对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及制备方法

专利名称：对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及制备方法
技术领域：
本发明涉及对淀粉样蛋白具有亲和性的新化合物的应用及其制备方法，特别是涉 及用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂，其可以在全身性淀粉样变性病和其他与淀粉 样蛋白蓄积有关的疾病的诊断中用于检测病灶部位中的淀粉样蛋白。
背景技术：
由被称作淀粉样蛋白的纤维状蛋白质在体内各种器官或组织中沉积而引发的疾 病统称作淀粉样变性病。淀粉样变性病的共同特征是，富含折叠结构的被称作淀粉样 蛋白的纤维状蛋白质在各种器官中系统性地或在位点局部性地沉积，以至于在器官或组织 中触发了功能异常。淀粉样蛋白一般是指生物体内各种淀粉样蛋白的前体蛋白例如淀粉样 蛋白-β、突变型转甲状腺素蛋白和β 2-微球蛋白聚集形成的蛋白凝聚物。淀粉样蛋白尽 管是由任意的淀粉样蛋白的前体蛋白形成的，但是它们具有富含折叠的特征性结构。 因此，能与β -折叠结构结合的化合物例如刚果红和硫磺素T的特征在于，它们与淀粉样蛋 白具有亲和性。根据淀粉样蛋白的沉积模式，淀粉样变性病分为全身性淀粉样变性病和局限性淀 粉样变性病。全身性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积发生在全身各个部分的疾病。全身性淀粉 样变性病的例子包括家族性淀粉样变性病(其中肝脏内产生的淀粉样蛋白沉积在全身的 各个器官而导致疾病)、老年性TTR淀粉样变性病(其中淀粉样蛋白沉积在心脏和大关节 例如手关节中)、透析性淀粉样变性病(发生在长期透析患者的骨和关节等部位)、反应性 AA淀粉样变性病(继发性淀粉样变性病，是由血清淀粉样蛋白A产生的淀粉样蛋白沉积导 致的，所述血清淀粉样蛋白A是慢性炎性疾病例如慢性风湿病之后继发的急性期蛋白)、和 免疫细胞性淀粉样变性病(其中由免疫球蛋白产生的淀粉样蛋白沉积在全身的各个器官 中)。局限性淀粉样变性病是淀粉样蛋白沉积仅发生在某些器官中的疾病。局限性淀粉 样变性病的例子包括脑淀粉样变性病例如阿尔茨海默病(其中淀粉样蛋白沉积在脑中)、 脑血管淀粉样变性病和克雅病、内分泌淀粉样变性病(其中淀粉样蛋白沉积在伴随I I型 糖尿病的胰岛和胰岛素瘤中、或者沉积在心房中)、皮肤淀粉样变性病(其中淀粉样蛋白 沉积在皮肤中)、和局限性结节性淀粉样变性病(其中结节状淀粉样蛋白沉积在皮肤和肺 中)。在全身性淀粉样变性病的情况下，如下进行淀粉样变性病的诊断首先从皮肤、肾 和胃肠道等可活组织检查的部位采集组织；并且用刚果红或硫磺素T将其染色。刚果红是 一种对淀粉样蛋白的β -折叠结构具有高度亲和性的荧光性化合物，刚果红由于其定向性 而在偏光显微镜下显示双折射，因此它可以选择性地染色组织中的淀粉样蛋白沉积物。同 样地，硫磺素T也是对淀粉样蛋白具有亲和性的荧光性化合物，并可与刚果红同样地使用。 在发现组织染色呈阳性后，组合利用抗体的免疫染色，进行确诊。然而，用刚果红或硫磺素
5T染色即使是在偏光显微镜下观察也往往难以判定为阳性。另一方面，人们考虑用近年来广泛发展的图像诊断装置例如PET、SPECT和MRI来 进行全身性淀粉样变性病的图像诊断。然而，当刚果红和硫磺素T是被标记的、并且用作图像诊断的探针时，它们的存在 问题是，与淀粉样蛋白的结合特异性较差，以至于不能获得良好的检测灵敏度。此外，由于刚果红具有致癌性，它不适用于人体的诊断。因此，已经提出，将作为刚果红衍生物的双-(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯 (BSB)及其衍生物用作检测淀粉样蛋白的荧光试剂，它对全身性淀粉样蛋白具有高度的亲 和性和检测灵敏度，可以用于体内检测(非专利文献14，专利文献7)。据报道，BSB与由脑 淀粉样变性病和全身性淀粉样变性病产生的淀粉样蛋白具有高度亲和性，并且其结构中没 有联苯胺结构，因此它几乎不存在致癌问题，并且可以是放射性标记的，用作图像诊断的探 针。另一方面，对于作为典型的脑淀粉样变性病的阿尔茨海默病(以下称作AD)，因为 不能采集活检标本，因此已经尝试使用与淀粉样蛋白具有高度亲和性的化合物作为标记物 来在体内检测AD。用于脑内淀粉样蛋白的图像诊断的这样的探针大多是疏水性的低分子量化合 物，其与淀粉样蛋白具有高度的亲和性，且脑转移性很高，并且用各种放射性核素例如"C、 18F和123I标记。例如，有报告指出，11C或放射性卤素标记的化合物包括各硫磺素衍生 物例如6-碘-2-[4' -(N, N-二甲基氨基)苯基]苯并噻唑(以下称作TZDM)和6-羟 基-2-[4' -(N-甲基氨基)苯基]苯并噻唑(以下称作6-0H-BTA-1)(专利文献1，非专利文 献3)；均二苯乙烯化合物例如(E)-4-甲基氨基-4'-羟基均二苯乙烯(以下称作SB-13) 和(E)-4-二甲基氨基-4'-碘代均二苯乙烯(以下称作m-1-SB)(专利文献2，非专利文献 4，非专利文献5)；苯并噁唑衍生物例如6-碘-2-[4' -(N，N-二甲基氨基)苯基]苯并噁 唑(以下称作ΙΒ0Χ)和6-[2-(氟)乙氧基]-2-[2-(2- 二甲基氨基噻唑-5-基)乙烯基] 苯并噁唑(非专利文献6，非专利文献7) ；DDNP衍生物例如2-(1-{6-[(2-氟乙基)(甲基) 氨基]-2-萘基}亚乙基)丙二腈(以下称作FDDNP)(专利文献4，非专利文献8)；和咪唑 并吡啶衍生物例如6-碘-2-[4' -(N, N-二甲基氨基)苯基]-咪唑并[l，2-a]吡啶(以 下称作IMPY)(专利文献3，非专利文献9)。此外，对用于图像诊断的某些探针，已经进行了 人体图像研究，并且报道了与正常人相比，在AD患者的脑中有显著的放射性蓄积(非专利 文献10，非专利文献11，非专利文献12，非专利文献13)。国际公开W02007/002540号小册子公开了一系列具有与淀粉样蛋白有亲和性的 基团的化合物，该基团通过乙二醇或聚乙二醇与放射性核素标记的位点连接(专利文献 5)。国际公开W02007/063946号小册子公开了一系列化合物，其与五元芳香杂环基相 连以防止它们在脑内代谢(专利文献6)。[专利文献 1] JP-T-2004-506723[专利文献 2] JP-T-2005-504055[专利文献 3] JP-T-2005-512945[专利文献 4] JP-T-2002-523383
[专利文献5]国际公开W02007/002540小册子[专利文献6]国际公开W02007/063946小册子[专利文献7]国际公开W02005/016888小册子[非专利文献 1]J. A. Hardy & G. A. Higgins, "Alzheimer ‘ s Disease :The Amyloid Cascade Hypothesis.，，，Science, 1992, 256, p. 184-185[非专利文献 2]G. McKhann 等人，"Clinical diagnosis of Alzheimer ' s disease :Report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer' s Disease. ”， Neurology, 1984，34，p.939-944[ # # ^lJ i； K 3]Z. -P. Zhuang 等 A, "Radioiodinated Styrylbenzenes and Thioflavins as Probes for Amyloid Aggregates. J. Med. Chem. ,2001,44,p. 1905-1914[非专利文献 4]Masahiro Ono 等人，“ llC—labeled stilbene derivatives as Aβ -aggregate-specific PET imaging agents for Alzheimer' s disease.，，，Nuclear Medicine and Biology,2003,30, p.565-571[非专利文献 5]H. F. Kung 等人，"Novel Stilbenes as Probes for amyloid plaques.，，，J. American Chemical Society, 2001,123, p. 12740-12741[非专利文献 6] Zhi-Ping Zhuang 等人，"IB0X(2_(4 ‘ -dimethyl aminophenyl) -6-iodobensoxazole) -.a ligand for imaging amyloid plaques in the brain. ”，Nuclear Medicine and Biology，2001，28，p.887—894[非专利文献 7]Furumoto Y 等人，“ ["C]BF_227 :A New 11C-Labelec^-Ethenyl benzoxazole Derivative for Amyloid-β Plaqueslmaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecularlmaging, 2005, 32, Sup.1, P759[非专利文献 8]Eric D. Agdeppa 等人，“2-Dialkylamino-6_Acylmalononitrile Substituted Naphthalenes(DDNP Analogs) :Novel Diagnostic and Therapeutic Tools in Alzheimer' s Disease.，，，Molecular Imaging and Biology, 2003, 5, p. 404-417[非专利文献 9]Zhi-Ping Zhuang 等人，“Structure-Activity Relationship of Imidazo[1,2_a]Pyridines as Ligands for Detecting β -Amyloid Plaques in the Brain. ”，J. Med. Chem, 2003，46，p. 237-243[非专利文献 10]W. E. Klunk 等人，"Imaging brain amyloid in Alzheimer' s disease with Pittsburgh Compound-B. Ann. Neurol. ,2004,55, p.306-319[非专利文献 11]Nicolaas P. L. G. Verhoeff 等人，“In-Vivo Imaging of Alzheimer Disease β -Amyloid With[11C]SB-13PET. ”,American Journal of Geriatric Psychiatry, 2004，12，p.584-595[非专利文献12]Hiroyuki Arai 等人，“ [11C]_BF_227 AND PET to Visualize Amyloid in Alzheimer' s Disease Patients，，,Alzheimer' s & Dementia :The Journal of the Alzheimer' s Association, 2006, 2, Sup. 1, S312[非专利文献 13] Christopher Μ. Clark 等人，“ Imaging Amyloidwith 1123 IMPY SPECT，，，Alzheimer' s & Dementia :The Journal ofthe Alzheimer' s Association, 2006，2，Sup. 1，S342
[非专利文献 14]D. M. Skovronsky 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，2000,97, 7609

发明内容
发明要解决的课题如上所述，公开了各种化合物可以作为以淀粉样蛋白为对象的图像诊断的探针， 并探索了其临床用途。在正常小鼠中的实验结果表明，用[125I]标记的TZDM、IBOX和m-1-SB都会在施 用2分钟后转移到脑内。但是，这些化合物从正常组织中的清除是不充分的，并且会随着施 用后时间的推移而在脑中逐渐蓄积(JP-T-2005-512945 ；Zhi-Ping Zhuang等人，Nuclear Medicine and Biology, 2001, 28, ρ· 887—894 ；H. F. Kung 等人，J. Am. Chem. Soc.，2001，123， p. 12740-12741)。当从正常组织中的清除不充分时，就出现了一个问题在淀粉样蛋白蓄积 位点不能获得足够的对比度。用[11C]标记的SB-13在大鼠的实验中显示了其具有从正常 组织中的清除性能，但清除速率还谈不上足够快(Masahiro Ono等人，Nuclear Medicine and Biology,2003,30, p.565-571)。同时，据披露，如用[125I]标记的化合物的实验结果所示，具有咪唑并吡啶骨架的 化合物例如IMPY具有在施用后转移到脑中并在淀粉样蛋白上蓄积的性质，其也具有与上 述化合物不同的从正常组织中迅速消除的优良性质。但是，IMPY是一种在回复突变试验中 呈阳性的化合物。为了将这种化合物用作图像诊断的探针，必须充分考虑剂量和给药方式 (国际公开WO 03/106439号小册子)。据报道，FDDNP在回复突变试验中也是呈阳性的。(国际公开WO 03/106439号小 册子)。靶向淀粉样蛋白的图像诊断探针优选是与淀粉样蛋白的亲和性优良并且像IMPY 同样从正常组织中清除足够迅速，但是又能抑制毒性例如诱变性的化合物。但是，还没有公 开过具有这种性质的化合物。本发明正是鉴于上述情况而完成的，其目的在于通过提供与淀粉样蛋白具有亲和 性并抑制毒性例如诱变性的化合物，使得体内或体外高灵敏度地检测淀粉样蛋白成为可 能。解决课题的方法本发明人发现，具有咪唑并吡啶_苯基骨架并且该骨架具有与羟基相连的碳原子 的特定的新化合物与淀粉样蛋白具有亲和性，且毒性例如诱变性低，并且通过使用一系列 这样的化合物作为探针，在体内或体外以高灵敏度检测淀粉样蛋白。由此完成了本发明。即，根据本发明的一个方面，提供了用于检测沉积在生物组织上的淀粉样蛋白的 试剂，其包含下述式(1)所示的化合物
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或其盐。生物组织可以是已知在淀粉样变性病中淀粉样蛋白沉积在其中的各种组织。这些 生物组织的典型例子包括脑、心、肺、胰脏、骨和关节，作为最典型的生物组织，可举出脑。在 脑为对象的情况下，典型的淀粉样变性病包括阿尔茨海默病和Lewy体痴呆。在式(1)中，R3如下式所示 R1是放射性卤素取代基，m是0-4的整数，η是0或1。作为放射性卤素，可以使用 各种核素，优选，可以使用选自18F、75Br、76Br、123I、124I、125I和131I的卤素，更优选地可以使用 选自18F、123I和125I的卤素。此外，在式(1)中，当η = 0时，优选m = 0-4,当n = 1时，优 选m = 1-4。ASA2，A3和A4独立地表示碳或氮，必要的是，它们中的至少1个表示碳。优选地， ASA2，A3和A4中的3个以上表示碳，更优选地，它们全部表示碳。在式(1)中，R3与A\A2， A3或A4所表示的碳键合。当A1，A2，A3和A4分别表示不与R3键合的碳时，与其键合的氢原 子是未取代的。式(1)中所示的羟基可以与构成苯基骨架的任意碳键合，但是优选羟基与
苯基骨架的4'-位的碳键合。R3的键合位置可以是A^A2，A3或A4中的任-碳即可，但是优选是A3所表示的碳，即，是6-位的碳。
上式(1)的化合物是新化合物，根据本发明的另一个方面，提供一种放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其包括 制备反应溶液的步骤，所述反应溶液包含下式(2)所示的化合物或其盐与放射性
卤离子 其中，A1，A2, A3和A4独立地表示碳或氮，R4是下式所表示的基团 m是0-4的整数，η是0或1的整数，且当m = η = 0时，R2是非放射性卤素取代基、硝基取代基、具有3_12个碳原子的三 烷基铵取代基、具有3-12个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基，当 m兴0和/或η兴0时，R2是非放射性卤素取代基、甲磺酰氧基取代基、三氟甲磺酰氧基取 代基或芳香族磺酰氧基取代基，条件是，A1，A2，A3和A4中的至少1个表示碳，R4与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合，
和向上述反应溶液赋予反应条件，以合成下式(1)所示的化合物或其盐的步骤 R3是下式所表示的基团 R1是放射性卤素取代基，m和η与式(2)中相同，条件是，A1，A2，A3和A4中的至少1个表示碳，R3与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合，在式(2)中，A\A2，A3和A4独立地表示碳或氮，必要的是，它们中的至少1个表示 碳。优选地，ASAW和A4中的3个以上表示碳，更优选地，它们全部表示碳。在式(2)中， R4与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合。当A1，A2，A3和A4分别表示不与R4键合的碳时，与其 键合的氢原子是未取代的。式(2)中所示的羟基可以与构成苯基骨架的任意碳键合，但是 优选羟基与苯基骨架的4'-位的碳键合。R4的键合位置没有特别限制，只要它是AU2，A3 或A4所表示的碳即可，但是优选是A3所表示的碳，即，是6-位的碳。进行制备包含上式(2)所示的前体化合物或其盐和放射性卤离子的反应溶液的 步骤，例如，包括将该前体化合物或其盐溶解于惰性有机溶剂，并向其中加入由已知方法获 得的包含放射性卤离子的溶液。作为惰性有机溶剂，可以使用与该前体化合物或其盐和放射性卤离子不具有反应 性的各种溶剂，例如，当所使用的放射性卤离子是放射性碘时，优选可以使用甲醇，当所使 用的放射性卤离子是放射性氟时，优选可以使用乙腈。在合成上式(1)所示的化合物或其盐的步骤中，对赋予反应溶液的反应条件没有 特殊限制，只要它是允许其中式(2)化合物的取代基R2与加入到该反应溶液的放射性卤离 子发生置换反应的条件即可，可以使用适合放射性卤离子的种类的已知反应条件。在本发明的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法中，作为放射性卤离子，可 以使用例如18F、75Br、76Br、123I、124I、125I或131L当制备其中R1所示的放射性卤素取代基是 123I、124I、125I或131I的式⑴化合物时，分别使用123I离子、124I离子、125I离子或131I离子作 为放射性卤离子。作为式⑵的化合物，优选使用的是其中当m = n = 0时，R2是碘、溴、 具有3-12个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基的化合物，其中当 m兴0和/或η兴0时，R2是碘的化合物；特别优选其中当m = n = 0时，R2是碘、三甲基甲 锡烷基取代基、三丁基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基取代基的化合物。当制备其中R1所示的放射性卤素取代基是18F的式⑴化合物时，使用18F离子作 为放射性卤离子，作为式(2)的化合物，优选使用其中当m = n = 0时，R2是硝基取代基或具有3-12个碳原子的三烷基铵取代基的化合物、和其中当m兴0和/或η兴0时，R2是甲 磺酰氧基取代基、三氟甲磺酰氧基取代基或芳香族磺酰氧基取代基的化合物，特别优选当 m兴0和/或η兴0时，R2是三氟甲磺酰氧基取代基或甲苯磺酰氧基取代基的化合物。当 制备其中R1所示的放射性卤素取代基是75Br或76Br的式(1)化合物时，分别使用75Br离子 或76Br离子作为放射性卤离子，作为式(2)的化合物，优选使用其中R2是溴的化合物。另外，根据本发明的另一个方面，提供用于制备放射性卤素标记的有机化合物的 前体化合物或其盐，该前体化合物如下式(2)所示
其中，A1，A2，A3和A4独立地表示碳或氮， R4是下式所表示的基团
m是0-4的整数，η是0或1的整数，当m = η = 0时，R2是非放射性卤素取代基、硝基取代基、具有3_12个碳原子的三 烷基铵取代基、具有3-12个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基，当 m兴0和/或η兴0时，R2是非放射性卤素取代基、甲磺酰氧基取代基、三氟甲磺酰氧基取 代基或芳香族磺酰氧基取代基，条件是，A1，A2，A3和A4中的至少1个表示碳，R4与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合。作为式(2)中的R2所示的非放射性卤素取代基，可以使用能在使用放射性氟的亲 核取代反应中作为靶标的卤素或能在与放射性碘的同位素交换反应中作为靶标的卤素，优 选可以使用碘、溴或氯。作为三烷基甲锡烷基取代基，可以使用各种取代基，优选可以使用 三甲基甲锡烷基取代基和三丁基甲锡烷基取代基。在式(2)中，优选的R2选自碘、溴、三甲 基甲锡烷基取代基、三丁基甲锡烷基取代基、三氟甲磺酰氧基取代基和三苯基甲锡烷基取 代基。同时，在式⑵中，当n = 0时，优选m = 0-4;当η = 1时，优选m= 1_4。在式(2)中，A\A2，A3和A4独立地表示碳或氮，必要的是，它们中的至少1个表示 碳。优选地，Α^,Α3和A4中的3个以上表示碳，更优选地，它们全部表示碳。在式(2)中， R4与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合。当A1，A2，A3和A4分别表示不与R4键合的碳时，与其 键合的氢原子是未取代的。式(2)中所示的羟基可以与构成苯基骨架的任意碳键合，但是 优选羟基与苯基骨架的4'-位的碳键合。R4的键合位置只要是ASAW或A4所表示的 碳，就没有特殊限定。但是优选是A3所表示的碳，即，6-位的碳。发明效果根据本发明，可以得到淀粉样蛋白检测试剂及其制备方法以及制备用中间体，该 淀粉样蛋白检测试剂与淀粉样蛋白具有亲和性并且能够抑制毒性例如诱变性，因此可用于广泛的与淀粉样变性病有关的淀粉样蛋白的体外和体内检测。


图1是6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的合成路 线。图2是6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的合成路线。图3是2_(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2_a]吡啶的合成路线。图4是2_(4'-羟基苯基)-6-碘咪唑并[l，2_a]嘧啶的合成路线。图5是6_(3'-氟丙氧基)-2_(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡啶的合成路 线。图6是6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]嘧啶的合成路线。图7是6-氟-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡啶的合成路线。图8是2_(4'-羟基苯基)-6-硝基咪唑并[l，2_a]吡啶的合成路线。图9(a)是注射化合物6后的脑切片的放射自显影图，图9(b)是硫磺素T染色的 样品的荧光显微图像(注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图)。图10是6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]嘧啶的合成路 线。图11是6-三丁基甲锡烷基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]吡嗪的合成路 线。图12是2-(4'-羟基苯基)-6-碘咪唑并[l，2-a]吡嗪的合成路线。图13是8-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的合成路 线。图14(a)是注射化合物60后的脑切片的放射自显影图，图14(b)是硫磺素T染色 的样品的荧光显微图像(注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图)。图15(a)是注射化合物61后的脑切片的放射自显影图，图15(b)是硫磺素T染色 的样品的荧光显微图像(注射淀粉样蛋白混悬液的位点的放大图)。图16是显示化合物6与淀粉样蛋白结合能力的图。
具体实施例方式(放射性卤素标记化合物的前 化合物的合成方法)下面，以6-三丁基甲锡烷基-2-(4 ‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶为例，描述 本发明的一个方面的用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物的合成方法。首先，将4'-羟基苯乙酮与溴化铜反应，制备2-溴-4'-羟基苯乙酮(图1，步 骤1)。此时，可以根据常规方法来进行该反应，例如在文献King，L. Carroll and Ostrum, G. Kenneth, Journal of Organic Chemistry, 1964,29(12)，p. 3459—3461 中所述的方法。然后，将上述制备的2-溴-4'-羟基苯乙酮与2-氨基-5-溴吡啶反应，以制备 6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]吡啶(图1，步骤2)。可以根据下述方法来进 行该步骤。首先，将2-溴-4'-羟基苯乙酮和2-氨基-5-溴吡啶溶解于惰性溶剂例如乙腈中，然后在回流温度下使它们彼此反应2-6小时，以制备呈白色沉淀的6-溴-2-(4'-羟基 苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的氢溴酸盐。此时所使用的溶剂可以是乙腈或通常用于类似反 应的其他溶剂，例如甲醇和丙酮。反应温度可以是允许回流的温度，例如当溶剂是乙腈时是 900C。所使用的溶剂的量可以是足以实现反应的量，但应当注意的是，如果溶剂过多，则难 以获得反应产物的沉淀。例如，当在该反应中使用的是相当于IOmmol量的2-溴-4'-羟 基苯乙酮时，所使用的溶剂的量可以是约40-50mL。接着，过滤反应溶液以回收沉淀。将该白色沉淀混悬于甲醇/水(1 1)的混合液 中。然后，将饱和碳酸氢钠水溶液以相对于沉淀物非常大地过量的量加入其中，以释放作为 沉淀的6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]吡啶。将新产生的沉淀过滤，以回收作为 本步骤目标化合物的6-溴-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]吡啶(图1，步骤2)。水 /甲醇的混合液的量没有特殊限制，只要它足以实现反应即可。但是，应当注意的是，如果混 合液的量过多，则会干扰产物的析出。例如，当使用的是相当于IOmmol量的2-溴-4'-羟 基苯乙酮时，可以使用的水/甲醇的混合液的量是约40-100mL。另外，对碳酸氢钠的量也没 有特殊限制，只要它相对于作为反应底物的上述沉淀为非常大地过量即可。例如，当在上述 条件下进行反应时，加入到反应溶液中的饱和碳酸氢钠水溶液的量可以是约25mL。然后，将上述制备的6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶充分干燥，并 溶解于二噁烷，在加入三乙胺后，加入双(三丁基锡)和催化剂量的四(三苯膦)钯。将该 反应混合物在约90°C下加热，并反应约24小时，然后蒸馏除去溶剂，进行色谱精制，以得到 作为目标化合物的6-三丁基甲锡烷基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]吡啶(图1， 步骤3)。此时所使用的双(三丁基锡)的量可以是满足相对于反应底物为过量条件的量， 具体地，优选它的摩尔比是相对于反应底物6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]吡 啶的约1. 5倍。当获得6-位的取代基是三丁基甲锡烷基取代基以外的三烷基甲锡烷基取代基的 化合物时，可以在步骤3中使用适合目的的各种双(三烷基锡)来代替双(三丁基锡)。例 如，当合成在6-位具有三甲基甲锡烷基取代基作为取代基的化合物时，可以在步骤3中用 双(三甲基锡)进行与上述同样的反应。为了得到6位取代基是非放射性卤素取代基的化合物，可以将步骤2获得的化合 物本身用作含有溴作为卤素取代基的化合物，对于6位的卤素取代基是氟、氯和碘的化合 物，进行与步骤2相同的反应，除了在步骤2中分别使用2-氨基-5-氟吡啶、2-氨基-5-氯 吡啶和2-氨基-5-碘吡啶代替2-氨基-5-溴吡啶。为了得到6位上通过氧原子连接有取代基的化合物，在步骤2中，可以用2-氨 基-5-羟基吡啶代替2-氨基-5-溴吡啶来进行反应，以合成2-(4'-羟基苯基)-6-羟基 咪唑并[l，2-a]吡啶，可以在碱的存在下，将含有希望引入的取代基的溴化物与其反应。例 如，为了获得6位具有3-氟丙氧基取代基的化合物，可以在碳酸钾的存在下将2-(4'-羟 基苯基)-6_羟基咪唑并[l，2-a]吡啶与1-溴-3-氟丙烷反应。此外，为了得到6位上通过烷基链连接有取代基的化合物，可以进行下列操作。 例如，对于6位取代基是3'-溴丙基的化合物，可以将步骤2得到的2_(4'-羟基苯 基)-6_溴咪唑并[l，2-a]吡啶与烯丙基三丁基锡反应，转化成6-烯丙基-2-(4'-羟 基苯基)咪唑并[l，2-a]吡啶。然后进行硼氢化和氧化反应，以转化成2-(4'-羟基苯
13基)-6_(3'-羟基丙基)咪唑并[l，2_a]吡啶。此外，可以在三苯膦的存在下，通过四溴甲 烷进行羟基的溴化。除了在图1的步骤2中使用2-氨基-5-溴嘧啶代替2-氨基-5-溴吡啶以外，根 据上述方法，可以制备其中AU2，A3和A4中的A1是氮的上式⑴所示的化合物，和其中A5， A6，A7和A8中的A5是氮的上式(2)所示的化合物。除了在图1的步骤2中使用6-氨基-3-溴-1，2，4-三嗪代替2-氨基-5-溴吡啶 以外，根据上述方法，可以制备其中AU2，A3和A4中的A2和A4是氮的上式⑴所示的化合 物，和其中A5，A6，A7和A8中的A6和A8是氮的上式(2)所示的化合物。(放射性卤素标记的有机化合物的合成方法)接着，以2_(4'-羟基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[l，2_a]吡啶为例，描述根据本发 明另一个方面的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法。在2_(4'-羟基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[l，2_a]吡啶的制备中，首先得到作为 标记用的放射性卤离子的[123I]碘化钠溶液。可以通过例如将氙气用作靶标并暴露于质子 轰击的已知方法来获得[123I]放射性碘。使用已知方法将该[123I]放射性碘制入到[123I] 碘化钠溶液中，并用于标记。然后，将标记前体6-三丁基甲锡烷基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶 溶解于惰性有机溶剂，向其中加入[123I]碘化钠溶液、酸和氧化剂，使它们反应，得到作为目 标化合物的2-(4'-羟基苯基)-6-[123I]碘咪唑并[l，2-a]吡啶。作为溶解前体化合物的 惰性有机溶剂，可以使用与标记前体和[123I]碘化钠之间不具有反应性的各种溶剂，优选可 以使用甲醇。作为酸，可以使用各种酸，优选盐酸。对于氧化剂没有特殊限制，只要它能在反应溶液中氧化碘即可，优选过氧化氢或 过氧乙酸。所加入的氧化剂的量可以是足以在反应溶液中氧化碘的量。用碘以外的放射性卤素标记的化合物，可以通过用适合目的的放射性卤素标记适 合合成目的的标记前体来合成。例如，为了合成6-[18F]氟丙氧基-2-(4'-羟基苯基)咪 唑并[l，2-a]吡啶，可以在相转移催化剂和碳酸钾的存在下，将标记前体2-(4'-羟基苯 基)-6-(3'-对甲苯磺酰氧基丙氧基)咪唑并[l，2-a]吡啶与[18F]氟离子反应。(本发明检测试剂的制备方法和使用方法)根据前体蛋白的种类不同，淀粉样蛋白具有多种不同结构，但它们的共同点是具 有β-折叠结构。已知以淀粉样蛋白为对象的许多染色试剂例如硫磺素T和刚果红靶向该 β -折叠结构，并且对不同种类的淀粉样蛋白具有同等的染色能力。本发明的式(1)的化合物对以淀粉样蛋白蛋白(下文称作Αβ)为前体化合 物的淀粉样蛋白具有亲和性，并且还具有抑制已知能结合广泛的淀粉样蛋白的硫磺素T与 淀粉样蛋白结合的活性。因此，认为本发明的式⑴的化合物与硫磺素T同样，对淀粉样蛋白的折叠结 构具有亲和性。这启示本发明式(1)的化合物对各种淀粉样蛋白具有相同的亲和性。S卩，本发明的淀粉样蛋白检测试剂可以与硫磺素T和刚果红同样地，用于诊断全 身性淀粉样变性病和局限性淀粉样变性病。全身性淀粉样变性病包括免疫球蛋白性淀粉样 变性病、反应性AA淀粉样变性病、家族性淀粉样变性病、透析淀粉样变性病、老年性淀粉样
14变性病等。局限性淀粉样变性病包括脑淀粉样变性病、内分泌淀粉样变性病、皮肤淀粉样变 性病和局限性结节性淀粉样变性病等。 本发明的淀粉样蛋白检测试剂不仅可以用作体外活组织检查使用的试剂，也可以 作为放射性诊断剂，用作体内使用的试剂。本发明的淀粉样蛋白检测试剂，可以与其他一般公知的放射性诊断剂同样地，配 制成将上述式(1)的放射性卤素标记的化合物根据期望混入任选调节至适当PH的水、生理 盐水或林格液等而成的溶液。此时，应将本发明化合物的浓度调节至不超过确保本发明化 合物稳定性的浓度。对本发明化合物的剂量没有特殊限制，只要它足以得到所给予试剂的 分布图像即可。例如，就碘-123 (123I)标记的化合物和氟-18 (18F)标记的化合物而言，可以 通过静脉内或局部给予约50_600MBq/60kg成人体重。可以通过公知方法使所给予的试剂 分布显像。例如，可以通过该柱PECT装置使碘-123 (123I)标记的化合物显像，另外可以通 过PET装置使氟-18 (18F)标记的化合物显像。通过对生物体给予本发明的淀粉样蛋白检测试剂，可以使沉积在生物组织例如 脑、心脏、肺、消化道、血管、肝、胰脏、肾、关节和骨中的淀粉样蛋白显像，并且用于使难以活 检采集的生物组织例如脑、心脏、肺、胰脏、骨和关节中的淀粉样蛋白沉积显像。
实施例以下，通过实施例、比较例和参考例更详细地描述本发明。然而，以下的例子决不 限制本发明的范围。在以下实施例中，用于实验的各化合物的名称如表1-1中所定义。表1 实施例中使用的评价化合物的化合物名称 (实施例1-1) 6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的合 成将50mL乙酸乙酯加入到28. 17g(相当于126mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其 中加入8. 18g(相当于60.0mmol)的4'-羟基苯乙酮在50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合 液中的溶液。然后加热回流所得混合物。5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙 酸乙酯/石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图 1，步骤1)。将2. 15g(相当于lO.Ommol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮和1. 74g (相当于 10. Ommol)的2-氨基-5-溴吡啶溶解于50mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在105°C下加热 回流6小时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减 压干燥。将所得粗结晶混悬在20mL水和20mL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约25mL 饱和碳酸氢钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理5分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到2.41g(相当于8.32mmol)的6-溴_2_(4'-羟基苯基) 咪唑并[l，2-a]吡啶(图1，步骤2)。将138mg(相当于0.476mmol)的6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡 啶溶解于20mL的二噁烷中，向其中加入2mL的三乙胺。然后，向其中加入360 μ L(相当于
0.713mmol)的双(三丁基锡)和20mg(催化剂量)的四(三苯膦)钯。在将反应混合物在 90 V下搅拌22小时后，减压蒸馏除去溶剂。通过制备型TLC (洗脱溶剂己烷/乙酸乙酯= 1/4)精制残余物，再通过再循环制备型HPLC(HPLC装置LC-908(商品名；日本分析工业公 司制)；色谱柱2根JAIGEL 2H(商品名；日本分析工业公司制)串联；流动相氯仿)精制 所得粗产物，得到47mg(相当于94.9μπι01)的6-三丁基甲锡烷基-2-(4 ‘-羟基苯基)咪 唑并[l，2-a]吡啶(图1，步骤3)。所得6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的NMR测定结 果(内标物四甲基硅烷)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-NMR(溶剂氯仿 _dl，共振频率500MHz) δ 8. 01-7. 94 (m, 1H)，7. 71-7. 67 (m, 2H)，7. 70-7. 67 (m, 1H)，7. 64-7. 60 (m, 1H)，7. 20-7. 11 (m, 1H)，6. 89-6. 85 (m, 2H)，
1.62-1. 46 (m, 6H)，1. 34(sext, J = 7. 3Hz，6H)，1. 18-1. 03(m，6H)，0· 90 (t, J = 7. 3Hz，9H)。13C-NMR (溶剂氯仿-dl，共振频率:125MHz) δ 157. 85，145. 11，144. 72，131. 90， 129. 93，127. 62，124. 02，122. 59，116. 14，116. 09，106. 19,28. 96,27. 27，13. 62,9. 81。(实施例1-2)[125I]-2-(4‘-羟基苯基)_6_碘咪唑并[l，2_a]吡啶的合成
向53μ L的6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的甲 醇溶液(浓度lmg/mL)中，加入75 μ L的lmol/L盐酸，136MBq的[125I]碘化钠(体积为 40 μ L)和10 μ L的10% (W/V)过氧化氢。将该混合液在50°C下静置10分钟后，在下述条 件下将该溶液进行HPLC，以获得[1251]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡啶级 分。HPLC 条件色谱柱Phenomenex Luna C18(商品名；由 Phenomenex 公司制；规格4. 6x150mm)流动相含0. 三氟乙酸的水/含0. 三氟乙酸的乙腈=80/20 - 0/100(17 分钟，线性梯度)流速LOmL/分钟检测器紫外可见吸光光度计(检测波长282nm)和放射性计数器(Raytest公司 制；型号=STEFFI)将IOmL水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱(商品名；S印_Pak(注册商 标)Light C18 Cartridges, Waters公司制；填充剂的填充量130mg)，以使得该柱吸附收 集[1251]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡啶。用ImL水冲洗该柱，然后让ImL 乙醇通过，以洗脱[1251]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡啶。在合成刚结束 时，所得化合物的放射性活度是37. 5MBq。此外，在下述条件下进行TLC分析，结果，该化合 物的放射化学纯度是96. 5%。TLC分析条件TLC板RP-18F254(商品名；由默克公司制)流动相甲醇/水=20/1检测器生物图像分析仪，BAS_2500(型号BAS_2500 ；由富士胶片株式会社制)(实施例1-3)[123I]-2-(4‘-羟基苯基)_6_碘咪唑并[l，2_a]吡啶的合成向70μ L的6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的甲 醇溶液(浓度:lmg/mL)中，加入75-100 μ L的lmol/L盐酸、236_454MBq的[123I]碘化钠 (体积为15-120 μ L)、7· 5-10 μ L的lmmol/L碘化钠溶液和10-15 μ L的10% (W/V)过氧化 氢。将该混合物在50°C下加热10分钟后，在与实施例1-2相同的条件下进行HPLC，以获得 [123I]-2-(4‘-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡啶级分。将IOmL水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱(商品名；S印_Pak(注册商 标)Light C18 Cartridges, Waters公司制；填充剂的填充量130mg)，以使得该柱吸附收 集[1231]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡啶。用ImL水冲洗该柱，然后让ImL 乙醚通过，以洗脱[1231]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡啶。在合成刚结束 时，所得化合物的放射性活度是21-180MBq。此外，在与实施例1_2相同的条件下进行TLC 分析，结果，该化合物的放射化学纯度是99. 5%。(实施例1-4)6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的合成将50mL乙酸乙酯加入到28. 17g(相当于126mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其 中加入8. 18g(相当于60.0mmol)的4'-羟基苯乙酮的50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混 合液。然后加热回流所得混合物。5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减压浓缩 所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓缩所得
17溶液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙酸乙酯 /石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图2，步骤 1)。将2. 15g(相当于lO.Ommol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮和1. 74g (相当于 10. Ommol)的2-氨基-5-溴吡啶溶解于50mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在105°C下加热 回流6小时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减 压干燥。将所得粗结晶混悬在20mL水和20mL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约25mL 饱和碳酸氢钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理5分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到2.41g(相当于8.32mmol)的6-溴_2_(4'-羟基苯基) 咪唑并[l，2-a]吡啶(图2，步骤2)。所得6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的NMR测定结果(内标物 二甲亚砜)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-匪R (溶剂二 甲亚砜-d6，共振频率500MHz) δ 9. 54 (br. s, 1H),
8.83-8. 81(m，lH)，8. 17 (s，1H)，7. 79-7. 74 (m，2H)，7. 51 (d，J = 9. 6Hz，1H)，7. 30 (dd，J =
9.6，1. 8Hz，1H)，6. 86-6. 81 (m, 2H)。13C-NMR(溶剂二 甲亚砜-d6，共振频率:125MHz) δ 158. 15，146. 40，143. 79， 127. 82，127. 67，127. 14，125. 01，117. 87，116. 15，108. 60，106. 05。(实施例1-5)2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2_a]吡啶的合成将50mL乙酸乙酯加入到28. 17g(相当于126mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其 中加入8. 18g(相当于60.0mmol)4'-羟基苯乙酮的50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合液。 然后加热回流所得混合物。5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减压浓缩所得滤 液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓缩所得溶液。 通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙酸乙酯/石油 醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图3，步骤1)。将441mg(相当于2. Ommol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮和449mg(相当于2. Ommol) 的2-氨基-5-碘吡啶溶解于15mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在110°C下加热回流5小 时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。 将所得粗结晶混悬在IOmL水和IOmL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约IOmL饱和碳酸 氢钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理5分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀，用水充 分洗涤，减压干燥，得到526mg(相当于1.56mm0l)的2_(4'-羟基苯基)_6_碘咪唑并[1， 2-a]吡啶(图3，步骤2)。所得2_(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2_a]吡啶的NMR测定结果(内标物 二甲亚砜)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-NMR(溶剂二 甲亚砜 _d6，共振频率500MHz) δ 8. 86-8. 84(m, 1H)，8· 14(s， 1H)，7. 78-7. 74 (m, 2H)，7. 40-7. 35 (m, 2H)，6. 86-6. 82 (m, 2H)。13C-NMR(溶剂二 甲亚砜-d6，共振频率125MHz) δ 158. 08，145. 87，143. 87， 132. 48，131. 72，127. 67，124. 99，118. 14，116. 14，108. 02,75. 85。
(实施例1-6)2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2_a]嘧啶的合成将50mL乙酸乙酯加入到28. 17g(相当于126mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其 中加入8. 18g(相当于60.0mmol)的4'-羟基苯乙酮的50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混 合液。然后加热回流所得混合物。5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减压浓缩 所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓缩所得 溶液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙酸乙酯 /石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图4，步骤 1)。将646mg(相当于3. Ommol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮和668mg(相当于3. Ommol) 的2-氨基-5-碘嘧啶溶解于20mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在110°C下加热回流8小 时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。 将所得粗结晶混悬在IOmL水和IOmL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约15mL饱和碳酸 氢钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理3分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀，用水充 分洗涤，减压干燥，得到737mg(相当于2. 19mmol)的2_(4'-羟基苯基)_6_碘咪唑并[1， 2-a]嘧啶(图4，步骤2)。所得2_(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2_a]嘧啶的NMR测定结果(内标物 二甲基甲酰胺)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-NMR(溶剂二甲基甲酰胺-d7，共振频率500MHz) δ 9. 80 (br. s，lH)，9. 35 (d, J = 2. 3Hz, 1H)，8. 60 (d, J = 2. 3Hz, 1H)，8. 23 (s, 1H)，7. 94-7. 90 (m, 2H)，6. 98-6. 94 (m, 2H)。13C-匪R(溶剂二甲基甲酰胺-d7，共振频率125MHz) δ 158. 87，154. 00，147. 18， 146. 77，139. 07，127. 68，124. 50，115. 85，106.10，73.46。(实施例1-7)6-(3'-氟丙氧基)-2_(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡啶的合 成将31. llg(相当于178. 88mmol)的2_溴_3_羟基吡啶溶解于95. 8mL的二甲亚砜 中，向其中加入89.9mL(相当于89.9mmol)的lmol/L的甲醇钠-甲醇溶液。然后加热该 反应溶液至90°C，以蒸馏除去甲醇。在将反应溶液冷却至5°C以下后，加入29. 2g(相当于 205. 62mmol)的碘甲烷，然后在室温下搅拌17小时。反应结束后，将反应溶液倒入冰水中， 用氯仿萃取2次。用lmol/L的氢氧化钠溶液洗涤合并的氯仿层，再用饱和氯化钠溶液洗 涤2次，用无水硫酸钠干燥。在减压蒸馏除去溶剂后，得到20.74g(相当于110.31mmol)的 2-溴-3-甲氧基吡啶(图5，步骤1)。将83mL的浓硫酸冷却至_5°C，向其中小心加入83mL的90%硝酸。随后，向其中 小心加入20. 69g(相当于110. (Mmmol)的2-溴-3-甲氧基吡啶。在将反应混合物在冰浴 中搅拌5分钟后，将该混合物在室温下搅拌10分钟，然后加热至55°C，再搅拌1小时。在 反应溶液冷却至室温后，将反应溶液一点一点地倒入碎冰中以产生沉淀。过滤沉淀并用水 洗涤，然后在减压下用五氧化二磷干燥，得到17.41g(相当于74.71mmol)的2-溴-3-甲氧 基-6-硝基吡啶(图5，步骤2)。将17. 36g(相当于74. 50mmol)的2_溴_3_甲氧基-6-硝基吡啶溶解于520mL的 乙醇中，在氩气流下向其中加入11.63g(50%湿度)的10%钯碳。然后向该混合物中滴加88.4mL的一水合胼。在将反应混合物加热回流45分钟后，将反应溶液冷却至室温。然后， 在滤除钯碳后，用乙醇洗涤残余物，合并洗液和滤液。减压浓缩合并的溶液。然后向该浓缩 物中加入402mL水和38mL浓氨水，将所得混合物用氯仿萃取8次。用无水硫酸钠干燥合 并的氯仿层，减压浓缩。减压蒸馏出所得粗产物，得到8. 14g(相当于65.57mmol)的2-氨 基-5-甲氧基吡啶(图5，步骤3)。将13. 50g(相当于59.66mmol)的4'-苯甲酰氧基苯乙酮溶解于IlOOmL的甲醇 中，向其中加入34. 52g(相当于71.59mm0l)的四正丁基三溴化铵。将混合物在室温下搅拌 过夜，减压蒸馏以除去溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯，用水洗涤2次，然后用饱和氯化钠 溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层，减压浓缩后，通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂 己烷/ 二氯甲烷=1/1)精制所得粗产物，得到13.38g(相当于43.84mmol)的4'-苯甲酰 氧基-2-溴苯乙酮(图5，步骤4)。将13. 33g(相当于43.68mmol)的4'-苯甲酰氧基_2_溴苯乙酮和5. 67g(相当 于45. 67mmol)的2-氨基-5-甲氧基吡啶溶解于481mL的乙醇。将所得溶液加热回流2小 时。在反应溶液冷却后，向其中加入6.64g(相当于79.09mmol)的碳酸氢钠。再将所得反 应混合物加热回流4小时。反应结束后，减压浓缩溶剂。将所得残余物溶解于氯仿，然后用 水洗涤。用无水硫酸钠干燥氯仿层后，蒸馏除去溶剂。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯 仿/乙酸乙酯=20/1)精制所得粗产物，得到10.20g(相当于30.87mmol)的2_(4'-苯甲 酰氧基苯基)-6-甲氧基咪唑并[l，2-a]吡啶(图5，步骤5)。将充分干燥除去水分的4.90g(相当于14.83mmol)的2_(4'-苯甲酰氧基苯 基)-6_甲氧基咪唑并[l，2-a]吡啶溶解于245mL的氯仿中并冷却至_15°C。向该溶液中 滴加将12. 62mL(相当于133. 48mmol)三溴化硼溶解于134mL 二氯甲烷中而成的溶液。在 将所得溶液的温度升高至室温后，将所得溶液搅拌17小时。反应结束后，用冰冷却反应溶 液，并补充668mL的甲醇，在室温下再搅拌3小时。然后减压浓缩反应混合物。向所得粗产 物补充290mL的氯仿和29mL的甲醇以获得浆液，然后过滤回收沉淀。用氯仿洗涤回收的沉 淀，然后减压干燥，得到3.00g(相当于13.28mmol)的2_(4'-羟基苯基)-6-羟基咪唑并 [1,2-a]吡啶(图5，步骤6)。将560mg (相当于2. 48mmol)的2_ (4 ‘-羟基苯基)_6_羟基咪唑并[1，2_a] 吡啶溶解于21mL的二甲基甲酰胺中，向其中加入1.37g(相当于9.90mmol)的碳酸钾和 349mg(相当于2.48mmol)的1_溴_3_氟丙烷。将该溶液在室温下搅拌24小时。减压浓 缩反应溶液，然后补充IOmL的氯仿和IOmL的甲醇以获得浆液。过滤该浆液，浓缩滤液。通 过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，得到151mg(相当于 0. 527μπι01)的6-(3'-氟丙氧基)_2_(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡啶(图5，步 骤7)。所得6_(3'-氟丙氧基)-2_(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的NMR测定 结果(内标物二甲亚砜)如下所示。所使用的NMR装置JNM-GSX-270 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-NMR(溶剂二 甲亚砜-d6 ；共振频率270MHz) δ 9. 52 (s，1H)，8. 22 (d，J = 2. 2Hz, 1H), 8. 08 (s, 1H), 7. 75-7. 65 (m, 2Η), 7. 44 (d, J = 9. 6Hz，1Η)，6. 99 (dd，J = 9.6， 2. 2Ηζ，1Η)，6. 85-6. 75 (m，2Η)，4. 62 (dt，2Jhf = 47. OHz，J = 6. OHz，2Η)，4. 05 (t，J =
206. 0Hz, 2H) ,2. 13(dquint，3JHF = 25. 9Hz, J = 6. 0Hz，2H)。(实施例1-8)6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]嘧啶的合成将50mL乙酸乙酯加入到28. 17g(相当于126mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其 中加入8. 18g(相当于60.0mmol)的4'-羟基苯乙酮的50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合 液。然后加热回流所得混合物。5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减压浓缩所 得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓缩所得溶 液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，再从乙酸乙酯 /石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图6，步骤 1)。将748mg(相当于3. 5mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮和605mg(相当于3. 5mmol) 的2-氨基-5-溴嘧啶溶解于30mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在110°C下加热回流5小 时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。 将所得粗结晶混悬在IOmL水和15mL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约IOmL饱和碳 酸氢钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理5分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀，用 水充分洗涤，减压干燥，将所得粗产物从N，N- 二甲基甲酰胺中重结晶，得到289mg (相当于 0. 997mmol)的6-溴-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]嘧啶(图6，步骤2)。所得6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]嘧啶的NMR测定结果(内标物 二甲亚砜)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-NMR(溶剂二 甲亚砜-d6，共振频率500MHz) δ 9. 56 (br. s, 1H) ,9. 21 (d, J = 2. 5Hz, 1H)，8. 46 (d, J = 2. 5Hz, 1H)，8. 09 (s, 1H)，7. 79-7. 75 (m, 2H)，6. 83-6. 79 (m, 2H)。13C-NMR(溶齐[J 二 甲亚砜-d6，共振频率:125MHz) δ 158. 63，149. 99，147. 68， 146. 88，134. 78，127. 93，124. 52，116. 23，106. 83，103. 94。(实施例1-9)6-氟-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的合成将70mL乙酸乙酯加入到40. 0g(相当于179mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其中 加入11.6g(相当于85. 3mmol)的4'-羟基苯乙酮在70mL乙酸乙酯和70mL氯仿的混合液 中的溶液。然后加热回流所得混合物。5. 5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙 酸乙酯/石油醚中重结晶，得到10.2g(相当于47.3mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图 7，步骤1)。将439mg(相当于2. Ommol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮和224mg(相当于2. Ommol) 的2-氨基-5-氟吡啶溶解于20mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在110°C下加热回流5小 时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。 将所得粗结晶混悬在8mL水和SmL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约IOmL饱和碳酸氢 钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理5分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀，用水充分 洗涤，减压干燥，得到302mg(相当于1.32mm0l)的6-氟_2_(4'-羟基苯基)咪唑并[1， 2-a]吡啶(图7，步骤2)。所得6-氟-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的NMR测定结果(内标物
21二甲亚砜)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-NMR(溶剂二 甲亚砜 _d6，共振频率500MHz) δ 9. 45 (br. s, 1H) ,8. 65(ddd, 3Jhf = 4. 6Hz, J = 2. 5,0. 7Hz, 1H)，8· 16-8. 15 (m, 1H)，7. 75-7. 69 (m，2H)，7. 56-7. 51 (m, 1H)， 7. 23(ddd，3JHF = 8. 4Hz, J = 9. 9,2. 5Hz, 1H)，6· 82-6. 76 (m, 2H)。13C-NMR(溶剂二 甲亚砜-d6，共振频率:125MHz) δ 157. 82，152. 81 (d，1Jcf = 232. 3Hz) , 146. 58,142. 92,127. 35,124. 99,117. 19 (d, 3Jcf = 9. 6Hz) ,116. 40 (d, 2Jcf = 25. 9Ηζ)，115. 89，113. 66 (d, 2Jcf = 41. 8Ηζ)，109. 48。19F-NMR(溶剂二 甲亚砜 _d6，共振频率:470MHz) δ 141. 93 (br. s)。(实施例1-10)2-(4‘-羟基苯基)-6_硝基咪唑并[l，2_a]吡啶的合成将70mL乙酸乙酯加入到40. Og (相当于179mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其中 加入11.6g(相当于85. 3mmol)的4'-羟基苯乙酮在70mL乙酸乙酯和70mL氯仿的混合液 中的溶液。然后加热回流所得混合物。5. 5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减 压浓缩所得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓 缩所得溶液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙 酸乙酯/石油醚中重结晶，得到10.2g(相当于47.3mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图 8，步骤1)。将432mg(相当于2. Ommol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮和279mg(相当于2. Ommol) 的2-氨基-5-硝基吡啶溶解于20mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在110°C下加热回流6 小时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减压干燥。 将所得粗结晶混悬在8mL水和SmL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约SmL饱和碳酸氢钠 溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理3分钟。从所得混合物中过滤回收沉淀，用水充分洗 涤，减压干燥，得到148mg(相当于0.580mmol)的2_(4'-羟基苯基)-6-硝基咪唑并[1， 2-a]吡啶(图8，步骤2)。所得2_(4'-羟基苯基)-6-硝基咪唑并[l，2_a]吡啶的NMR测定结果(内标物 二甲亚砜)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-NMR(溶剂二 甲亚砜 _d6，共振频率500MHz) δ 9. 74-9. 72 (m, 1H) ,9. 59 (br. s, 1H) ,8. 39 (s, 1H) ,7. 87 (dd, J = 9. 9，2. 3Hz，1H)，7. 79-7. 74 (m，2H)，7. 65-7. 61 (m，1H)， 6. 84-6. 80 (m, 2H)。13C-NMR(溶齐[J 二 甲亚砜-d6，共振频率:125MHz) δ 158. 47，148. 51，145. 25， 136. 63，127. 93，127. 81，124. 06，118. 92，116. 09，115.92，110.37。(实施例11-1)6-三丁基甲锡烷基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]嘧啶的 合成将50mL乙酸乙酯加入到28. 17g(相当于126mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其 中加入8. 18g(相当于60.0mmol)的4'-羟基苯乙酮的50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合 液。然后加热回流所得混合物。5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减压浓缩所 得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓缩所得溶 液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙酸乙酯/石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图10，步骤 1)。将748mg (相当于3. 48mmol)的2_溴_4 ‘-羟基苯乙酮和605mg (相当于 3. 48mmol)的5-溴-2-氨基嘧啶溶解于30mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在110°C下加热 回流5小时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀，减 压干燥。将所得粗结晶混悬在IOmL水和15mL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约IOmL 饱和碳酸氢钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理5分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀，用水充分洗涤，减压干燥。从DMF中重结晶所得固体，得到289mg(相当于1. OOmmol)的 6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]嘧啶(图10，步骤2)。将75. 4mg(相当于0. 260mmol)的6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]嘧 啶溶解于10. OmL的二噁烷中，向其中加入2. OmL的三乙胺。然后，向其中加入0. 20mL(相 当于0.39mmol)的双(三丁基锡)和20. Img(催化剂量)的四(三苯膦)钯。在将反应 混合物在90°C下搅拌10小时后，减压蒸馏除去溶剂。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂己 烷/乙酸乙酯=1/1)精制残余物，得到24.01^(相当于0.048讓01)的6-三丁基甲锡烷 基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]嘧啶(图10，步骤3)。所得6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]嘧啶的NMR测定结 果(内标物四甲基硅烷)如下所示所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-匪R (溶剂氯仿 _dl，共振频率500MHz) δ 8. 41 (s，1H)，8. 23 (s，1H)，7. 80 (d， J = 8. 7Ηζ，2Η)，7· 63 (s，1Η)，6· 93(d, J = 8. 7Ηζ，2Η)，1. 57-1. 51(m，6H)，1. 37-1. 23(m，6H)， 1. 16-1. 12(m，6H)，0· 88 (d, J = 7. 3Ηζ，9Η)(实施例11-2)6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡嗪的 合成将50mL乙酸乙酯加入到28. 17g(相当于126mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其 中加入8. 18g(相当于60.0mmol)的4'-羟基苯乙酮的50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合 液。然后加热回流所得混合物。5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减压浓缩所 得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓缩所得溶 液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙酸乙酯/ 石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图11，步骤 1)。将4.66g(相当于21.6mm0l)的2-溴-4 ‘-羟基苯乙酮和2. 53g (相当于 14. 5mmol)的5-溴-2-氨基吡嗪溶解于IOOmL乙腈中。将所得溶液在油浴中在110°C下加 热回流3. 5小时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉 淀，减压干燥。将所得粗结晶混悬在IOmL水和IOmL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约 20mL饱和碳酸氢钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理10分钟。从所得混合物中过滤回 收沉淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到1.32g(相当于4.55mmol)的6-溴_2_(4'-羟基苯 基)咪唑并[l，2-a]吡嗪(图11，步骤2)。将1.00g(相当于3.45mmol)的6-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡嗪 溶解于50. OmL的二噁烷中，向其中加入20. OmL的三乙胺。然后，向其中加入4. 5mL(相当于5. ISmmol)的双(三丁基锡)和239mg(催化剂量)的四(三苯膦)钯。在将反应混合物在 90°C下搅拌24小时后，减压蒸馏除去溶剂。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂己烷/乙酸乙 酯=1/1)精制残余物，得到314mg(相当于0.628mmol)的6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟 基苯基)咪唑并[l，2-a]吡嗪(图11，步骤3)。所得6-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡嗪的NMR测定结 果(内标物四甲基硅烷)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-WR (溶剂氯仿 _dl，共振频率500MHz) δ 9. 21 (s，1H)，7. 95 (s，1H)，7. 79 (d， J = 8. 7Hz,2H)，7. 77 (s, 1H)，6. 91 (d，J = 8. 7Hz,2H)，1. 70-1. 55 (m, 6H)，1. 38-1. 31 (m, 6H)，
1.18-1. 15(m，6H)，0· 89 (d, J = 7. 3Hz，9H)13C-NMR (溶剂氯仿 _dl，共振频率:125MHz) δ 157. 3，146. 4，143. 5，140. 3 128. 0，124. 9，123. 6，116. 1，106. 9,29. 0,27. 3，13. 7，10. 0。(实施例ΙΙ-3)2-(4'-羟基苯基)_6_碘咪唑并[1，2_a]吡嗪的合成将实施例II-2所得的314mg(相当于0. 628mmol)的6-三丁基甲锡烷 基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]吡嗪溶解于5. OmL 二氯甲烷中，向其中加入溶解于 5. OmL 二氯甲烷的114mg(相当于0. 942mmol)碘。将该反应混合物在0°C的温度下搅拌10 分钟，在室温下搅拌30小时。然后向其中加入饱和碳酸氢钠水溶液和饱和硫代硫酸钠水溶 液。过滤回收沉淀，依次用水和乙酸乙酯洗涤，减压干燥，得到131mg(相当于0.389mmol) 的2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡嗪(图12，步骤1)。所得2_(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2_a]吡嗪的NMR测定结果(内标物 四甲基硅烷)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-匪 R(溶剂二甲基甲酰胺-d7，共振频率500MHz) δ 9. 89 (s，1H)，9. 01 (s， 1H)，8· 82 (s，1Η)，8· 42 (s, 1Η)，7· 92 (d, J = 8. 7Ηζ，2Η)，6· 93 (d, J = 8. 7Ηζ，2Η)。(实施例11-4)8-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡啶的 合成将50mL乙酸乙酯加入到28. 17g(相当于126mmol)的溴化铜中获得混悬液，向其 中加入8. 18g(相当于60.0mmol)的4'-羟基苯乙酮的50mL乙酸乙酯和50mL氯仿的混合 液。然后加热回流所得混合物。5小时后，将反应混合物冷却至室温，并过滤。减压浓缩所 得滤液。将残余物溶解于乙酸乙酯，通过加入活性炭进行脱色操作。然后，过滤浓缩所得溶 液。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂氯仿/甲醇=20/1)精制所得粗产物，从乙酸乙酯/ 石油醚中重结晶，得到7.25g(相当于33.7mmol)的2-溴-4'-羟基苯乙酮(图13，步骤 1)。将432mg(相当于2. Olmmol)的2_溴_4 ‘-羟基苯乙酮和348mg(相当于
2.Olmmol)的3-溴-2-氨基吡啶溶解于20mL乙腈中。将所得溶液在油浴中在110°C下加 热回流6小时。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，过滤回收沉淀。用乙腈洗涤沉淀， 减压干燥。将所得粗结晶混悬在8mL水和SmL甲醇的混合液中。然后，向其中加入约SmL 饱和碳酸氢钠溶液，用超声洗涤器将混合物超声处理5分钟。从所得混合物中过滤回收沉 淀，用水充分洗涤，减压干燥，得到368mg(相当于1.27mm0l)的8-溴_2_(4'-羟基苯基)
24咪唑并[1,2-a]吡啶(图13，步骤2)。将75. 2mg(相当于0. 260mmol)的8-溴-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡 啶溶解于10. OmL的二噁烷中，向其中加入2. OmL的三乙胺。然后，向其中加入0. 20mL(相 当于0.39mmol)的双(三丁基锡)和20. Img(催化剂量)的四(三苯膦)钯。在将反应 混合物在90°C下搅拌11小时后，减压蒸馏除去溶剂。通过快速硅胶柱色谱(洗脱溶剂己 烷/乙酸乙酯=1/1)精制残余物，得到62.5mg(相当于0. 125mmol)的8-三丁基甲锡烷 基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[l，2-a]吡啶(图13，步骤3)。所得8-三丁基甲锡烷基-2-(4‘-羟基苯基)咪唑并[l，2_a]吡啶的NMR测定结 果(内标物四甲基硅烷)如下所示。所使用的NMR装置JNM-ECP-500 (日本电子株式会社(JEOL)制)1H-NMR (溶剂氯仿-dl，共振频率500MHz) δ 8. 01(d,J = 6. 4Hz，1H)，7. 87 (d，J =8. 7Ηζ，2Η)，7· 70 (s，1H)，7. 17(d, J = 6. 4Hz, 1H)，6· 87 (d, J = 8. 7Hz，2H)，6· 68-6. 66 (m, 1H)，1. 69-1. 56 (m, 6H)，1. 38-1. 30 (m, 6H)，1. 28-1. 16(m，6H)，0· 88 (t, J = 7. 3Hz，9H)13C-NMR (溶剂氯仿 _dl，共振频率:125MHz) δ 145. 2，141. 0，139. 2，132. 4， 131. 8，127. 7，127. 3，125. 0，115. 4，112. 2，106. 4,29. 2,27. 4，13. 7，10. 2。(实施例ΙΙ-5)[123I]-2-(4‘-羟基苯基)_6_碘咪唑并[l，2_a]嘧啶的合成向IOOyL的6-三丁基甲锡烷基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]嘧啶的 甲醇溶液(浓度:lmg/mL)中，加入IOOyL的2mol/L盐酸，621MBq的[123I]碘化钠(体 积为150 μ L)，20 μ L的lmmol/L碘化钠溶液和20 μ L的10 % (W/V)过氧化氢。在将该混 合物在50°C下静置10分钟后，将该溶液在与实施例1-2相同的条件下进行HPLC，以获得 [123I]-2-(4‘-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]嘧啶级分。进行与上段所述相同的操作，得到[1231]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[1， 2-a]嘧啶(试剂的添加量150 μ L的6-三丁基甲锡烷基_2_(4'-羟基苯基)-6-碘咪唑 并[1,2-a]嘧啶的甲醇溶液(浓度lmg/mL)，75μ L的2mol/L盐酸，487MBq的[123I]碘化 钠(体积为150 μ L)，20 μ L的lmmol/L碘化钠溶液和30 μ L的10% (W/V)过氧化氢)。混合上述两段操作获得的两种级分，向其中加入IOmL水。让所得溶液通过反相柱 (商品名；S印-Pak(注册商标)Light C18 Cartridges, Waters公司制；填充剂的填充量 145mg)，以使得该柱吸附收集[1231]-2-(4'-羟基苯基)_6_碘咪唑并[1，2_a]嘧啶。用 ImL水冲洗该柱，然后让ImL乙醚通过，以洗脱[1231]_2_(4'-羟基苯基)_6_碘咪唑并[1， 2-a]嘧啶。在合成刚结束时，所得化合物的放射性活度是67MBq。此外，在下述条件下进行 TLC分析，结果，该化合物的放射化学纯度是92. 5%。TLC分析条件TLC板硅胶60 F254 (商品名；由默克公司制)流动相氯仿/甲醇/三乙胺=100/1/2检测器RitaStar (商品名；由 raytest 制)(实施例II-6)[123I]-2-(4‘-羟基苯基)_6_碘咪唑并[l，2_a]吡嗪的合成向IOOyL的6-三丁基甲锡烷基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡嗪的 甲醇溶液(浓度:lmg/mL)中，加入75 μ L的2mol/L盐酸，469MBq的[123I]碘化钠(体积 为IOOyL)，20μ L的lmmol/L碘化钠溶液和20μ L的10% (W/V)过氧化氢。在将该混合物在50°C下静置10分钟后，将该溶液在与实施例1-2相同的条件下进行HPLC，以获得 [123I]-2-(4‘-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡嗪级分。将IOmL水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱(商品名；S印_Pak(注册商 标)Light C18 Cartridges, Waters公司制；填充剂的填充量145mg)，以使得该柱吸附收 集[1231]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡嗪。用ImL水冲洗该柱，然后让ImL 乙醚通过，以洗脱[1231]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡嗪。在合成刚结束 时，所得化合物的放射性活度是133MBq。此外，在与实施例11_5相同的条件下进行TLC分 析，结果，该化合物的放射化学纯度是99. 0%。(实施例II-7)[123I]-2-(4‘-羟基苯基)_8_碘咪唑并[l，2_a]吡啶的合成向70yL的8-三丁基甲锡烷基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡嗪的 甲醇溶液(浓度:lmg/mL)中，加入50 μ L的2mol/L盐酸，454MBq的[123I]碘化钠(体积 为10(^0，2(^1^的111111101/1碘化钠溶液和2(^1^的10% (W/V)过氧化氢。在将该混 合物在50°C下静置10分钟后，将该溶液在与实施例1-2相同的条件下进行HPLC，以获得 [123I]-2-(4‘-羟基苯基)-8_碘咪唑并[l，2-a]吡啶级分。将IOmL水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱(商品名；S印_Pak(注册商 标)Light C18 Cartridges, Waters公司制；填充剂的填充量130mg)，以使得该柱吸附收 集[1231]-2-(4'-羟基苯基)-8_碘咪唑并[l，2-a]吡啶。用ImL水冲洗该柱，然后让ImL 乙醚通过，以洗脱[1231]-2-(4'-羟基苯基)-8_碘咪唑并[l，2-a]吡啶。在合成刚结束 时，所得化合物的放射性活度是185MBq。此外，在与实施例11_5相同的条件下进行TLC分 析，结果，该化合物的放射化学纯度是91.7%。(参考例1) [125IJ-IMPY 的合成根据下述步骤来合成在用于评价IogP^eW比较例(比较例1-6)中使用的-impy。根据在文献(Zhi-PingZhuang 等人，J. Med. Chem, 2003，46，p. 237-243)中所述的 方法，合成6-三丁基甲锡烷基-2-[4‘ -(N，N-二甲基氨基)苯基]咪唑并[l，2-a]吡啶， 并溶解于甲醇(浓度lmg/mL)中。向53 μ L所得溶液中，加入75 μ L的lmol/L盐酸，20 μ L 的13. 5MBq的[125I]碘化钠和10 μ L的10% (W/V)过氧化氢。在将混合液在50°C下静置 10分钟后，将该溶液在与实施例1-2相同的条件下进行HPLC，以得到[125I]-IMPY级分。将IOmL水加入到该级分中。让所得溶液通过反相柱(商品名；S印_Pak(注册商 标)Light C18 Cartridges, Waters公司制；填充剂的填充量130mg)，以使得该柱吸附收 集[125I]-IMPY。用ImL水冲洗该柱，然后让ImL乙醇通过，以洗脱[125I]-IMPY。在合成刚 结束时，所得化合物的放射性活度是2. 6MBq。此外，在与实施例1-2相同的条件下进行TLC 分析，结果，该化合物的放射化学纯度是98. 0%。(参考例2) [123IJ-IMPY 的合成根据下述步骤来合成在用于评价脑中蓄积性的比较例(比较例1-7)中使用的 [123Il-IMPYo根据在文献(Zhi-PingZhuang 等人，J. Med. Chem，2003，46，p. 237-243)中所述 的方法，合成6-三丁基甲锡烷基-2-[4' -(N, N-二甲基氨基)苯基]咪唑并[l，2-a]吡 啶，并溶解于甲醇(浓度lmg/mL)中。向53μ L所得溶液中，加入IOOyL的lmol/L盐酸，20-50 μ L 的 190-240MBq 的[123I]碘化钠、10 μ L 的 lmmol/L 碘化钠溶液和 10 μ L ^ 10 % (ff/v)过氧化氢。将该混合液在50°C下静置10分钟后，将该溶液在与实施例1-2相同的条 件下进行HPLC，以得到[123I]-IMPY级分。向该级分中加入IOmL水。让所得溶液通过反相柱(商品名；S印-Pak(注册商标) Light C18 Cartridges, Waters公司制；填充剂的填充量130mg)，以使得该柱吸附收集 [123U-IMPY0用ImL水冲洗该柱，然后让ImL乙醚通过，以洗脱[123I]_IMPY。在合成刚结束 时，所得化合物的放射性活度是47_56MBq。进而，在与实施例1_2相同的条件下进行TLC分 析，结果，该化合物的放射化学纯度是98. 0%。(实施例I-Il至1-14，比较例1_1至1_5)与淀粉样蛋白的结合性的测定通过下述的体外结合试验检验本发明的化合物与淀粉样蛋白的亲和性。(1)将A β H0 (肽研究所制)溶解于磷酸盐缓冲液(ρΗ 7. 4)，在37°C下振荡62-72 小时，以获得凝集Αβ混悬液(浓度相当于lmg/mL，以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白 混悬液)。(2)根据文献(Naiki, H.等人，Labeled Investigation, 74, ρ· 374-383 (1996)) 所述的方法，基于使用硫磺素T(由Fluka公司制)的荧光分光光度法，进行该淀粉样蛋白 混悬液的定性实验，以证实在(1)中获得的凝集Αβ是淀粉样蛋白(测定条件激发波长 446nm,荧光波长 490nm)。(3)根据文献(Wang, Y.等人，J. Labeled CompoundsRadiopharmaceut. 44, S239(2001))中所述的方法，由标记前体2-(4 ‘-氨基苯基)苯并噻唑制备 [125I]2-(3‘-碘-4'-氨基苯基)苯并噻唑(以下称作[125Ι]3' -Ι-ΒΤΑ-0)，将其溶解于 乙醇中。使用12-7IMBq ^ [125I]碘化钠(体积为10-30 μ L)进行制备，以得到合成刚结束 时l-22MBq的[125I]3' -I-BTA-O0将刚果红、硫磺素T和6_甲基~2~[4' -(N，N- 二甲基 氨基)苯基]苯并噻唑(以下称作6-Me-BTA-2)，直接以市售试剂的形式称重并使用。(4)分别根据文献(Wang, Y.等人，J. Labeled Compounds Radiopharmaceut. 44' S239(2001))和文献(Zhuang，Z.P.等人，J. Med. Chem.坚，237 (2003))中所述的方法来合成 2-(3'-碘-4'-氨基苯基)苯并噻唑(以下称作3' -Ι-ΒΤΑ-0)和IMPY。(5)制备将[125Ι]3' -Ι-ΒΤΑ-0、各评价化合物和淀粉样蛋白溶解于含有0. 牛 血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PH 7.4)中、并使它们的最终浓度如表2所示的样品。将所得 样品填充在96孔微量培养板的各孔(体积约0. 3mL)中。表2 在样品溶液中各化合物的最终浓度
27 (6)将填充有样品溶液的微量培养板以指定速度(400rpm)在22°C下振荡3小时。 然后让各样品溶液通过玻璃纤维过滤器(商品名；MulutiScreenTM-FC，由Millipore制造) 过滤，以从游离的[125I]3' -I-BTA-O中分离出与淀粉样蛋白结合的[125Ι]3' -Ι-ΒΤΑ-0。(7)用含有0. 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PH7.4)洗涤(0.5mLX5)用于 过滤各样品溶液的玻璃纤维过滤器，用Autowell Gamma系统(由Aloka公司制，型号 ARC-301B)测定该玻璃纤维过滤器的放射性。将该放射性作为与淀粉样蛋白结合的各样品 溶液的放射性水平，用于计算抑制率(以下，A表示各评价化合物的浓度为零(0)时样品中 的放射性水平，B表示各评价化合物的浓度为0. OOlnmol/L以上时样品中的放射性水平)。(8)另外，制备在含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中含有 15 μ mol/L 的 6-Me-BTA-2,400pmol/L 的[125I]3' -I-BTA-O 禾口 1 μ mol/L 的 Αβ H0 的溶液， 进行与上文(6)和(7)中所述相同的操作来测定放射性水平。将所测定的放射性水平定义 为背景放射性水平，用于计算抑制率(以下称作BG)。(9)使用在上述(7)和(8)中所测定的放射性水平，通过下述式(1)来求出抑制率。
抑制率=Ιζ^χ οο (%) -'-(I)
A-BG绘制相对于评价化合物浓度的对数的由所获得的抑制率通过概率单位(probit) 变换的值的图，以通过最小二乘法获得近似的直线。使用这条线，评价当放射性水平是不含 各评价化合物样品的一半时的各评价化合物的浓度，将其定义为各化合物的50%抑制浓度 (以下称作1(5(|%值)。使用该值作为指标，评价各评价化合物与淀粉样蛋白(凝集Aii1,) 的亲和性。各评价化合物的IC5(1%值如表3所示。化合物1 4都显示了小于100的IC5(1%值，
28与刚果红和硫磺素T相比，与淀粉样蛋白(凝集Αβ^)具有更高的亲和性。结果显示，化 合物1 4与淀粉样蛋白(凝集Aii1,)具有良好的亲和性。特别地，与3' -I-BTA-O和 6-Me-BTA-2相比，化合物1与淀粉样蛋白(凝集Αβ^)具有更高的亲和性，且其亲和性与 IMPY相当。表3 本发明化合物的IC5。％ (实施例1-15，实施例II-8至11_10，比较例1_6)基于辛醇萃取法的分配系数的 测定测定采用一般已知作为化合物渗透通过血脑屏障(以下称作BBB)指标的辛醇萃 取法的分配系数(以下称作IogP^l)。用包含lOmg/mL抗坏血酸的生理盐水溶液分别稀释实施例1_2制备的化合物5的 乙醚溶液(实施例1-15)，实施例II-5制备的化合物9的乙醚溶液(实施例II-8)，实施例 11-6制备的化合物10的乙醚溶液(实施例II-9)，实施例II-7制备的化合物11的乙醚溶 液(实施例11-10)和参考例1制备的[123I]-impy的乙醚溶液(比较例1-6)，调节放射性 浓度至20-30MBq/ml。分别向2mL的辛醇中加入各IOyL所制备的样品溶液，再加入2mL的 lOmmol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 4)，然后搅拌30秒。在用低速离心机离心分离(2000rpmx60 分钟)该混合物后，分别取样各ImL的辛醇层和水层，并且用Autowell Gamma系统(型号 ARC-301B，由Aloka制造)测定各自的放射性计数。使用所获得的放射性计数，根据公式 (2)计算IogP辛醇。
29,ρ ,,辛醇层的放射性计数、 … logP辛醇=logi°(水层的放射性计数)……⑵结果如表4所示。化合物5显示的IogP_值为1. 6，[125Ij-IMPY显示的IogP辛醇 值为2. 1。已知能渗透通过BBB的化合物的IogP^e值在1 3之间(Douglas D. Dischino 等人，J. Nucl. Med.，(1983)，24，p. 1030-1038)。因此，这表明，这两种化合物都具有与IMPY 同等的BBB渗透性。表4 本发明化合物的IogP辛醇值 (实施例1-16，比较例1-7)脑中转移性和清除性的测定使用化合物6，测定在雄性Wistar大鼠(7周龄)的脑中放射性蓄积的经时变化。在硫喷妥钠麻醉下，将化合物6 (实施例1-16)溶解于包含lOmg/mL抗坏血酸的 生理盐水溶液中的0. 05mL溶液(放射性浓度为20-30MBq/mL)和将上述参考例2制备的 [123I]-IMPY (比较例1-7)溶解于包含lOmg/mL抗坏血酸的生理盐水溶液中的0. 05mL溶液 (放射性浓度为20-30MBq/mL)，分别注射到各Wistar大鼠(7周龄)的尾静脉中。注射2， 5，30和60分钟后，通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠，移取脑，用autowell gamma系 统(型号:ARC-301B,由Aloka制造)测定脑的放射性(以下，在本实施例中，称作A)，此外 在注射后2，5，30和60分钟后，测定脑的质量。另外，按照与上述相同的方式测定0. 05mL 所注射溶液的1000倍稀释溶液的放射性(以下，在本实施例中，称作B)。使用这些测定结 果，根据下式(3)计算在各个时间点每单位脑重量的放射性分布(％ ID/g)。在各个时间点，各两只动物用于实施例1-16和比较例1-7。 结果如表5所示。如表5所示，在注射后2分钟的时间点，化合物6显示的蓄积与 123I-IMPY相当，随后显示出在60分钟内迅速清除的趋势。这些结果启示，化合物6具有与 123I-IMPY同样的优良的脑转移性和从脑中的迅速清除性。表5 化合物6在静脉注射后在脑中的放射性蓄积(大鼠)
30 (实施例1-17)脑中淀粉样蛋白的显像确认进行下述实验以检验通过本发明的化合物是否可以使脑中的淀粉样蛋白显像。(1)将Aii1,(肽研究所制)溶解于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，在371下振荡72小 时，以获得凝集Αβ混悬液(Αβ浓度相当于lmg/mL，以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋 白混悬液)。(2)将25 μ L(相当于25 μ g)的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性Wistar大鼠(7周 龄)一侧的杏仁核中。作为对照，将25 μ L的磷酸盐缓冲生理盐水溶液(pH 7.4)注射到该 大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液(PH 7.4)1 天后检查该大鼠。(3)将化合物6溶解于包含lOmg/mL的抗坏血酸的生理盐水溶液中，得到样品溶液 (放射性浓度为32MBq/mL)。将该溶液通过尾静脉注射到大鼠中(剂量0. 5mL，给予的放射 性活度相当于16MBq)。(4)在注射后60分钟移取脑，用切片机(型号CM3050S，由LEICA制造)制成厚度 IOym的脑切片。将该脑切片在成像板上曝光20小时，然后通过使用生物图像分析仪(型 号BAS-2500 ；由富士胶片株式会社制)进行图像分析。(5)在用生物图像分析仪进行图像分析后，用硫磺素T进行病理学染色，通过使用 荧光显微镜(型号TE2000-U型；由尼康公司制；激发波长400-440nm ；检测波长470nm) 进行显像。从而证明了淀粉样蛋白沉积在该切片上(图9b)。图9显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠脑切片的放射自显影图和硫磺素T染色的 图像。如图9所示，在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄积。 由硫磺素T在放射性蓄积位点染色的结果，证明了在该蓄积位点上存在着淀粉样蛋白。另 一方面，与其他位点相比，在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到明显的放射性蓄积。这些结果启示，化合物6具有在脑内的淀粉样蛋白上蓄积的性质，并具有使脑内 淀粉样蛋白显像的能力。(实施例1-18至1-20)回复突变试验为了检验化合物1、2和4的基因诱变性，使用鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100进行 回复突变试验(以下称作Ames试验)。本试验在添加S9mix和不添加S9mix的条件下进行。将二甲亚砜作为阴性对照。 阳性对照在不添加S9mix的情况下使用2- (2-呋喃基)-3- (5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺， 在添加S9mix的情况下使用2-氨基蒽。加入到试验平板上的各样品的量是7个剂量(几何比4)，最大剂量是5000 μ g/ 板。将各受试样品溶液和试验菌株(TA98或TA100)、或者将受试样品、S9mix和试验菌株混合在一起，然后用软琼脂在试验平板的培养基上将混合物重叠成多层，然后在37°C下培养 48小时。通过在培养后对平板上的回复突变菌落数计数来进行判断，当回复突变的菌落数 是阴性对照的2倍以上、且表现出浓度依赖性增加时，判定诱变性为阳性。结果如表6所示。在用化合物1、2和4处理的组中的各试验菌株回复突变菌落 数均小于用阴性对照物处理的组中回复突变菌落数的2倍，而不论各菌株中是否加入了 S9mix以及受试样品的添加量是多少。从上述结果可以判定，化合物1，2和4在Ames试验 中呈阴性，没有基因诱变性。表6 =Ames试验的结果 (实施例11-11，11-12，比较例11_1)脑中转移性和清除性的测定使用化合物10和11，测定在雄性Wistar大鼠(7周龄)的脑中放射性蓄积的经时变化。在硫喷妥钠麻醉下，将化合物10 (实施例11-11)，化合物11 (实施例II-12)和上 述参考例2制备的[123I]-IMPY分别溶解于包含lOmg/mL抗坏血酸的生理盐水溶液中而得 到的各0. 05mL溶液(放射性浓度为20-31MBq/mL)注射到各Wistar大鼠的尾静脉中。注 射2，5，30和60分钟后，通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠，移取脑，测定脑质量，再用 单通道分析仪(检测器型号SP-20，应用光研株式会社制)测定脑的放射性(以下，在本实 施例中，称作A)。此外，按照与上述相同的方式测定全身其余部分的放射性(以下，在本实 施例中，称作B)。使用这些测定结果，根据下式(4)计算在各解剖时间点的每单位脑重量的 放射性蓄积(% ID/g)。在各个时间点使用3只动物进行实验。 结果如表7所示。如表7所示，在注射后2分钟的时间点，化合物10和11与 [123I]-IMPY同样，显示出显著的放射性蓄积，随后在60分钟内显示出迅速消除的趋势。这 些结果启示，化合物10和11与[123I]-impy同样，具有优良的脑内转移性以及从脑中的迅 速清除性。表7 本发明化合物在静脉注射后在脑中的放射性蓄积(大鼠) (实施例11-13)使用注射淀粉样蛋白的大鼠模型进行的化合物10的离体放射自 显影图(1)将A β H2 (株式会社肽研究所制)溶解于磷酸盐缓冲液(ρΗ7. 4)，在37°C下振 荡72小时，以获得lmg/mL的凝集Αβ混悬液(以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白混悬 液)。(2)将2.5yL(相当于25yg)的淀粉样蛋白混悬液注射到雄性Wistar大鼠(7周 龄)一侧的杏仁核中。作为对照，将2. 5μ L的磷酸盐缓冲生理盐水溶液(ρΗ 7. 4)注射到该 大鼠另一侧的杏仁核中。在注射淀粉样蛋白混悬液和磷酸盐缓冲生理盐水溶液(PH 7.4)1 天后检查该大鼠。(3)将化合物10溶解于包含lOmg/mL的抗坏血酸的生理盐水溶液中，得到样品溶 液(在该样品溶液中，放射性浓度为31MBq/mL)。在硫喷妥钠麻醉下，将该溶液通过尾静脉 注射到大鼠中(剂量0. 5mL，给予的放射性活度相当于15MBq)。(4)在注射60分钟后移取脑，用切片机(型号CM3050S，由LEICA制造)制成厚度 IOym的脑切片。将该脑切片在成像板上曝光20小时，然后通过使用生物图像分析仪(型 号BAS-2500 ；由富士胶片株式会社制)进行图像分析。(5)在用生物图像分析仪进行图像分析后，用硫磺素T进行病理学染色，通过使用 荧光显微镜(由尼康公司制；型号TE2000-U型；激发波长400-440nm ；检测波长470nm) 进行显像。从而证明了淀粉样蛋白沉积在该切片上(图14b)。图14显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠脑切片的放射自显影图和硫磺素T染色 的图像。如图14所示，在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄 积。另一方面，与其他位点相比，在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到显著的放 射性蓄积。在放射自显影图上，在注射淀粉样蛋白的位点以外的位置几乎观察不到放射性 蓄积。由硫磺素T染色的结果，确认了在该蓄积位点存在着淀粉样蛋白(图14b)。这些结 果启示，化合物10具有在脑内淀粉样蛋白上蓄积的性质，并具有使脑内淀粉样蛋白显像的 能力。(实施例11-14)使用注射淀粉样蛋白的大鼠模型进行的化合物11的离体放射自 显影图进行与实施例11-13同样的操作，除了使用将化合物11溶解在lOmg/mL抗坏血酸 溶液中而成的溶液(在样品溶液中的放射性浓度为30MBq/mL)作为样品溶液。 图15显示了脑内注射淀粉样蛋白的大鼠脑切片的放射自显影图和硫磺素T染色 的图像。如图15所示，在注射了淀粉样蛋白混悬液一侧的杏仁核中观测到明显的放射性蓄 积。由硫磺素T染色的结果，确认了在该蓄积位点存在着淀粉样蛋白(图15b)。另一方面，与其他位点相比，在注射生理盐水溶液一侧的杏仁核中没有观察到显著的放射性蓄积。这 些结果启示，化合物11具有在脑内淀粉样蛋白上蓄积的性质，并具有使脑内淀粉样蛋白显 像的能力。(实施例11-15)回复突变试验为了检验化合物8的基因诱变性，使用鼠伤寒沙门氏菌TA98和TA100进行回复突 变试验(以下称作Ames试验)。本试验在没有添加S9mix和添加S9mix的情况下进行。将二甲亚砜用作阴性对 照。阳性对照在不添加S9mix的情况下使用2- (2-呋喃基)-3- (5-硝基-2-呋喃基)丙烯 酰胺，在添加S9mix的情况下使用2-氨基蒽。加入到试验平板上的化合物8的量是7个剂量(几何比3)，最大剂量是5000 μ g/ 板。在将化合物8和试验菌株(TA98或TA100)、或者将化合物8、S9mix和试验菌株混合 在一起后，用软琼脂在试验平板的培养基上将混合物重叠成多层，然后在37°C下培养48小 时。通过在培养后将板上的回复突变的菌落数计数来进行判断，当回复突变的菌落数不小 于阴性对照的2倍以上、且显示浓度依赖性增加时，判定诱变性呈阳性。结果如表8所示。在用化合物8处理的组中各试验菌株的回复突变菌落数均小于 用阴性对照物处理的组中回复突变菌落数的2倍，而不论各菌株中是否加入了 S9mix以及 受试样品的添加量是多少。另一方面，在用阳性对照物处理的组中观察到了突变回复菌落 数显著增加。从上述结果可以判定，化合物8在Ames试验中呈阴性，没有基因诱变性。表8 =Ames试验的结果
化合物诱变性不添加S9mix添加S9mixTA98TAlOOTA98TAlOO实施例11-15化合物8阴性阴性阴性阴性(实施例III-I至实施例III-2)与淀粉样蛋白结合性的确认为了研究本发明化合物的结合机制，使用以糊精作为前体化合物产生的淀粉样蛋 白进行抑制与硫磺素T结合的实验。糊精是在I I型糖尿病中蓄积在胰脏中的淀粉样蛋白。(1)将糊精(人)(由Wako公司制)溶解于磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)中，在37°C振 荡72小时，以获得lmg/mL的凝集糊精混悬液(以下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白混悬 液)。(2)根据文献(Naiki, H.等人，Labeled Investigation, 74, ρ· 374-383 (1996)) 所述的方法，基于使用硫磺素T(由Fluka公司制)的荧光分光光度法，进行该淀粉样蛋白 混悬液的定性实验，以证实在(1)中获得的凝集糊精是淀粉样蛋白(测定条件激发波长 446nm,荧光波长 490nm)。(3)将该淀粉样蛋白混悬液以糊精浓度为15 μ M溶解于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)中。同时，将硫磺素T以15 μ M的浓度溶解于50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8. 5)中。
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(4)配制将各评价化合物和淀粉样蛋白溶解于50mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)中、且 最终浓度分别如表9所示的样品。将(3)中制备的各50 μ L的淀粉样蛋白溶液和硫磺素T 溶液、以及50 μ L的样品溶液填充在96孔微量培养板的各孔中(体积约0. 3mL)。表9 样品溶液中各化合物的最终浓度 (5)制备混合了 100 μ L的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)和50 μ L的50mM甘氨 酸-NaOH缓冲液(pH 8.5)的样品作为空白，进行与⑷同样的操作，用于计算抑制率(以 下称作BG)。(6)将填充有样品溶液的微量培养板在室温下静置30小时。然后，用微量培养板 读板器(型号SPECTRA MAX GEMINI XS,由Molecular Devices公司制)测定各样品溶液 的荧光强度(测定条件激发波长446nm，荧光波长490nm)(以下，A表示各评价化合物的浓 度为零(0)的样品中的荧光强度，B表示各评价化合物的浓度为1.5ymol/L以上的样品中 的荧光强度)。(7)使用在上述(6)中测定的荧光强度，通过下式(5)求出抑制率
抑制率=Hxloo (%) · · · (5)
A-BG各评价化合物的抑制率如表10所示。任意浓度的化合物1和2都抑制了硫磺素 T的结合。该结果表明，化合物1和2竞争性地抑制硫磺素T的结合。一般已知，硫磺素T 通过识别淀粉样蛋白的折叠结构而与之结合。因此，这启示，化合物1和2具有与硫磺 素T相同的与淀粉样蛋白结合的机制，即，识别β -折叠结构而与之结合。表10 本发明化合物对硫磺素T与淀粉样蛋白(糊精)结合的抑制率(％ )
实验评价化合 物抑制率(%)评价化合物浓度 1. 5 μmol/L评价化合物浓度 15 μ mol/L评价化合物浓度 30 μ mol/L实施例ΙΙΙ 化合物18. 741. 327. 0实施例ΙΙΓ-2化合物211. 216. 332. 0(实施例II1-3)与淀粉样蛋白亲和性的测定通过以下体外结合试验评价本发明化合物的淀粉样蛋白亲和性。^^(1)使用实施例III-I和ΙΙΙ-2所述的方法，制备lmg/mL的凝集糊精的混悬液(以 下，在本实施例中，称作淀粉样蛋白混悬液)。通过以下操作⑵和(3)制备具有交联β-折叠结构的胰岛素，操作(2)和(3)是对已知的文献(Burke,M. J.等人，Biochemistry. U，p. 2435-2439 (1972))中所述的方法 进行了少许变更的方法。(2)将5mg胰岛素(由Sigma Aldrich Japan制)溶解于用盐酸调节至pH 2的 ImL去离子水中，将该反应混合物在90°C下加热10分钟，然后在干冰/乙醇中急速冷却。(3)将(2)的样品溶液在90°C下加热5分钟，然后在干冰/乙醇中急速冷却。在 重复同样的操作10次后，目测确认样品溶液变成凝胶形式。(4)将(3)的样品离心分离(16000gX 15分钟)，然后除去上清液，用ImL的去离 子水溶解沉淀，得到凝集胰岛素的混悬液(以下，在本实施例中，称作胰岛素淀粉样蛋白混 悬液)。通过以下操作(5)和(6)制备具有交联β -折叠结构的β 2-微球蛋白，操作(5) 和(6)是在已知文献(Ohhashi, Y.等人，Biochemistry.等人，Journal of Biological Chemistry. 280, p. 32843-32848(2005))中所述的方法，但对其进行了少许变更。(5)向 β 2-微球蛋白(由 Oriental Yeast Co. ,ltd.制)的 lmg/mL 溶液添加包 含IOOmM NaCl的50mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2. 5)，然后在超声热水槽中、在37°C下超声 处理1分钟，然后在没有超声波处理的情况下在37°C加热9分钟(6)在重复(5)的操作17次后，对该样品溶液进行与上述(2)同样的处理。将样 品溶液离心分离(16000gX 15分钟)，然后除去上清液，将沉淀物溶解于0. 5mL的包含IOOmM NaCl的50mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2. 5)中，得到凝集β 2-微球蛋白的混悬液(以下，在 本实施例中，称作β 2-m-淀粉样蛋白混悬液)。(7)根据实施例III-I和实施例III-2所述的基于使用硫磺素T(由Fluka公司 制)的荧光分光光度法进行的定性实验，确认了在(4)和(6)中得到的凝集胰岛素和凝集 β 2微球蛋白是淀粉样蛋白。(7)制备通过上述实施例1-3的方法合成的化合物6的溶液(放射性浓度为 500MBq/mL)，用包含0. 1 %牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)稀释，制备2_(4'-羟 基苯基)-6-碘咪唑并[l，2-a]嘧啶的总量为1.0-101. OpM溶液。(8)向96孔微量培养板的各孔中添加50 μ L上述(7)制备的溶液(最终浓度为 0. 2-20. 2ρΜ)和将糊精淀粉样蛋白混悬液、胰岛素淀粉样蛋白混悬液或β 2-m-淀粉样蛋白 混悬液用含有0. 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(pH7. 4)稀释而成的50yL溶液(最终 浓度为0. 8 μ g/mL)，然后加入150 μ L相同的缓冲液。(9)将该微量培养板在22°C以指定速率(400rpm)振荡3小时。然后让各孔的混 合液通过玻璃纤维过滤器(商品名MulutiScreenTM-FC，由Millipore公司制)过滤，以从 游离的化合物6中分离出与淀粉样蛋白结合的化合物6。(10)将过滤混合液后的玻璃纤维过滤器用含有0. 牛血清白蛋白的磷酸盐缓 冲液洗涤(0. 2mLX5次)，然后用Autowell Gamma系统(Aloka公司制，型号:ARC_7001)测 定该玻璃纤维过滤器的放射性。(11)由(10)的测定结果评价化合物6与淀粉样蛋白的结合量与淀粉样蛋白的添 加量之间的关系。由在上述(8)中没有添加淀粉样蛋白混悬液的样品，确定非特异性结合 (实施例1-3)。样品溶液中的化合物6的浓度与上述(11)测定的玻璃纤维过滤器的放射性计数(CPM)之间的关系如图16所示。在添加淀粉样蛋白混悬液的组(图16，添加糊精淀粉样 蛋白的组、添加胰岛素淀粉样蛋白的组和添加β 2-m-淀粉样蛋白的组)中，放射性活度全 部高于不添加淀粉样蛋白混悬液的组(图16，没有添加淀粉样蛋白的组)，且玻璃纤维过滤 器上的放射性活度随化合物6的添加浓度呈比例地增加。在本实验的条件中，所有的淀粉 样蛋白(以及与化合物6结合的淀粉样蛋白)都大于玻璃纤维的孔径。因此，淀粉样蛋白 被保持在玻璃纤维上，玻璃纤维的放射性计数是反映与淀粉样蛋白结合的化合物6的量的 值。因为玻璃纤维的放射性计数的数值随化合物6的浓度的增加而增加、并且其放射性活 度比没有添加淀粉样蛋白的组高，因此表明化合物6是具有与淀粉样蛋白特异性结合的性 质的化合物。(实施例IV)各器官中放射性分布率的测定为了证明本发明化合物能分布于靶器官中并具有良好的清除到体外的性质，使用 化合物6在SD大鼠(8周龄)中测定向各器官的放射性蓄积的经时变化。向400yL的6-三丁基甲锡烷基-2-(4'-羟基苯基)咪唑并[1，2_a]吡啶的乙 腈溶液(浓度:lmg/mL)中，加入400 μ L的lmol/L硫酸、10 μ L的lmmol/L碘化钠、270 μ L 的1074MBq的[123I]碘化钠和10 μ L的30% (W/V)过氧化氢。将该混合液在40°C下静置10 分钟后，在下述条件下进行HPLC，以获得[1231]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a] 吡啶级分。HPLC 条件色谱柱YMC_PackPro C8 (商品名；YMC 公司制；规格4· 6x150mm)流动相IOmM甲酸(pH 3. 0) / 乙腈=80/20 — 80/20 — 10/90 (0 分钟-20 分钟-30 分钟)流速LOmL/分钟检测器紫外可见吸光光度计(检测波长254nm)和放射性计数器(Raytest公司 制；型号=STEFFI)向该级分中加入IOmL水。让所得溶液通过S印-Pak C18柱(商品名；Sep-Pak (注 册商标)Light C8 Cartridges,Waters公司制；填充剂的填充量130mg)，以使得该柱吸附 收集[123I]-2-(4‘-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2-a]吡啶。用ImL水冲洗该柱，然后让 ImL乙醚通过，以洗脱[1231]-2-(4'-羟基苯基)-6_碘咪唑并[l，2_a]吡啶(化合物6)。 在合成刚结束时，所得化合物的放射性活度是470MBq。此外，在下述条件下进行TLC分析， 结果，该化合物的放射化学纯度是98%。TLC分析条件TLC板硅胶60F254 (商品名；由默克公司制)流动相乙酸乙酯/甲醇/ 二乙胺=100/4/1检测器=Rita Star (商品名；raytest公司制)用包含lOmg/mL抗坏血酸的生理盐水溶液稀释化合物6的乙醚溶液，并调节放射 性浓度至8-12MBq/mL。在无麻醉下将0. 2mL所制备的样品溶液给药于上述大鼠的尾静脉。 通过从腹部大动脉放血来处死这些大鼠，在给药后5，30，60和180分钟移取表11所示的各 器官。采用与实施例II-Il同样的方法，测定各移取器官的质量和放射性。同时，测定移取 器官后大鼠全身(以下称作全身其余部分)的放射性。使用这些测定结果，根据下式(6)计算各时间点的各器官每单位重量的放射性分布(％ ID/g)在各个时间点，使用3只动物进行实验。
6)Rt 靶器官的放射性(cpm)Rs 所有器官的放射性总和(cpm)Rk 全身其余部分的放射性(cpm)Mt:靶器官的质量(g)结果如表11所示。如表11所示，在给药后5分钟的时间点，化合物6分布于各器 官，随后大部分放射性分布于小肠和大肠。此外，其放射性分布从小肠向大肠转移。因此我 们发现，化合物6在给药后迅速经胆汁排泄，并良好地清除到体外。同时，观察认为淀粉样蛋白蓄积于其中的脑、心脏、肺、胰脏和骨，在给药后5分钟 的时间点在所有这些器官中都发现了明显的放射性蓄积，因此证实了化合物6的分布。此 外，给药后5分钟的时间点与给药后180分钟的时间点之比((给药后5分钟的时间点的％ ID/g)/(给药后180分钟的时间点的％ ID/g))显示出了高值，例如，脑为122，心脏为13，肺 为7，胰脏为14，骨为4。因此表明，在认为淀粉样蛋白会蓄积的器官中显示了迅速的放射性 分布和迅速的清除性。由上述可见，实现了对生物组织中的淀粉样蛋白检测试剂来说所需要的给药后早 期的放射性分布以及迅速的体外清除性。表 11
组织/器 官给药后5分钟给药后30分钟给药后60分钟给药后180分钟平均 值标准 偏差平均 值标准偏 差平均 值标准 偏差平均 值标准 偏差血液0. 2850. 0210. 1740. 0260. 1220. 0120. 1090. 013脑0. 7210. 0720. 1240. 0100. 0300. 0020. 0060. 001心脏0. 6190. 0540. 1470.0210. 0630. 0040. 0470. 004肺0. 6570. 0370. 2090, 0250. 1200. 0090. 0890. 007肝2. 0080. 2350. 5090. 0960. 1810, 0100. 0830. 008脾0,4620. 0240. 1400. 0280. 0750. 0030. 0720. 016胰脏0. 8460. 1190. 2070. 0280. 0840. 0040. 0600. 002胃0. 3600. 0791. 0250. 1641. 0430. 2271, 0810. 373小肠1. 0780. 3376. 3350. 3498. 2070. 4551. 4080.107大肠0.1160. 0140. 0700. 0100. 0660. 0057. 2960. 454肾0, 9990. 1330. 5400. 1030. 2440. 0100. 1080. 011肾上腺4. 6481. 3540. 6420. 2260. 2600. 0640. 0200. 035骨0. 2220. 0170. 0880. 0150. 0580. 0020. 0530. 010骨髄0. 7130. 1780. 1940. 0430. 0000. 0000. 0300. 053肌肉0. 3810. 0500. 0780. 0160. 0340. 0020. 0220. 001产业实用性本发明的用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂可用作淀粉样变性病例如全 身性淀粉样变性病中的淀粉样蛋白的体外和体内诊断剂。
权利要求
用于检测沉积在生物组织上的淀粉样蛋白的试剂，包含下式(1)所示的化合物或其盐其中A1，A2，A3和A4独立地表示碳或氮，且R3是下式所表示的基团其中R1是放射性卤素取代基；m是0 4的整数；且n是0或1的整数，条件是，A1，A2，A3和A4中的至少1个表示碳，且R3与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合。FPA00001172197200011.tif,FPA00001172197200012.tif
2.权利要求1的试剂，其中A1，A2，A3和A4中的至少3个表示碳。
3.权利要求2的试剂，其中A1，A2，A3和A4全部表示碳。
4.权利要求1-3任一项的试剂，其中R1选自18F、75Br、76Br、123I、124I、125I和1311。
5.权利要求1-4任一项的试剂，其中生物组织是脑、心脏、肺、胰脏、骨或关节。
6.放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，包括制备反应溶液的步骤，所述反应溶液包含下式(2)所示的化合物或其盐与放射性卤离子 其中A1，A2, A3和A4独立地表示碳或氮，且 R4是下式所表示的基团 其中m是0-4的整数； η是0或1的整数；且当m = η = O时，R2是非放射性卤素取代基、硝基取代基、具有3-12个碳原子的三烷 基铵取代基、具有3-12个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基；当 m兴0和/或η兴0时，R2是非放射性卤素取代基、甲磺酰氧基取代基、三氟甲磺酰氧基取 代基或芳香族磺酰氧基取代基，条件是，A1, A2, A3和A4中的至少1个表示碳，且R4与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合；禾口向上述反应溶液赋予反应条件，以合成下式(1)所示的化合物的步骤 其中ASA2，A3和A4与式(2)中相同，且 R3是下式所表示的基团 其中R1是放射性卤素取代基；且m和η与式⑵中相同，条件是，A1，A2，A3和A4中的至少1个表示碳，R3与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合。
7.权利要求6的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中和A4中的至 少3个表示碳。
8.权利要求7的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中ASAW和A4全部表 不碳。
9.权利要求6-8任一项的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R2选自碘、 溴、具有3-12个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基取代基，放射性卤离子 选自123I离子、124I离子、125I离子和131I离子，且R1选自123I、124I、125I和1311。
10.权利要求9的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R2选自碘、三甲基甲 锡烷基取代基、三丁基甲锡烷基取代基和三苯基甲锡烷基取代基。
11.权利要求6-8任一项的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R2选自硝 基取代基、具有3-12个碳原子的三烷基铵取代基、甲磺酰氧基取代基、三氟甲磺酰氧基取 代基和芳香族磺酰氧基取代基，放射性卤离子是18F离子，R1是18F。
12.权利要求11的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R2是三氟甲磺酰氧 基取代基或甲苯磺酰氧基取代基。
13.权利要求6-8任一项的放射性卤素标记的有机化合物的制备方法，其中R2是溴，放 射性卤离子是75Br离子或76Br离子，R1是75Br或76Br。
14.用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或其盐，该前体化合物如下 式(2)表示 其中A1，A2，A3和A4独立地表示碳或氮，且 R4是下式所表示的基团 其中m是0-4的整数；η是0或1的整数；且当m = η = 0时，R2是非放射性卤素取代基、硝基取代基、具有3-12个碳原子的三烷基 铵取代基、具有3-12个碳原子的三烷基甲锡烷基取代基或三苯基甲锡烷基取代基，当m兴0 和/或η兴0时，R2是非放射性卤素取代基、甲磺酰氧基取代基、三氟甲磺酰氧基取代基或 芳香族磺酰氧基取代基，条件是，A1，A2，A3和A4中的至少1个表示碳，R4与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合。
15.权利要求14的用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或其盐，其中 A1，A2，A3和A4中的至少3个表示碳。
16.权利要求15的用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或其盐，其中 A1jA2jA3和A4全部表示碳。
17.权利要求14-16任一项的用于制备放射性卤素标记的有机化合物的前体化合物或 其盐，其中R2选自碘、溴、三甲基甲锡烷基取代基、三丁基甲锡烷基取代基、三氟甲磺酰氧基 取代基和三苯基甲锡烷基取代基。
全文摘要
本发明提供用于检测生物组织中的淀粉样蛋白的试剂，该试剂使用一种化合物，可以以高灵敏度体外和体内检测淀粉样蛋白，所述化合物对淀粉样蛋白具有亲和性，并抑制毒性例如诱变性。该用于检测沉积在生物组织中的淀粉样蛋白的试剂包含下式(1)所示的化合物或其盐其中A1，A2，A3和A4独立地表示碳或氮，且R3是下式所表示的基团其中R1是放射性卤素取代基；m是0-4的整数；且n是0或1的整数，条件是，A1，A2，A3和A4中的至少1个表示碳，且R3与A1，A2，A3或A4所表示的碳键合。
文档编号A61K51/00GK101918039SQ20088012348
公开日2010年12月15日 申请日期2008年10月28日 优先权日2007年10月30日
发明者中村大作, 奥村侑纪, 谷藤树之, 高崎新也 申请人:日本医事物理股份有限公司