脂质体万古霉素制剂的制作方法

专利名称：脂质体万古霉素制剂的制作方法
脂质体万古霉素制剂相关申请本申请要求保护2007年10月23日申请的美国临时申请号60/981，990和2008 年10月8日申请的61/103，725的专利权，这两篇申请都通过引用结合到本文中。
背景技术：
万古霉素是由放线菌(Actinobacteria)东方拟无枝酸菌(Amycolaopsis orientalis)发酵产生的一种支链三环糖基化非核糖体肽抗生素。据信万古霉素是通过 抑制革兰氏阳性菌细胞壁的正确合成而起作用。另外，万古霉素还改变细胞膜通透性和 RNA合成。因此，万古霉素通常用于预防和治疗由对其它类型的抗生素无反应的革兰氏 阳性菌引起的感染。万古霉素通常用作对其它一线抗生素具有耐药性的感染的最终治疗 手段。这是因为，对于大多数适应症而言，万古霉素是经静脉内给予。另外，还考虑到万 古霉素相关毒性，万古霉素具有毒性问题，并且已经开发出半合成青霉素并可优选使用。 然而，万古霉素的使用已经增加，尤其是随着70年代开始的多重耐药性金黄色葡萄球菌 (multiple-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的扩散。万古霉素通常经静脉内给予，因为它不能穿过肠内壁。因为会引起疼痛和血栓性 静脉炎，所以必须缓慢给药，使用稀溶液并且时间至少在约60分钟以上。万古霉素活性是 时间依赖性的。因此，其抗菌活性依赖于药物水平超过目标生物体的最低抑制浓度(MIC) 的时间长短。例如，通常给予万古霉素，使其血液水平保持在约10-20mcg/mL。成人静脉内 给予万古霉素的量通常为6小时内经静脉内输注约500mg或12小时约lg。儿童静脉内接 受万古霉素的量为6小时内约10mg/kg。婴儿和新生儿静脉内可接受万古霉素的最初用量 在出生第一周为12小时内约15mg/kg，以后为12小时内10mg/kg，然后每8小时1次直到出 生后1个月。通常，万古霉素的成人口服量为每天约500mg至2g，分3或4次服用，连服约 7-10天。通常给予儿童的量为约40mg/kg/天(至多2g/天)，分3或4次服用，连服7-10 天。万古霉素已用于治疗假膜性结肠炎，其中经口服给药以到达感染部位。万古霉素 也已在标签之外(off-label)用于通过使用喷雾器而吸入给药，以治疗呼吸道感染。囊性纤维化(CF)患者在肺部具有浓厚粘液和/或痰液分泌，频繁的继发感染和细 菌定殖所导致的生物膜。所有这些液体和材料都是抗感染药有效靶向感染的屏障。本说明 书的一方面克服这些屏障，并且甚至允许减少给予(量或频次)，因而减少患者的药物负荷 并有可能改善患者的依从性。通常对于肺部感染，本发明提供的给药方案提供了降低药物 负荷的方法。囊性纤维化也可导致支气管扩张。支气管扩张是由粘液阻塞而导致的呼吸道 异常拉伸和增大。当机体不能清除粘液时，粘液变粘并刺激气道。阻塞和伴随而来的感 染引起炎症，导致通道的弱化和扩张。弱化的通道可具有瘢痕和变形，更易受到粘液和 细菌的刺激，导致感染和阻塞气道的循环。支气管扩张是引起部分支气管分枝局部不可 逆扩张的一种疾病。受累支气管扩张、发炎并容易扭曲，导致气流阻塞和分泌物清除受 阻。支气管扩张与多种疾病相关，但通常是由坏死性细菌感染所致，所述感染例如由葡萄球菌(Staphylococcus)或克雷伯氏菌(Klebsiella)或百日咳鲍特氏菌(Bordatella pertussis)所致的感染。支气管扩张是一种慢性阻塞性肺病(COPD)并可并发肺气肿和支气管炎。该病通 常被错误诊断为哮喘或肺炎。支气管扩张可在任何年龄发病，通常大部分是在儿童期开始， 但症状可能不明显，直到过很久才明显。支气管扩张可以是出生缺陷的组成部分，例如原发 性纤毛运动障碍或囊性纤维化。在美国，所有支气管扩张病例中约有50%是由囊性纤维化 所致。它也可以是在出生后因损伤或肺结核、肺炎和流感等其它疾病所致而发病。支气管壁扩张导致气流阻塞和分泌物清除受阻，因为扩张区破坏了支气管道的正 常气压，使痰液聚集在扩张区内，而不是向上推出。聚集的痰液提供了有利于感染性病原体 生长的环境，而且肺部的这些区域因此而易于受到感染的攻击。肺部遭受的感染越多，对肺 组织和肺泡的损伤就越多。当这发生时，支气管道变得更缺乏弹性和扩张，由此产生该疾病 的永久的破坏性循环。有3类支气管扩张，严重程度各不相同。纺锤状(柱状)支气管扩张(最常见的 类型)是指轻度发炎的、在末梢不能逐渐变细的支气管。在曲张状支气管扩张中，支气管壁 出现串珠状，因为扩张区与收缩区混合。囊状(囊性)支气管扩张的特征是支气管外周严 重不可逆的气囊，伴有或无气_液面。慢性排痰性咳嗽是显著症状，在高达90%的支气管扩 张患者中都有发生。有76%患者每天都产生痰液。支气管扩张既有先天性原因也有获得性原因。一个常见的遗传性原因是囊性 纤维化，其中少量患者发生严重局限性支气管扩张。另一个遗传性原因或贡献因子包括 Kartagener综合征、Young综合征、α 1_抗胰蛋白酶缺陷和原发性免疫缺陷。获得性支气管扩张发生得更频繁，一个最大原因是肺结核。该病在儿童中的一 个特别常见的原因就是起源于人免疫缺陷病毒的获得性免疫缺陷综合征。支气管扩张的 其它原因包括呼吸道感染、阻塞、吸入和误吸(aspiration)氨气和其它有毒气体、肺吸入 (pulmonaryaspiration)、酒精中毒、使用海洛因和变态反应。吸烟也可促发支气管扩张。对支气管扩张的诊断是根据对临床史的回顾和高分辨率CT扫描结果的特征性模 式的发现。这类模式包括“tree-in-bud”异常和具有明确边界的囊。如果临床史清楚表明 频繁的呼吸道感染，并经血分析和痰培养标本证实潜在问题后，无需CT扫描证实，也可诊 断支气管扩张。症状包括咳嗽(平躺时加重)、气促、异常胸音、虚弱、体重减轻和疲劳。伴随感染， 粘液可能变色、带腐烂气味并可带血。症状的严重程度在患者与患者之间有很大差异，并且 有时候，患者并无症状。对支气管扩张的治疗旨在控制感染和支气管分泌、减轻气道阻塞和预防并发症。 这包括延长使用抗生素以预防有害感染，以及用体位引流和胸腔物理疗法消除积聚的液 体。手术也可用于治疗局限性支气管扩张，消除能引起疾病发展的阻塞。持续坚持吸入留体治疗可减少痰液产生，并且在一段时间内减少气道收缩将会阻 止支气管扩张的发展。一种常用的治疗是二丙酸倍氯米松，也用于哮喘的治疗。沙丁胺醇 (沙丁胺醇)、氟替卡松(Flovent/Flixotide)和异丙托品(Atrovent)等吸入剂的使用可 通过清除气道并减少炎症而有助于降低感染的可能性。FDA已经批准名为Bronchitol的甘露醇吸入干粉剂用于伴有支气管扩张的囊性纤维化患者。最初在2005年2月获批准的该罕用药的适应症允许其用于治疗支气管扩张。 最初的批准是基于2期临床研究的结果，其结果表明产品是安全的，具有良好耐受性，能有 效刺激粘液的液化/清除，因此可改善慢性阻塞性肺病(例如支气管扩张)患者的生活质 量。长期研究在2007年开始进行，以确保治疗的安全性和有效性。通常给予支气管扩张患者用于对付感染的抗生素和用于打开通道的支气管扩张 药物。有时，给予长期抗生素以预防复发性感染，尤其是在患有囊性纤维化的病人中。也有 物理性治疗技术以帮助清除粘液。肺移植对于严重病例而言也是一种备选方案。致死并不 常见，但大量出血就有可能会致死。如果肺部感染得到及时治疗的话，较少可能发生支气管 扩张。肺炎是一种肺及呼吸系统的疾病，其中肺泡(显微镜可见的肺部充气小囊，负责 从空气中吸收氧气)发炎并涌进液体。肺炎可因各种不同原因所致，包括细菌、病毒、真菌 或寄生虫的感染，以及对肺部的化学或物理伤害。肺炎相关的典型症状包括咳嗽、胸痛、发 热和呼吸困难。诊断工具包括χ射线和痰液检查。通过将万古霉素等药物例如经由吸入给予患者肺部，对上述疾病进行治疗是特别 有利的。药物吸入将药物更直接递送到患病部位，并减少了药物的全身暴露。适于供吸入给药的某种缓释技术采用了基于脂质的制剂(例如脂质体)，以通过 缓释方式在肺部和全身提供延长的药物治疗效果，并提供靶向和增强将药物摄取到患病部 位的能力。对于脂质体药物递送系统，通常希望尽可能地将脂质与药物(L/D)比例降至最 低，以减少脂质负荷，避免在体内的饱和效应。对于通过吸入的肺部递送而言，这一点特别 正确，因为长期使用，脂质体的给予可超过脂质从肺部的清除，因此限制了给药并因此限制 了药品的有效性。降低L/D比例将会在满足给予/清除阈值之前允许给予更多药物。另外， 降低L/D比例减少了患者经历吸入治疗所需要花费的时间长短，因为药物浓度更高。因此， 降低L/D比例可便于给药并增加了患者的舒适性和依从性。发明概述本发明的一个目标就是提供具有低的脂质/药物比例的基于脂质的万古霉素制 剂。在一个实施方案中，本发明涉及脂质体万古霉素，所述脂质体万古霉素包含脂质体和万 古霉素。在某些实施方案中，万古霉素包封在所述脂质体中。在其它实施方案中，万古霉素 是在包封在脂质体内的含水介质中，例如所述含水介质是含水胶凝剂或粘稠混悬剂。在某些实施方案中，在所述含水介质中万古霉素浓度为约25-400、约25-200、约 30-175、约 40-150、约 40-125、约 40-100、约 40-80、约 45-80、约 50-75、约 50-65、约 40-70、 约 40-60 或约 45-55mg/mL。在某些实施方案中，所述脂质体包含至少一种脂质，并且所述组合物中脂质与万 古霉素的比例为约3 1或以下。在某些实施方案中，所述脂质与万古霉素的比例为约 0.1 1-3 1。在其它实施方案中，所述脂质与万古霉素的比例为约0.1-1。在某些实施方案中，所述脂质体的平均粒径为约0. 1-5、约0. 1-2、约0. 1-2. 5、约 0. 5-3、约 0. 5-2、约 1-3、约 1. 25-3 微米或约 1. 5-2. 5 微米。在某些实施方案中，所述脂质体包含选自以下的脂质磷脂酰胆碱类(PC)、磷脂 酰甘油类(PG)、磷脂酸类(PA)、磷脂酰肌醇类(Pl)、磷脂酰丝氨酸类(PS)及其混合物。在 其它实施方案中，所述脂质体包含选自以下的脂质卵磷脂酰胆碱(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、卵磷脂酰肌醇(EPI)、卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、磷脂酰乙醇胺(EPE)、卵磷脂酸(EPA)、 大豆磷脂酰胆碱(SPC)、大豆磷脂酰甘油(SPG)、大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)、大豆磷脂酰肌 醇(SPI)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)、大豆磷脂酸(SPA)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化 卵磷脂酰甘油(HEPG)、氢化卵磷脂酰肌醇(HEPI)、氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)、氢化磷脂 酰乙醇胺(HEPE)、氢化磷脂酸(HEPA)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、氢化大豆磷脂酰甘油 (HSPG)、氢化大豆磷脂酰丝氨酸(HSPS)、氢化大豆磷脂酰肌醇(HSPI)、氢化大豆磷脂酰乙 醇胺(HSPE)、氢化大豆磷脂酸(HSPA)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱 (DMPC)、二豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油烯基磷脂酰-乙醇胺(DOPE)、棕榈酰硬脂酰磷脂 酰胆碱(PSPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰甘油(PSPG)、一油酰-磷脂酰乙醇胺(MOPE)、生育酚、 脂肪酸的铵盐、磷脂的铵盐、甘油酯的铵盐、十四胺、十六胺、十二胺、十八胺、二月桂酰乙基 磷酸胆碱(DLEP)、二豆蔻酰乙基磷酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂 酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N- (2，3- 二- (9- (Z)-十八碳烯基氧基)_丙基-N，N，N-三甲 基氯化铵(DOTMA)、1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)、二硬脂酰磷脂酰甘 油(DSPG)、二豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二豆 蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二豆 蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS) 及其混合物。在其它实施方案中，所述脂质是磷脂酰胆碱。在其它实施方案中，所述脂质是 饱和磷脂酰胆碱，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。在某些实施方案中，所述脂质体不包含固醇。在其它实施方案中，所述脂质体包含 基本上由磷脂酰胆碱组成的脂质。在其它实施方案中，所述脂质基本上由DPPC组成。在某些实施方案中，至少约50%万古霉素在喷雾工艺(nebulization process) 期间保留在脂质体内。本发明的另一方面涉及制备万古霉素脂质体制剂的方法，所述方法包括a)将含醇脂质溶液注入含水/含醇万古霉素溶液中，形成初始万古霉素脂质体制 剂；和b)除去所述醇，形成所述万古霉素脂质体制剂。在某些实施方案中，步骤b)还包括从所述万古霉素脂质体制剂中除去未包封的
万古霉素。在某些实施方案中，所述醇是乙醇。在某些实施方案中，所述醇通过透析或渗滤或离心而除去。在其它实施方案中，所述含水/含醇万古霉素溶液的万古霉素浓度为约 100-500mg/mLo在其它实施方案中，所述含醇脂质溶液的脂质浓度为约50-250mg/mL。根据以下描述、附图和所附权利要求书，本发明的这些实施方案、其它实施方案以 及它们的特性和特征都将会是显而易见的。附图简述

图1描绘了在生理条件下万古霉素从两种不同脂质体制剂中释放的图。图2描绘了在不同贮存温度下万古霉素从典型脂质体万古霉素制剂中渗漏。
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图3描绘了典型脂质体制剂通过密度梯度分级。脂质体群体是均勻的，其脂质/ 药物比例在群体中是一致的。图4描绘了在用吸入脂质体万古霉素和吸入可溶性万古霉素治疗后患有肺炎和 脓毒症的Swiss Webster小鼠的存活图。图5描绘了在用吸入脂质体万古霉素和吸入可溶性万古霉素治疗后患有肺炎和 脓毒症的Swiss Webster小鼠的存活图。图6描绘了在用盐水、吸入脂质体万古霉素和腹膜内注射万古霉素治疗的小鼠肺 的LogltlCFU/肺的图。图7描绘了治疗后3天在小鼠肺中万古霉素水平的剂量依赖性增加的图。图8描绘了在不同条件下万古霉素暴露后的肺中的菌落形成单位(CFU)的检测 图。发明详述I.定义为了方便起见，在进一步描述本发明之前，将本说明书、实施例和所附权利要求书 所用的某些术语汇集在此。根据本公开的其余部分的内容，本领域技术人员应当阅读并理 解这些定义。除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本领域普通技术人员公 知的含义。术语“肺病(pulmonary distress) ”是指人类呼吸道相关的任何疾病、小病或其它 不健康病症。通常肺病(pulmonary distress)导致呼吸困难。术语“治疗”是本领域公知的并且是指治愈以及改善任何病症或疾病的至少一种症状。术语“预防”是本领域公知的并且是指将一种或多种主题组合物给予受试者。如 果在有害的病症(例如宿主动物的疾病或其它有害的状态)的临床表现之前给予，则治疗 就是预防性的，即它保护宿主以免患上有害的病症，而如果在有害的病症表现之后给予，则 治疗就是治疗性的(即旨在减少、改善或维持现有有害的病症或其副作用)。术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”是指能使患者症状得到预防或改善或产生 期望的生物学结果(例如改善临床病征、延迟疾病发作、降低细菌水平等)的化合物的量。用本发明方法治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”可指人或非人类动物。术语“哺乳动物”是本领域公知的，示例性哺乳动物包括人、灵长类、牛、猪、犬、猫 和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。术语“生物可利用的”是本领域公知的，是指允许被所给予的受试者或患者吸收、 掺入或其它生理上可利用的本发明形式或给予量的部分。术语“药学上可接受的盐”是本领域公知的，是指相对无毒、化合物的无机和有机 的酸加成盐，包括例如含在本发明组合物中的那些。术语“药学上可接受的载体”是本领域公知的，是指药学上可接受的材料、组合物 或溶媒，例如液体填充剂或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其涉及将任何本 发明组合物或其成分从机体的一个器官或一部分携带或传送到机体的另一器官或一部分。 每种载体必须是“可接受的”，意即本发明组合物及其成分对患者是相容的，并且对患者无害。
术语万古霉素是指下式化合物或其药学上可接受的盐
例如，所述盐可以是盐酸盐。
^NHCH5在一个实施方案中，本发明涉及包含万古霉素和脂质体的脂质体万古霉素组合 物，例如，其中万古霉素包封在脂质体中。在某些实施方案中，万古霉素是在包封在脂质体 内的含水介质中。在某些实施方案中，脂质体内的含水万古霉素具有高万古霉素浓度，因而 形成粘稠混悬剂或胶凝剂。因此，所述组合物包括被脂质膜包封的含水万古霉素胶凝剂或 混悬剂。本发明组合物最好具有低的脂质与万古霉素的比例。对于脂质体药物递送系统， 通常希望尽可能地将脂质与药物(L/D)比例降至最低，以减少脂质负荷，从而避免在体内 的饱和效应。在一个实施方案中，上述组合物中脂质与万古霉素的重量比为约3 1或以 下，例如，约 0.1 1-3 1、约 0. 1 1-1 1、约 0. 1 1-0. 9 1、约 0. 1 1-0.8 1、 约 0.2 1-0. 75 1、约 0.25 1-0.7 1 或约 0. 35 1-0.65 1。在其它实施方案中， L/D重量例为约0. 50、约0. 55、约0. 60、约0. 65或约0. 70。在一个实施方案中，上述组合物在含水介质中具有的万古霉素浓度为约25-200、 约 30-175、约 40-150、约 40-125、约 40-100、约 40-80、约 45-80、约 50-75、约 50-65、约 40-70、约40-60或约45-55mg/mL。在其它实施方案中，万古霉素浓度为约0. 40、约0. 45、约
0.5、约 0. 55 或约 0. 60mg/mL。在另一个实施方案中，上述组合物的脂质体的平均粒径为约0. 1-5、约1. 0-5. 0、 约 1. 0-3. 0、约 1. 0-2. 0、约 1. 25-3. 0、约 1. 5-2. 5 微米、约 1. 0-2. 0 或约 1. 25-1. 75 微米。 在其它实施方案中，所述平均粒径为约1. 0、约1. 1、约1. 2、约1. 3、约1. 4、约1. 5、约1. 6、约
1.7、约1. 8、约1. 9、或约2. 0微米。本发明的脂质万古霉素制剂可包括所述脂质体的含水分散系。所述制剂可含有形 成脂质体的脂质赋形剂，以及提供合适渗透压和PH的盐/缓冲剂。所述制剂可包含药物赋 形剂。药物赋形剂可以是液体、稀释剂、溶剂或包封材料，其涉及将任何本发明组合物或其 成分从机体的一个器官或一部分携带或传送到机体的另一器官或一部分。每种载体必须是 “可接受的”，意即本发明组合物及其成分对患者是相容的，并且对患者无害。合适的赋形剂 包括海藻糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖、亮氨酸、三亮氨酸和氯化钙。其它合适赋形剂的实例包 括(1)糖类，例如乳糖和葡萄糖；(2)淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其 衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状西黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂用蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红 花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如甘 油、山梨醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂， 例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等张盐水；(18)林格液；(19) 乙醇；(20)磷酸缓冲溶液；和(21)用于药物制剂的其它无毒相容物。脂质和脂质体本发明组合物所用的脂质可以是合成的、半合成的或天然存在的脂质，包括磷脂、 生育酚、留体、脂肪酸、糖蛋白(例如白蛋白)、带负电的脂质和带正电的脂质。脂质可以是 带负电的、带正电的或中性的。在一个实施方案中，脂质制剂基本上不含带负电的脂质，基 本上不含带正电的脂质，或这两者。在一个实施方案中，脂质制剂只包含中性脂质。在另一 个实施方案中，脂质制剂不含带负电的脂质或带正电的脂质或这两者。在另一个实施方案 中，脂质是磷脂。磷脂包括卵磷脂酰胆碱(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、卵磷脂酰肌醇(EPI)、 卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、磷脂酰乙醇胺(EPE)和卵磷脂酸(EPA)；大豆对应物、大豆磷脂酰 胆碱(SPC) ;SPG、SPS、SPI、SPEJP SPA ；氢化的卵和大豆对应物(例如HEPC、HSPC)、由脂肪 酸的酯键在甘油2和3位而不同头部基团在甘油1位所构成的其它磷脂，其中脂肪酸含有 12-26个碳原子的链，头部基团包括胆碱、甘油、肌醇、丝氨酸、乙醇胺，以及相应的磷脂酸。 在这些脂肪酸上的链可以是饱和的或不饱和的，而且磷脂可以由不同链长和不同不饱和度 的脂肪酸组成。具体地讲，制剂的组合物可包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC，一种天然存在 的肺表面活性剂的主要成分)以及二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。其它实例包括二豆蔻酰磷脂 酰胆碱(DMPC)和二豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二棕榈酰磷 脂酰甘油(DPPG)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)，二油酰磷脂 酰乙醇胺(DOPE)和混合磷脂例如棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)和棕榈酰硬脂酰磷脂酰 甘油(PSPG)、三脂酰甘油(driacylglycerol)、二脂酰甘油、seranide、神经鞘氨醇、神经鞘 磷脂和一酰化磷脂例如一油酰_磷脂酰乙醇胺(MOPE)。所用的脂质可包含脂肪酸的铵盐、磷脂和甘油酯、磷脂酰甘油类(PG)、磷脂酸类 (PA)、磷脂酰胆碱类(PC)、磷脂酰肌醇类(PI)和磷脂酰丝氨酸类(PS)。脂肪酸包括碳链长 度为12-26个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸。一些具体的实例包括十四胺、十六胺、十二 胺和十八胺、二月桂酰乙基磷酸胆碱(DLEP)、二豆蔻酰乙基磷酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙 基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N-(2，3-二-(9 (Z)-十八碳烯基氧 基)_丙-1-基-N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)和1，2_双(油酰氧基)_3_(三甲基铵) 丙烷(DOTAP)。PG、PA、PI, PC 和 PS 的实例包括 DMPG、DPPG、DSPG、DMPA、DPPA、DSPA、DMPI、 DPPI、DSPI、DMPS、DPPS 禾口 DSPS、DSPC、DPPG、DMPC、DOPCjP PC。在另一个实施方案中，所述脂质体包含选自以下的脂质磷脂酰胆碱类(PC)、磷 脂酰甘油类(PG)、磷脂酸类(PA)、磷脂酰肌醇类(Pl)和磷脂酰丝氨酸类(PS)。在另一个实施方案中，所述脂质选自卵磷脂酰胆碱(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、 卵磷脂酰肌醇(EPI)、卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、磷脂酰乙醇胺(EPE)、磷脂酸(EPA)、大豆 磷脂酰胆碱(SPC)、大豆磷脂酰甘油(SPG)、大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)、大豆磷脂酰肌醇 (SPI)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)、大豆磷脂酸(SPA)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化卵磷 脂酰甘油(HEPG)、氢化卵磷脂酰肌醇(HEPI)、氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)、氢化磷脂酰乙醇胺(HEPE)、氢化磷脂酸(HEPA)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、氢化大豆磷脂酰甘油 (HSPG)、氢化大豆磷脂酰丝氨酸(HSPS)、氢化大豆磷脂酰肌醇(HSPI)、氢化大豆磷脂酰乙 醇胺(HSPE)、氢化大豆磷脂酸(HSPA)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱 (DMPC)、二豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油烯基磷脂酰-乙醇胺(DOPE)、棕榈酰硬脂酰磷脂 酰胆碱(PSPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰甘油(PSPG)、一油酰-磷脂酰乙醇胺(MOPE)、生育酚、 脂肪酸的铵盐、磷脂的铵盐、甘油酯的铵盐、十四胺、十六胺、十二胺、十八胺、二月桂酰乙基 磷酸胆碱(DLEP)、二豆蔻酰乙基磷酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂 酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N- (2，3- 二- (9- (Z)-十八碳烯基氧基)_丙基-N，N，N-三甲 基氯化铵(DOTMA)、1、2_ 二(油酰氧基)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)、二硬脂酰磷脂酰甘 油(DSPG)、二豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二豆 蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二豆 蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS) 及其混合物。在另一个实施方案中，所述脂质体包含磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱可以是不饱和 的(例如DOPC或P0PC)或不饱和的(例如DPPC)。在某些实施方案中，所述磷脂酰胆碱是 (DPPC)。在另一个实施方案中，所述脂质体不包含固醇。在一个实施方案中，所述脂质体基 本上由磷脂酰胆碱组成。在另一个实施方案中，所述脂质体基本上由DPPC组成。脂质体抗感染制剂或脂质抗感染制剂由磷脂酰胆碱HfOnDPPC)组成，目 的是可被肺部细胞(例如肺泡巨噬细胞)摄取并有助于在肺部持续释放抗感染药物 (Gonzales-Rothi ^ (1991))。带负电荷的脂质(例如PG、PA、PS和PI)除了能减少颗粒聚 集之外，还可在吸入制剂的缓释特性中起作用，以及在将制剂跨越肺部(胞转作用)以全身 摄取的转运中起作用。尽管不受任何具体理论的束缚，据信当脂质包含中性脂质，并且不含带负电荷的 或带正电荷的磷脂时，则脂质体制剂可被肺部更好地摄取。例如，当脂质仅含中性脂质时， 则脂质体可具有更好的穿透生物膜或粘液层的能力。示例性的中性脂质包括磷脂酰胆碱， 例如DPPC。脂质体是全封闭的脂质双层膜，其含有包封在内的水体积。脂质体可以是单层囊 泡(具有单一膜的双层)或多层囊泡(洋葱样结构，其特征是多膜双层，各自被水层彼此间 隔开)。双层由具有疏水性“尾部”区和亲水性“头部”区的两个脂质单层构成。膜双层的 结构使得脂质单层的疏水性(非极性)“尾部”朝向双层的中心，而亲水性“头部”则朝向水 相。脂质抗感染制剂是脂质和抗感染药的缔合。这种缔合可以是共价缔合、离子缔合、静电 缔合、非共价缔合或空间缔合。这些复合物是非脂质体的，不能包封额外的水溶性溶质。这 类复合物的实例包括两性霉素B的脂质复合物(Janoff等，Proc. Nat Acad. Sci. ,85 6122 6126,1988)和与多柔比星缔合的心磷脂。脂质包合物是一种三维笼样结构，其使用了一种或多种脂质，其中该结构包封了 生物活性剂。这类包合物包括在本发明的范围之内。前脂质体(Proliposome)是接触含水液体形成颗粒时就可变为脂质体或脂质复 合物的制剂。搅拌或其它混合可以是必要的。这类前脂质体包括在本发明的范围之内。
治疗和预防肺病的方法本发明的组合物可用于治疗或预防肺病。具体地讲，本发明的万古霉素组合物可 用于治疗囊性纤维化、支气管扩张、肺炎、COPD或肺部感染。所述肺部感染可以是革兰氏阳 性感染。在肺部感染中，可用本发明方法治疗的肺部感染是以下细菌所致的感染假单胞 菌(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、少动假单胞菌(P. paucimobilis)、 恶臭假单胞菌(P. putida)、荧光假单胞菌(P. fluorescens)和食酸假单胞菌 (P. acidovorans)),葡萄球菌、甲氧西林而 药性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (MRSA),链球菌(包括月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)),大肠杆菌(Escherichia coli)，克雷伯氏菌(Klebsiella)，肠杆菌(Enterobacter)，沙雷氏菌(Serratia)，嗜 血杆菌(Haemophilus)感染，Yersinia pesos,类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、洋葱伯克霍尔德氏菌(B. cepacia)、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B. gladioli)、 多噬伯克霍尔德氏菌(B. multivorans)、越南伯克霍尔德氏菌(B. vietnamiensis)，结核分 枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、鸟分枝杆菌复合群(M. avium complex (MAC)，鸟分 枝杆菌(M. avium)和胞内分枝杆菌(M. intracellulare))、堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)、 蟾分枝杆菌(Mxenopi)、海分枝杆菌(Mmarinum)、(M. ulcerans，或偶发分枝杆菌复合群 (M. fortuitum complex (偶发分枝杆菌(M. fortuitum)和龟分枝杆菌(M. chelonei))。在某些实施方案中，本发明涉及预防肺病或感染的方法，所述方法包括给予受试 者任一种上述组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及预防支气管扩张。在某些实施方 案中，给药是在肺部给予，例如通过气管内给予或通过吸入装置。在某些实施方案中，给药 是通过喷雾器。囊性纤维化患者特别易于罹患上述肺部感染。另外，上述肺部感染可导致支气管 扩张，其不限于、但通常会累及囊性纤维化患者。为了治疗感染，临床医师将会知道抗感染药的有效量，包括治疗、减少、改善、消除 或预防欲治疗疾病或者欲避免或治疗病症的一种或多种症状的有效量，或者产生疾病或病 症的病理学上的其它临床可辨识的改变的有效量。改善包括降低经预防性治疗的动物的感 染的发病率或严重程度。在某些实施方案中，有效量是肺部感染症状已出现之后的治疗或 改善的有效量。在某些其它实施方案中，有效量是治疗或改善经预防性治疗的动物的感染 的平均发病率或严重程度的有效量(经统计学研究测定)。在某些实施方案中，有效量足 以消除肺部感染。“消除”是指用本领域技术人员的常规方法在患者体内无法检测到感染。 例如，当肺中CFU检测不到时，就是消除了感染。在一个实施方案中，至少约25%的万古霉素在喷雾后与脂质体缔合。在另一个实 施方案中，至少约50%或至少约60%的万古霉素在喷雾后与脂质体缔合。在另一个实施方 案中，约50-95%、约50-80%或约60-75%的万古霉素在喷雾后与脂质体缔合。在另一个实施方案中，以约50-1000mg/天、100-500mg/天或250-500mg/天的万古 霉素剂量给予所述组合物。在另一个实施方案中，组合物一天给予1-4次。在其它实施方案中，组合物一天给 予1次、一天2次、一天3次或一天4次。在其它实施方案中，可在一段时间周期内的每日 治疗循环中给予组合物，或者可在一段时间周期内的每2天、每3天、每4天、每5天、每6 天或每1周1次的循环中给予组合物，时间周期可以从1周到几个月，例如，1、2、3或4周或1、2、3、4、5 或 6 个月。在一个实施方案中，所述肺病是囊性纤维化、支气管扩张或肺部感染，例如上述肺 部感染。在某些实施方案中，万古霉素给予量大于肺部感染的最低抑制浓度(MIC)。在某些 实施方案中，肺部感染的MIC为至少约0. 10微克/mL。在其它实施方案中，MIC为约0. 10 微克/mL至25微克/mL、约0. 10-10微克/mL或约0. 10-5微克/mL。在某些实施方案中，受试者肺中的LogltlCFU减少。例如，LoglOCFU可减少至少约 0. 5、约1. 0、约1. 5、约2. 0或约2. 5。在某些实施方案中，在给予所述脂质体万古霉素制剂 之后，肺中总CFU为小于约1. 0、约0. 75、约0. 5或约0. 25。在其它实施方案中，受试者肺 部的肺部感染被消除。在其它实施方案中，肺部感染比用相同剂量的游离万古霉素的吸入 治疗减少的更多。例如，与用相同剂量的游离吸入万古霉素治疗的群体相比，用脂质体万古 霉素治疗的受试者群体中肺部感染的减少率或消除率更高。在某些实施方案中，与用吸入 游离万古霉素治疗相比，用吸入脂质体万古霉素治疗群体中减少率至少高出约20、约30、 约40、约50、约70、约80或约90%。在其它实施方案中，与用相同剂量的吸入游离万古霉 素治疗相比，在更短时间内减少了肺部感染。在一个实施方案中，本发明允许将所述脂质体万古霉素直接递送到肺部，因此减 少或避免了药物的全身暴露。本发明的一个实施方案也允许减少给予万古霉素(量和/或 频次)，因而减少患者的药物负荷。囊性纤维化患者在肺部具有浓厚粘液和/或痰液分泌， 频繁的继发感染和细菌定殖所导致的生物膜。与囊性纤维化无关的肺感染有时也涉及生物 膜或粘液。这类粘液和生物膜造成了抗细菌药物有效靶向感染的障碍。脂质体或其它脂质递送系统可经吸入给予(可以是雾化喷雾剂、粉剂或气溶胶) 或通过气管内给予。优选吸入给予。在某些实施方案中，与游离药物吸入或药物胃肠外形 式相比，所述给予频次更低和/或具有增加的治疗指数。另外，与游离药物吸入相比，所需 万古霉素治疗剂量的给予时间减少。因此，在某些实施方案中，所述脂质体万古霉素制剂比 同样剂量游离药物的吸入更有效。脂质体制剂或其它脂质制剂尤其有利，因为当与肺部内 膜或肺表面活性剂相容时它们能保护药物。尽管不受任何具体理论的束缚，据信脂质体万 古霉素具有在肺部有储库作用。这样，当完成吸入给药后，所述脂质体万古霉素在一段时间 内能维持其治疗性生物利用度。在某些实施方案中，该时间比游离万古霉素维持治疗性利 用度的时间更长。例如，在治疗后，药物的治疗性生物利用度可长于3、4、5、6、7、8、9或10 天，或者在给药后甚至长于2周。在另一个实施方案中，以约50-1000mg/天、约100_500mg/天或约250_500mg/天 的万古霉素剂量给予所述组合物。例如，剂量可以是每天约100mgJ々 200mg、约300mg、约 400mg 或约 500mgo制备方法生成脂质体抗感染制剂或脂质抗感染制剂的工艺涉及“溶剂注入(solvent infusion) ”工艺。这是包括以下过程的工艺将一种或多种脂质溶于少量、优选最低量的工 艺相容性溶剂中，形成脂质悬液或溶液，然后将所得溶液注入含有万古霉素的含水介质中。 通常，工艺相容性溶剂是可在含水工艺(例如透析或渗滤)中被洗去的一种溶剂。相容性 溶剂包括醇类，例如乙醇、异丙醇、丙醇和丁醇。“乙醇注入”是一类溶剂注入，是包括以下过
13程的工艺将一种或多种脂质溶于少量、优选最低量的乙醇中，形成脂质溶液，然后将所得 溶液注入含有万古霉素的含水和乙醇的介质中。“少”量溶剂是在注入工艺中与形成脂质体 或脂质复合物相容的量。本发明的方法提供在脂质体内异常高浓度的万古霉素。所得脂质体悬液的万古霉 素浓度大于5mg/mL。在某些实施方案中，脂质体悬液的万古霉素浓度大于10、20、30、40、 50、60、70、80、90或100mg/mL，和至多250mg/mL。在某些实施方案中，所述脂质体制剂的 万古霉素浓度范围为约40mg/mL至约200mL。在其它实施方案中，万古霉素浓度范围为约 40-150mg/mL、约 50_125mg/mL 或约 50_100mg/mL。尽管不受任何具体理论的束缚，据信通过在制备脂质体制剂的醇注入步骤中使用 高浓度万古霉素贮液，提供高万古霉素浓度。通过将万古霉素溶于醇(例如乙醇)与水的混 合物(而不是单独使用水)中，得到高浓度贮液。与单用水相比，通过使用水/醇混合物， 可得到更高浓度的万古霉素溶液。另外，高浓度万古霉素的水溶液非常粘稠。同样不受任 何具体理论的束缚，据信高粘度使得贮液的除菌过滤变得困难或不可能。另外，粘度在将脂 质/乙醇溶液注入万古霉素/水溶液的步骤中带来问题，产生不太有利的脂质体特性。在 万古霉素贮液中使用醇和水的混合物，使得贮液的除菌过滤成为可能并且当用脂质/醇贮 液注入时可提供更好的脂质体特性。在一个实施方案中，本发明涉及制备万古霉素脂质体制剂的方法，所述方法包 括a)将含醇脂质溶液注入含水/含醇万古霉素溶液中，形成初始万古霉素脂质体制 剂；和b)除去所述醇和未包封的万古霉素，形成所述万古霉素脂质体制剂。在一个实施方案中，所述醇通过渗滤而除去。在另一个实施方案中，所述醇被除 去。在另一个实施方案中，所述醇是乙醇。在一个实施方案中，所述含水/含醇万古霉素贮液的万古霉素浓度为约100-500、 200-400 或 250-350mg/mL。在一个实施方案中，所述醇脂质贮液的脂质浓度为约50-250、50_200或 75_125mg/mL0将脂质-醇溶液注入含万古霉素的含水溶液的步骤可在含万古霉素的含水溶液 表面上或下完成。优选地，该步骤在溶液表面上完成。脂质体制剂或脂质制剂的分级(sizing)可通过普通技术人员熟知且容易实施的 大量方法(例如挤出、超声处理和勻浆技术)来完成。挤出包括使脂质体在压力下一次或 多次通过具有确定孔径的滤器。滤器通常由聚碳酸酯制成，但滤器也可由不与脂质体发生 相互作用的、并且足够坚固、能允许在足够压力下挤出的任何耐用材料制成。优选的滤器包 括“直通”滤器，因为它们通常可耐受本发明优选挤出工艺中的较高压力。“回路(Tortuous path) ”滤器也可使用。挤出也可使用不对称滤器，例如Anopore 滤器，其包括将脂质体通 过分枝孔型氧化铝多孔滤器而挤出。脂质体制剂或脂质制剂也可经超声处理而使尺寸减小，所述超声处理使用声能以 破碎或剪切脂质体，其可自发地重新形成更小的脂质体。通过将含有脂质体悬液的玻璃管 浸入浴型超声发生器所产生的超声震荡中心(sonic epicenter)中，进行超声处理。或者，
14可使用探针型超声发生器，其中通过与脂质体悬液直接接触的钛探针振动而产生声能。勻 浆和研磨仪器，例如Gifford Wood勻浆机、Polytron 或微射流机(Microfluidizer)也可 用于将较大的脂质体制剂或脂质制剂破碎成较小的脂质体制剂或脂质制剂。使用本领域众所周知的方法(例如切向流过滤)可将所得脂质体制剂分离成均勻 群体。在该方法中，使脂质体制剂或脂质制剂的不同大小的群体通过切向流滤器，因而得到 具有尺寸的上限和/或下限的脂质体群体。当使用不同尺寸的两种滤器(即具有不同孔 径)时，小于第一孔径的脂质体通过滤器。该滤液可通过具有比第一滤器更小孔径的第二 滤器进行切向流过滤。该滤器的保留物就是具有分别由第一和第二滤器的孔径所限定的尺 寸的上限和/或下限的脂质体/复合群体。肺表面活性剂允许肺在呼吸时扩张和压缩。这是通过由脂质和蛋白质组合包被 肺部而完成的。脂质以疏水链朝外的单层形式存在。脂质代表了 80%的肺表面活性剂， 大部分脂质是磷脂酰胆碱，其50%是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC) (Veldhuizen等，1998)。 表面活性蛋白(SP)存在的作用是维持结构并促进在呼吸期间发生的肺表面活性剂的扩张 和压缩。它们中间，SP-B和SP-C特别具有溶解行为并可溶解脂质体(Hagwood等，1998 ； Johansson，1998)。该溶解行为可促进脂质体的逐步破碎。脂质体也可被巨噬细胞通过吞 噬作用而直接摄取(Couveur 等，1991 ；Gonzales-Roth 等，1991 ；Swenson 等，1991)。肺泡巨 噬细胞对脂质体的摄取是药物递送到患病部位的另一种方式。优选用于形成脂质体制剂或脂质制剂的、供吸入用的脂质是肺表面活性剂中存在 的内源性脂质所共有的。脂质体是由包封所需药物的双层组成。可将它们设计成同心双层 的多层囊泡，其中在不同层的脂质内或各层间的含水空间内包封有药物。本发明采用独特 工艺，产生独特脂质体抗感染制剂或脂质抗感染制剂。这些工艺的过程和产物都是本领域 的组成部分。根据以下描述、附图和所附权利要求书，本发明的这些实施方案、其它实施方案以 及它们的特性和特征都将会是显而易见的。
实施例实施例1 脂质体万古霉素制剂用上述方法制备脂质体万古霉素制剂。具体地讲，用于脂质贮液的醇是乙醇。用 于含水/含醇万古霉素贮液的醇也是乙醇。用DPPC、DPPC/CHOL、D0PC/CH0L和P0PC/CH0L 制备制剂。使用这些方法所生产的万古霉素的脂质与药物比例非常低，见下表1。万古霉素 的浓度也见下表1。表1.脂质体万古霉素制剂 用于制备它们的所选的脂质体万古霉素制剂和贮液浓度的额外特征(平均粒径 和pH)见下表2。表2.示例性的脂质体万古霉素制剂的特征 实施例2 在生物条件下的降解研究 本发明的脂质体制剂阻止万古霉素在生物环境中降解。已知万古霉素降解为两种 晶体降解产物(CDP)，称为CDP-m和CDP-M。为了评价脂质体万古霉素制剂的稳定性，将两种 制剂(A和B)稀释在10%大鼠血清中并在37°C孵育，然后用HPLC测定渗漏和降解成CDP。 如上所述，示例性的制剂A在DPPC脂质体内含有万古霉素。制剂B在DPPC/CH0L脂质体内含有万古霉素。与在脂质体之外的万古霉素相比，这两种制剂显示出包封在脂质体内万古霉素降 解较少(表3)。因此，脂质体制剂的脂质体看来减少了从万古霉素到CDP的降解，尤其是在 孵育的最初4天期间。与含有DPPC和胆固醇的制剂B相比，含有DPPC的制剂A的脂质体 能更有效地阻止⑶P形成。表3. 实施例3 制剂A和制剂B的药物释放图谱将制剂A和制剂B在大鼠血清中、在体内温度(37°C )孵育。制剂A在150小时的 孵育期间显示出快速药物释放，而制剂B则显示出极少的任何药物释放(图1)。实施例4:制剂A的渗漏在不同贮存温度下监测脂质体万古霉素的渗漏。制剂A在4°C稳定。通过增加 温度，尤其是当温度接近DPPC脂质体的相变温度时，脂质体组合物释放持续量的万古霉素 (图2)。因此，本发明的脂质体制剂在约2-8°C的温度下(例如贮存在冰箱中)应当具有长 货架期。预期脂质体万古霉素组合物具有良好的体内释放图谱。因此，这些特征可用于在 体内温度下靶向药物释放。实施例5 脂质体万古霉素的雾化典型的脂质体制剂，制剂A，通过PARI LC星形喷雾器喷雾20分钟。喷雾后，脂质 体保留了 63%万古霉素在脂质体内。实施例6 脂质体制剂的均勻性典型的脂质体制剂，制剂A，通过0-40%碘沙克醇(iodiaxanol)密度梯度分级。脂 质体群体是均勻的，其脂质/药物比例在群体中是一致的(图3)。实施例7.荧光各向异性水溶性荧光染料(钙荧光素，lmg/ml)包封在两种类型的脂质体万古霉素中。一 种含有高浓度万古霉素，另一种含有低浓度万古霉素。在50°C通过乙醇注射加入DPPC，制 备 5mg/ml脂质体。通过截止值为20K分子量的管、针对0. 9%盐水而透析，洗去游离万古 霉素和染料。荧光各向异性在495nm激发波长和520nm发射波长进行测定。荧光各向异性 是一种有序参数，在含水溶液中其范围为0-0. 4。数值越高表明溶液越粘。在具有高浓度万古霉素的脂质体内检测到的各向异性与具有低浓度万古霉素的 脂质体相比要更高。这表明本申请所公开的脂质体万古霉素在脂质体内具有高万古霉素浓 度(200 300mg/ml)，并含有非常粘稠的内容物。
实施例8 在鼠肺炎链球菌(S. pneumoniae)模型中，吸入脂质体万古霉素与吸入 可溶性万古霉素的比较在饲养园(vivarium)内接受六十只(60)、三十六只(36)雌性小鼠(Swiss Webster, Charles River)，在开始本方案之前，让其适应至少7天。在用氯胺酮/赛拉 嗪溶液(80mg/kg和10mg/kg)麻醉之后，所有小鼠都通过鼻腔吹入而灌输肺炎链球菌 (S. pneumoniae ATCC，6303，4. IxlO4CFU/小鼠)。用带尖头的微量移液管(Gilson，用 Femt Scientific校准)通过鼻孔途径进行灌输。通过小鼠耳朵固定小鼠并借助微量移液管逐 渐释放20 μ 1细菌(每次呼吸2 μ 1)到鼻孔中(每鼻孔10 μ 1)。每隔10分钟观察一次小 鼠，直到它们从麻醉中完全恢复过来。在第1、2和3天对小鼠给药。共有5组，每组12只小鼠。第1组小鼠经吸入接受 脂质体万古霉素(6mg/kg/天，制剂Α)。第2组小鼠经吸入接受脂质体万古霉素(3.8mg/ kg/天，制剂Α)。第3组小鼠经吸入接受游离可溶性万古霉素(6mg/kg/天，无菌盐酸万古 霉素)。第4组小鼠经吸入接受游离可溶性万古霉素(3. 8mg/kg/天，无菌盐酸万古霉素)。 第5组小鼠经吸入接受无菌生理盐水(0. 9% NaCl)。安乐死标准每天用Raynger MX4高效红外温度扫描温度计(Raytek，Santa Cruz，CA)测量腹部区的表面体温。将小鼠垂直固定，暴露其腹部区。对它们的表面体温测 定3次。温度计自动平均3次读数。如果体温降至280°C以下，对小鼠实施安乐死。每天测 量体重，共测量7天并记录在数据表上(S0P-19)。对于损失其起始体重大于20%的小鼠进 行安乐死。对于不满足以上标准、但濒死的小鼠也在研究主管的判断下实施安乐死。在小鼠肺和血液中测量细菌菌落在第7天之前安乐死的小鼠和存活至第7天的 小鼠都通过CO2窒息而安乐死。安乐死之后，通过心脏穿刺采血。立即在BHI肉汤中制备 1/10稀释的血液。无菌取出肺，称重并放入无菌的5ml聚丙烯圆底管的Iml BHI肉汤中。i^M PolytronE (Brinkmann, Rexdale, Ontario, Canada), Stffi^^jSiS；, ^ 5ml 聚 丙烯圆底管中对肺进行无菌勻浆。对组织进行勻浆，直到光滑为止。在补充有10yg/ml黏 菌素(C)、5 μ g/ml Oxolinic (0)的BHI肉汤中制备肺勻浆液的10倍稀释液。将100 μ 1肺 勻浆液的各稀释液接种到CBO琼脂板上并涂布开。将各板在37°C孵育24小时，然后进行菌 落计数。
图4显示感染肺炎链球菌ATCC 6303的小鼠的存活。用吸入万古霉素制剂治疗的 小鼠的存活率(100% )显著大于(P < .0001)接受吸入盐水的小鼠的存活率(25% )(图
4)。盐水组小鼠的中位存活时间为5天。每组各有12只小鼠。用盐水、脂质体万古霉素 和万古霉素的吸入治疗发生在研究的第1、2和3天。通过GraphPad的Prism 进行统计 (Log-rank Mantel-Cox )。通过经典的琼脂板涂布法，测定存活至第7天的小鼠肺和血液的细菌菌落数(表
5)。吸入可溶性万古霉素(6mg/kg和3.8mg/kg)分别不能消除100%和92%小鼠肺的肺 炎链球菌(表5)。这些小鼠的血液中没有细菌。相比之下，100%的吸入脂质体万古霉素 (6mg/kg)小鼠的肺和血液中都已消除该菌。而且，在较低剂量(3. 8mg/kg)脂质体万古霉素 时，58%小鼠的肺和血液中都已消除该菌。在盐水组中存活至第7天的3只小鼠中有100% 在其肺中具有细菌，并且这些小鼠中约有66%在其血液中具有细菌(数据未显示)。这些 结果证明，脂质体万古霉素在消除受感染肺部的细菌方面比可溶性万古霉素更有效。 表6显示最后一次吸入治疗后4天小鼠肺的万古霉素浓度。两种剂量(6和3. Smg/ kg)的吸入脂质体万古霉素的小鼠肺部都具有比这两种剂量的吸入可溶性万古霉素的小鼠 肺部的万古霉素浓度更高(表6)。肺炎链球菌(ATCC 6303)对万古霉素非常敏感(MIC = 0.25yg/ml)。对于这两种万古霉素制剂而言，肺中的峰浓度/MIC都大于200。吸入脂质 体万古霉素的小鼠肺中万古霉素浓度的这种增加，可导致细菌从这些小鼠肺部清除掉(表 5)。
实施例9 在鼠肺炎链球菌模型中，吸入脂质体万古霉素与腹膜内注射万古霉素 的比较在饲养园内接受三十六只(36)雌性小鼠(Swiss Webster, CharlesRiver)，在开 始本方案之前，让其适应至少7天。按照实施例8所述，所有小鼠都通过鼻腔吹入而灌输 肺炎链球菌。在第1、2和3天对小鼠给药。第1组小鼠接受20分钟吸入脂质体万古霉素 (12mg/kg/天，制剂A)。第2组小鼠接受腹膜内注射万古霉素(6mg/kg/天，BID，无菌盐酸万 古霉素，批号NDC0409-6509-010)。第3组小鼠接受20分钟吸入无菌0.9% NaCl (Cardinal， 批号WBA194)。按照实施例8所述，进行安乐死，并测定血液和肺中的细菌菌落。图5显示感染肺炎链球菌(ATCC 6303)并用盐水、可溶性万古霉素、或脂质体万古 霉素治疗的小鼠的存活。仅16%的接受吸入盐水的小鼠(η= 12)存活至第7天，其中位存 活时间为4天。100%的接受腹膜内注射万古霉素的小鼠(η = 12)存活至第7天，而58% 的接受脂质体万古霉素的小鼠(η = 12)存活至第7天。用脂质体万古霉素和可溶性万古霉 素治疗的小鼠的存活与盐水治疗组相比具有统计学差异(分别为ρ = . 049和ρ = . 0009)。 用可溶性万古霉素治疗的小鼠的存活与接受吸入脂质体万古霉素的小鼠相比也有显著(P =.013)差异。每组各有12只小鼠。用盐水、吸入脂质体万古霉素和腹腔内注射(IP)万 古霉素的治疗发生在研究的第1、2和3天。通过GraphPad的Prism 进行统计(Log-rank Mantel-Cox 检验)。通过经典的琼脂板涂布法，测定实施安乐死以及存活至第7天的小鼠肺和血液的 细菌菌落数(图6)。即使用万古霉素IP治疗时有更多小鼠存活，但该治疗在25%小鼠肺 中未消除肺炎链球菌，并且在42%小鼠血液中未消除肺炎链球菌。相比之下，吸入脂质体万 古霉素之后存活的所有小鼠的肺和血液中都消除了该菌。表7显示用吸入脂质体万古霉素或腹膜内可溶性万古霉素的治疗结束后4天的小 鼠肺的万古霉素浓度。在通过腹膜内注射接受万古霉素的小鼠肺中没有检测到可检测的 万古霉素浓度。在通过吸入接受脂质体万古霉素的小鼠肺中检测到明显的万古霉素浓度 (44士 13 μ g/g肺)(表7)。在20分钟吸入脂质体万古霉素之后立即检测的小鼠肺中万古 霉素的起始平均浓度为58士6 μ g/g肺。尽管在IP注射可溶性万古霉素(6mg/kg)后30分 钟的小鼠肺中，计算出万古霉素起始平均浓度为48yg/g肺，根据具有正常肺的小鼠中有 4. 5%注射剂量的蓄积，所以该百分率可能在具有受感染肺的小鼠中会更高。该结果表明， 相同的总递送剂量并不等同于向肺部递送相同的量，因为IP注射可溶性万古霉素会导致 比吸入脂质体万古霉素更高的每日肺剂量。
感染肺炎链球菌并用每日3次气溶胶化脂质体万古霉素(12mg/kg)治疗的小鼠(η =12)在研究的第7天具有58%存活率。通过腹膜内注射用万古霉素(6mg/kg，BID)治疗 的小鼠在第7天具有100%存活率。相比之下，感染肺炎链球菌并用每日3次气溶胶化盐水 治疗的小鼠(η = 12)在第7天仅有16%小鼠存活，其中位存活时间为4天。用脂质体万 古霉素和可溶性万古霉素治疗的小鼠的存活与盐水治疗组相比具有统计学差异(分别为P =.049和ρ = . 0009)。用可溶性万古霉素治疗的小鼠的存活与接受吸入脂质体万古霉素 的小鼠相比也有显著(P = .013)差异。即使用万古霉素IP治疗时有更多小鼠存活，但该 治疗在25%小鼠肺中未消除肺炎链球菌，并且在42%小鼠血液中未消除肺炎链球菌。相比 之下，吸入脂质体万古霉素之后存活的所有小鼠的肺和血液中都消除了该菌。而且，脂质体 万古霉素和可溶性万古霉素的起始每日肺剂量是相似的(分别为IOug和15ug万古霉素 /肺)。可溶性万古霉素浓度是基于在IP注射后30分钟的肺中的4%递送剂量的万古霉 素。这些结果表明，每日3次给予气溶胶化脂质体万古霉素，在Swiss Webster小鼠中能非常有效地预防败血症并消除肺炎。但是，可溶性万古霉素分别不能消除42%和25%的小鼠 的血液和肺的感染。脂质体万古霉素的这一有益特征可能是因为它在吸入后在肺中的持久 性(最后一次吸入治疗后4天为6ug/肺)，而可溶性万古霉素在肺中的半衰期非常短。在 Swiss Webster小鼠中，IP注射后六(6)小时就观察不到可检测的万古霉素。表8总结了上述结果，以及1. 2mg/kg/天吸入脂质体万古霉素的研究结果。该表 显示每日一次脂质体万古霉素与两次游离万古霉素相比具有更好的肺部蓄积(对于两次 给药方案；3. 8&6)。对于IP给药，如较早以前用6mg/kg/天、甚至用12mg/kg/天、每天2次 所显示的那样，在治疗结束后7天在肺中没有检测到万古霉素蓄积。表8在鼠肺炎链球菌模型中脂质体万古霉素的功效 *存活至第7天的动物数据包括在平均值的计算中。在第7天之前死亡的动物的 数据排除在考虑之外。**仅1只小鼠在第7天在血液中具有> IxlO6细菌，并在肺中具有>4. 69Log CFU。 该剂量组的所有其它小鼠在第7天在血液中都没有CFU。图7总结了在按照表7所述引入肺炎链球菌之后7天，小鼠肺中的万古霉素水平 的剂量依赖性增加。给予量为1. 2mg、3. 8mg和6mg/kg/天的吸入脂质体万古霉素显示出在 第7天肺中浓度增加。与给予3.8和6. Omg/kg/天吸入游离万古霉素相比，其浓度更高。在 IP注射12mg/kg/天的游离万古霉素之后7天，在肺中未检测到万古霉素。在图8中，用CFU(菌落形成单位)评价了每次治疗后7天的肺中细菌水平。对于 6. Omg/kg/天剂量，脂质体万古霉素完全消除该细菌，而用相同剂量的游离万古霉素治疗的 所有12只小鼠却仍表现出相当高的细菌水平。甚至在较低剂量(3.8mg/kg/天)时，对于 脂质体万古霉素和游离万古霉素，细菌水平类似，但仅有不到50%小鼠显示出细菌水平，而 相比之下，超过90%的小鼠在游离万古霉素治疗后仍然处于感染中。参考文献的结合本文所引用的所有美国专利和已公布的美国专利申请都通过引用结合到本文中。等同实施方案本领域技术人员将会知道，或着可以确定，仅使用常规实验，在本文中描述了本发 明具体实施方案的许多等同实施方案。这样的等同实施方案将会包括在所附权利要求书 中。
权利要求
一种脂质体万古霉素，所述脂质体万古霉素包含脂质体和万古霉素。
2.权利要求1的组合物，其中万古霉素包封在所述脂质体中。
3.权利要求2的组合物，其中万古霉素是在包封在脂质体内的含水介质中。
4.权利要求3的组合物，其中所述含水介质是含水胶凝剂或粘稠混悬剂。
5.权利要求3的组合物，其中在所述含水介质中万古霉素浓度为约25-400、约25-200、 约 30-175、约 40-150、约 40-125、约 40-100、约 40-80、约 45-80、约 50-75、约 50-65、约 40-70、约 40-60 或约 45-55mg/mL。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述脂质体包含至少一种脂质。
7.权利要求6的组合物，其中所述组合物中脂质与万古霉素的比例为约3 1或以下。
8.权利要求7的组合物，其中所述脂质与万古霉素的比例为约0.1 1-3 1。
9.权利要求7的组合物，其中所述脂质与万古霉素的比例为约0.1-1。
10.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述脂质体的平均粒径为约0.1-5微米。
11.权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述脂质体包含选自以下的脂质磷脂酰 胆碱类(PC)、磷脂酰甘油类(PG)、磷脂酸类(PA)、磷脂酰肌醇类(Pl)、磷脂酰丝氨酸类(PS) 及其混合物。
12.权利要求1-11中任一项的组合物，其中所述脂质体包含选自以下的脂质卵磷脂酰胆碱(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、卵磷脂酰肌醇(EPI)、卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、磷脂酰乙醇胺(EPE)、磷脂酸(EPA)、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、大豆磷脂酰甘油(SPG)、 大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)、大豆磷脂酰肌醇(SPI)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)、大豆磷脂酸 (SPA)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化卵磷脂酰甘油(HEPG)、氢化卵磷脂酰肌醇(HEPI)、 氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)、氢化磷脂酰乙醇胺(HEPE)、氢化磷脂酸(HEPA)、氢化大豆磷 脂酰胆碱(HSPC)、氢化大豆磷脂酰甘油(HSPG)、氢化大豆磷脂酰丝氨酸(HSPS)、氢化大豆 磷脂酰肌醇(HSPI)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、氢化大豆磷脂酸(HSPA)、二棕榈酰 磷脂酰胆碱(DPPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈 酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油 烯基磷脂酰-乙醇胺(DOPE)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰甘 油(PSPG)、一油酰-磷脂酰乙醇胺(MOPE)、生育酚、脂肪酸的铵盐、磷脂的铵盐、甘油酯的 铵盐、十四胺、十六胺、十二胺、十八胺、二月桂酰乙基磷酸胆碱(DLEP)、二豆蔻酰乙基磷 酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N-(2， 3-二-(9-(Z)_十八碳烯基氧基)-丙-1-基-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1，2_双 (油酰氧基)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二豆蔻酰磷脂酸 (DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二豆蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二 棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、 二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)及其混合物。
13.权利要求11的组合物，其中所述脂质是磷脂酰胆碱。
14.权利要求13的组合物，其中所述脂质是饱和磷脂酰胆碱。
15.权利要求14的组合物，其中所述磷脂酰胆碱是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。
16.权利要求1-15中任一项的组合物，其中所述脂质体不包含固醇。
17.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述脂质体包含基本上由磷脂酰胆碱组成的脂质。
18.权利要求17的组合物，其中所述脂质基本上由DPPC组成。
19.权利要求1-18中任一项的组合物，其中至少50%万古霉素在喷雾工艺期间保留在 脂质体内。
20.一种制备万古霉素脂质体制剂的方法，所述方法包括a)将含醇脂质溶液注入含水/含醇万古霉素溶液中，形成初始万古霉素脂质体制剂；和b)除去所述醇，形成所述万古霉素脂质体制剂。
21.权利要求20的方法，其中步骤b)还包括从所述万古霉素脂质体制剂中除去未包封的万古霉素。
22.权利要求20或21的方法，其中所述醇是乙醇。
23.权利要求20-22中任一项的方法，其中所述醇是通过透析或渗滤或离心而除去。
24.权利要求20-23中任一项的方法，其中所述含水/含醇万古霉素溶液的万古霉素浓 度为约 100-500mg/mL。
25.权利要求20-24中任一项的方法，其中所述含醇脂质溶液的脂质浓度为约 50-250mg/mLo
全文摘要
本公开部分涉及具有低的脂质与药物比例和高浓度万古霉素的脂质体万古霉素组合物。本公开还部分涉及制备所述组合物的方法。
文档编号A61P11/00GK101917972SQ200880123325
公开日2010年12月15日 申请日期2008年10月23日 优先权日2007年10月23日
发明者W·R·伯金斯, X·李 申请人:特兰萨夫公司