释的化合物。加入440PL 膜-WGA-SPA小珠浆液并将该板搅拌15分钟。然后，将两份(每份210 yL)各自转移到含有 15uL GTP[y -35S] (4nM,位于试验缓冲液中)的96-孔Optiplate板中。在将其在室温下 在恒定振摇的情况下培养120分钟后，将这些板在1000g下离心10分钟，从而使该膜-SPA 小珠浆液成团。然后，将这些板在TOPcoimt NXT中进行测量。用化合物的8个不同浓度来 产生浓度响应曲线(每个浓度使用两个数据点)并用GraphPad Prism的曲线拟合工具来 产生相应的EC5(1值。S1P2、-3、-4*-5GTP[y」5S]结合试验是以与S1P1 GTP[y-35S]结合试验相当的 方式，用得自表达c-末端c-myc标记或未标记受体的CH0细胞的膜来进行的。对于各膜制 剂而言，首先用S1P对照来进行滴定实验以确定加入到每个试验孔中的膜的最佳数量。根据上面的试验对式I化合物进行试验，其对S1P受体表现出激动活性，例如对 S1P1受体具有< 1 P M的EC5(1。更具体地，式I化合物对S1P1受体表现出选择性。在表2中表示了体外生物学激动活性(EC5Q，以y mol/1为单位)。表2: 此外，与S1P2、S1P3和S1P4相比，式I的化合物可对S1P1受体表现出选择性，例 如对S1P1受体的选择性可比对S1P2、S1P3和S1P4受体的选择性高至少20倍。通常，式I化合物还可能对S1P1和S1P5受体具有高于其它亚型、即S1P3和S1P4 的所谓的双重选择性。所述选择性通常为大约5-20 (以受体选择性而言)。所述双重S1P1/ S1P5受体激动剂具有有价值的药理学功效。游离或可药用盐形式的式I化合物还表现出其它有价值的药理学性质，例如改善 了的药动学性质(通常可用ADME-研究(ADME =吸收、分布、代谢和消除)来评估)。具体 地讲，式I的化合物通常可表现出相对快速的消除，并且因此具有改善了的耐受性或较少 的副作用。B.体内用于测量血液淋巴细胞消耗的筛诜试骑循环淋巴细胞的测量给Lewis大鼠(雄性，6_12周大)以0. 1至5mg/kg的剂量 口服施用化合物(4ml/kg载体，例如在最多2% DMS0/最多2% PEG200/水或0. 5%甲基纤 维素中)。包括载体组作为阴性对照。在基线时(Oh)和在给药后2、6、24和48小时，在短暂异氟烷麻醉的情况下由舌下 静脉收集血液。对金血样品进行血液学分析。用自动分析器测定外周淋巴细胞计数。用二 至四只大鼠来对各剂量的淋巴细胞计数进行评估。实施例1的化合物在0. 1至5mg/kg p. o的剂量下施用时导致剂量依赖性的外周 淋巴细胞计数减少。在以1或5mg/kg的剂量给药后6小时获得最大降低。在48小时内淋 巴细胞计数完全(lmg/kg)或部分(5mg/kg)恢复至基线。C.体内实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型多发性硬化最广泛使用的动物模型是以与人类疾病共享的组织病理学特征为基 础的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。可以通过单次注射在完全弗氏佐剂中乳化的抗原 来在敏感动物中诱导EAE。在敏感大鼠品系例如Lewi&Wistar大鼠中，在致敏后约8_11天 出现单相的急性麻痹性疾病。该出现症状的大鼠在接下来的7天内恢复，但是在其它种属 中，该攻击通常是致命性的。在慢性进行性疾病中，模型大鼠在急性疾病发作后会经历慢性 疾病。
急性EAE模型在后爪给雌性Lewis大鼠皮内注射0. Iml豚鼠脊髓和完全弗氏佐剂的混合物 [3. 5g 豚鼠脊髓+3. 5ml 0. 9% NaCl+105mg 结核分枝杆菌 H37Ra+7ml CFA]。在 9_10 周内发 展出一些疾病症状(尾部和两条后腿麻痹)。记录患病动物数以及疾病的发病时间。每组 最少使用五只大鼠。每天，即从0-13天每天通过口服管饲法施用试验化合物例如实施例1 的化合物，每天给药一次或两次。在缺乏药物处理的情况下，通常在8-11天内发展出疾病 症状(尾部和两条后腿麻痹)。可见的临床症状级别通常为1 =尾部张力丧失2 = 一条或两条后腿虚弱无力，或轻微共济失调3 =严重共济失调或有时导致死亡的伴有尿失禁的麻痹在上述试验模型中，本发明的化合物，例如实施例1的化合物在10mg/kg b. i. d的 剂量下有效，并且通常可预防疾病症状。慢性-进行性EAE模型(治疗性处理)如之前所述那样(Lorentzen等人，1995，J. Neuroimmunol. ；63 (2) 193-205 和 Adelmann 等人，1995，J. Neuroimmunol. ；63(1) 17-27)在 DA 大鼠中诱导 EAE。简单地说， 通过将冷冻干燥的牛脊髓在Arlacel A中进行勻化和将DA大鼠脑和脊髓在生理盐水中进 行勻化来制备抗原。然后，将这两种混合物(1 1)加入到等体积的含有16.6mg/mL结核 分支杆菌H37Ra抗原的完全弗氏佐剂(CFA)中。将全部内容勻化以提供一种具有抗原的 一致和充分混合的佐剂。所有的勻化步骤都是用Polytron PT3100勻浆器(Kinematica， Lucerne，瑞士)进行的。在8_9周大时，在尾根部用200 μ L抗原/佐剂混合物(分别与 26mg和19mg DA大鼠脑和脊髓组织一起施用大约19mg牛脊髓)皮下对大鼠进行免疫，同时 用异氟烷对其进行麻醉。通常用进行性麻痹的数字等级来对所产生的急性期疾病和随后的慢性期疾病进 行评估，所述数字等级如0，无麻痹1，尾部张力丧失2，后肢虚弱或共济失调3，存在或不存在尿失禁的后肢麻痹4，后肢和前肢麻痹5，垂死或死亡。通常每天都对临床得分进行评估。在该临床疾病的高峰和在治疗方案开始前，根 据临床疾病的发病和严重程度，将动物均勻分布到不同组中以确保在导致慢性期的最初急 性疾病中各组之间的可比性。在临床疾病的高峰后开始对动物进行治疗并持续每天治疗直 至该实验结束。将试验化合物，即本发明的化合物，如实施例1的化合物在例如0.5%甲基 纤维素(也被用作用于对照组的载体)中进行施用。给药体积为5mL/kg，根据体重变化对 其进行调整。在上述试验模型中，通常所有的动物都在开始治疗前，即通常在第12天刚刚达到 疾病高峰。通常从免疫后第15天，即通常在治疗4天后，用本发明化合物，例如用实施例1的化合物对所述动物进行的治疗通常将临床得分降低至几乎为零(< 0. 5)。直至中断治疗 (实验结束)时，所述疾病得分通常停留在低于0. 5的水平上。E.体内实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)的动物模型如文献所述那样制备S-抗原(例如Dorey C等人，1982，Ophthalm Res 14: 249-255 ；或 Wacker WB 等人，1977，J Immunol 119:1949-1958)。如 Wacker (1977)之前所 述的那样来完成S-抗原(S-Ag)-诱导的EAU模型。典型地，给12周大的雌性Lewis大鼠 在右足垫注射75 μ g纯化的牛视网膜S-Ag。所述抗原被溶解于磷酸盐缓冲的生理盐水中 并1+1地与完全弗氏佐剂和结核分支杆菌H37Ra混合。注射体积为0. 1ml，其含有50 μ 1完 全弗氏佐剂和1. 14mgH37Ra。在注射后第10天开始每天用检眼镜检查大鼠的眼睛(Heine， BETA200)。用检眼镜，按照下面的等级以半定量的方式对眼部炎症的程度进行打分0，没有可见的改变1，脉管系统最小程度的改变，虹膜和结膜血管有一些扩张 2，中等改变，脉管的清晰度下降，虹膜和血管扩张，中膜混浊3，显著改变，突眼，瞳孔被遮蔽，脉管结构显著丧失，有一些出血4，严重改变，显著突眼，结构完全丧失，具有弥散性出血。在上述模型中，未进行处理的动物通常在第9天开始疾病发作，通常在免疫接种 后第13天达到最高临床得分4。通常在免疫接种后第7天开始用本发明化合物如实施例1 的化合物进行治疗(通常以3和10mg/kg bid p.o.的剂量进行治疗；η = 5)并一直治疗 至第18天(实验结束)。用本发明的化合物，例如实施例1的化合物进行治疗通常对自身 免疫性葡萄膜炎产生了一种剂量依赖性的保护作用。因此，式I的化合物可用于治疗和/或预防由淋巴细胞相互作用介导的疾病或病 症，例如用于移植术中，例如用于同种或异种移植物的急性或慢性的细胞、组织或器官排斥 或移植物功能延迟、移植物抗宿主疾病、自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、全身性红 斑狼疮、桥本氏甲状腺炎(hashimoto’ s thyroidis)、多发性硬化、重症肌无力、I或II型 糖尿病及与其有关的病症、脉管炎、恶性贫血、斯耶格伦氏综合征、葡萄膜炎、牛皮癣、格雷 夫斯氏眼病、斑秃等、变应性疾病，例如变应性哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎/结膜炎、过 敏性接触性皮炎、任选地具有失常反应的炎性疾病，例如炎性肠病、克罗恩氏病或溃疡性结 肠炎、内因性哮喘、炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、动脉粥样硬化、骨关节炎、刺 激性接触性皮炎和其它湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、免疫介导的病症的皮肤表现、炎性眼病、 角结膜炎、心肌炎或肝炎，例如急性或慢性肝炎、局部缺血/再灌注损伤，例如心肌梗塞、中 风、肠局部缺血、肾衰或出血性休克、创伤性休克、癌症，例如乳癌、T细胞淋巴瘤或T细胞白 血病、肾病综合征、感染性疾病，例如中毒性休克(例如超级抗原诱导的)、脓毒性休克、成 人呼吸窘迫综合征或病毒感染，例如AIDS、病毒性肝炎，例如乙型或丙型肝炎、慢性细菌感 染、或神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化或老年痴呆。细胞、组织或实 体器官移植物的实例包括胰岛、干细胞、骨髓、角膜组织、神经元组织、心、肺、心-肺联合、 肾、肝、肠、胰腺、气管或食管。对于上面的用途而言，所需剂量当然将根据给药方式、所治疗 的具体情况和所需作用而改变。一般而言，表明在约1. 0至20. 0mg/kg体重的日剂量下可系统获得令人满意的结果。对于较大的哺乳动物例如人而言，所示日剂量为约0. 5mg至约500mg，方便地以例如最 多每天四次的分割剂量形式施用或者以延迟形式施用。用于口服施用的适宜单位剂型包含 约0. 1至50mg活性成分。式I的化合物可以通过任何方便的途径施用，特别是可以肠道给药，例如口服给 药，例如以片剂或胶囊的形式进行给药，或者可以胃肠外给药，例如以可注射溶液或混悬液 的形式进行给药，可以被局部给药，例如以洗剂、凝胶、软膏或霜剂的形式进行给药，或者以 鼻用或栓剂形式进行给药。可以用常规方式，通过与可药用的载体或稀释剂混合来制备包 含游离或可药用盐形式的式I化合物和至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物。式I的化合物可以以游离或可药用盐的形式例如如上所述的形式进行施用。所述 的盐可以以方便的方式制备并且表现出与游离化合物相同的活性。根据前面所述，本发明进一步提供了 1. 一种预防或治疗需要该类治疗的个体的由淋巴细胞介导的病症或疾病例如如 上所示的病症或疾病的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的式I化合物或其可药用 的盐；2. 一种预防或治疗需要该类治疗的个体的急性或慢性移植排斥或T-细胞介导的 炎性或自身免疫性疾病例如如上所示的疾病的方法，该方法包括给所述个体施用有效量的 式I化合物或其可药用的盐；3.用作药物，例如用于上面1或2所示的任何方法中的游离或可药用盐形式的式 I化合物。4.药物组合物，例如用于上面1或2任意一项的方法中的药物组合物，特别是包含 游离或可药用盐形式的式I化合物，优选还包含用于其的可药用稀释剂或载体。5.用于制备用于上面1或2的任意一项的方法中的药物组合物的式I化合物或其 可药用的盐。式I的化合物可以作为唯一的活性成分施用或者可以例如作为佐剂与其它药物 联合施用，所述其它药物例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其它抗炎剂，例如用于治疗或预 防急性或慢性同种或异种移植物排斥或炎性或自身免疫性病症的活性剂，或化疗剂，例如 恶性细胞抗增殖剂。例如，式I的化合物可以与下面的活性剂联用神经钙蛋白抑制剂， 例如环孢菌素A或506 ；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素、40-0-(2-羟基乙基)-雷帕霉素、 CCI779、BT578、AP23573、百利莫司(biolimus)-7或百利莫司-9 ；具有免疫抑制性质的子囊 霉素，例如ABT-281、ASM981等；皮质激素类；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特； 咪唑立宾；麦考酚酸或盐；麦考酚酸莫酯；15-脱氧链霉胺或其免疫抑制同系物、类似物或 衍生物；PKC抑制剂，例如如WO 02/38561或WO 03/82859中所公开的物质，例如实施例56 或70的化合物；JAK3激酶抑制剂，例如N-苄基-3，4- 二羟基-亚苄基-氰基乙酰胺α -氰 基 _(3，4_ 二羟基)-]Ν-苄基肉桂酰胺(Tyrphostin AG 490)、灵菌素 25-C(PNU156804)、 [4-(4'-羟基苯基)_氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉](WHI-P131)、[4-(3'-溴-4'-羟基苯 基)-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉](冊1寸154)、[4-(3' ,5' -二溴-羟基苯基)_氨 基-6，7-二甲氧基喹唑啉]冊1-卩97、10 -211、3-{(31 ，410-4-甲基_3_[甲基-(7H-吡咯并 [2，3-d]嘧啶-4-基)-氨基]-哌啶-1-基}-3_氧代-丙腈(游离或可药用盐形式，例如 单柠檬酸盐(也被称为CP-690，550))、或如WO 04/052359或WO 05/066156中公开的化合
18物；免疫抑制的单克隆抗体，例如白细胞受体例如MHC、⑶2、⑶3、⑶4、⑶7、⑶8、⑶25、⑶28、 ⑶40、⑶45、⑶52、⑶58、⑶80、⑶86或其配体的单克隆抗体；其它免疫调节化合物，例如具 有CTLA4或其突变体的细胞外区域的至少一部分的重组结合分子，例如与非CTLA4蛋白序 列例如CTLA4Ig (例如被称为ATCC 68629)或其突变体例如LEA29Y结合的CTLA4或其突变 体的至少细胞外部分的重组结合分子；粘附分子抑制剂，例如LFA-I拮抗剂、ICAM-I或-3 拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化疗剂，例如紫杉醇、吉西他滨、顺钼、阿霉素或 5-氟尿嘧啶；或抗感染剂。在式I化合物与其它免疫抑制/免疫调节、抗炎、化疗或抗感染治疗联合施用的情 况中，共同施用的免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、化疗或抗感染化合物的剂量当然将根 据所用共给药剂的类型(例如其是留族化合物还是神经钙蛋白抑制剂)、所用的具体药物、 所治疗的情况等而改变。根据上面所述，本发明另一方面还提供了 6.如上面所定义的方法，其包括共同施用例如相伴或顺序施用治疗有效的无毒量的式I化合物和至少一种第二种药物，例如免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂或化疗药物， 例如如上所示的药物。7. 一种药物组合，例如药盒，其包含a)第一种物质，其为游离或可药用盐形式的 本文所公开的式I化合物；和b)至少一种共给药剂，例如免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎剂、 化疗或抗感染剂。该药盒可包含关于其给药的说明书。本文所用的术语“共同施用，，或“联合施用，，等包括将所选择的治疗剂给药于单个 个体，并且意指包括其中所述治疗剂不一定通过相同给药途径给药或不一定同时给药的治
疗方案。本发明所用的术语“药物组合”是指通过将一种以上活性成分混合或组合产生的 产品并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”是指活性成分例如式I的 化合物和共给药剂以单一实体或剂量的形式被同时给药于患者。术语“非固定组合”是指 活性成分例如式I的化合物和共给药剂以独立实体的形式被同时、相伴或在没有特定时间 限制的情况下顺序施用于患者，其中该类给药在患者体内提供了 2种化合物的治疗有效水 平。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用3种或更多种活性成分。
权利要求
式I的化合物和/或其可药用的盐其中X是氨基、烷基氨基、羟基、烷氧基或卤素；R1、R2、R3和R4彼此独立地是H或低级烷基；R5是任选地被卤素取代的烷氧基、任选地被卤素取代的C3-6环烷氧基；R6是氰基、酰基、任选地被卤素取代的烷基或被烷氧基取代的烷基；且R7是H、任选地被卤素取代的低级烷基、任选地被卤素取代的低级烷氧基或卤素。FPA00001142684300011.tif
2.权利要求1的化合物，其中X是氨基或羟基，更优选地是氨基。
3.权利要求1的化合物，其中Rl、R2、R3和R4是H。
4.权利要求1的化合物，其中R5是任选地被卤素取代的烷氧基或任选地被卤素取代的 C3_6环烷氧基，R5优选地是烷氧基或C3_6环烷氧基，更优选地是低级烷氧基。
5.权利要求1的化合物，其中R6是氰基或酰基，更优选地是氰基。
6.用作药物的如前面任意一项权利要求所述的式I化合物或其可药用的盐。
7.—种药物组合物，其包含如前面任意一项权利要求所述的式I化合物或其可药用的 盐以及可药用的稀释剂或载体。
8.用于预防或治疗由淋巴细胞介导的病症或疾病的如前面任意一项权利要求所述的 式I化合物或其可药用的盐。
9.一种药物组合，其包含a)第一种物质，其是游离或可药用盐形式的如前面任意一项 权利要求所述的式I化合物，和b)至少一种共给药剂，其是免疫抑制剂、免疫调节剂、抗炎 剂、化疗或抗感染剂。
10.一种预防或治疗需要该类治疗的个体的由淋巴细胞介导的病症或疾病的方法，其 包括给所述个体施用有效量的如前面任意一项权利要求所述的式I化合物或其可药用的
11.一种制备式(I)化合物的方法，其中的变量如权利要求1中所定义，R3烧-3—酮 与烷基磺酰胺(例如与叔丁基亚磺酰胺)在使用脱水剂例如原钛酸四乙酯的情况下反 应，其中可以使用其R-或S-对映异构体或外消旋物质，得到式(vi)的烷基-2-亚磺酸氧 杂环丁烷-3-亚基酰胺，其中的锯齿形键表示R-或S-对映异构体或一种外消旋物质， 可以将其与例如4-卤素-苄腈和碱如丁基锂反应，从而得到式(iiia)的4-氰基化合物 可以对其进行转换，例如通过与酸反应、然后与boc2o反应而被转化成式(iiib)的氨基甲酸叔丁酯， 其可以被转换，例如可以用过量的羟基胺在例如含水溶液中将其转化成式(iia)的羟基甲脒基-苯基-氧杂环丁烷-3-基-氨基甲酸叔丁酯， 通常可以在氨基酸偶合条件如EDC. HC1/H0BT下用苯甲酸例如R5-和R6- 二取代的苯 甲酸使其环化成式(la)的-[1，2，4]噁二唑化合物， 然后，可以用酸如纯TFA将其转化成式(Ic)的终产物 (Ic)。
12.如前面权利要求中所公开的式(iia)、(iiia)、(iiib)和/或(vi)的中间体化合 物，其中的变量具有上文所述的定义，其基本如工作实施例、权利要求书和/或说明书中所 定义，它们特别是可用于制备权利要求1中的式(I)化合物，其中的变量如权利要求1中所 述。
13.式(vi)的化合物， (vi)其中Rl、R2、R3和R4彼此独立地是H或低级烷基，R是烷基，尤其是低级烷基，并且其 中的锯齿形键表示R-或S-对映异构体或外消旋物质，所述的式(vi)化合物特别是可用作 制备通式(I)化合物的中间体。
14.权利要求13的化合物，其中R1、R2、R3和R4是氢，R是叔-丁基，其中的锯齿形键 表示R-或S-对映异构体或外消旋物质，其是式(via)的化合物 (vi a)
全文摘要
描述了并要求保护一些新型有机化合物，这些化合物特别是可用于治疗由(人)自身免疫系统触发的疾病。
文档编号A61K31/337GK101878205SQ200880118201
公开日2010年11月3日 申请日期2008年12月1日 优先权日2007年11月30日
发明者F·泽克里, I·刘易斯, N·G·库克, R·阿尔贝特 申请人:诺瓦提斯公司