专利名称：一种通过去除或灭活巨噬细胞抑制因子-1而治疗恶病质的方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗恶病质的方法，具体地说，本发明涉及一种通过去除或灭活 恶病质患者血液、血浆或血清中的巨噬细胞抑制因子-1，而治疗恶病质的方法。参考文献本申请以申请号为AU2007905524，发明名称为〃 一种治疗恶病质的方法〃，申请 日为2007年10月9日的在先申请要求优先权。该申请的所有内容在此作为参考。另外， 本申请说明书参阅国际专利申请号为PCT/AU2005/000525 (W0 2005/099746)，该申请的所 有内容在此作为参考。
背景技术：
正常的体重控制对健康和幸福都非常重要。尽管低于平均体重也有问题，但肥胖 尤其可能会使受试者的发病率和死亡率有很大增加。事实上，恶病质(典型表现为减重、 肌萎缩、疲乏、虚弱、明显丧失胃口)显著促进患有一些慢性疾病(如癌症、慢性肾病、慢性 发炎和通常说的神经性厌食的饮食紊乱)患者的死亡率。例如，在癌症末期，恶病质很常 见(大多发生于身患绝症的癌症患者)，与四分之一的癌症相关死亡有关。不幸的是，体重 控制是一个复杂的，目前没有完全了解的过程。然而，众所周知，这个过程是多因素的，且 尤其是受食欲、食物摄取、食物能量转化、能量利用和消耗的影响。而且，普遍认为，在调节 这个过程的不同方面时，存在大量的可溶性介质，包括激素和细胞因子，如细蛋白、生长素、 黑素肾上腺皮质激素、刺鼠相关性肽和神经肽Y(NPY)。在本发明的探讨工作中发现人类 TGF-β总科细胞因子，通常称为巨噬细胞抑制因子-I(MIC-I)H在人体中一般低水平表 达，而在上皮恶性肿瘤，炎症或伤口处显著增加H1，这导致血清MIC-I水平的上升。本发明发现，患有如上皮癌末期或慢性肾病的患者的血清MIC-I水平上升，与过 度表达MIC-I的转基因鼠中观察到的血清水平呈相关性，且表现出显著的失重。因此，有人 提议，患有与MIC-I表达增加呈相关性的慢性疾病患者的恶病质是由于MIC-I过度表达或 MIC-I清除减少，且通过去除或灭活这些病人血液、血浆或血清中的MIC-I (如通过利用抗 MIC-I抗体)，有可能逆转或减少失重的严重度。
发明内容
因此，第一方面，本发明提供了一种治疗或预防恶病质的方法，包括将表现为恶病 质或倾向于发展成恶病质的受试者的血液(如全血)、血浆或血清进行活体外处理，从而使 所述血液、血浆或血清中的巨噬细胞抑制因子-I(MIC-I)去除或失活，然后，将处理后的血 液、血浆或血清返回到所述受试者。在一个优选实施例中，本发明一种治疗或预防恶病质的方法，包括以下步骤(i)准备结合MIC-I的合适底物；( )活体外使受试者中的血液、血浆或血清与所述底物接触，从而，存在于血液、血浆或血清中的MIC-I结合到底物上；(iii)分离底物与处理后的血液、血浆或血清；(iv)将处理后的血液、血浆或血清返回到受试者。第二方面，本发明提供了一种诊断或预防受试者恶病质的方法，所述方法包括测 定所述受试者的MIC-I的量(特别是血清MIC-I水平)。
图1为MIC-I初期到成熟过程的结构图，112个氨基酸形式，放射自显影法显示前 肽从成熟结构域的切割；图2为裸鼠体重与最大的鼠肿瘤达到Icm直径时的人类血液中MIC-I血清水平之 间的关系图；裸鼠移植了过度表达的人类DU145细胞；或(i)人类MIC-I全长(包括前肽) (系列3) ； (ii)成熟人类MIC-I (没有前肽)(系列1) ； (iii)人类MIC-I，包括前肽，但删除 了类蛋白转换酶前转化酶位点(去除蛋白转换酶)(系列2) ； (iv)仅阴性对照载体(系列 4)；图3为裸鼠失重百分数(与试验开始时的体重进行比较)与最大的鼠肿瘤达到 Icm直径时的人类血液中MIC-I血清水平之间的关系图；裸鼠移植了过度表达的人类DU145 细胞；⑴人类MIC-I全长(包括前肽)(系列3) ； (ii)成熟人类MIC-I (没有前肽)(系列 1) ； (iii)人类MIC-1，包括前肽，但删除了类蛋白转换酶前转化酶位点(去除蛋白转换酶) (系列2) ； (iv)仅阴性对照载体(系列4)；图4为羊抗人类MIC-I抗体对鼠重(g)的影响结果图；(A)第27天，给予两只鼠 IOmg(腹膜内地)纯化的羊IgG，该羊通过高纯化重组MIC-I获得免疫，而获得高滴定量人 类MIC-I抗体；⑶第27天，给予两只鼠IOmg(腹膜内地)对照纯化的正常羊血清IgG ；图 A和图B为两组鼠中其中一只的代表性数据；图5为利用过度表达MIC-I的转基因(TG)鼠系28评估失重的结果图；与同类系 的野生型(3窝，大小为59-61天)相比，公或母鼠28的体重都显著降低(P<0.001)；图6为利用MIC-I过度表达转基因(TG)鼠系75评估失重的结果图；与同类系的 野生型(WT) (3窝，大小是59-61天)相比，公或母鼠75的体重都显著降低(P < 0. 001)；图7为7窝野生型鼠(WT)和杂合转基因鼠(TG)的体重(g)比较；数据为每窝里 杂合转基因鼠相比较于野生型鼠的平均重量；新生WT和TG鼠(鼠小于48h大)的体重没 有显著不同；图8展示了施加人类MIC-I单克隆抗体(MAb26)可以逆转移植了人类DU145细 胞的裸鼠的体重，人类DU145细胞通过构建成熟人类MIC-I (没有前肽)转导了过度表达 的MIC-I ；注射了过度表达MIC-I的DU145细胞的鼠开始迅速失重；第11天，施药单注射 剂0. I-Img的MAb26，使其体重增加，其恶性肿瘤和持续时间随着MAb26量的增加而增加 (A-C) ；MAb26对恶性肿瘤的生长没有影响(D-F)；未经处理的鼠(G)和仅用PBS缓冲液处理 的鼠在试验过程中快速且持续失重；垂直轴表示重量(g)；图9展示了移植了人类DU145细胞的裸鼠和转导了对照结构的DU145细胞的对照 裸鼠连续三天的食物摄取比较，人类DU145细胞通过构建成熟人类MIC-I (没有前肽)转导 了过度表达的MIC-I ；
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图10展示了移植了人类DU145细胞的裸鼠和转导了对照结构的DU145细胞的对 照裸鼠脂肪垫和肌肉重的比较，人类DU145细胞通过构建成熟人类MIC-I (没有前肽)转导 了过度表达的MIC-I ；承载了 DU145表达肿瘤的MIC-I用实心柱表示，空心柱表示承载了对 照肿瘤的鼠；用T试验进行统计比较，*的数量表示统计学显著性的增加(从ρ = 0. 003到 P = 0. 0001)；腹沟股脂肪、附睾脂肪、腹膜后脂肪的脂肪重显著下降；两组鼠的肌肉重没有 显著差异；NS 不显著；**p < 0. 01 ；***p < 0. 001 ；图11为MIC-I转基因鼠与野生型对照的食物摄取量图；5只野生型鼠(WT)和6 只转基因鼠(TG)逐个于笼中放置48h，以适应单个住所；放置于送料斗的食物在零时间点 称重；每24小时，通过放入到送料斗的食物重减去剩余量和溢出量，来评估食物的消耗量； 测定四次以上的食物摄取量，每次24小时；WT组中每只鼠每天的食物摄取量明显偏大(ρ <0.04) (A)；然而，当用鼠的体重校正后，食物摄取量之间的这种差异就消失了(B)；图12为MIC-I转基因鼠(TG)和野生型鼠(WT)的器官重；缩写m =公，f =母， 印id =附睾，ut =子宫，retroperit =腹膜后；**p < 0. 01***p < 0. 001 ；图13为MIC-I结合胎球蛋白的试验结果图；纯化重组MIC-1 (溶于0. 1 % BSA) 用胎球蛋白包膜琼脂糖微粒孵育；然后洗涤微粒，利用抗-MIC-I抗体Western杂交后 SDS-PAGE具体分析；带1 纯化重组MIC-I ；带2 结合胎球蛋白微粒的MIC-I ；带3 只有胎 球蛋白微粒；带4 只用琼脂粉微粒孵育的MIC-I ；箭头表示MIC-I带；图14为正常成熟鼠脑视丘部下区域和第三脑室(V3)被切除的截面图，A 利用 35S标记RNA探针进行MIC-I原位杂交和射线自显迹法；B 利用纯化多克隆抗体与重组鼠 MIC-I的亲合力进行免疫组织化学；截面图显示了弓状核(AN)区域和室旁区域mRNA和蛋 白质的MIC-I表达。
具体实施例方式早前发现许多癌症，尤其是上皮器官中，MIC-I过度表达，患有这些癌症的患者中 血清MIC-I水平，与疾病期和严重度成比例地上升。尤其是在癌症后期，血清水平可以达到 3. 7-5. Ong/ml以上，鼠的血清水平与显著的失重有相关性。通过降低癌症患者或其他显示 恶病质或可能发展成为恶病质患者的MIC-I水平或MIC-I活性，可以预测到失重，且随后 对病人安康和尊敬的不良影响可以被逆转或减少。相应地，这有助于患者对潜在的慢性疾 病(如癌症或慢性肾病)的处理，对治疗作出正面反应，从而减少发病率和死亡率。因此，第一方面，本发明提供了一种治疗或预防恶病质的方法，包括将表现为恶病 质或倾向于发展成恶病质的受试者的血液(如全血)、血浆或血清进行活体外处理，从而使 所述血液、血浆或血清中的巨噬细胞抑制因子-I(MIC-I)去除或失活，然后，将处理后的血 液、血浆或血清返回到所述受试者。受试者可能患有慢性疾病如癌症(尤其是上皮癌如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直 肠癌、膀胱癌和胰腺癌)、慢性肾病、慢性炎症(如风湿性关节炎和克隆氏病)、慢性阻塞性 肺病(COPD)、心脏疾病如充血性心脏衰竭、饮食紊乱，通常称为神经性厌食症、或某些传染 病如肺结核、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和疟疾。这些疾病或紊乱通常与恶病质相关。 受试者可能已经表现出恶病质或可能发展成为恶病质。有代表性地，受试者会表现出其血 液、血浆或血清MIC-I水平上升(如观察到血清水平为3 . 721-50ng/ml或5_50ng/ml，尽管一些疾病中，可观察到血清MIC-I水平高达100-200ng/ml)，或者至少，血清MIC-I水平始终处 于正常范围0. 2-1. 15ng/ml2°的高端。如果有必要，可以利用MIC-I试验(如MIC-I ELISA4) 测定MIC-I水平上升来筛选这样的受试者。除了患有上段提到的疾病或紊乱的受试者的治疗，本发明的方法还适用于治疗 或预防与MIC-I过度表达(如受伤、压力、放射线疗法和化学疗法)或MIC-I清除减少 的状况或治疗呈相关性的恶病质。通过活体体外处理受试者的血液、血浆或血清，以使 MIC-I去除或失活，然后将处理后的血液、血浆或血清返回到受试者，血清MIC-I水平可有 效地降低，相应地，可导致食欲增强和/或体重增加，或者至少减少受试者体重的损失。理 想的是，受试者血液、血浆或血清被处理后，血清MIC-I水平处于血清MIC-I水平正常范 围0. 2-1. 15ng/ml的低端，血液或血浆MIC-I水平处于对应于血清MIC-I水平正常范围 0. 2-1. 15ng/ml的低端的量(血浆血液粘度的对应的量与血清完全相等，由于血浆的主成 分是血清，区别仅在于血浆还包括纤维蛋白原和其他凝血因子，而血液对应的量约为血清 的量的两倍)。有必要定期处理受试者的血液、血浆或血清，以维持MIC-I降低的水平，来达 到预期的结果(如食欲增加)。血液、血浆或血清中的MIC-I利用如结合MIC-I的分子和/或底物可被去除或失活。结合MIC-I的合适分子包括MIC-I受体和其片段(如MIC-I受体的可溶性细胞质 外受体结构域)，以及结合成熟MIC-I的其他可溶性分子或核骨架结合蛋白。用于本发明 的结合成熟MIC-I的可溶性分子的一个例子是胎球蛋白。胎球蛋白22是胎血中富含的一种 糖蛋白，在胎血中参与多种物质的转运。胎球蛋白的MIC-I结合片段也适用于本发明。用 于使血液、血浆或血清中MIC-I去除或失活的合适的物质包括如结合成熟MIC-I的天然或 人工物质，大多为类似细胞外基质(ECM)的物质。这些物质可以以颗粒、纤维、膜或其他表 面的形式存在，可以容易地与血液、血浆或血清接触而捕获MIC-I (即使MIC-I结合到底物 上)，从而从处理后的血液、血浆或血清中去除MIC-1。优选地，血液、血浆或血清的活体外处理包括使用抗体或其功能性片段(如Fab片 段或重组scFv片段12)，其特异性结合MIC-1(即抗MIC-I抗体或其片段)。用于本发明的抗 MIC-I抗体或其片段(还有其他结合MIC-I的分子如MIC-I受体或其片段)优选包括在合适 的底物表面提供MIC-I结合分子，其可以容易地与血液、血浆或血清接触而捕获MIC-I (即 通过所述MIC-I结合分子使MIC-I结合到底物上)，从而从处理后的血液、血浆或血清中去 除MIC-1。在这种情况下，底物包括惰性颗粒(如聚苯乙烯或琼脂糖颗粒)、纤维、膜(如高 渗透膜如聚丙烯腈或聚砜膜)或其他表面。优选地，MIC-I结合分子通过共价键结合到底 物上，然而，其他的结合形式(如静电结合)也是适用的。使MIC-I结合分子结合到底物表 面的常规方法为本领域技术人员所熟知。在一个优选实施例中，本发明治疗或预防恶病质的方法包括以下步骤(i)准备结合MIC-I的合适底物(即具有MIC-I结合分子的底物)；(ii)将活体外的血液、血浆或血清与所述底物接触来处理从受试者中取得的血 液、血浆或血清，这样，血液、血浆或血清中的MIC-I结合到底物上；(iii)分离底物与处理后的血液、血浆或血清；(iv)将处理后的血液、血浆或血清返回到受试者中(如通过灌输)。
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该优选实施例中的方法包括使用或改良任何一种或多种体外处理血液、血浆或血 清的方法(如血液透析、血红素除去法、血浆净化和血浆除去法)。因此，例如，当受试者患 有慢性肾病，需要血液透析(例如，连续动静脉血液滤过(CAVH)、连续静脉-静脉血液滤过 (CVVH)或连续性单纯超滤(SCUF))，血液透析可以适宜地改良以适于本发明的方法(即血 液在返回到受试者前，也与结合MIC-I的底物接触，通过与底物结合，血液中的MIC-I被去 除)。本发明治疗或预防恶病质的方法可与其他如肠道或非肠道营养法的恶病质治疗 法或预防法结合使用。非肠道营养法可以方便施加给受试者，这通过在去除或失活MIC-I 之前、之时或之后，活体外将适当的营养物质混合到血液、血浆或血清中而实现的。更进一步地，第二方面，本发明提供了一种诊断或预防受试者恶病质的方法，所述 方法包括测定所述受试者MIC-I的量(尤其是血清MIC-I水平)。第二方面的方法可以结合其他恶病质分析法如失重观察和/或测量，检测恶病质 标记物(如血液、血浆或血清中IL-6或生长素恶病质相关水平)一起使用。优选地，该方法包括测定受试者是否有与恶病质相关的MIC-I水平上升(如血 清水平3. 7-50ng/ml以上，或至少血清MIC-I水平一直处于正常范围0. 2-1. 2ng/ml的高 端)。这可以利用MIC-I分析(如MIC-I ELISA4)来测定。MIC-I水平的上升也表明特殊 恶病质患者可以通过本发明第一方面的方法，或对受试者施加MIC-I抑制剂而可治疗/预 防，这些MIC-I抑制剂和方法如本发明申请人的国际专利申请号PCT/AU2005/000525 (TO 2005/099746)中所描述。优选的MIC-I抑制剂包括以上提及的MIC-I结合分子。为了更好地理解本发明的本质，以下以非限制的实施例来详细说明本发明的优选 形式。实施例1血清MIC-I水平的调节MIC-I，像TGF-β总科蛋白的其他成员一样，被合成为具有N端前肽和C端成熟 MIC-I结构域的前体。前体在内质网(ER)中经过二硫化物连接的二聚作用，且一旦二聚化， 离开内质网进入高尔基体，在高尔基体内被类蛋白转换酶在保守RXXR位点切割(氨基酸 196) (SEQ ID NO :1)。这种切割从成熟C端结构域去除了前肽，因此，MIC-I释放一条24. 5kD 二硫化物聚合的成熟的112个氨基酸多肽1 (图1)。之前发现，大量MIC-I以未加工形式分泌。例如，内生未加工蛋白MIC-I从包括滋 养层细胞系BeWo4、前列腺癌细胞系LnCAP和PC3、胰腺细胞系Pane 1和单核细胞样细胞系 U937在内的多种细胞中分泌。在前列腺癌细胞系LnCAP中发现未加工的蛋白MIC-I与胞外 基质(ECM)呈相关性，而成熟MIC-I定位于条件培养基13。对转染的犬肾细胞(MDCK)的初 步研究也表明ECM的相关性也由前肽的C端区域在氨基酸144-195处介导。另外，纯化重 组前肽和蛋白MIC-I通过相同的前肽C端与肝磷脂相互作用。蛋白MIC-I和ECM的相关性表明ECM相关性可以提供潜在的MIC-I的局部储存 量，其中对储存的蛋白MIC-I的加工会导致成熟MIC-I (对ECM几乎没有亲合力)快速释放 到循环中。为检验这种观点，建立了异种转植肿瘤裸鼠模型14。材料与方法使用DU145人类前列腺癌细胞系，没有内生MIC-I (主要是因为细胞不产生功能性 P53)，因此，可以作为表达不同人类MIC-I构建的载体，得到永久转染、亚克隆的DU145细胞
7系(转导了真核表达载体(IRES II EGFP 载体，Clontech Laboratories, Inc.，Mountain View, CA，美国))，其包含编码以下任一种的序列(i)人类蛋白MIC-I全长(除利用FSH 前导序列，而非天然前导序列V，( )成熟人类MIC-I (没有前肽，但包括FSH前导序列)，
(iii)人类蛋白MIC-I(包括FSH前导序列)，缺失包含类弗林蛋白转移酶位点(用粗体表 示)的氨基酸序列RGRRRAR(SEQ ID NO :2)，从而阻止加工和随后成熟MIC-I从前肽中释放，
(iv)仅阴性对照载体5。高表达亚克隆基于EGFP表达而筛选出来。这些细胞经皮下注射到免疫不全BALB/ cnu/nu裸鼠的侧面。定期监测鼠，每2-3天测定其体重。注射2个月后或当肿瘤直径达到 1.1cm时处死鼠。在处死之前取得鼠的血清，通过ELISA4’14_16评估人类MIC-I的水平。用 于人类MIC-I的ELISA不会与鼠MIC-I交叉反应，且之前成功地、专用地用于测量鼠的人类 肿瘤MIC-I水平140结果结果如图2和3。表达成熟MIC-I的肿瘤鼠显示血清MIC-I显著地提高。与此 相反，表达MIC-1FURIN DEL突变体(其不能正常加工，因此保留了前肽)的肿瘤鼠的血清 MIC-I水平明显较低。通过体外和体内数据的外推法，显示这个结果是由于FURIN DEL突变 体和ECM之间的紧密的相关性。讨论该实施例结果表明MIC-I前肽对调节MIC-I在血液和组织间的分配是很重要的。 这样，任何结合MIC-I前肽的底物或竞争前肽的基质结合位点(如重组纯化前肽自身)的 底物(如肝磷脂和乙酰肝素硫化物)，可以预期增加循环中的MIC-I水平。因此，血清MIC-I 介导的功能可被调控。实施例2通过MIC-I调节食欲在实施例1的研究过程中，注意承载过度表达MIC-I的肿瘤异种移植模型鼠，与对 照鼠相比，或者失重，或者不会增加那么多重量。因此，这引导了对鼠重影响程度和原因的 研究。材料和方法将鼠处死前称重，失重(重)与测定的血清MIC-I水平进行相比(即如实施 例1的通过ELISA测定)。为评估血清MIC-I水平是否与观察到的失重有关，进行了第二项研究，其中裸鼠 经皮下注射过度表达成熟人类MIC-I (之前与最高血清MIC-I水平呈相关)的DU145克 隆，第27天，鼠减少大量体重后，经腹膜注射Img或IOmg对照纯化羊IgG或从羊(之前用 重组人类MIC-I获得免疫，对人类MIC-I有高滴定量的抗体)血清纯化的IgG。羊抗人类 MIC-IIgG与高粘附人类MIC-I产生反应，之前用于MIC-I ELISA中。为了进一步证明观察到的失重由MIC-I介导，没有其他的肿瘤获得性产物，利用 两个转基因鼠系(min28和min75，均由C57B16鼠获得)来评估失重，其在巨噬细胞特异性 c-fms启动子的调控下过度表达鼠MIC-I。结果羊抗人类MIC-I IgG的研究中，发现Img羊抗人类MIC-I IgG对鼠的体重没有差 异(数据没有表示)，然而，IOmg羊抗人类MIC-IIgG(图4A)诱导每个承载肿瘤的裸鼠体重快速增加(cf.图4B为IOmg对照IgG的结果)。施加抗体后5_6天体重增加达到最高，然 后在接下来第7-10天开始逐渐失重。转基因鼠系min28和min75失重评估结果如图5_7所示，表明这些鼠也比它们的 野生型同窝小很多。这些鼠出生时的体重是相同的，在生命刚开始的几个星期体重开始出 现差异。讨论可以观察到一些鼠失重很严重，且发现失重与肿瘤获得性人类MIC-I的血清水平 相关。到目前为止，转导了过度表达成熟人类MIC-I的DU145克隆的鼠具有最高血清MIC-I 水平，这些鼠以非常快的速度失重。对动物行为的观察表明其主要原因是这些鼠的食物摄 取显著降低。通过施加羊抗-MIC-I IgG(不是对照IgG)可以逆转失重的发现证实了失重 归因于MIC-I。这通过转基因鼠系min28和min75的失重评估得到确证。尽管MIC-I表达 是巨噬细胞特异性的，血清MIC-I水平显著上升的鼠，与同类系野生型鼠相比，可以观察到 体重有显著的差异。由于转基因鼠系和同类系野生型具有相同的出生重量(即出生后24h 测得)，这种失重效应出生后开始出现。实施例3与分泌肿瘤MIC-I相关的失重通过施加抗MIC-I单克隆抗体而逆转结果和讨论利用裸鼠建立异种移植鼠模型(如前所述)，裸鼠侧面注射了过度表达成熟MIC-I 的DU145细胞。注射了过度表达成熟MIC-I的DU145细胞的鼠开始迅速失重。仅施加MIC-I 单克隆抗体(MAb26) 0. 1-lmg,第11天，使体重开始增加，量值和持续时间随着MAb26的增加 而增加(图8A-C)。最高剂量约Img时，体重上升至异种移植前水平，17天后又下降到首先 施加抗体时的体重。MAb26对肿瘤生长(图8D-F)、未处理鼠(图8G)和仅用磷酸盐缓冲液 (PBS)处理鼠(图8F)没有影响，在试验期间快速不断地失重。实施例4异种移植鼠模型食物摄取结果材料与方法利用裸鼠建立异种移植鼠模型(如前所述)，裸鼠侧面注射了过度表达成熟MIC-I 的DU145细胞或承载对照质粒。注射了过度表达成熟MIC-I的DU145细胞后8天，当平均 肿瘤体积为56mm3且平均失重7%时，连续测定3个24小时时间周期的食物摄取。鼠放置 于5个笼子分组。食物放置于送料斗，在时间点0称量体重。24小时后，通过放入到送料斗 的食物重减去剩余量和溢出量，来评估食物的消耗量。对照鼠的食物摄取也以相同的方式 测定，但是在肿瘤注射第21天，当平均肿瘤体积达到70mm3时测定。结果注射了过度表达MIC-I 的 DU145 的鼠在第 1 (ρ = 0. 01)、第 2 (ρ = 0.0001)、第 3 天(P = 0. 02)比对照鼠摄食明显要少(约30% )(图9)。这些鼠脂肪量的直接测定表明 过度表达的MIC-I与附睾的、腹股沟的、腹膜后区域脂肪量显著下降呈相关，而在两块代表 性肌肉中脂肪量没有下降(图10)。实施例5异种移植鼠模型血清新陈代谢标记物的确定材料与方法利用裸鼠建立异种移植鼠模型(如前所述)，裸鼠侧面注射了过度表达成熟MIC-I 的DU145细胞或对照DU145细胞。注射过度表达MIC-I的DU145肿瘤细胞后第11_16天，注射对照肿瘤第21-30天，当肿瘤体积达到100-200mm3，和/或鼠失重约18%时，将鼠处死。 从之前的实验，可以知道肿瘤获得性人类MIC-I的血清水平在15-58ng/ml之间。心脏穿刺 收集血清，商业化免疫分析来化验新陈代谢标记物。T检验进行统计比较。结果和讨论鼠的一系列新陈代谢标记物的测定表明MIC-I过度表达肿瘤鼠的甘油三酸酯、自 由脂肪酸、胰高血糖素和IGF-I呈统计学显著下降(数据没有显示)。瘦素水平也有下降与 脂肪量下降相一致，表明MIC-I降低食物摄取不太可能由MIC-I刺激物瘦素来介导。葡萄 糖的差异低于统计学显著性，为P = · 053。这些发现很大程度上是与饥饿和减少脂肪量相
一致的。实施例6异种移植鼠模型脂肪垫和肌肉重的测定材料与方法利用裸鼠建立异种移植鼠模型(如前所述)。20只鼠侧面注射过度表达成熟MIC-I 的DU145细胞，20只鼠侧面注射转导对照质粒的DU145细胞。注射过度表达MIC-I的DU145 肿瘤细胞后第11-16天，注射对照肿瘤第21-30天，当肿瘤体积达到100-200mm3，和/或鼠 失重约18%时，将鼠处死。仔细切割、去除并称重肩胛间棕色脂肪组织、腹股沟、附睾、腹膜 后脂肪、胫骨、腓肠肌，并用体重校正重量。结论与讨论棕色脂肪没有减少，但是腹股沟、附睾、腹膜后脂肪的身体脂肪(即白色脂肪)显 著减少(图10)。两组鼠的肌肉重之间没有显著差异(图10)。然而，PIXImus成像仪(GE Lunar)进行更灵敏的总瘦体重分析表明瘦体重全面下降。这也证实了总脂肪量和腹部脂肪 量减少更多。实施例7MIC-1转基因鼠结果与讨论转基因鼠单核细胞在c-fms启动子的调控下过度表达MIC-1。这些鼠自身升高 MIC-I水平，看起来良好，且正常繁殖。它们不能区别于野生型鼠，但是从3周开始生长明显 延迟，且进入成熟期(图5-7)。这些效应在两个独立的转基因系min75和min28中都有观察到。如肿瘤异种移植鼠，过度表达MIC-I转基因鼠比其野生型同伴进食明显要少，但 是如果食物摄取量经鼠重校正后，这种差异就没有了(图11)。人们相信出生后Mic-I水平 上升导致食物摄取的下降和达到平衡，食物摄取下降导致大小减小，达到平衡时它们的大 小与其减少的食物摄取量是相称的。如肿瘤异种移植鼠一样，测定转基因动物中相同的新 陈代谢标记物，显示MIC-I转基因鼠中仅IGF-I水平有显著的差异，其水平降低了。腹股沟、附睾/子宫和腹膜后区域脂肪量的测定显示过度表达转基因鼠中脂肪 量的下降，相比于公鼠，母鼠表现更为突出(图12)。除了脾稍小，胸腺稍大外，所有三个分 析的脂肪垫在大小上都有所减小。按绝对值计算，WT和TG胸腺重之间没有差异。实施例8胎球蛋白对血清MIC-I水平的调控可能像一些其他TGF-β总科细胞因子一样，血清MIC-I (所有受试者中的中值浓 度为450pg/ml)可以结合一种或多种循环调节剂。糖蛋白，胎球蛋白在细胞和组织里广泛
10表达，存在于血液血清中。接下来的研究是用于确定MIC-I是否与这些糖蛋白发生反应。材料与方法纯化重组细胞，成熟MIC-I (溶于0. 1 % BSA)用胎球蛋白包膜琼脂糖颗粒进行孵 育；然后洗涤微粒，利用抗-MIC-I抗体Western杂交后SDS-PAGE具体分析带1 纯化重组 MIC-I ；带2 结合胎球蛋白颗粒的MIC-I ；带3 仅胎球蛋白颗粒；带4 仅用琼脂糖颗粒孵 育的MIC-I。结果与讨论结果如图13所示，清楚地表明成熟MIC-I与胎球蛋白反应且结合胎球蛋白。胎球 蛋白从而提供一个选择一使用抗MIC-I抗体从患者血液中去除MIC-I来调节体重。实施例9正常鼠脑MIC-I表达分析结果与讨论食物摄取与胃口由一系列复杂机制来调控，其中很多位于中央神经系统内。调控 许多基本身体功能如胃口和体温的神经系统内的区域局限于视丘下部区域内。就胃口来 说，调节这个过程的许多复杂的因子位于视丘下部的弓状核，调控的许多介质或受体如神 经肽Y位于这个区域。这个区域的血脑阻塞也是有漏洞的，且血脑阻塞是脑部一个非常有 限的区域，这个区域使自身分子有机会跨过血脑阻塞，在脑部直接反应。人们认为Mic-I可 以通过这种机制在弓状核和视丘下部发挥直接作用。然而，MIC-I也在正常鼠脑的这些区 域内表达(图14)。这并不代表如原位杂交研究中所指出的循环Mic-I的扩散，原位杂交研究表明弓 状核、脑室周和视旁视丘下部区域的MIC-ImRNA和蛋白质的协同局部化。正常脑部那些区 域的MIC-I局部化，与如胃口控制等功能非常相关，这引起了关于来自末梢循环和脑内自 生的MIC-I在调控这种重要功能中扮演的角色的强烈争议。实施例10血清Mic-I水平与前列腺癌晚期患者失重程度呈相关结果与讨论为测定MIC-I与人类恶病质的关联，测定了表现良好的前列腺癌晚期患者(PCa) 的血清MIC-I水平，其中血清IL-6水平与恶病质呈相关性17。与没有患前列腺癌晚期恶病质 的病人相比，患前列腺癌晚期恶病质的病人的血清MIC-I水平显著上升(12416士 10235pg/ mlVS 3265 士 6370pg/ml (平均值士SD) ；ρ = 0. 0001 ；非参数检验方法-秩和检验 (Mann-Whitney-U检验))。相似地，恶病质患者中血清IL-6水平也上升了(33. 8 士 64. 2pg/ ml VS 7. 8 士 3. 4pg/ml，p < 0. 002 ；非参数检验方法-秩和检验(Marm-Whitney-U 检验))。 而且，血清MIC-I很弱但显著地与血清IL-6水平正相关(r = 0. 2949，ρ < 0. 04 ；线性回 归)。此外，在单变量和多变量回归分析中，血清MIC-I和IL-6水平是癌症恶病质存在的单 独的预测因子(分别为P = O. 0002，ρ < 0. 0001 ；单变量回归分析，分别为ρ = 0. 0017，ρ =0.0005;多变量回归分析)。然而，最客观，可计量测定恶病质的是失重。血清MIC-I水 平和与失重关联的前列腺癌级别显著相关(P = 0. 0002,r = 0. 4899 ；线性回归)，而和血清 IL-6之间没有这样的相关性(ρ = 0. 6303 ；线性回归)。实施例11血清MIC-I水平与慢性肾衰竭患者BMI呈相关性结果与讨论慢性肾衰竭，就像癌症晚期一样，也是一般与失重和恶病质相关。这个过程的标志
11如厌食、失重和BMI在肾衰竭末期是死亡率的有力的预测因子18。由于BMI是死亡率有力 的预测因子，且上升的血清MIC-I水平与动物相似的变化呈相关性，因而研究了肾衰竭末 期血清MIC-I水平和BMI之间的相关性。因此，检测了 381个肾衰竭末期患者的血清样本， 这些血清样本在这之前没有用来研究恶病质或其他新陈代谢过程19。在研究期间(长达三年)死亡的患者的BMI显著要低(26. 17士5. 63 ；266 (平均值 士 SD ；η), 23. 15 士 4. 92 ；104 :ρ < 0. 0001 ；不配对t检验)。在研究开始获取透析血清样本， 测定MIC-I血清水平。血清MIC-I水平与BMI相互关联，渐增的血清MIC-I水平与降低的 BMI相互关联(ρ = 0. 0003 ；r = 0. 189 ；线性回归)。在说明书中，词语"包含"意思是为整体的包含物，而不是排除在整体以外。在该说明书里所有公开内容都以参考文献作为参考。本说明书中关于文件、法规、 原料、装置、文章等等的讨论仅用来提供本发明的背景条件。在本申请权利要求的优先权日 之前，与本发明相关的现有技术或本领域普通技术即已经在澳大利亚或其他地方存在，因 此，不在本发明的保护范围内。本领域技术人员可以对本发明进行没有脱离本发明范围的多种变化和/或修饰， 因此，本发明的实施例为说明性的，而非限制性的。参考文献I. Bootcov MR et al, MIC-I, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member ofthe TGF-β superfamily cluster. Proc Natl Acad Sci USA 1997 94 :11514-11519.2. Breit SN & MR Bootcov, " Novel TGF-beta like cytokine" ,International Patent ApplicationNo PCT/AU96/00386 (WO 97/00958).3. Fairlie WD et al. , Expression of a TGF-β superfamily protein, Macrophage InhibitoryCytokine-I, in the yeast Pichia pastoris. Gene 2000254 67-76.4. Moore AG et al, TGF-β superfamily cytokine MIC-I is present in high concentrations in theserum of pregnant women. J Clin Endocrinol Metab 2000 85 4781-4788.5.Fairlie WD et al,Epitope mapping ofthe Transforming Growth Factor-13 superfamily protein, MIC-I identification of at least five distinct epitope specificities. Biochemistry 2001 40:65-73.6.Breit SN et al.，" Diagnostic assay and method of treatment involving macrophage inhibitorycytokine-1(MIC-I)" , International Patent Application No PCT/AU01/00456(WO 01/81928).7. Fairie WD et ah, MIC-I is a novel TGF-β superfamily cytokine associated with macrophageactivation. J Leukocyte Biol 1999 65 :2_5.8. Koniaris LG, Induction ofMIC-1/growth differentiation factor-15 following bile duct injury.JGastrointest Surg 20037(7) :901_905·9. Welsh JB et al, Analysis of Gene Expression Identifies Candidate Markers andPharmacological Targets in Prostate Cancer. Cancer Res 2001 61
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权利要求
一种治疗或预防恶病质的方法，其特征在于，包括抽取表现为恶病质或倾向于发展成恶病质的受试者的血液、血浆或血清进行活体外处理，从而去除或灭活所述血液、血浆或血清中的巨噬细胞抑制因子 1(MIC 1)，然后，将处理后的血液、血浆或血清返回到所述受试者。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述受试者患有癌症、慢性肾病或慢性炎症。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述受试者的血清MIC-I水平上升至 3. 7-50ng/ml 以上。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤 (i)准备结合MIC-I的合适底物；( )活体外使受试者中的血液、血浆或血清与所述底物接触，从而，血液、血浆或血清 中的MIC-I结合到底物上；(iii)分离底物与处理后的血液、血浆或血清；(iv)将处理后的血液、血浆或血清返回到受试者中。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，利用MIC-I结合分子，血液、血浆 或血清中的MIC-I被去除或灭活。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤 (i)准备可结合合适底物的MIC-I结合分子；( )活体外使受试者中的血液、血浆或血清与所述可结合合适底物的MIC-I结合分子 接触，从而，血液、血浆或血清中的MIC-I通过MIC-I结合分子结合到底物上；(iii)分离底物与处理后的血液、血浆或血清；(iv)将处理后的血液、血浆或血清返回到受试者中。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述MIC-I结合分子为抗MIC-I抗体 或其功能性片段。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述MIC-I结合分子为胎球蛋白或其 MIC-I结合片段。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述受试者患有慢性肾病，且所 述方法被纳入所述受试者的血液透析疗法中。
10.一种诊断或预防受试者恶病质的方法，其特征在于，所述方法包括测定所述受试者 的MIC-I的量。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测受试者的血清MIC-I 水平是否上升至3. 7-5. Ong/ml或以上。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，通过权利要求1-9任一项所述的 方法或，通过对受试者施加MIC-I抑制剂，可识别可治疗/可预防的恶病质。
全文摘要
本发明公开了一种通过去除或灭活恶病质受试者血液、血浆或血清中的巨噬细胞抑制因子-1(MIC-1)而治疗恶病质的方法。该方法包括准备结合MIC-1的合适底物(如具有MIC-1结合分子的底物)；活体外使受试者中的血液、血浆或血清与所述底物接触，从而，血液、血浆或血清中的MIC-1结合到底物上；分离底物与处理后的血液、血浆或血清；将处理后的血液、血浆或血清返回到受试者中。本发明还公开了一种诊断或预防受试者恶病质的方法，该方法包括测定所述受试者的MIC-1的量。
文档编号A61P3/04GK101896192SQ200880120824
公开日2010年11月24日 申请日期2008年10月9日 优先权日2007年10月9日
发明者塞缪尔·诺伯特·布赖特 申请人:圣文森特医院悉尼有限公司