涉及呼吸障碍的方法

专利名称：涉及呼吸障碍的方法
涉及呼吸障碍的方法发明领域
本发明涉及治疗呼吸障碍如呼吸暂停的方法，及用于该方法中的诊断和筛选的方 法和组合物。
发明背景
呼吸暂停和婴儿猝死综合症(SIDQ是新生儿面临的主要健康问题，且感染在其 发病机制中可能起着决定性的作用。呼吸暂停是新生儿感染的常见症状，多数SIDS的患者 死亡前有轻度病毒或细菌感染(1，2，111)。
患有非-最佳或者迟发性脑干呼吸控制的儿童如早产儿(在他们生命的整个第一 年，且一些也超过儿童期早期)，患有先天性中枢肺换气不足综合征(Congenital Central Hypoventilation Syndrome) (CCHS) (79)、雷特氏综合征(Rett' s Syndrome)和帕-魏二 氏综合征(Prader Willi Syndrome) (PffS) (80)的儿童，具有伴有呼吸暂停的周期性不规则 呼吸，在睡眠时增加，以及在感染发作时可导致呼吸暂停，若没有发生外部或自动复苏，有 时是致命的。
死于SIDS的儿童在死亡之前经常出现轻度感染，并出现迹象显示，脑干功能障碍 和缺氧事件后自动复苏失败与大多数这些无法解释的死亡相关(81，82)。
在年龄较大的儿童和成年人中，潜在的致命的呼吸功能障碍的风险在患有后天性 或先天性受损的呼吸控制，例如雷特氏综合征和PWS的儿童和成人中增加了，而且，患有睡 眠呼吸暂停综合征的儿童与成人及患有帕金森氏病的成人具有受损的呼吸控制且死亡经 常与感染相关(83)。呼吸障碍(呼吸功能不全或感染)已被确定为PWS儿童中最常见的死 亡原因(107)。此外，儿童的打鼾和阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)可能会导致睡眠不 安和损害神经认知发展，结果造成长期功能障碍。呼吸道感染和附加危险因素如吸烟环境 和哮喘的流行导致病情恶化(108-111)。
潜在的有害的和危及生命的呼吸障碍也常见于成人。因此，在成年人的帕金森氏 病，睡眠相关呼吸障碍例如睡眠呼吸暂停综合征和OSAS中，换气不足导致的缺氧可能起着 关键作用。
前炎症细胞因子(pro-inflammatorycytokines)例如白介素_1 β (IL-1 β )可作 为这些事件间的关键介体(3)。IL-I β产生于感染和炎症的急性免疫应答时期，并引起一 系列疾病症状(综述参见G))。此前的研究表明这种免疫调节剂也改变了呼吸和自动复苏 (5-10)。在脑干呼吸相关区域，如核孤束(NTS)及延髓腹头端腹外侧(RVLM)，IL-I β诱导 即刻早期基因c-fos表达(11)。然而，IL-Ιβ是一个大的疏脂蛋白质，不容易穿过血脑障 壁。此外，NTS和RVLM似乎不表达IL-I受体mRNA(U)，且体外研究表明IL-I β不会改变 脑干呼吸相关的神经元活性(5)。
申请人先前阐述的吲哚美辛，一种非特异性COX抑制剂，能够减弱由IL-I β诱导 的呼吸抑制(5)。体内试验显示PG&本身抑制绵羊胎儿和新生儿的呼吸(17-19)且抑制呼 吸相关神经元。早产儿和足月儿中的新生儿尿类前列腺素排泄物质已经被研究(11 且鉴 定了 PGE-M与早产儿呼吸暂停的关系(113)。
吲哚美辛以前一直被用于治疗早产儿呼吸暂停05)。然而，吲哚美辛对新生儿产 生多种副作用(46)。新生儿使用吲哚美辛引起的副作用包括药物引起的肾、肠、脑血流减少 06)。咖啡因被用于呼吸功能障碍的治疗，作为持续气道正压(CPAP)和补充氧气。此外， 纳洛酮(一种阿片受体拮抗剂)亦被用于急性治疗。但是，仍然明确需要治疗呼吸障碍，尤 其是治疗呼吸暂停的方法。发明内容
发明人现在发现诱导PGE2通路是对感染和缺氧引起的呼吸道反应的关键调节物 (参见114)。诱导？6&通路描述在本申请的图6。
IL-I β与血脑屏障中的血管内皮细胞上的IL-I受体结合，并诱导环氧合 酶-2(C0XD和微粒体前列腺素E合成酶-l(mPGES-l)活化(综述参见(1 )。C0X-2催 化花生四烯酸生成前列腺素压(PGH2)，mPGES-1继而催化PGH2合成PGE2。PGE2然后被释放 到最近已被证明介导IL-I β的一些中枢效应如发热感应(14)，行为反应(15)，和神经内分 泌变化(16)的脑实质中。作为进一步的说明，前列腺素还介导IL-Ιβ的换气反应64)。 此外，PGE2的受体E-前列腺素类受体亚型3 (EP3R)都位于脑干呼吸相关区域NTS和RVLM 区域 00，21)。
如本申请所述，IL-Ιβ通过mPGES-1的活化和PG&与脑干EP3R结合，导致呼吸暂 停频率增加和缺氧事件后自动复苏失败，从而对中枢呼吸产生不利影响。诱导PG&通路与 呼吸障碍相关，因此，可通过在一个或多个位点靶向作用该通路，例如通过抑制C0X-2，抑制 mPGES-1和/或抑制EP3R来改善呼吸障碍。
因此，一方面本发明提供了治疗哺乳动物受试者的呼吸障碍的方法，包括 给有治疗需要的受试者施用治疗有效量的组合物，组合物包括E-前列腺素类受体 亚型3 (Ε-prostanoid receptor subtype 3，EP3R)抑制剂；微粒体前列腺素E合成 酶-1 (mPGES-1)抑制剂；和/或选择性环氧合酶-2 (C0X-2)抑制剂。
使用本文所述的组合物靶向作用于诱导PGE2通路中的一个或多个阶段，对准确 阻断涉及诱导呼吸障碍如呼吸暂停的通路的能力，被期望最大限度地减少与较小选择性治 疗相关的有害作用。例如，通过选择性靶向作用C0X-2，mPGES-1和/或EP3R，本文进一步 描述的呼吸障碍可以被改善，并同时最大限度地减少副作用，例如与非选择性COX抑制剂 吲哚美辛使用相关的副作用。
在进一步的方面中，本发明提供了用于治疗哺乳动物受试者呼吸障碍的方法中的 组合物，其中组合物包含EP3R抑制剂；mPGES-1抑制剂；和/或C0X-2选择性抑制剂。
在进一步的方面中，本发明提供了组合物在制备治疗哺乳动物受试者呼吸障碍的 药物中的应用，其中组合物包括EP3R抑制剂，mPGES-1抑制剂；和/或C0X-2选择性抑制 剂。
在进一步的方面中，本发明提供了评估哺乳动物受试者易感，或存在呼吸障碍的 方法，包括
在哺乳动物的试样中检测前列腺素-E2(PGE2)或其代谢物的水平，和
比较试样和对照中的PGE2或其代谢物的水平，
其中与对照中PGE2或其代谢物的水平相比，试样中PGE2或其代谢物升高的水平表明受试者易感，或存在呼吸障碍。
本发明人在此提供了证据，以证明PGE2在呼吸障碍如呼吸暂停和缺氧后引起的自 动复苏减少中起着重要的作用。特别地，在脑脊髓液(CSF)和/或尿液中或其代谢 产物水平升高，与呼吸暂停频率增加和缺氧后自动复苏能力减弱相关。C-反应蛋白(CRP) 水平，PGE2的水平和呼吸暂停间的相互关系，表明所检测的PGE2和/或其代谢物水平单独 或与感染标志物如CRP联合，对于呼吸疾病和对其易感性的诊断可提供帮助。响应细胞因 子和缺氧刺激的PGE2快速合成使它在诊断和监视哺乳动物中呼吸障碍，例如由于疑似感染 或窒息导致的婴儿呼吸暂停的增加，有着突出的效用。
本发明人已令人惊奇地发现，在持续感染并伴有呼吸暂停的婴儿，患有PWS的儿 童和患有睡眠呼吸暂停的成人亚群(包括那些呼吸暂停指数高的人)中，尿液中前列腺素 代谢物(u-PGEM)的水平会提高。使用对尿液特异性且敏感性检验来获得测量PG&水平的 能力，提供了一种非侵袭性方法来预测和评估呼吸障碍(尤其是呼吸暂停)，其可以用于年 龄范围十分宽的患者。其中患有感染并伴有呼吸暂停的婴儿，u-PGEM水平的升高出现似乎 要早于CRP水平的升高。因此，对生物试样(如尿液，血液或脑脊液)中PGE2和/或其代 谢物水平的评估，与对CRP水平的评估相比而言，对于诊断，治疗和管理患有感染并伴随炎 症和呼吸功能障碍的患者是有益的。
相应地，本发明提供了评估人类受试者呼吸暂停的存在和/或严重程度的方法， 包括
在获自受试者尿液试样中检测一种或多种PGE2代谢产物的水平，和
对比试样中和对照品中所述一种或多种PGE2代谢产物的水平，
其中试样中所述的一种或多种PGE2代谢产物的水平，与对照品中所述的一种或多 种PG&代谢产物的水平相比，超出至少为20%、至少为50%、至少为100%或至少为200% 以上，表明受试者呼吸暂停存在和/或更严重。在某些情况下，受试的人患有阻塞性睡眠呼 吸暂停综合征(0SAS)，帕-魏二氏综合征，先天性低通气综合征和/或雷特氏综合征。在某 些情况下，受试的人是大于16岁；介于1至16岁之间，或介于0至1岁之间。
本发明人在此描述了受试者在出生窒息后的PGE2提高及PGE2与缺氧缺血性脑病 (HIE)的相互关系。这些结果表明，对于由于围产期大脑氧输送不足引起的神经学上的损 伤而言，PG&及其代谢物提供了有效的预示标志物。此外，结果表明，受试者遭受缺氧的程 度，可以通过测量试样中(例如CSF，尿液或血液试样)的？6氏水平反映出来。
相应地，本发明另一方面提供了评估哺乳动物受试者易感或存在缺氧缺血性脑病 (HIE)的方法，包括
检测在受试者试样中的前列腺素-E2 (PGE2)或其代谢产物的水平，和
对比试样中和对照品中所述PGE2或其代谢产物的水平，
其中试样中的PGE2或其代谢产物的水平，与对照中所述的PGE2的水平相比提高 了，则表明受试者易感或存在HIE。
本发明另一方面提供了评估哺乳类受试者已遭受的缺氧或严重缺氧窒息(如围 产期窒息)的方法，包括
检测在受试者试样中的前列腺素-E2 (PGE2)或其代谢产物的水平，和
对比试样中和对照品中所述PGE2或其代谢产物的水平，
其中试样中的PGE2或其代谢产物的水平，与对照中所述的PGE2的水平相比提高 了，则表明受试者已经遭受缺氧或缺氧窒息(如围产期窒息)。
本发明另一个方面提供了一种用于鉴定物质用于治疗哺乳动物呼吸障碍的方法， 包括分析测试物质抑制诱导PGE2通路的能力，例如分析测试物质抑制以下一种或多种的能 力
(a) C0X-2 介导的 PGH2 合成；
(b)mPGES-l介导的mPGES_l的环式内氧化物底物转化的产品，其为底物的9_酮 基，11 α羟基形式；和
(c) EP3R激动剂介导的EP3R活化，
其中抑制诱导？6氏通路，例如抑制(a)，(b)和(c)中的一种或多种，表明测试物 质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。
发现具有抑制诱导PGE2通路能力的测试物质，可以配制成组合物，其包含一种或 多种其他组分，例如药学上可接受的赋形剂。这样的组合物可用于治疗哺乳动物呼吸障碍 的方法中。
诱导PGE2通路的中枢重要性及其对呼吸障碍如呼吸暂停贡献的认识(见图6)，提 供了鉴别对于治疗呼吸障碍具有治疗效用的试剂的基础。特别是，一种筛选测试物质抑制 下列一种或多种能力的方法
(a) C0X-2 介导的 PGH2 合成；
(b)mPGES-l介导的mPGES_l的环式内氧化物底物转化的产品，其为底物的9_酮 基，11 α羟基形式；和
(c) EP3R激动剂介导的EP3R活化，
可以使用一种或多种体外实验检测来进行。测试物质的抑制活性的筛选可以比依 赖于呼吸障碍动物模型的测试物质测量效应的筛选方法更容易扩大。这对于在呼吸障碍动 物模型上筛选测试物质之前进行初始体外筛选是有利的。这样，具有适合的体外药理学活 性的有希望的物质可被选择用于进一步的体内研究。
本发明另一个方面提供了一种鉴定物质用于治疗哺乳动物呼吸障碍的方法，包 括
将测试物质给药到受试哺乳动物，其中测试物质是诱导PGE2通路的抑制剂，例如 EP3R抑制剂，mPGES-1抑制剂和/或C0X-2的选择性抑制剂；以及
与未给予测试物质的对照哺乳动物的指标或症状相比，确定受试哺乳动物呼吸障 碍的指标或症状的严重程度，
其中与对照哺乳动物相比，受试哺乳动物的指标或症状的严重程度更低，说明该 测试物质在治疗哺乳动物呼吸障碍中是有用的物质。
本发明该方面的方法可以进一步包括早期阶段，该阶段包括确定测试物质是否有 能力抑制诱导PGE2通路，例如充当EP3R抑制剂、mPGES-1抑制剂和/或C0X-2选择性抑制 剂的能力。
发现具有能够降低呼吸障碍的指标或症状的严重程度因而治疗呼吸障碍的试验 化合物，可以配制成组合物，其包含一种或多种其他组分、例如药学上可接受的赋形剂。该 组合物可以在治疗哺乳动物的呼吸障碍的方法中使用。
本发明另一个方面提供了一种在哺乳动物中诱导呼吸抑制的方法，包括给药哺乳 动物有效量的组合物，其含有与PGE2不同的E-类前列腺素受体亚型3 (EP3R)激动剂；微 粒体前列腺素E合成酶-1 (mPGES-1)活化剂和/或选择性环氧合酶_2 (C0X-2)活化剂。
诱导哺乳动物呼吸抑制可能对于呼吸障碍研究特别有用。例如，诱导哺乳动物的 呼吸抑制可能对于提供呼吸障碍如呼吸暂停、缺氧和/或减少自动复苏的动物模型有用。 这种模型可能在测试EP3R或m PGES-I的激活在呼吸暂停例如睡眠呼吸暂停，和帕金森氏 病例如伴随帕金森氏症的呼吸功能障碍的动物模型中是否出现是有用的。
PGE2,在缺氧时释放，可能具有急性神经保护作用，例如，通过刺激EPSR-Gi-活化 然后降低cAMP和减少神经元活性从而导致对于急性缺氧的脑抵抗性增强。
本发明包括这些方面的组合及所述的优选特征，除了该组合是明显不可能的或者 明确声明要避免的。本发明的这些以及其他方面和以及实施方案将在下文进一步详细描 述，并提供实施例和附图供参考。


图1显示了 IL-I β和缺氧快速诱导脑干mPGES-1。mPGES-1在皮质和脑干微粒体 部分的活性，包括血脑屏障(BBB)的内皮细胞，通过使用IL-I β或载体治疗，和受到常氧或 常氧加缺氧(100% N2, 5分钟)的9日龄小鼠(n = 33)进行分析。Α)在野生型小鼠，在受 到NaCl处理后(对照)90分钟或者IL-I β治疗后的90分钟和180分钟测定mPGES-1活 性。相比于对照mPGES-Ι"+小鼠的皮质，在脑干中观察到更高内源性mPGES-Ι活性。此外， IL-I β诱导mPGES-Ι活性具有时间依赖性。B)在90分钟，IL-I β处理过的小鼠表现在脑 干的活性比用生理盐水处理的老鼠大约高2倍。缺氧也显著的诱导mPGES-Ι活性。此外，附 加有IL-I β和短暂缺氧暴露的效果。当将IL-I β处理过的小鼠暴露在缺氧环境中，观察 到小鼠脑干中活性比对照组小鼠高4倍。然而，缺失mPGES-Ι基因的小鼠表现出对IL-I β 和缺氧的反应微小的活性。数据以均值士SEM表示。**Ρ < 0. 01 ；***Ρ < 0. 001。
图2显示IL-I β通过mPGES-Ι活化抑制呼吸作用。使用全身流体积描记法，检查 9日龄mPGES-Ι野生型小鼠(n = 66)和mPGES-1敲除小鼠(n = 34)(腹腔注射方法给药 IL-I β (n = 52)或NaCl (η = 48)后)对高氧症的基本的呼吸和通气反应。A)体积描计器 记录说明了给药NaCl或IL-I β的野生型小鼠在常氧和高氧时的呼吸(5秒周期，呼吸振幅 Ιμ /s)。B，C)所有小鼠对高氧的反应是呼吸频率(fK，呼吸/分)的减少。IL-I β比使用 NaCl处理的mPGES-Ι小鼠减弱的fK范围更大，而IL-I β并没有改变mPGES+小鼠在常 氧或高氧时的呼吸。mPGES-l+A小鼠比mPGES+小鼠在高氧时表现出更强的呼吸抑制。数 据以均值士 SEM表示。与使用NaCl处理的mPGES-l+/+小鼠相比，*p < 0. 05。
图3显示IL-I β通过mPGES-Ι减少缺氧存活率。9日龄的mPGES-lv+小鼠(n = 37)和mPGES-Ι^小鼠(n = 20)在外周给药IL-1 β (n = 29)或者载体(n = 28)后80分 钟，暴露在缺氧环境5分钟(100%的队)。Α)体积描计器记录给药NaCl的HiPGES-IvVjHll 表现出初始的呼吸过度接着对缺氧产生喘息反应。给予100% O2后小鼠自动复苏。B)体积 描计器记录给予IL-I β的mPGES-lv+小鼠显示短暂呼吸过度期接着对缺氧产生喘息反应。 给予100%02后小鼠没有自动复苏。该喘气次数(C)在不同组之间趋向不同(Wilcoxon X2， P = 0.06)。对比每个基因型的治疗效果，IL-I β降低了野生型小鼠喘气的次数，而这种影响在缺少mPGES-1的小鼠中没有观察到。D) IL-1 β与NaCl相比，减少了 mPGES-Γ"小鼠 的缺氧存活率，但在mPGES-l+小鼠没有该表现。数据以均值士SEM表示。Y < 0. 05，呷 < 0. 01。
图4显示了 PGE2降低了脑干呼吸活动并通过脑干EP3受体诱导呼吸暂停。在具 有EP3R+/+(n = 13)和EP3R+(n = 25)基因型的新生小鼠按下述方式给药PGE2 (η = 19)或 NaCl (n = 19)后检测呼吸作用。Α)在新生EP3Rv+( ■)和EP3R"_( □)小鼠0分钟时注射 (脑室内注射)PGE2后接着常氧和高氧1分钟。在EP3RV+小鼠表现出较低的呼吸频率(fK， 呼吸/分)和不规则的呼吸节律，以及在常氧和高氧造成的呼吸暂停期间升高的变异系数 (C. V.)。在EP3R+小鼠中，在麻醉时期之后基本的fK并没有减少，且呼吸模式的差异性较 小。icv给予PG&后的前20分钟没有观察到温差或依赖性。B)体积描计器记录(10秒内， 呼吸振幅1μ Ι/s)显示，EP3RV+小鼠在常氧环境时对PGE2的反应产生了呼吸暂停发作，但 EP3R+小鼠没有发生。C)在EP3RV+小鼠，与载体相比，在常氧环境和高氧环境中？6氏诱导 了更多的呼吸暂停。PG&的这种影响在EP3R+小鼠中没有观察到。D)在2-3天龄EP3RV+ 小狗(·，η = 5) “整块”脑干脊髓标本，PG^OO μ g/1)可逆的抑制呼吸节律至64 士 5%对 照频率(fE) (AN0VA重复测量设计，ρ < 0. 01)。PGE2并没影响EP3R+小鼠(□，η = 6)标 本中的呼吸活动。Ε)在延髓横断切面，头端腹外侧延髓内(RVLM)腹侧至疑核(NA)内的呼 吸相关神经元和包括预包钦合(preB6tzinger)复合体共同表达NKlR和EP3R。NKlR和EP3R 的表达皆有显示。箭头表示EP3R和NKlR共同定位在一些RVLM呼吸相关的神经元。F)鉴 定了在EP3R+小鼠中的NK1R，但不是EP3R的表达。刻度=100微米。数据以均值士SEM 表示。*p < 0. 05，与使用NaCl的EP3R+/+小鼠相比。
图5显示了新生儿脑脊液中PGE2与呼吸暂停指数的关联。脑脊液(CSF)从在新生 儿重症监护病房中具有可腰椎穿刺的临床适应症的婴儿(n = 12，平均产后年龄16士4天， 平均妊娠年龄为32士2周)中收集。然后进行婴儿心肺记录(持续时间9.2士2. 4h)。脑 脊液中PG&浓度采用标准化的酶免疫法(EIA)方案进行分析并与传染病标记C反应蛋白 (CRP)和呼吸暂停指数(#呼吸暂停/小时)相关。中枢PG&浓度与血液中C反应蛋白水平 呈正相关(P = 0. 01)。此外，发现中枢PG&浓度和呼吸暂停指数间显著的关联(P < 0. 05)。 在这里，我们区分了无法检测水平的PGE2 (0士0皮克/毫升)，与高水平的PGE2 (52士22皮 克/毫升)相比。数据以均值士标准差表示。
图6显示了通过前列腺素E2介导通路的IL-I β诱导的呼吸抑制和自我复苏失败 的模型。在系统性免疫应答中，促炎症细胞因子白介素-1 β (IL-Ιβ)被释放到外周血液 中。它结合到其位于血脑屏障(BBB)内皮细胞的受体(IL-IR)。IL-IR的激活诱导花生四 烯酸(AA)通过环氧合酶-2(C0X1)合成前列腺素H2 (PGH2)和PGH2通过限速酶微粒体前列 腺素E合成酶-1 (mPGES-1)合成前列腺素E2 (PGE2)。PGE2释放到脑实质并和其位于脑干如 孤束核(NTQ和延髓腹外侧头端区(RVLM)的呼吸控制区域的EP3受体(EP3R)结合。这造 成了中枢呼吸相关神经元和呼吸的抑制，可能致命地降低了在缺氧事件中喘气和自我复苏 的能力。
图7A)CSF中PGE2代谢物浓度与人类婴儿窒息程度和不良预后的相关关系。CSF 中PG&代谢物在出生后<对小时内的腰椎穿刺过程中取得，并与缺氧缺血性脑病(HIE)相 关。B)CSF中PGE2代谢物浓度与人类婴儿出生后5分钟Apgar评分的相关关系。11
图8显示了健康对照成人与患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的成人尿液中前列 腺素代谢物(u-PGEM)的水平。测量方法使用三重四极质谱-tetranor PGEM方法(PGE代 谢产物表示为pmol PGEM/yg肌酸酐)。与对照组相比，呼吸暂停组数值显示出更大的多样 性，包括一个PGEM水平高得多的亚群(椭圆虚线)。
图9显示了健康对照儿童与患有帕-魏二氏综合征(PWS) (3-16岁)的儿童尿液 中前列腺素代谢物(u-PGEM)浓度。测量方法使用三重四极质谱-tetranorPGEM方法(PGE 代谢产物表示为pmol PGEM/ μ g肌酸酐)。与对照组相比PWS组显示出显著升高的u-PGEM 水平。
图10显示了健康对照婴儿(年龄1个月-1年)与正患有炎症、病毒毛细支气管 炎和伴随呼吸暂停的婴儿尿液中前列腺素代谢物(u-PGEM)浓度。测量方法使用三重四极 质谱-tetranor PGEM方法(PGE代谢产物表示为pmol PGEM/ μ g肌酸酐)。与对照组相比 呼吸暂停和炎症组显示出显著升高的u-PGEM水平。
发明的详细描述
呼吸障碍
本发明包括涉及呼吸和/或换气的异常性中枢控制的呼吸障碍的范围。特别是， 呼吸障碍可能涉及异常一例如不规则或减少一呼吸频率，减少和/或较短的喘气，减少潮 气量和/或缺氧造成的呼吸损伤。呼吸障碍可以是周期性呼吸。
呼吸暂停
呼吸障碍可以是呼吸暂停。呼吸暂停是指呼吸停止，这可能是暂时或永久性的。呼 吸暂停可通过例如阻抗呼吸描记法确定并通过事件监测系统记录下来，如同本文的进一步 说明。呼吸暂停频率可被定义为超过预先设定的呼吸暂停阈值的事件数量。已知定义取决 于被考查的受试者的年龄。在一些实施方案中，比如当哺乳动物是不到5岁的人类婴儿，呼 吸暂停可被定义为在前0. 5秒时的平均阻抗信号的幅度> 10秒的减少至前25秒期间测量 的平均振幅小于16 %，在其它实施方案中，例如当哺乳动物是成年人类，呼吸暂停可被定义 为> 10秒的呼吸停顿。在某些实施方案中，呼吸暂停可被定义为超过两个呼吸周期的呼吸 暂停。
睡眠相关的呼吸障碍
呼吸障碍可能是在睡眠时发生的紊乱。婴儿睡眠呼吸暂停，在严重的情况下，可能 伴有婴儿猝死综合症(SIDS)风险的增加。本文也涉及成人睡眠呼吸暂停，其可包括打鼾。
周期性呼吸
睡眠呼吸障碍的特点是周期性呼吸，缺氧发作，反复从睡眠中觉醒；其症状包括白 天过度嗜睡，记忆、学习和注意力损害。间歇性缺氧和睡眠中断都可以独立导致海马和前额 叶皮层神经元的缺陷；与记忆和执行功能的神经突有密切相关的区域。
周期性呼吸，或呼吸过度和呼吸暂停的交互周期，是早产儿常见的呼吸模式。临 床上重要的早产儿呼吸暂停几乎始终与周期性呼吸相关。低通气周期可能会降低I^o2，这 在幼儿和先前脑干呼吸中枢受影响的患者，可能会减少呼吸。这种情况通过部分由腺苷和 PG&释放介导的缺氧引起的脑干呼吸中枢抑制而发生(54，85)。呼吸过度或过度换气周期 可能减少Pa(X)2并减少对呼吸的刺激，导致呼吸暂停。
晚期的早产儿仍然有对(X)2的轻微减弱通气反应，超过50%的睡眠时间是REM，并继续有呼吸暂停或周期性呼吸，患病率10%，出生时小于1500克的婴儿的患病率在60%。
真正的周期性呼吸或呼吸暂停在当具有最浅的呼吸深度的周期部分确实转变成 停顿一呼吸暂停时出现。
在新生儿，儿童和成年人中，睡眠障碍周期性呼吸和间歇性缺氧与神经缺陷有关， 而这种损害可能导致认知功能障碍(92，93)。
自动复苏失败
在缺氧事件下呼吸障碍可能会导致自动复苏失败。自动复苏是大脑从睡眠或严重 缺氧抑制呼吸运动时的自我唤醒能力，通过在长期缺氧时期有力的规则的吸气喘息。这使 身体和血液恢复氧饱和度。
哺乳动物通常对缺氧表现出二相反应，在通气的初始增加(即呼吸深快)后接着 缺氧通气抑制(即原发性呼吸暂停，喘息，继发性呼吸暂停)。缺氧后给予氧气接着会产生 自动复苏。缺氧后自动复苏失败若没有外界介入措施的话可能导致死亡。
SIDS
呼吸障碍，可能是导致婴儿猝死综合症(SIDS)的障碍。SIDS(也称为“婴儿猝死 症”)是一种婴儿突然意外死亡，一般在低于两岁年龄。呼吸停止且自动复苏失败，这可能 发生在睡眠期间，可能会导致如所述SIDS的死亡。因此，特别严重的呼吸障碍可能导致猝 死。在某些实施方案中，本发明具体考虑了严重程度足以导致猝死的呼吸障碍。
感染相关的呼吸障碍
呼吸障碍可能是与病毒和/或细菌感染相关。在感染过程中各种感染有关的标志 物可能会增加，如CRP，白细胞计数及促炎性细胞因子，包括IL-I β，这可能表明呼吸障碍 具有与感染相关的组成。
本发明的一些实施方案中呼吸障碍可能是IL-I β相关的呼吸障碍。IL-I β产生 于感染和炎症免疫应答的急性期。如本文披露，IL-I β作用于血脑屏障的血管内皮细胞 IL-I受体，并诱导C0X-2，导致诱导PGE2通路激活，并最终导致呼吸中枢抑制进而导致呼 吸暂停频率增加和缺氧事件后的自动复苏失败。与对照中的IL-Ιβ水平相比，血液中的 IL-I β水平升高，可能表明呼吸障碍是IL-I β相关的呼吸障碍。
在某些实施方案中哺乳动物或哺乳动物的受试者可以是先天或后天遭受呼吸调 节损坏的人，包括自主神经功能障碍，如帕-魏二氏综合征(PWS)，先天性换气不足综合症 (“CCHS”，也称为“翁丹呼吸困扰(Ondine' s curse)，，)和/或雷特氏综合征。患有PffS, CCHS或雷特氏综合征的婴儿，增加了由于感染事件期间的呼吸功能障碍致死的危险。
缺氧缺血性脑病
缺氧缺血性脑病(HIE)是用来指定足月婴儿经历过围产期大脑氧输送不足而导 致大脑能量代谢中断的情况(97)。这种情况可导致死亡或严重的神经后遗症。
使用磁共振波谱分析手段研究脑能量代谢产生了一种假说，即氧气输送至脑细胞 的初始中断后，大脑细胞中发生的二次神经元损失，可延迟数小时或数天(98，99)，这也被 动物实验所证明(100)。这种神经损伤的延迟被认为是部分由于炎症介质释放到损伤反应 的周围环境中。
神经系统和免疫系统之间的相互作用在许多种疾病中起着重要的作用。无论是关 于HIE的病理生理学还是病因学都没有完全了解。缺氧缺血之外的其他原因近来已被强调，例如宫内或新生儿炎症(101，102)且研究兴趣已转向作为损伤介质的细胞因子(103)。 也有证据支持炎症的级联反应与缺血性脑损伤的发病机制有关(104)。星形胶质细胞和小 神经胶质细胞分泌的细胞因子，作为这种炎性应答的介质起到了特殊的作用，和它们被认 为是在众多不同的信号之中，在围产期窒息之后可以引起大脑中的细胞凋亡，并促进神经 细胞的死亡。然而，在身体其他地方，CNS中的某些细胞因子可能早就产生放大这种疾病过 程接着削弱它的功能。细胞因子和缺氧刺激引致的PGE2快速合成，可能使其在诊断和监视 已遭受出生窒息的新生婴儿中特别有用。
作为本文进一步的描述(特别是参见下文实施例7)，现已发现，由于围产期窒息 使得放于大脑中。这表明，mPGES-Ι是迅速活化，并参与哺乳动物例如人类或者小鼠 严重缺氧的应答。诱导PGE2通路在缺氧应答例如围产期窒息中的这种作用的发现，提供了 一种治疗措施和诊断工具的靶点，特别是对于那些遭受围产期窒息的新生儿。
哺乳动物
根据本发明任何方面，哺乳动物或哺乳动物受试者可以是成人，儿童或婴儿，如新 生儿。哺乳动物或哺乳动物受试者优选人类。在某些实施方案中，人可以是任何年龄或特 定年龄范围，如未满16岁，未满10岁，0至5岁和0至M个月的年龄。在某些情况下，受试 者是患有自主神经功能障碍如PWS，CCHS或雷特氏综合征的人类儿童。因此，按照本发明的 任何方面，受试者可以是患有家族型自主神经功能异常的人(婴儿，儿童或成人)或因脑干 未知病因引起的呼吸与自主紊乱的人(婴儿，儿童或成人)。
在某些情况下，受试者是患有OSAS的儿童(0-18岁)。受试者可能是产后年龄 0-25周和观-36周孕龄的婴儿。在某些实施方案中，人可能是成人，例如年龄大于18岁。 哺乳动物可能是患有睡眠呼吸暂停(如OSASjTi)和/或帕金森氏症的成人。本文所述 的研究结果表明，有迹象显示u-PGEM的提高，在患有OSAS和身体质量指数(BMI)小于30的 成年亚群之中可能对增加呼吸暂停(包括睡眠呼吸暂停)的易感性和/或其严重程度特别 重要。BMI是通过使用受试者的体重kg除以他或她的身高米数的平方。因此，一个BMI > 30受试者通常被认为肥胖。在根据本发明任何方面的某些实施方案中，受试者可能是BMI > 30的成人。
诱导PGE2通路
本发明涉及处理诱导PGE2通路来治疗本文所定义的呼吸障碍。发明人发现，诱导 PGE2通路与缺氧事件后造成的呼吸暂停频率增加和自动复苏失败有关系。诱导PGE2通路 如图6所示。在系统性的免疫反应中，促炎症细胞因子IL-I β被释放到外周血流。它结合 其位于血脑屏障内皮细胞的受体(IL-IR)。IL-IR的活化诱导花生四烯酸通过C0X-2合成 PGH2,和通过限速酶m PGES-I使PGH2合成PGE2。PG&释放到脑实质并与位于脑干呼吸控制 中枢区域，例如孤束核(NTQ和延髓头端腹外侧(RVLM)的EP3R结合。
本发明涉及，在一个或多个位置处理例如药理学处理诱导PGE2通路进而阻止或减 少对脑干呼吸控制中枢位置下游的影响作用。诱导PGE2通路可能抑制在具有阻断或减少 对脑干呼吸控制中枢区域下游影响作用的任何位点。特别是，诱导PGE2通路可能通过抑制 C0X-2，mPGES-Ι和/或EP3R而被阻断，如本文的进一步说明。
诱导PG&通路的抑制剂
诱导PGE2通路的抑制剂具有阻断或减少对脑干呼吸控制区域的下游作用的能力。该抑制剂可直接或间接的作用于诱导PG&通路的任何位点。例如，该抑制剂可以
(a)直接与参与通路的多肽相互作用(一种“诱导PGE2通路多肽”)，例如C0X-2 多肽，mPGES-1多肽和/或EP3R多肽；
(b)间接与参与通路的多肽相互作用，例如通过结合和抑制C0X-2多肽的， mPGES-1多肽/或EP3R多肽的活化剂；和/或
(c)干扰编码诱导PGE2通路多肽的基因的表达，例如下调C0X-2编码基因， mPGES-1编码基因和/或EP3R编码基因的表达(如转录和/或翻译)。
EP3R
E-类前列腺素受体亚型3 (EP3R)多肽具有结合EP3R激动剂的能力，如PGE2,以及 信号下游，如通过G-蛋白传递信号。人类和老鼠EP3R氨基酸序列曾被报道(84，其披露内 容在此明确引入本申请作为参考)。人类EP3R核苷酸序列已存在于GenBank数据库(登录 号L26976，其披露内容在此明确引入本申请作为参考)。优选的EP3R多肽含有或包括SEQ ID N0:2的人类EP3R氨基酸序列。然而，EP3R多肽可能是非人类的哺乳动物如老鼠或其他 啮齿类动物的类似物。EP3R多肽可能是人EP3R蛋白的变异体或派生物，其中一个或多个氨 基酸被插入，删除或取代而改变。优选地，EP3R多肽包括含有至少70%，更优选80%，还更 优选90%，还更优选95%，最优选99%的与SEQ ID NO 2号全长氨基酸序列同一性的氨基 酸，并且能够与EP3R激动剂如PGE2及下游信号结合。在一些实施方案中，EP3R多肽可以是 分离的。
人EP3R的激活导致[cAMP] i的减少，和[Ca++] i适度的增加(84)。cAMP的减少已 经显示出能引起脑干中与呼吸相关的神经元的开放幅度和频率的下降，从而引起呼吸活动 (85)。在神经元中，EP3R的激活可能通过蛋白激酶C-独立他0-激活通路妨碍神经突的 延长(86，87)。此外，EP3R高表达于肾脏，且在肾脏中EP3R的活化会产生血管收缩的影响 (88)。
EP3R多肽可能是活性部分，比拥有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的全长EP3R多肽 要短，但其保留了其基本生物活性。特别是，活性部分能够与EP3R激动剂如PGE2和下游信 号如通过G-蛋白发出的信号结合。
EP3R编码基因可能包括编码本文所定义的EP3R多肽的核苷酸序列。该EP3R编码 基因可能包括核苷酸序列，其具有至少70 %，更优选80 %，还更优选90 %，还更优选95 %， 最优选99%的与SEQ ID NO :1号全长核苷酸序列同一性的核苷酸序列。
EP3R 抑制剂
EP3R抑制剂阻止或减少对脑干呼吸控制区域的EP3R介导效应，例如阻止或减少 EP3R介导的呼吸暂停，呼吸抑制和/或自动复苏失败。
本发明涉及多种不同类型EP3R抑制剂的用途。例如，EP3R抑制剂可以是一种拮 抗剂，其与本文所定义的EP3R多肽结合，并防止或减少激动剂诱导(如PGE2-诱导)的下 游信号(包括G蛋白偶联信号)。此外，抑制剂可以通过结合并抑制EP3R多肽的活化剂而 间接发挥作用。本发明还涉及EP3R抑制剂，其下调本文所述的EP3R编码基因的表达(例 如抑制EP3R编码基因的转录和/或翻译)。
与EP3R多肽结合的抑制剂实例包括特异性结合的成员，如抗体分子，与PGE2竞争 性结合EP3R多肽的小分子。下调EP3R编码基因表达的抑制剂的实例包括与EP3R编码基15因或其部分互补的核酸分子，和与编码EP3R基因序列或其片段相应的双链RNA。下调EP3R 编码基因表达的抑制剂还包括核酶和/或三链螺旋因子。本文描述了更详细的多种不同类 别的抑制剂，包括小分子，特异性结合成员和核酸。
EP3R的小分子抑制剂
本发明涉及高达约2000道尔顿，如50-1000道尔顿的有机或无机化合物的使用， 其与EP3R多肽结合，防止或减少激动剂诱导(例如PGE2诱导)的下游信号，如G-蛋白信 号。该小分子EP3R抑制剂可能是拮抗剂，它竞争性地与EP3R多肽结合，使得它与PGE2竞 争性的结合到同一个位置，或者非竞争性地结合。优选具有中枢活性(即能够穿过血脑屏 障)的小分子EP3R拮抗剂。然而，不能够穿过血脑屏障的小分子EP3R拮抗剂也可以使用， 其可能通过中枢给药，例如脑室内(i.e. ν)给药。
小分子EP3R拮抗剂可能包括QE)-N-[(5-溴_2_甲氧苯基)磺酰 基]-3-[5-氯-2-(2-萘甲基)苯基]丙烯酰胺(L8^^66)或其药学上可接受的盐。
此外，小分子EP3R拮抗剂可以通过使用本文进一步阐述的筛选方法鉴定。
EP3R的特异性结合成员抑制剂
在一些实施方案中，EP3R抑制剂可能是特异性结合成员，其与本文所定义的EP3R 多肽结合，阻止或减少激动剂诱导(如PGE2诱导)的下游信号，如G-蛋白信号。
在一些实施方案中，特异性结合成员可以是抗体分子。在其他的实施方案中，特异 性结合成员可以包括在非抗体分子内部的抗原结合位点，如在非抗体蛋白支架内的一系列 ⑶Rs位点。
术语“抗体分子”，是天然或部分或全合成生产的免疫球蛋白。它已被证明整体抗 体的片段具有结合抗原的功能。因此，提及的抗体分子涵盖完整的抗体，还涵盖任何含有抗 体结合片段的多肽或蛋白。
结合片段的实例是⑴由VL、VH、CL和CHl区构成的Fab片段；(ii)由VH和CHl 区构成的Fd片段；(iii)由单抗体的VL和VH区构成的Fv片段；(iv)由VH区构成的dAb 片段(55) ； (ν)分离的⑶R区；(vi)F(ab' )2片段，包含两个相连的Fab片段的二价体片段 (vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH区和VL区通过肽键相连并使得这两个区形成抗原结合 位点(56-57) ； (viii)双特异性单链Fv 二聚体(W0 93/11161)和(ix)“双特异抗体”，基因 融合构建的多价或多特异性片段(W094/13804;58)。Fv，scFv或双特异抗体分子可能是通 过并入的二硫桥连接VH和VL域达到稳定状态(59)。也可以使用包括scFv结合至CH3区 的 Minibodies (60)。
EP3R的核酸抑制剂
本发明还包括在使用本领域技术人员已知的用于下调EP3R基因表达的技术手 段。包括使用RNA干扰(RNAi)。
在人类中，EP3R是通过含有核苷酸序列SEQ ID NO 1的基因编码形成。人类EP3R 氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。核苷酸序列可能被用于设计能够下调EP3R编码基因表 达的核酸分子，如同本文中进一步说明。
小RNA分子可能会被用来调节基因的表达。这些包括使用小干扰RNAs (siRNAs) 靶向降解mRNA，转录后基因沉默(PTGs)，通过微-RNAs (miRNAs)深入调节序列特异性的翻 译抑制mRNA和靶向转录基因沉默。
也证明了 RNAi机制和小RNAs的作用是靶向作用于特异性的染色体位点的异染色 质复合物和后生基因沉默。双链RNA(dsRNA)依赖性转录后沉默，也称为RNA干扰(RNAi)， 是一种dsRNA复合物可以在很短的时间内靶向同源性特异基因而沉默的现象。它作为信号 序列，以促进相同序列的mRNA降解。一般20-nt的siRNA对于诱发基因特异性沉默是足够 长的，但也足够短以逃避宿主反应。少量siRNA分子的诱导，靶向基因产物的表达减少即可 达90%的沉默。
在本领域，根据它们的端点不同，这些RNA序列被称为“短或小干扰 RNAs" (siRNAs)或“微RNA” (miRNAs)。这两种类型的序列可以通过与互补RNAs结合和激 发mRNA消除(RNAi)或阻止mRNA翻译成蛋白而用于下调基因表达。siRNA是在处理长的双 链RNAs时衍生的，其在自然界发现时是一般外生源。微-干扰RNAs(miRNA)内生编码小的 非编码RNAs，通过处理短发夹结构衍生。siRNA和miRNA都可以抑制携带部分互补靶序列 的mRNA的翻译，并且不导致RNA的断裂和携带全部互补序列的mRNA的降解。
siRNA配体是一般的双链，为了优化RNA介导的对目标基因功能的下调作用，优选 siRNA分子的长度是，选择确保通过RISC复合物(通过mRNA靶标的siRNA斡旋识别)正确 的识别siRNA，使得siRNA足够短以减少宿主反应。
miRNA配体是一般的单链，并有部分互补区域使配体形成发夹结构。miRNA是从 DNA转录的RNA基因，但并不翻译成蛋白质。编码miRNA的DNA序列比miRNA更长。这种 DNA序列包括miRNA的序列和近似的反向互补。当这种DNA序列转录成单链RNA分子时， miRNA序列和它的反向互补碱基对组成部分双链RNA片段。在(61)中对microRNA序列的 设计进行了讨论。
通常情况下，预期能够模仿siRNA或miRNA效果的RNA配体具有10至40个核糖 核苷酸(或其合成类似物)，优选17至30个核糖核苷酸，更优选19至25个核糖核苷酸和 最优选21至23个核糖核苷酸。在本发明的一些实施方案中使用双链siRNA，该分子可能 有对称的3'突出部分，例如，一个或两个(核糖)核苷酸，通常3' dTdT突出端是UU。根 据本申请所披露信息，本领域技术人员可以很容易设计合适的siRNA和miRNA的序列，例如 使用诸如 Ambion， s siRNA finder 的资源，参见 http//www. ambion. com/techlib/misc/ siRNA_finder. html。siRNA和miRNA的序列可以合成产生且外源性插入来引起基因下调或 者使用表达系统(例如，载体)制得。优选的实施方案中，siRNA是综合的合成。
更长的双链RNAs可以在细胞内处理产生siRNAs (例子见(62))。长的dsRNA分子 可能具有对称的3'或5'突出端，例如一个或两个(核糖)核苷酸，或可能含有平端。长 的dsRNA分子可能含有25个核苷酸或更长。优选长的dsRNA分子含有25至30个核苷酸 长度。更优选，长的dsRNA分子含有25至27个核苷酸长度。最优选，长的dsRNA分子含有 27个核苷酸长度。30个核苷酸或更长的dsRNA可以通过使用载体pDECAP表达(63)。
另一种选择是细胞中短发夹RNA分子(shRNA)的表达。shRNAs比合成的siRNA更 稳定。shRNA包括短的反向重复序列，被小环序列分隔。反向重复与基因靶点互补。在细胞 中shRNA是由DICER插入能够降解靶基因mRNA和抑制表达的siRNA制得。在优选的实施方 案中，shRNA通过从载体，如发明所述的腺病毒载体转录内源性(在细胞内)制得。shRNAs 可以在细胞内通过载体转染细胞制得，该载体在RNA聚合酶III启动子例如人HL或7SK启动 子或RNA聚合酶II启动子的控制下编码shRNA序列。可选地，shRNA可以通过从载体转录外生性(在体外)合成。接着shRNA可以直接进入细胞。优选地，shRNA分子包括EP3R编 码基因的部分序列。优选地，shRNA序列含有40至100碱基长度，更优选40至70碱基长 度。发夹柄(stem)优选含有19至30个碱基对长度。发夹柄可能含有用于稳定发夹结构 的G-U配对。
siRNA分子，长的dsRNA分子或miRNA分子可以通过核酸序列的转录制成重组体， 优选包含在载体内的。优选地，siRNA分子，长的dsRNA分子或miRNA分子包含EP3R编码 基因的部分序列。
在一个实施方案中，siRNA，长的dsRNA或miRNA是通过转录载体而内生性(在细 胞内)制得。该载体可以通过本领域已知的任何方法引入细胞。任选地，可以使用组织特 异性启动子调节RNA序列的表达。在另外的实施方案中，siRNA，长的dsRNA或miRNA是通 过转录载体外生性(在体外)制得。
在一个实施方案中，在正义和反义引物中载体可以包含EP3R编码基因的全部或 部分核酸序列，因此，当表达为RNA时，正义和反义引物片段将联合形成双链RNA。优选地， 载体包含SEQ ID NO :1核酸序列；或其变体或片段。在另一个实施方案中，在不同的载体上 提供正义和反义序列。优选地，载体包含SEQ ID NO :1核酸序列；或其变体或片段。
另外，siRNA分子可以使用本领域公知的标准固相或液相合成技术来合成。核 苷酸间的连接为磷酸二酯键或其他链接，例如，连接基团的结构为式P(O)S,(硫代酯 (thioate)) ；P (S) S, ( 二 硫代酯(dithioate)) ；P (O)NR ‘ 2 ；P (O)R' ；P(O) 0R6 ；CO ；或 CONR' 2，其中R是H(或盐)或烷基(1-12C)和R6是烷基(1_9C)，通过-0-或-S-链接到 相邻的核苷酸。除了天然碱基还可以使用修饰过的核苷酸碱基，可赋予含有这些的siRNA 分子优异的特性。
例如，修饰碱基可以增加siRNA分子的稳定性，从而减少沉默所需的数量。修饰碱 基的提供可提供或多或少比未经修饰的siRNA更稳定的siRNA分子。
术语“修饰核苷酸碱基”包含了共价修饰碱基和/或糖的核苷酸。例如，修饰核苷 酸包括含有通过共价键连接到除了在3位的羟基和除了5位的磷酸基的低分子量有机基团 的糖基的核苷酸。因此，修饰核苷酸可能还包括2位被取代的糖例如2' -0-甲基-;2-0-烷 基；2-0-烯丙基；2' -S-烷基；'-S-烯丙基；2'-氟-;2'-卤代或2'-叠氮-核糖， 碳环糖类似物α -异头糖，异构糖，如阿拉伯糖，木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，和景天庚 酮糖。
修饰核苷酸是本领域已知的且包括烷基化嘌呤和嘧啶，酰化嘌呤和嘧啶，和其他 杂环化合物。这些系列的嘧啶和嘌呤是本领域已知的，包括pseudoisocytosine (假异胞嘧 啶)，N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶，8-羟基-N6-甲基腺嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基) 尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲 基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，肌苷，N6-异戊基-腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基假尿嘧啶，1-甲 基鸟嘌呤，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧 啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘧啶，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿 嘧啶，D-甘露糖化辫苷(-D-marmosylqueosine)，5_甲氧基羰基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧 啶，2-甲硫-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，假尿嘧啶，2-巯基胞嘧啶，5-甲 基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿18嘧啶-5-氧乙酸，辫苷(queosine)，2_巯基胞嘧啶，5_丙基尿嘧啶，5-丙基胞嘧啶，5-乙基 尿嘧啶，5-乙基胞嘧啶，5-丁基尿嘧啶，5-戊基尿嘧啶，5-戊基胞嘧啶，及2，6，二氨基嘌呤， 甲基假尿嘧啶，I"甲基鸟嘌呤，I"甲基胞嘧啶。关于使用RNAi在线虫，果蝇，植物和哺乳动物中沉默基因的方法是本领域已知的 (W0 01/29058 ；WO 99/32619 ；64-74，所有这些都明确引入本文作为参考)。优选的下调EP3R编码基因表达的核酶是对EP3R编码基因的RNA序列具有特异 性，例如含有SEQ ID N0:1的DNA序列的EP3R编码基因。核酶是核酸分子，实际上是RNA， 能在确定的序列特异性切断如mRNA的单链RNA，并能够设计它们的特异性。优选锤头核 酶，因为他们识别长度约11-18的碱基序列，因此比识别序列长度约4碱基的四膜虫类核 糖酶具有更大特异性，尽管后一种类型的核酶在某些情况有用。用于核糖酶类的参考包括 Marschall 等，1994 ；Hasselhoff, 1988 和 Cech，1988。mPGES-1微粒体前列腺素E合成酶-1 (mPGES-1)多肽在谷胱甘肽存在的情况下具有催化从 PGH2合成PGE2的能力。mPGES-1多肽优选含有或由SEQ ID NO 4的人类mPGES-1的氨基酸 序列组成。然而，mPGES-1多肽可能是来源于非人类哺乳动物，如鼠或其他啮齿类动物的同 系物。mPGES-1多肽可能是人类mPGES-1蛋白的变体或衍生物，其中一种或多种氨基酸被插 入、删除或取代而改变。优选地，mPGES-1多肽包含具有至少70%，更优选80%，还更优选 90%，还更优选95%，最优选99%的与SEQ ID NO :4全长氨基酸序列相同的氨基酸序列，并 在谷胱甘肽存在的情况下具有催化从PGH2合成PGE2的能力。在一些实施方案中，mPGES-1 多肽可以是分离的。人类mPGESl cDNA的基因编码序列如下SEQ ID NO :3所示。具有未被翻译的5， 和3’末端的全长cDNA在GenBank的登记号是NM_004878. 3。mPGES-1多肽可能是活性部位，比具有SEQ ID NO :4氨基酸序列的全长mPGES_l多 肽要短，但保留其基本的生物活性。特别是，活性部位在谷胱甘肽存在的情况下具有催化从 PGH2合成PGE2的能力。mPGES-1编码基因可能包括核苷酸序列，编码本文所定义的mPGES-1多肽。 mPGES-1编码基因可能含有核苷酸序列，其具有至少70 %，更优选80 %，还更优选90 %，还 更优选95%，最优选99%的与SEQ ID NO :3全长核苷酸序列同样的核苷酸序列。mPGES-1 的抑制剂mPGES抑制剂阻止或减少mPGES_l介导的PGE2合成。mPGES-1抑制剂可以阻止或 减少mPGES-Ι介导的PGE2水平升高，特别是在血脑屏障内皮细胞和/或脑实质中PGE2水平。 通过阻止或减少PGE2的合成，mPGES-Ι抑制剂可以改善诱导PGE2通路介导的呼吸暂停，呼 吸抑制和/或自动复苏失败。本发明涉及一系列不同类型的mPGES-Ι抑制剂的使用。例如，抑制剂可能会结合 到本文所述的mPGES-Ι多肽以破坏其催化功能，这样的抑制剂包括结合到mPGES-Ι多肽的 活性催化位点的竞争性抑制剂和结合到远离mPGES-Ι多肽活性催化位点的变构抑制剂。此 外，抑制剂通过结合和抑制mPGES-Ι多肽的活化剂起到间接的作用。本申请还涉及mPGES-1 抑制剂，其下调mPGES-Ι编码基因的表达(例如通过抑制mPGES-Ι编码基因的转录和/或 翻译)。
结合到mPGES-Ι多肽的抑制剂的实例包括特异性结合成员，如抗体分子，和竞争 性或非竞争性结合到mPGES-1多肽的小分子。下调mPGES-Ι编码基因表达的抑制剂的实例 包括与mPGES-Ι编码基因或其部分互补的核酸分子，和与mPGES-Ι编码基因序列或其片段 相应的双链RNA。下调mPGES-Ι编码基因表达的抑制剂的实例还包括核酶和/或三重螺旋 因子。对于一系列不同类别的抑制剂的详细说明，包括小分子，特异性结合成员和核酸如同 本文所述。mPGES-Ι的小分子抑制剂小分子mPGES-Ι抑制剂可以结合到mPGES_l多肽上，并阻止或限制mPGES_l多 肽将环式内氧化物底物转化为底物的9-酮，11 α羟基形式的产品。小分子可以结合到 mPGES-Ι多肽的活性部位或远程位点，并可以可逆或不可逆的结合。一系列化合物已发现可以抑制mPGES-Ι酶，包括白三烯C4，NS-398，IC50值分别 为5，20和80 μ M的舒林酸硫化物(75，其中披露的信息在此明确引入本申请作为参考)。 另外，15-脱氧-Δ 12，14-PGJ2，花生四烯酸，十二碳六烯酸，二十碳五烯酸和3_[叔-丁基 硫-1-(4-氯苄基)-5-异丙基-IH-吲哚-2-基]-2，2-二甲基丙酸(MK-886)均被报道为 具有相似的IC50值为0. 3 μ M的mPGES抑制剂(76-77)此外，小分子mPGES-Ι抑制剂可以通过下文所述筛选方法来鉴定。mPGES-Ι特异性结合抑制剂成员在某些实施方案中，mPGES-Ι抑制剂可为特异性结合抑制剂成员，与本文定义的 mPGES-Ι多肽结合并阻止或减少mPGES-Ι介导的将环式内氧化物底物转化为底物的9-酮， 11 α-羟基形式的产品。mPGES-Ι特异性结合抑制剂成员可以是抗体分子。上文所述的不同类型抗体分子 与EP3R抑制剂特异性结合成员有关。抗体分子如本申请所述，除了仅结合mPGES-Ι多肽而 不结合到EP3R多肽的抗体分子。mPGES-Ι核酸抑制剂本发明还涉及下调mPGES-Ι编码基因表达的抑制剂。在人体内，mPGES-Ι是由具有如SEQ ID NO :3核苷酸序列的基因编码。人类 mPGES-Ι氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。核苷酸序列可以用于设计能够下调mPGES-1 编码基因的表达的核酸分子，作为对上文所述有关的EP3R抑制剂的进一步说明，除了下调 mPGES-Ι编码基因表达而不下调EP3R编码基因表达的核酸分子。EP3R编码基因的序列、部 分序列或互补序列的参考，因此比照(mutatis mutandis)应用至mPGES-1编码基因的序 列、部分序列或互补序列。C0X-2环氧合酶-2(C0X_2的)多肽具有催化从花生四烯酸合成PGH2的能力。人类C0X-2 的氨基酸序列在GenBank的登记号是NP_000954(这是明确引入本申请作为参照)，如下文 的SEQ ID NO 6所示。C0X-2多肽优选包含或由SEQID NO 6的人C0X-2氨基酸序列组成。 然而，C0X-2多肽可能是来源于非人类哺乳动物，如鼠或其他啮齿类动物的同系物。C0X-2 多肽可能是人类C0X-2蛋白的变体或衍生物，其中一种或多种氨基酸被插入，删除或取代 而改变。优选地，C0X-2多肽包含的氨基酸序列具有至少70 %，更优选80 %，还更优选90 %， 还更优选95%，最优选99%的与SEQ ID NO :6全长氨基酸序列同样的氨基酸，并具有催化花生四烯酸合成PGH2的能力。在一些实施方案中，C0X-2多肽可以是分离的。C0X-2多肽可能比具有SEQ ID NO :6氨基酸序列的全长C0X-2多肽要短，但仍保 持其基本的生物功能。特别是，其活性部分具有催化花生四烯酸合成PGH2的能力。人类C0X_2cDNA序列存在于GenBank (基因库)(登记号是NM_000963，其在本申请 明确地被引入作为参考)且如下述SEQ ID NO 5所示。编码序列是从核苷酸135至1949， 显著的标记。C0X-2编码基因可能包括编码本申请所定义的C0X-2多肽的核苷酸序列。C0X-2 编码基因可能含有核苷酸序列，其具有至少70 %，更优选80 %，还更优选90 %，还更优选 95%，最优选99%的与SEQ ID NO :5或其编码区域(SEQ ID NO :5的核苷酸135至1949) 的核酸序列的编码区域同样的核苷酸序列。C0X-2的选择性抑制剂C0X-2的选择性抑制剂阻止或减少C0X-2介导的PGH2合成。C0X-2的选择性抑制 剂可以阻止或减少C0X-2介导的PGH2水平的升高，从而改善诱导PGE2通路介导的呼吸暂 停，呼吸抑制和/或自动复苏失败。此外，C0X-2的选择性抑制剂抑制C0X-2的活性比抑制C0X-1的活性更大。C0X-2 抑制剂的选择性普遍减少了与非选择性COX抑制剂相关的副作用，如对重要组成C0X-1活 性的抑制造成的副作用。C0X-2的选择性抑制剂对C0X-2的抑制活性可能是对C0X-1的抑 制活性的2倍或更大，如5或10倍。因此，C0X-2选择性抑制剂的IC5tl值低于同样的C0X-1 选择性抑制剂IC5tl值的2倍，优选低于5倍或10倍。本发明涉及多种不同类型的C0X-2选择性抑制剂的用途。例如，抑制剂可能与本 文所定义的C0X-2多肽结合以破坏其催化功能，这些抑制剂包括结合C0X-2活性催化位点 的竞争性抑制剂和结合远离C0X-2活性催化位点的变构抑制剂。此外，抑制剂可以结合并 抑制C0X-2多肽的活化剂而起到间接作用。本发明还涉及C0X-2抑制剂，其下调C0X-2编 码基因的表达(例如抑制C0X-2编码基因的转录和/或翻译)。与C0X-2多肽结合的抑制剂实例包括特异性结合成员，如抗体分子，与C0X-2多肽 竞争性或非竞争性结合的小分子。下调C0X-2编码基因表达的抑制剂的实例包括与C0X-2 编码基因或其部分互补的核酸分子，和与C0X-2多肽编码基因序列或其片段相应的双链 RNA。下调C0X-2编码基因表达的抑制剂仍包括核酶和/或三链螺旋因子。本文描述了更 详细的不同类别的抑制剂，包括小分子，特异性结合成员和核酸。C0X-2小分子抑制剂C0X-2的小分子选择性抑制剂可以结合到C0X-2多肽，并阻止或减少C0X-2介导的 花生四烯酸转化成PGH2。小分子可以结合到C0X-2多肽的活性催化位点或远离的位点，结 合可以是可逆或不可逆的。大量可充当C0X-2选择性抑制剂的化合物已被描述。一种C0X-2选择性抑制剂的 实例类型是已知的“昔布类”药物。在一些实施方案中，C0X-2的小分子选择性抑制剂可能包括4-(5_甲基_3_苯 基-异噁唑-4-基)苯磺酰胺(戊地昔布)或其药学上可接受的盐；4-[5-(4_甲基苯 基)-3-(三氟甲基)吡唑-1-基]苯磺酰胺(塞来昔布)或其药学上可接受的盐；和/或 4-(4-甲基磺酰基苯基)-3-苯基-5H-呋喃-2-酮(罗非昔布)或其药学上可接受的盐。
大量的C0X-2抑制剂，根据本发明的用途，已被现有技术所公开(参见94，其披露 的内容在此明确被引入作为参考，对于COX药理学的综述，尤其是C0X-2，抑制活性)。此外，C0X-2的小分子选择性抑制剂可以通过使用本文进一步阐述的筛选方法进
行鉴定。C0X-2的特异性结合抑制剂成员在一些实施方案中，C0X-2选择性抑制剂可能是特异性结合成员，其与本文所定义 的C0X-2多肽结合，并阻止或减少C0X-2诱导花生四烯酸转化为PGH2。C0X-2特异性结合成员抑制剂可能是抗体分子。上述不同类型的抗体分子与EP3R 抑制剂特异性结合成员有关。此处所述的抗体分子，除了那些仅结合C0X-2多肽而不结合 EP3R多肽的抗体分子。优选地，C0X-2抑制剂特异性结合成员将不会与C0X-1多肽发生交 叉反应。C0X-2的核酸抑制剂本发明还涉及下调C0X-2编码基因表达的抑制剂。在人体内，C0X-2是通过含有SEQ ID NO :5核苷酸序列的基因编码形成。人类 C0X-2氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。核苷酸序列可以用于设计能够下调C0X-2编码基 因的表达的核酸分子，作为对上文所述有关的EP3R抑制剂的进一步说明，除了下调C0X-2 编码基因表达而不下调EP3R编码基因表达的核酸分子。参考的EP3R编码基因的序列，部 分序列或互补序列，因此比照(mutatis mutandis)应用至C0X-2编码基因的序列，部分序 列或互补序列。治疗本发明涉及治疗和预防本文定义的呼吸障碍。该治疗可以减少哺乳动物对呼吸障 碍的易感性，和/或全部或部分消除哺乳动物呼吸障碍的一种或多种临床病征。例如，本发 明涉及调整患有呼吸暂停的患者呼吸。还涉及，促进缺氧事件之后的自动复苏的增强。优选的实施方案是，哺乳动物是经确定有如本文所述呼吸障碍的危险。例如，患 有感染，尤其是感染造成IL-I β水平升高的婴儿，可用于治疗的试剂含有EP3R抑制剂； mPGES-1抑制剂；和/或C0X-2选择性抑制剂，以减少呼吸暂停的可能性和严重性。制剂本发明涉及本申请所述抑制剂的多种药物组合物。药物组合物通常包括一种或 多种药学上可接受的盐，载体或赋形剂。此外，也涉及药物组合物，其包括多于一种的本 文定义的抑制剂。例如，组合物可以包含两种或更多种选择自以下的试剂EP3R抑制剂； mPGES-1抑制剂；和C0X-2选择性抑制剂。或者，如果应用超过一种的抑制剂，这些试剂可 以制成单独的组合物，用于同时或相继给药。给药方式依据本发明，可应用任何适合的给药方式。通常，含有本文定义的抑制剂的组合物 可以通过口服，直肠给药，鼻内，静脉注射，肌肉注射，皮下，腹膜内或脑室内注射，经皮贴剂 或微型真空泵给药。对于包含EP3R抑制剂的无法跨越血脑屏障的组合物，可以优选通过脑
室内注射。评估和诊断本发明涉及通过在哺乳动物试样中检测一种或多种诱导PGE2通路的标志物，评估哺乳动物对呼吸障碍的易感性或存在的方法。发现患有呼吸障碍或者呼吸障碍危险性增加 的受试者可以接着通过本文定义的抑制剂进行治疗。本发明涉及一系列评估患者诱导PGE2通路活性是否增加的方法。在一些实施方 案中，检测受试者试样中PGE2或其代谢物的水平并与对照水平相比。对照水平优选是预先 设定的“正常”范围。例如，对照水平可以是健康对照者的相似试样中发现的PGE2或其代谢 物的水平。对照水平可以代表预先确定的或健康对照受试者报告的数值范围，并可以代表 从人群获得的平均值。如本文进一步说明，PGE2和/或一种或多种其代谢物可在生物试样中测定。存在 一系列的PGE2代谢物，其中大部分可以通过LC-MS/MS(液相色谱三重四极质谱仪)检测 (105，其完整公开内容在此明确地引入本申请作为参考)。根据本申请的PGE2代谢物的示例包括E和F系列的7 α -轻基-5，11- 二酮-2， 3,4, 5，20-戊-19-羧基前列腺酸和13，14- 二氢-15-酮代谢物。对检测试样中的PGE2 和/或一种或多种的PGE2代谢物(包括E和F系列的7 α -羟基-5，11- 二酮-2，3，4，5， 0-戊-19-羧基前列腺酸和13，14- 二氢-15-酮代谢物)可以通过任意适合的技术来测量。 根据本发明，PGE2代谢物及其用于检测和测量的技术描述于(106，其完整公开内容在此明 确地引入本申请作为参考)。对测量PGE2及其代谢物的分析的具体示例包括如下述实施例部分更详细描述的 酶免疫检测(EIA)。EIA试剂盒可商业购买且能够敏感的检测个体化合物。更多的示例，PGE2和/或其一种或多种代谢物(包括E和F系列的7 α -羟基_5， 二酮-2，3，4，5，20-戊-19-羧基前列腺酸和13，14- 二氢-15-酮代谢物)的测量或检测可 以应用LC. MS/MS和/或三重四极质谱(也被称为三重四极(QQQ))。优选在一定的条件下 根据其检测化合物飞/皮摩尔(femto/pmol)浓度的分析能力使用三重四极质谱。使用串 联四极杆(三重四极杆)仪器来量化已知的代谢物和肽类(例如PGE2和/或其一种或多 种代谢物)。该仪器可用于花生四烯酸级联的定量通路分析。此外，该仪器可用于定量确认 临床材料的肽类和在代谢产物学鉴定中定量确认代谢产物以区别不同临床材料间的差异。 提议的仪器将通过电喷雾电离接口(ESI)连接到超高效液相色谱(UPLC)。在液相色谱中 使用的小粒度颗粒(< 1.8微米)显著的缩小了色谱峰宽，通常是3-5秒(UPLC)，相比于 常规的LC的30-60秒。这可以更好的分离，从而更多的化合物可以在较短的时间内分离。 在三重四极质谱仪中，特定代谢物的分子离子在第一四极中被选中，代谢物碎片通过碰撞 气体产生于碰撞单元内。特定的“子体离子”在第二四极被选中产生电子跃迁痕迹(反应 监测)。由于不同的代谢物/肽会不同的碎裂，该子体离子构成了化合物非常特异的痕迹。 通常可同时监测 100痕迹(多反应监测，MRM)，使得在一个试验中可以特异性和敏感性的 量化多种代谢物。优选地，本发明的方法包括在尿液试样中测量一种或多种PGE2的代谢产 物，并采用三重四极质谱法。优选的测量尿液中PGE2代谢物(u-PGEM)的具体分析方法如 实施例8所描述。在某些情况下，本发明的方法包括在尿液试样中测量一种或多种PGE2代 谢产物，且该方法进一步包括确定尿液试样中的肌酸酐水平，其中，尿液中的PGE2水平与尿 液中肌酸酐水平相关。将试样中的PGE2或其代谢物的水平与对照水平相比，可以考虑通过图表，数据库 或文献报告预定的对照值或对照值范围得到结论。在一些情况下，例如当没有预定的对照值可用时，比较试样的水平和对照水平可以包括连续检测健康受试者的对照试样中PGE2或 其代谢物的水平或并行检测所研究受试者的试样中PGE2或其代谢物的水平。与对照组水平相比PGE2或PGE2代谢物水平的升高，被认为是显示存在呼吸障碍或 其风险增加，例如增加呼吸暂停的频率。下面公开的数据提供了证据，表明PGE2代谢物可被用作评价出生时期时婴儿经 历窒息(“围产期窒息”)的程度和/或哺乳动物受试者的缺氧缺血性脑病(HIE)的存在或 严重程度的有用指标。与对照水平相比，PGE2或PGE2R谢物水平的升高，特别是七天内取 自受试者的试样，如在受试者出生的96，48，24，12，6，4，3或2小时内或在60，30，20，10或5 分钟内的试样，显示了哺乳动物受试者HIE存在的前兆和/或以显示受试者患有围产期窒 息。PGE2或其代谢物水平升高的程度与对照水平相比，已经显示与围产期窒息程度和/或 HIE的严重程度有关联，因此可能是受试者神经作用的结果。本发明的方法，从而有助于对预后和长期神经系统的结果的判断，从而对关于治 疗的立即决定有价值。实验结果表明，PGE2的半衰期，在某些情况下，为约12-18小时。PGE2及其代谢物 可以持续甚至可以在超过72小时后被测量。PGE2降解的半衰期根据细胞环境而相差很大。 PGE2的半衰期可以从几分钟到几个小时不等。在评价身体中产生的和分泌在尿液中或其他 体液中的PGE2时，测量其代谢物亦很重要。在一些实施方案中，试样中的PGE2或其代谢物水平与PGE2或其代谢物的参考水平 相比。该参考水平可能会与对照水平不同。例如，参考水平可以是显示如本文定义的呼吸 障碍或哺乳动物受试者的围产期窒息或HIE的值或值的范围。在这种情况下，PGE2或其代 谢物的水平约等于参考水平或在参考值范围内显示本文定义的呼吸障碍存在或其风险增 加；在出生时婴儿经历窒息的严重程度和/或受试者存在HIE或其严重程度。该参考水平 可为有关于以下具体的严重程度或阶段的值或值的范围呼吸障碍；婴儿出生时经历的窒 息；和/或受试者患有的HIE的特定。在一些实施方案中，该方法包括通过检测mPGES-Ι编码基因的表达来评估患者诱 导PGE2通路的活性是否增加。这可能包括测量mPGES-Ι编码基因的mRNA水平，例如，采用 基于定量，半定量或实时PCR的方法。mPGES-Ι编码基因表达的升高显示呼吸障碍的风险增 加。其他评估患者诱导PGE2通路的活性是否增加的方法包括检测PGH2水平升高，增加的 0 -2的基因表达和/或增加的仏-10水平。本发明涉及检测一种或多种诱导PGE2通路 活性增加的标志物。例如，检测PGE2水平可以与检测PGH2水平，mPGES-Ι的表达，C0X-2表 达和/或IL-I β水平相结合。在一些实施方案中，本方法可能涉及鉴别编码mPGES-Ι和C0X-2和/或EP3R基因 中的一个或多个突变。例如，在编码mPGES-Ι和C0X-2和/或EP3R基因中的单核苷酸多态 性(SNP)可能与本文定义的呼吸障碍的易感性增加相关。试样试样可以是液体试样例如CSF试样，血液试样，尿液试样或非液体试样例如活组 织试样。优选的试样是CSF，尿液或血液试样。在某些实施方案中，特别优选尿试样。试样可以取自哺乳动物受试者，例如人受试者，其在本申请所述的症状实际或疑 似发生或者开始之后的预定时间点。例如，样品可取自婴儿，在受试者出生或进入医院或有
24临床症状的96，48，24，12，6，4，3或2小时内或在60，30，20，10或5分钟内。在某些情况下， 试样可能是储存于低温下的人的尿液试样(例如，在大约4°C或在-80°C至_20°C之间)。感染标记本发明人发现，PGE2水平，CRP和呼吸暂停指数是相关的(见图5)。在一些实施 方案中，诊断方法可能还包括检测感染相关标记物的水平。例如，评估试样优选患者的血液 或尿液试样中CRP的水平。与对照水平相比感染标记物水平的升高显示呼吸障碍风险的增 强，特别是当将PGE2水平的升高或其他诱导PGE2通路活性增加的标记物一起出现时。对照水平优选是预定的“正常”范围。例如，对照水平可以是从健康对照的同样试 样中获得的CRP水平。对照水平可以代表预先确定的或健康对照受试者的报告数值范围， 并可以代表从人群获得的平均值。将试样中的CRP的水平与对照水平相比，可以考虑通过图表，数据库或文献报告 预定的对照值或对照值范围得到结论。在一些情况下，例如当没有预定的对照值可用时，比 较试样的水平和对照水平可以包括连续检测健康受试者的对照试样中CRP的水平或并行 检测所研究受试者的试样中的CRP水平。与对照组水平相比CRP水平的升高，被认为是显示呼吸障碍的存在或其风险增 加，例如增加呼吸暂停的频率。在一些实施方案中，试样中的CRP水平与CRP参考水平相比。该参考水平可能会 与对照水平不同。例如，参考水平可以是显示如本文定义的呼吸障碍的值或范围。在这种 情况下，CRP的水平约等于参考水平或在参考范围内则显示本文定义的呼吸障碍存在或其 风险增加。该参考水平可为与本文定义的呼吸障碍的特定的严重程度或阶段有关的值或值 的范围。此外，测量PGE2或其代谢物，可用做补充，或作为替代方案测量作为炎症标志物的 CRP 或高敏感 CRP (hsCRP)。筛选方法本发明涉及鉴别用于治疗呼吸哺乳动物障碍的物质。相应地，鉴别用于治疗呼吸 哺乳动物障碍的物质的方法包括测定受试物质抑制诱导PGE2通路的能力，例如作为EP3R 抑制剂、mPGES-1抑制剂和/或C0X-2选择性抑制剂的受试物质，其中对诱导PGE2通路的抑制显示受试物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。受试物质，可以是候选化合物或组合物，可通过以下方式抑制诱导PGE2通路(a)与参与通路的多肽(一个“诱导PGE2通路多肽”)直接作用，例如C0X_2多肽， mPGES-1多肽和/或EP3R多肽；(b)与参与通路的多肽间接作用，例如通过与C0X-2多肽，mPGES-1多肽和/或 EP3R多肽的活化剂结合并对其抑制；和/或(c)下调编码诱导PGE2通路多肽的基因的表达，例如编码C0X-2基因，编码 mPGES-1的基因和/或编码EP3R基因的表达(如转录和/或翻译)的下调。多肽抑制剂的筛选测定受试物质相互作用和/或结合诱导PGE2通路多肽的能力，可以用于鉴定受试 物质可能作为诱导PGE2通路的抑制剂。该方法可包括检测或观察相互作用或结合，然后使 用受试物质用进一步测定方法测定其是否抑制诱导PGE2通路的多肽活性，例如酶活性或受体介导信号。本发明的检测方法的精确形式可通过本领域技术人员常规的技能和知识来变化。 例如，多肽或肽间的相互作用可以通过体外实验进行研究，通过使用可探测的标记对多肽 进行标记并将其与固定在固体载体上的其他肽或多肽相接触。适合的探测标记包括35S-蛋 氨酸，其可混合入重组生产的肽类和多肽。重组生产的肽和多肽也可以表达为含有可用抗 体标记表位的融合蛋白。固定在固体载体上的该蛋白质或肽可以通过结合固体载体的拮抗该蛋白的抗 体或通过其他本来已知的技术手段固定。优选的体外相互作用可以是利用含有谷胱甘 肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。其可以固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上。在上述类型的体外 测定形式中，受试化合物可以通过测定其减少结合在已固定的GST-融合多肽上的标记肽 类或多肽的量的能力来确定。这可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离谷胱甘肽_琼脂 糖珠进行确定。另外，这些珠可通过冲洗以除去未结合的蛋白，已结合的蛋白的数量可以通 过计算存在的标记的量来测定，例如，适合的闪烁计数器。一般而言，鉴定受试物质与诱导PGE2通路多肽结合或相互作用的能力和鉴定其作 为潜在的PGE2通路抑制剂后，还需进行进一步的分析步骤，包括鉴定受试物质是否具有抑 制诱导PGE2通路多肽活性的能力。自然地，在不知道受试物质是否能够与诱导PGE2通路 多肽结合或相互作用的情况下，进行涉及确定该受试物质抑制诱导PGE2通路多肽的能力测 定，但可应用先行的结合/相互作用的测定测试大量化合物进行筛选功能性测试，包括测 定抑制诱导PGE2通路多肽活性的能力，以减少潜在的抑制剂的数量至更易控制的水平。本文进一步描述了确定受试物质是否可以作为诱导PGE2通路多肽的检测方法，特 别是C0X-2，mPGES-1和EP3R的检测方法。组合库技术(78)提供了一种有效的测试潜在大量不同物质的对多肽的调节能力 的方法。可加到本发明检测中的受试物质或化合物的量通常是通过反复试验来确定，且取 决于所用化合物的类型。通常情况下，使用大约0. InM至IOnM浓度的测试化合物(如假定 抑制剂)。当受试物质是肽时可以使用更高的浓度。可使用的化合物可以是在药物筛选程 序中所用的自然或人工合成的化合物。也可以使用含有数种确定或不确定组分的植物提取 物。其他抑制剂或待研究的抑制剂化合物可以是基于多肽或肽片段的三维结构模型，通过 合理药物设计提供具有特定的分子的形状，大小和电荷特性的潜在的抑制剂化合物。基因表达抑制剂的筛选诱导PGE2通路的抑制剂可以通过干扰编码诱导PGE2通路多肽基因的表达而抑制 通路，所述基因例如C0X-2编码基因，mPGES-1编码基因和/或EP3R编码基因。因此，本发 明的检测方法可以包括鉴定受试物质作为用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质，其中该方法 包括筛选一种能够减少或抑制编码诱导PGE2通路多肽基因表达的物质，包括(a)将含有所述基因的启动子的DNA与受试物质接触，其中，启动子通过操作链接 到基因；(b)从启动子确定基因表达水平；和(c)在可比较条件下，将所述受试物质存在情况下的基因表达水平与受试物质不 存在情况下的基因表达水平相比较，
其中在受试物质的存在下基因表达水平的降低显示出测试物质具有抑制编码诱 导PGE2通路多肽基因的能力。该方法可进一步包括鉴定受试物质作为编码诱导PGE2通路多肽基因抑制剂，即作 为用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。因此，步骤(C)可以包括在可比较条件下与受试物质不存在情况下的基因表达水 平相比较，检测在受试物质存在情况下基因表达降低的水平，据此鉴定受试物质为用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。该方法可包括与受试物质接触的表达系统，如含有通过操作将基因启动子连接基 因的宿主细胞，并确定该基因表达。该基因可以是编码诱导PGE2通路多肽的基因或者它可 以是异源性基因，例如报告基因。“报告基因”是在表达后其编码产物可以测定的基因，即 “报告”启动子活性的基因。“启动子”是指DNA转录起始向下游延伸的核苷酸序列(即双链DNA在正义链上的 3'方向)。基因的启动子包括或基本上由人类染色体基因的5'的核苷酸序列组成，或其 他物种如大鼠或小鼠的等价序列。启动子活性水平可以量化，例如通过从启动子转录的mRNA产物量进行评估或通 过启动子转录产生的mRNA翻译产生的蛋白产物的量进行评估。出现在表达系统的特定 mRNA的数量可以确定，例如通过使用能够与mRNA杂交的和被标记的或可用于特异性扩增 反应例如聚合酶链反应(PCR)的特定寡核苷酸类物质。通过参考蛋白质产物使用报告基因令启动子活性的测定变得容易。报告基因优选 编码催化产生可探测信号(优选可视检测信号，如有色产物)反应的酶。许多示例是已知 的，包括半乳糖苷酶和荧光素酶。半乳糖苷酶的活性可以测定底物产生的蓝色，检 测可以通过肉眼或使用分光光度计来测量吸光度。荧光，例如，作为荧光素酶活性的产物， 可以使用分光光度计进行量化。可以使用放射性检验，例如使用氯霉素乙酰转移酶，它也可 以在非放射性检测中使用。报告基因表达产生的基因产物的存在和/或数量可以使用能够 与产物结合的分子如抗体或其片段来确定。结合分子可以使用任何标准技术直接或者间接 标记。可以使用任意适合的技术将启动子结构引入细胞系中以生产稳定的细胞系，其包 含报告基因构造整合至基因组中。该细胞可以生长和通过测试化合物培养不同的时间。这 些细胞可以在96孔板中培养，方便分析大量的化合物。然后将这些细胞清洗并分析报告基 因的表达。对于一些报告基因，如荧光素酶，将细胞裂解后再分析。本领域技术人员知道许多可能的报告基因和可用于检测基因活性的分析技术。 更多的示例，参见Sambrook和Russell，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning :a Laboratory Manua) 1 3 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press。C0X-2 测定本发明涉及确定可能是候选的化合物或组合物的受试物质，是否具有C0X-2选择 性抑制活性的测定方法，据此将确定具有C0X-2选择性抑制活性的受试物质鉴定为用于治 疗呼吸障碍的物质。在一些实施方案中检测方法包括将受试物质与花生四烯酸和C0X-2多肽相接触，在不含受试物质的情况下，花生四烯酸会被C0X-2转换为PGH2 ；和测定在受试物质存在下的PGH2产物水平，与在受试物质不存在的PGH2产物水平对 比，其中与所述对照水平相比，含有受试物质的PGE2产物的更低水平表明受试物质是 可以用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。鉴定C0X-2抑制剂的方法包括上文所描述的(89，90，91，所有这些都明确引入本 申请作为参考)。发现抑制C0X-2的待选化合物或组合物可以用于本申请所述的进一步测 试，如在体内试验，以确定化合物或组合物是否能够治疗哺乳动物呼吸障碍。一系列的C0X-2抑制剂筛选试剂盒可商业购得。例如，开曼化工公司(Cayman chemicals)产品No. 560131 "COX抑制剂筛选实验”提供的人C0X-2所需的辅助因子，且检 测是基于SnCl2使PGH2减少转变为主要是PGF2 α。(参见http://www. caymanchem. eom/ app/template/Product, vm/catalog/560131/a/ζ)。有其他几种检测产生的PGH2的选择，如PGH2可以在使用氯化铁处理后，转换成 12-HHT和丙二醛，这两者都可以通过高通量方式测量或可以利用C0X-2的过氧化物酶活 性，例如仍然是开曼化工公司提供的试剂盒中所述(参见http://WWW. caymanchem. eom/ app/template/Product, vm/catalog/760111/a/ζ)。该方法通常包括培养受试物质或将受试物质与酶以及酶的底物共同培养。底物可 以是生理学上的底物如花生四烯酸，或者可以是改良的或非-生理学上的底物，如经设计 的能够在酶促反应中引起可探测的产物(如有色的)的底物。将C0X-2多肽与受试物质和底物如花生四烯酸等接触的顺序，可能不同。例如， C0X-2多肽可以先与受试物质共同培养，然后再与底物接触，反之亦然。因此，在含有受试物质的产物产量可以通过与不含受试物质中产物产量进行对 比。产物水平较低，或形成产物的产率较低表明该受试物质抑制了酶的活性。测定抑制剂的另外一种可能的方法是通过表达C0X_2(自然或重组的)的合适细 胞系来测试物质影响PGH2产生的能力。根据本发明的测定可以在细胞系如酵母菌株中进 行，其中有关的多肽或肽由一个或多个引入细胞的载体来表达。测定抑制剂的另外一种可能的方法是通过包含C0X_2(人类或其它哺乳动物的) 的不纯蛋白制品来测试物质影响PGH2产量的能力。本发明优选测定方法包括确定受试物质 抑制分离/纯化的C0X-2多肽(包括全长的C0X-2或其活性部分)的C0X-2活性的能力。本发明的测定方法中，产物的产量可以通过量化底物的水平和/或量化产物的水 平来测量。剩余的底物水平越大，产物产量的水平就越小。在一些实施方案中，测定方法可以包括测定受试物质抑制C0X-2与另一个多肽例 如C0X-1对比的选择性。例如，测试方法可能包括测定抑制活性，如受试物质拮抗C0X-1的 IC50,以及抑制活性如受试物质拮抗C0X-2的IC5(1。优选地，经鉴定是C0X-2选择性抑制剂 的受试物质，相比拮抗C0X-1，具有2倍或更大，如5或10倍，的抑制C0X-2的活性。因此， 受试物质抑制C0X-2的IC5tl值可能是2倍低于，优选5倍或10倍低于该同样受试物质抑制 C0X-1 的 IC5tl 值。产物的测定可使用HPLC，UV光谱测定法，放射性检测，或RIA(如用于检测PGE的 市售RIA试剂盒)。产物的结构可以通过气相色谱(GC)或质谱(MS)，或具有放射性扫描的TLC来分析。本发明方法中使用C0X-2蛋白，不必使用整个(全长)C0X_2蛋白质序列。本发明 的对两种分子间结合或对C0X-2酶活性的测定方法可以使用片段或变异体。片段可以通过 本领域已知的任何适合的方法制得和使用。产生片段适当的方法包括但不限于，编码DNA 片段的重组表达。这些片段可以通过编码DNA，确定表达合适限制性内切酶识别位点任一 侧的部分，并从DNA切割出所述部分制得。然后该部分可以在标准的可商业购买的表达系 统中可操纵地连接至合适的启动子。另一种重组方法是使用适合的PCR引物扩大DNA相关 部分。小片段(例如高达约20或30个氨基酸)也可以使用本领域已知的肽合成方法生 成。C0X-2的活性部分可用于测定方法中。C0X-2多肽的“活性部分”可用于本发明的方法。活性部分是指短于完整长度多肽 的肽，但其保留了基本的生物活性。特别是，活性部分保留了在适当条件下催化从花生四烯 酸合成PGH2的能力。mPGES-1 的测定本发明涉及确定受试物质，可能是候选的化合物或组合物，是否具有mPGES-1抑 制活性的测定方法，其中将确定具有mPGES-1抑制活性的受试物质鉴定为用于治疗呼吸障 碍的物质。在一些实施方案中检测方法包括将mPGES-Ι多肽与受试物质和mPGES_l的环式内氧化物底物相接触，在不含受试 物质的情况下，mPGES-Ι的环式内氧化物底物会被mPGES-1转换为底物的9-酮，11 α羟基 形式；和测定在含有受试物质的情况下PGH2或其非酶降解产物(PGE2，PGD2或PGF2 α )的 水平，与不含受试物质时的产物生成的对照水平相比；其中与所述对照水平相比，含有受试物质时的产物生成的更低水平表明受试物质 是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。该方法通常包括培养受试物质或受试物质与酶及酶的底物共同培养。底物可以是 生理学上的底物如PGH2，或者可以是经修饰的或非-生理学上的底物，如经设计的能够在酶 促反应中引起可探测的产物(如有色的)的底物。将mPGES-Ι多肽与受试物质和底物如PGH2接触的顺序，可能不同。例如，mPGES_l 多肽可以先与受试物质培养，然后再与底物接触，反之亦然。因此，受试物质存在时产物的产量可以通过与不含受试物质时产物的产量进行对 比。产物水平较低，或形成产物的产率较低表明该受试物质抑制了酶的活性。测定抑制剂的另外一种可能的方法是通过表达mPGES-Ι (自然或重组的)的适合 的细胞系来测试物质影响PGH2产量的能力。根据本发明的测定可以在细胞系如酵母菌株 上进行，其中有关的多肽或肽由引入细胞的一个或多个载体来表达。测定抑制剂的另外一种可能的方法是通过包含mPGES-Ι (人类或其它哺乳动物 的)的不纯蛋白质制品来测试物质影响PGH2产量的能力。本发明优选测定方法包括确定受 试物质抑制分离/纯化的mPGES-Ι多肽(包括全长的mPGES-Ι或其活性部分)的mPGES-1 活性的能力。筛选抑制mPGES-Ι多肽活性的物质(即mPGES-Ι抑制剂)的方法可以包括在合适
29的反应介质中将一个或多个受试物质与多肽接触，测试处理后的多肽的活性和将其活性与 在可比的反应介质中未经受试物质(们)处理的多肽活性进行比较。处理和未经处理的多 肽活性的差异显示了相关测试物质(们)的调整效果。该检测方法可包括(a)在含有还原性谷胱甘肽和PGH2条件下培养mPGES_l多肽和受试物质，在该条 件下PGE2正常产生；和(b)确定PGE2的产量。 mPGES-Ι的PGH2底物可以通过培养C0X-2和AA来提供，所以这些可能在测量媒介中提供以产生PGH2。
此外，mPGES-1催化从环式内氧化物形成立体特异性的9_酮，11 α羟基前列腺素，且其他mPGES-Ι底物可用于mPGES-1的活性测定，和对受试化合物活性的影响，通过适当产物的产量来测定。底物产物PGH2PGE2PGH1PGE1
PGH3PGE3PGG215(S)氢过氧(hydroperoxy) PGE2PGG1IS(S)SilftPGE1PGG315(S)氧过氧PGE3如前所述，底物可以是上述的任意一种，或本领域技术人员认为适合的任意的其 他底物。这可能是PGH2,及其以PGE2形式存在的产物。本发明的测定方法，产物的产量可以通过量化底物的水平和/或量化的产物的水 平测量。测定结束后或测定反应被终止时的任何剩余的底物，通过加入氯化铁或加入氯化 亚锡可以被分别转换成12-羟基十七三烯酸(12-hydroxyh印tadeca trienoicacid)和丙 二醛酸或PGF2Ci。因此，这些化合物的含量进而间接的反映了 PGE2W形成。量化这些化合 物是一种确定产物产量的方法，通过量化剩余底物的量。剩余底物水平越大，产物的产量就 越低。mPGES-Ι抑制剂可以通过测定PGE2或其他产物(取决于使用的底物)减少的产量 被鉴定(或推测为mPGES-1抑制剂的候选物质可以像这样被确定)，与不应用受试物质的对 照实验相比。因此，在含有受试物质时的产物产量可以与不含受试物质时的产物产量相比。 产物水平较低，或形成产物的比率较低表明该受试物质具有抑制mPGES-Ι活性。因此，受试 物质可以被确定为用于治疗哺乳动物呼吸障碍的药剂。产物的测定可使用HPLC，UV光谱测定法，放射性检测，或RIA(如用于检测PGE的 市售RIA试剂盒)。产物的结构可以通过气相色谱(GC)或质谱(MS)，或放射性扫描TLC来 分析。本发明方法中使用mPGES-Ι蛋白，不必使用整个(全长)mPGES_l蛋白质序列。本 发明的对两种分子间结合或对PGE合酶活性的测定方法可以使用片段或变异体。片段可以通过本领域已知适合的方法制得和使用。产生片段适当的方法包括但不限于，从编码DNA 的片段重组表达。这些碎片可以通过编码DNA，确定表达合适限制性内切酶识别位点任一 侧的部分，并从DNA切割出所述部分制得。然后该部分可以在标准的可商业购买的表达系 统中可操纵地连接至合适的启动子。另一种重组方法是使用适合的PCR引物扩大DNA相关 部分。小片段(如高达约20或30个氨基酸)也可使用本领域已知的肽合成方法产生。 mPGES-1的活性部分可用于测定方法中。mPGES-1多肽的“活性部分”可用于本发明的方法。活性部分是指肽，其短于完整 长度多肽，但保留了其基本的生物活性。特别是，活性部分保留了在含有谷胱甘肽的条件下 催化从PGH2合成PGE2的能力。EP3R 检测本发明涉及确定受试物质，可能是候选的化合物或组合物，是否具有EP3R抑制活 性的测定方法，其中将确定具有EP3R抑制活性的受试物质鉴定为用于治疗呼吸障碍的物 质。在一些实施方案中检测方法包括将EP3R的多肽与受试物质和EP3R激动剂相接触，在不含受试物质的情况下，EP3R 激动剂会活化EP3R多肽；和测定含有受试物质时的EP3R多肽活化水平，与不含受试物质时的EP3R多肽活化 的对照水平相比，其中与所述对照水平相比，含有受试物质时的EP3R多肽活化的更低水平表明受 试物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。EP3R激动剂可以是自然存在的激动剂，如PGE2,或也可能是合成的激动剂。一 系列的EP3R激动剂可商业购买，例如从Biomol公司。一个特征明确的例子是硫前列 酮(Sulprostone)(参 JAL :http://www. caymanchem. com/app/template/Product. vm/ catalog/14765)。EP3R多肽的活化可能是在受体蛋白中构象变化从而导致耦合至G蛋白的 结果。EP3R多肽的活化可以是通过监测对腺苷酸环化酶活性的影响来检测。例如，在基于 细胞的检测中，出现于细胞表面的EP3R多肽活化可以通过监测细胞中cAMP浓度的增加或 降低来检测。在一些实施方案中EP3R多肽出现在细胞表面，其中EP3R与报告因子耦合。该报 告因子提供了受体活化的指标。例如，报告因子可能包括在EP3R-介导信号通路中的EP3R 下游的物质。通过监测这种下游物质水平的任何变化，可以监视EP3R的活化。该报告因子 可以通过许多技术包括检测荧光或放射性标记中的任何一种来监测。在某些实施方案中， EP3R通过G-蛋白与腺苷酸环化酶偶联，从而调节cAMP的产生。通过监测含有或者不含受 试化合物时响应EP3R激动剂的cAMP水平，可以确定受试化合物作为EP3R多肽拮抗剂的能 力。人EP3R的活化可以导致[cAMPh的减少和[Ca++]i的适度增加。因此，EP3R激动剂可 以引起细胞内[cAMP]的降低和/或细胞内[Ca++]的增加。这可以被监测，例如使用基于 FLIPR的检测。EP3R拮抗剂可以阻止或限制任何EP3R激动剂诱导的细胞内[cAMP]降低和 /或细胞内[Ca++]增加。体内筛选本发明涉及鉴定用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质的方法。该方法可应用一种或
31多种已知抑制或被认为抑制诱导PGE2通路的受试物质。 因此，本发明涉及鉴定用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质的方法，包括 将受试物质给予受试哺乳动物，其中受试物质是EP3R抑制剂，mPGES-1抑制剂和/
或C0X-2选择性抑制剂；和与未给予受试物质的对照哺乳动物的指标或症状相比，测定受试哺乳动物呼吸障 碍的指标或症状的严重程度，其中与对照哺乳动物相比，受试哺乳动物中呼吸障碍的指标或症状更低的严重程 度，表明测试物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。例如，测试物质可以是发现具有抑制一种或多种下列能力的物质(a) C0X-2 介导的 PGH2 合成；(b)mPGES-1介导的mPGES_l的环内过氧化物底物转化为底物的9_酮、11 α基体
羟基形式的产物；和(c)EP3R激动剂介导的EP3R活化。鉴定受试物质是EP3R抑制剂，mPGES-Ι抑制剂或C0X-2的选择性抑制剂的方法将 进一步描述。鉴定作为EP3R抑制剂，mPGES-Ι抑制剂或C0X-2选择性抑制剂的受试物质可 在体内筛选前作为先行阶段进行。这样大多数化合物可被体外筛选其想要的药理学活性， 那些发现具有想要的药理学活性的化合物接着进行体内筛选。EP3R抑制剂，mPGES-Ι抑制 剂和C0X-2选择性抑制剂将进一步描述。呼吸障碍的指标和症状可包括呼吸抑制，呼吸暂停频率，缺氧后自我恢复的受损， 呼吸频率的降低，潮气量的降低和/或因缺氧而起的喘气减少。对指标和症状的严重程度 的确定可包括测量受试/对照哺乳动物在暴露于低氧张力，缺氧后和/或对受试/对照哺 乳动物给予IL-I β，脂多糖(LPS)或PGE2后的指标和症状。如本文所用，呼吸障碍的指标或症状严重程度减轻，意味着这些指标或症状可能 减少对哺乳动物的伤害。例如，当该方法涉及在给予IL-I β后检测呼吸暂停的频率时，低 的呼吸暂停频率和/或更短的呼吸暂停发作将被认为是指标或症状的严重程度的减轻。在此将进一步描述监测呼吸障碍指标或症状的合适技术。例如，该方法可以使用 体积描记法或阻抗呼吸描记法。该方法可使用允许改变其中氧张力的气控室。优选，该室 是可温度控制的。或者，测定呼吸障碍的指标或者症状可以包括监测脑干呼吸活动，如使用从受试/ 对照哺乳动物分离的脑干_脊髓标本。脑干呼吸活动可以通过如本文进一步描述的电极来监测。当该方法涉及使用从 受试/对照哺乳动物分离的脑干_脊髓标本检测脑干呼吸活动时，受试物质可以是在脑 干_脊髓离体之前给药或者在从受试/对照动物分离之后直接给药至脑干_脊髓标本。本发明的方法可以使用活体外脑干脊髓整块的标本或脑干切片标本。所述标本允 许平行监测激动剂和/或拮抗剂的细胞，网络，和行为的影响，例如诱导PGE2通路和环境的 变化。该方法可进一步结合如本申请所述的原位置和体内的方法。可以通过改变环境例如 降低O2的浓度如缺氧来实现诱导呼吸暂停。替代地或另外地，可以通过药物或麻醉处理例 如阿片样物质受体激动剂和/或升高cAMP药物包括福司柯林(forskolin)来实现诱导呼 吸暂停。
受试哺乳动物和对照哺乳动物可以是啮齿类动物，它们分别优选大鼠或小鼠。该 方法优选用于鉴别用于治疗人呼吸障碍的试剂。本发明的方法可包括使用气压计的或流动体积描计法技术确定呼吸障碍的指标 或症状的严重程度。这种技术优选受试和对照的哺乳动物是啮齿类动物，例如大鼠或小鼠 的情况。在某些实施方案中，测试哺乳动物可能是人。在这种情况下，确定呼吸障碍的指标 或症状的严重程度可以包括使用多导睡眠图(polysomnigraphic)记录方法。受试哺乳动物和对照哺乳动物优选经受同样的条件，除了对照哺乳动物不含受试 物质之外。优选，对照药剂如生理盐水溶液用于对照哺乳动物中，且优选通过与给药受试物 质的受试哺乳动物相同的途径给药于对照哺乳动物。在某些实施方案中，受试哺乳动物和对照哺乳动物可以是相同的动物。在这种情 况下，测定受试动物呼吸障碍指标或症状的严重程度，与未给药受试物质的对照哺乳动物 的指标或症状相比，其执行可通过首先在给药受试物质之前测定哺乳动物呼吸障碍指标或 症状的严重程度(“对照阅读”)，其次在给药受试物质之后测定哺乳动物呼吸障碍指标或 症状的严重程度(“测试阅读”)。然后可进行比较该对照阅读和测试阅读，其中测试阅读 比对照阅读的严重程度较低表明该物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。使用相同的 动物作为受试哺乳动物和对照哺乳动物可以是优选的，当哺乳动物为人时，例如在临床研 究阶段。以下以实施例的方式提出且其不能被解释为对本申请权利要求范围的限制。 实施例材料及方法动物使用同系繁殖的 DBA/1 IacJ 系(η = 158) (JacksonLaboratory, BarHarbor, ME) 和C57BL/6系(η = 75) (Dr. Beverly Koller提供，北卡罗莱纳州教堂山大学，北卡罗来纳 州)新生小鼠。微粒体前列腺素E合酶l(mPGES-l)和EP3受体(EP3R)基因在基因敲除小 鼠中被选择性敲除，如前所述(47，48，两者都明确被引入本申请作为参考)。所有动物试验 后都通过断头立即处死，并通过PCR和Southern印迹分析进行基因分型。从一些野生型 DBA/llacJ小鼠获得的数据包括在新生的DBA/llacJ小鼠的呼吸行为特征中(6)。所有小 鼠在12小时白天12小时昼夜循环的标准化条件下饲养。无限制地提供食物和水。受试人婴儿(平均胎龄32士2周)来自在卡罗林斯卡大学医院的新生儿重症监护治疗 病房的婴儿(产后平均年龄16士4天)(η = 12)。因为临床适应症而遭受了腰椎穿刺并得 到了书面同意的婴儿是合适准入的。这些研究依据欧洲共同体的准则完成，且经过区域伦 理委员会批准。因为临床适应症如疑似感染，神经系统的变化，和心肺问题遭受了腰椎穿 刺的婴儿是合适准入的。有脑室出血(等级>2)，脑白质病(PVL-脑白质软化症)，癫痫 (seizures)，出血后脑积水，或先天性畸形的婴儿被排除在外。有关医学资料记载，包括新 生儿分娩的数据，医疗条件，感染性标志物，呼吸治疗，和药物。在进行腰椎穿刺后在18小 时内进行心肺记录(平均4. 8士 1. 7小时)。药物
重组小鼠白介素-1β (IL-1 β) (Nordic Biosite AB，Hby, Sweden)重新溶解在 灭菌 NaCl 中以制得 1 μ g/ml 工作液。前列腺素 E2(PGE2) (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI,USA)用人工CSF(aCSF)稀释至浓度为2nmol/y 1以用于体内实验和20 μ g/1 (60nM)以 用于体外实验。无限制全身流体积描记法将树脂玻璃箱(35ml)连接至高度敏感的直接气流传感器(0-200ml/min ； TRN3100, Kent Scientific Corporation, Litchfield，美国康涅狄格州)。该流动信号通 过四通道放大器(P/N 770S/N 5 ； SENSE lab, SomedicSales，H0rby,瑞典)放大，转换为数 字信号，并在 IOOHz 通过使用 DasyLab 软件(Datalog GmbH 和 Co. KG, Monchengladbach, 德国)的在线计算机进行记录。计算呼吸频率(fK，呼吸/min)，潮气量(VT，μ 1/呼吸)，和 每分钟通气量(VE，μ 1/min) 0依据记录的对新生小鼠热平衡范围，将箱子通过浸入水浴槽 内使箱子温度保持在30. 1 士0.1 °C (49)。如前所述，箱子通过使用预置的精密刻度注射器 (Hamilton Bonaduz AG，瑞士)重复注射标准化量的空气(5-200 μ 1)进行标定(6)。95% 的气体交换发生在给药的35秒内，其通过CO2含量分析验证(Metek⑶-3Α和S-3A，美国宾 夕法尼亚洲)。阻抗呼吸描记法婴儿心肺活性使用阻抗呼吸描记法非侵入性地进行测定和经由事件监测系统 (KIDS, Hoffrichter GmbH，Schwerin，德国)进行记录。监视器根据程序记录基线呼吸率， 以及超出呼吸暂停阈值的事件。呼吸暂停定义为在前0. 5秒时的的平均阻抗信号振幅> 10 秒的减少至前25秒期间测得的平均振幅小于16%。在事件之前和之后60s的时期也存储 在监控器数据库中。 腹腔注射IL-I β或NaCl后的体积描记法使用流体体积描记法检测mPGES-1和EP3R各自的不同表达的9日龄的DBA/llacJ 小鼠(η = 143)和C57BL/6小鼠(η = 16)的呼吸。每只小鼠接受腹膜内注射(0. 01毫升/ 克)IL-I β (10微克/公斤)或载体。在70分钟时，将小鼠无限制地放在体积描计器箱子 内。在4分钟的常氧环境(21% O2)后接着1分钟的高氧(100% O2)后评估呼吸。在5分 钟的常氧恢复阶段后，检查缺氧(IOO^N2)的呼吸反应。最后，给予100% O2 8分钟，并评 价自动复苏的能力。在基线，70分钟时，从箱子取出后记录皮肤温度。由于直肠探针的放置 可能改变呼吸行为所以不测量直肠温度，性别相近的测量肛门与生殖器间距离。脑室内注射PGE2或载体后的体积描记法使用流体体积描记法对EP3R不同表达的9日龄C57BL/6小鼠(η = 38)检测呼吸。 给药七氟烷麻醉后约60秒，PGE2 (4nmol在2-4 μ 1 aCSF中)或载体使用连接着聚乙烯管道 的薄壁拉出玻璃滴管被缓慢的注射入侧脑室。然后将小鼠立即放在体积描记器箱子内。在 常氧环境经过10分钟的恢复时期后，将小鼠暴露于上文所述的高氧和缺氧的挑战中。使用 热敏电阻温度探头记录基线和之后每分钟的动物皮肤温度。脑干呼吸活动从如前所述的具有EP3RV+和EP3R+基因型的2日龄C57BL/6小鼠迅速分离脑 干-脊髓标本(η = 11)(50，51，两篇文献都明确地引入本申请作为参考)。通过玻璃抽吸 电极在C4腹侧根监测与吸气节奏相对应的呼吸_有关的活动，记录(5kHz)，并脱机分析。对照记录进行至少20分钟，然后灌注含有PGE2的aCSF，随后是aCSF清除期。mPGES-1活动的测量新生小鼠大脑(η = 33)在含0. 25Μ蔗糖，IX竞争性蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics)和ImM还原型谷胱甘肽的0. IM KPi (无机磷酸钾)缓冲液中经过均勻加工处 理后进行超声处理。膜部分通过亚细胞分级分离得到。在膜部分如前面所述测定mPGES-1 活性(52，其公开的内容明确地引入本申请作为参考)。免疫组织化学断头处死9日龄野生型和EP3R敲除小狗后迅速切下脑干，固定在4%多聚甲醛 中，并过夜冷冻保护在含15%蔗糖，pH7. 4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。接着将脑干迅速 冷冻，在低温恒温器(Leica CM3050S, Leica Microsystems Nussloch GmbH)内收集 14 微 米横向切片。切片在空气中干燥，再用PBS水化，使用0. 3%过氧化氢抑制内源性过氧化物 酶10分钟。随后使用PBS洗涤后，该切片在含5%山羊血清中(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)，1 % 牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)，和 0· 3 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich)的PBS中封闭和渗透化处理45分钟，随后使用兔NK-IR抗体 (1 20，000稀释度；Sigma-Aldrich)孵育过夜。随后切片使用PBS洗涤和用1 50稀 释度的生物素化二抗(goat anti-rabbit ；Vector Laboratories, Burlingame, CA)培养。 在孵育1小时之后，冲洗切片和使用过氧化物酶结合的Vectastain ABC(1 100稀释度； Vector Laboratories)孵育30分钟，随后使用Cy3结合的酪氨酸酰胺(Tyramide)信号放 大(TSA，1 50 ；PerkinElmer，Boston，MA)2分钟。该反应在PBS中停止并使用含5%驴血清 (Jackson)，牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)，和 0. 3% Triton X-IOO(Sigma-Aldrich) 的PBS封闭45分钟。随后切片使用1 50稀释度的兔EP3R抗体(Cayman Chemical, MI)在4°C过夜孵育。次日，该切片用PBS冲洗和使用Alexa 488-结合的二抗(donkey anti-rabbit ；分子探针)孵育1小时。在使用PBS冲洗之后，该切片被包埋在Vectashield Hard Set包埋剂(Vector Laboratories)中。为了排除可能出现交叉反应的风险，将一抗逐 步滴定以确定最佳稀释度，且包括省略各自一抗的对照载玻片。此外，来自EP3R敲除小鼠 (η = 4)的脑干切片的研究通过使用带有标准NKlR染色的上述方案，但没有检测到EP3R。 照片使用ImageJ软件处理(NIH，Bethesda, MD)。CSF分析和心肺记录使用标准化酶联免疫分析(EIA)方案(CaymanChemicals, Ann Arbor, MI, USA) 分析脑脊液试样中的PGE2和PGE2代谢产物。刚完成腰椎穿刺就立即记录婴儿的心肺记录 (平均记录持续时间9. 2士2. 4小时)。在腰椎穿刺前12小时内也记录血液中感染标志物 (例如，C反应蛋白，白血细胞)的浓度。体积描记仪数据分析没有移动伪像(movement artefact)的平静呼吸周期，被选作分析。对在常氧和 高氧以及缺氧反应(即高通气，原发性呼吸暂停，喘气，继发性呼吸暂停，和自动复苏)的平 均fK，Vt和Ve值进行如上文所述的分析(6，其披露的内容明确地引入本申请作为参考)。记 录所有动物的存活率。呼吸暂停是指停止呼吸大于等于3个呼吸周期。呼吸的规律使用变 异系数(C. V.)来定量化(即在60秒周期中SD除以呼吸-呼吸间隔的均值)。婴儿心肺数据分析
监控软件是用来报告基线呼吸率和可视化所有心肺事件。确定呼吸暂停指数(Al， 呼吸暂停次数/小时的记录)。评价心肺活动，感染状况，和CSF中PGE2水平的相互关系。 分析不包括所有人为的活动。脑干-脊髓标本脑干是在第六根颅神经和斜方体稍下部边缘之间经嘴沿去除大脑的，使脑桥被移 除。标本在1. 5ml箱子里28°C连续的灌注人工脑脊液(aCSF) :130mMNaCl, 3. 3mM KC1，0. 8mM KH2PO4,0. 8mM CaCl2,1. OmM MgCl2, 26mMNaHC03，和 30mMD-葡萄糖(流速，3_4ml/min)。使用 95% O2和5%的CO2使溶液持续保持平衡在ρΗ7· 4 (50，51)。体积描计器数据分析由于缺氧反应是根据年龄而变化的(53)，我们试图在Ρ9年龄进行所有记录 ’然 而，在努力减少混淆的年龄相关的影响，体重用作与年龄的关联，只有体重在种群平均体重 ISD之内的动物才包括在缺氧和生存分析中(6)。动物特征在腹腔内注射IL-I β或NaCl后进行体积描记实验，mPGES-l+/+小鼠比显示出 比mPGES-1+小鼠较低的重量(分别为4.4士0. Ig比4.9士0. Ig)。动物性别上没有差 异。这两组间的动物在基线(34. 7士0. TC )和注射后70分钟(34. 8士0. TC )的皮肤温 度是相似的。缺氧后，mPGES-l+A小鼠表现出比mPGES-Ι+小鼠较高的皮肤温度(分别为 32. 2士0. 1°C比31.4士0. 2°C )。在C57BL/6小鼠，动物体重(4. 5士0. Ig)，动物性别，基准 温度(34. 4士0. 2°C )，70分钟时(34. 5士0. 5°C )或在缺氧后(30. 4士0. 1°C )的温度没有 差异。在脑室内注射PGE2或载体后的体积描记实验中，C57BL/6小鼠在动物性别和麻醉后 温度(31. 0士0. 20C )没有表现出差异。然而，EP3R+/+小鼠体重比EP3R+小鼠重(分别为 4. 9 士0. Ig 和 4. 1 士0. Ig)。测量 9 日龄 EP3R+"小鼠(η = 13)禾口 EP3R+ 小鼠(η = 26)脑 室内注射PGE2或载体后，在基线和常氧，高氧和缺氧时各分钟的皮肤温度。没有测量到皮 肤温度的明显差异，直到注射后在缺氧环境暴露的23分钟。在此时，EP3R+小鼠表现出比 EP3RV+小鼠低的皮肤温度(分别为30.9士0.3°C比31.8士0.3°C)。类似的温度差异，出现 在缺氧期间的30-31分钟时(分别为29. 8 士 0. 2°C比30. 4 士 0. 1°C )。统计通过正态分布和平均方差使用单向方差分析(ANOVA)来比较这些参数。通过 Student' s t 事后检验(Student' s t post-hoc test)进行多重比较。使用 WilcoxonX2 检验非参数测量和非高斯(non-Gaussian)分布数据。使用方差多变量分析(MAN0VA)重复 测量设计来验证变量随时间的变化。使用斯皮尔曼等级(Spearman' s Rho)相关检验，确 定变量之间的相关性。数据以均值士SEM表示。P <0.05的值认为具有统计学意义。实施例1 内源性脑干mPGES-1活性和紧张性(tonic)呼吸效应我们首先验证内源性PGE2产生和其对9日龄mPGES_lv+和mPGES_l+小鼠换气的 影响。野生型小鼠表现出基础的微粒前列腺素E合成酶1 (mPGES-1)活性，在均质脑干比在 均质皮质高(图1)。基因型之间在常氧时呼吸过程相似，虽然&趋向于在
比在 mPGES-l+ 小鼠{氐(Kruskal-ffallis, P = 0. 03 ；Student' s t post-hoc test, P = 0. 18)(表1)。通过1分钟的高氧挑战(100% O2,1分钟)检测中枢呼吸动力。两种基因 型小鼠对高氧的反应都是呼吸频率(fK)的减少(图2)。然而，mPGES-l+A小鼠的呼吸抑制比mPGES-1+小鼠更大(分别为27士2%比19士3% )。表1 在mPGES-Ι小鼠外周给药IL-I β后的常氧和高氧时的呼吸
权利要求
1.一种治疗哺乳动物受试者的呼吸障碍的方法，包括给该受试者施用组合物，所述组 合物包括E-前列腺素类受体亚型3(EP3R)抑制剂；微粒体前列腺素E合成酶-l(mPGES-l) 抑制剂；和/或环氧合酶_2(C0XD选择性抑制剂。
2.根据权利要求1的方法，其中组合物包含EP3R抑制剂。
3.根据权利要求2的方法，其中EP3R抑制剂是特异性结合成员，其与EP3R多肽或核苷 酸结合下调EP3R-编码基因表达。
4.根据权利要求2的方法，其中EP3R抑制剂是OE)-N-[(5-溴-2-甲氧苯基)磺酰 基]-3-[5-氯-2-(2-萘甲基)苯基]丙烯酰胺(L8^^66)或其药学上可接受的盐。
5.根据上述任一权利要求的方法，其中组合物包含mPGES-1抑制剂。
6.根据权利要求5的方法，其中mPGES-Ι抑制剂是特异性结合成员，其与mPGES-Ι多肽 或核苷酸结合下调mPGES-Ι编码基因表达。
7.根据权利要求5的方法，其中mPGES-Ι抑制剂是3_[叔-丁基硫-1-(4-氯苄 基)-5-异丙基-IH-吲哚-2-基]-2，2-二甲基丙酸(MK-886)或其药学上可接受的盐。
8.根据上述任一权利要求的方法，其中组合物包含选择性C0X-2抑制剂。
9.根据权利要求8的方法，其中C0X-2选择性抑制剂是特异性结合成员，其与C0X-2多 肽或核苷酸结合下调C0X-2编码基因表达。
10.根据权利要求8的方法，其中C0X-2选择性抑制剂是4-(5-甲基-3-苯基异噁 唑-4-基)苯磺酰胺(戊地昔布)或其药学上可接受的盐；4-[5-甲基苯基)-3-(三氟 甲基)吡唑-1-基]苯磺酰胺(塞来昔布)或其药学上可接受的盐；或4- -甲基磺酰基 苯基)-3-苯基-5H-呋喃-2-酮(罗非昔布)或其药学上可接受的盐
11.一种评估哺乳动物受试者易感或存在呼吸障碍的方法，包括在受试者的试样中检测前列腺素-E2(PGE2)或其代谢物的水平，和比较试样和对照中PGE2或其代谢物的水平，其中与对照中所述的PGE2或其代谢产物的水平相比，试样中的PGE2或其代谢产物升高 的水平表明受试者易感或存在呼吸障碍。
12.根据权利要求11的方法，其中试样包括尿样或脑脊髓液(CSF)试样。
13.根据权利要求11或权利要求12的方法，进一步包括检测受试者样品中C-反应蛋白(CRP)的水平，和比较试样和对照中的CRP水平，其中与对照中所述的CRP水平相比，试样中CRP升高的水平表明受试者易感或存在呼 吸障碍疾病。
14.根据上述任一权利要求的方法，其中呼吸障碍是呼吸暂停，周期性呼吸或缺氧事件 后的自动复苏失败。
15.根据上述任一权利要求的方法，其中呼吸障碍是发生在睡眠期间的呼吸障碍，特别 是阻塞性睡眠呼吸暂停综合征。
16.根据上述任一权利要求的方法，其中呼吸障碍是感染相关的呼吸障碍。
17.根据权利要求16的方法，其中感染相关的呼吸障碍是IL-Iβ相关的呼吸障碍。
18.根据权利要求14的方法，其中呼吸障碍是缺氧事件后的呼吸暂停。
19.根据权利要求15的方法，其中呼吸暂停是由缺氧事件诱导的。
20.根据上述任一权利要求的方法，其中哺乳动物受试者是人类受试者。
21.根据权利要求20的方法，其中人类受试者的年龄小于5岁。
22.根据权利要求21的方法，其中呼吸障碍是导致婴儿猝死综合征(SIDS)或增加其可 能性的障碍。
23.根据权利要求18或权利要求19的方法，其中缺氧事件是围产期窒息。
24.根据权利要求20的方法，其中人受试者的年龄大于18岁。
25.根据权利要求M的方法，其中呼吸障碍是成人睡眠呼吸暂停。
26.一种评估哺乳动物受试者易感或存在缺氧缺血性脑病(HIE)的方法，包括在受试者的试样中检测前列腺素-E2(PGE2)或其代谢物的水平，和比较试样和对照中的PGE2或其代谢物的水平，其中与对照中所述的PGE2的水平相比，试样中的PGE2或其代谢产物升高的水平表明受 试者易感或存在HIE。
27.根据权利要求沈的方法，包括与对照中PGE2或其代谢物水平相比，通过检测试样 中PGE2或其代谢物升高的水平的程度，对受试者HIE严重程度进行分级。
28.评估哺乳动物受试者已遭受围产期窒息的方法，包括检测在受试者试样中前列腺素-E2(PGE2)或其代谢产物的水平，和对比试样中和对照品中所述PGE2或其代谢产物的水平，其中与对照中所述的PGE2的水平相比，试样中的PGE2或其代谢产物升高的水平表明受 试者已经遭受围产期窒息。
29.根据权利要求观的方法，包括与对照中PGE2或其代谢物水平相比，通过检测试样 中PGE2或其代谢物升高的水平的程度，对已经遭受围产期窒息受试者的严重程度进行分 级。
30.根据权利要求沈至四任何一项的方法，其中试样是取自受试者出生后7天内的脑 脊髓液(CSF)，尿样或血样。
31.根据权利要求30的方法，其中试样取自受试者出生后的M小时内。
32.根据权利要求沈-31任何一项的方法，其中哺乳动物受试者是人受试者。
33.根据权利要求32的方法，进一步包括检测受试的人出生后30分钟内的Apgar评分。
34.根据权利要求33所述的方法，其中Apgar评分是在出生后的约1，5，10，15和/或 20分钟进行测量。
35.一种用于鉴定用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质的方法，包括分析受试物质抑制 以下一种或多种的能力(a)C0X-2介导的PGH2合成；(b)mPGES-l介导的mPGES-1的环式内氧化物底物转化的产品，其为底物的9-酮基、 Ila羟基形式；和(c)EP3R激动剂介导的EP3R活化，其中抑制(a)，(b)和(c)中的一种或多种，表明该受试物质是用于治疗哺乳动物呼吸 障碍的物质。
36.根据权利要求35的方法，包括将C0X-2多肽与受试物质和花生四烯酸相接触，在不含受试物质的情况下，花生四烯 酸会被C0X-2转换为PGH2 ；和测定含有受试物质下的PGH2产物水平，与不含受试物质的PGH2产物的对照水平相比，其中与所述对照水平相比，含有受试物质下的PGH2产物的更低水平表明该受试物质是 用于治疗哺乳动物呼吸障碍的试剂。
37.根据权利要求36的方法，包括与对照水平相比，测定含有受试物质下的PGH2产物 的更低水平，从而鉴定受试物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。
38.根据权利要求35的方法，包括将mPGES-Ι多肽与受试物质和mPGES-1的环式内氧化物底物相接触，在不含受试物质 的情况下，mPGES-Ι的环式内氧化物底物会被mPGES-1转换为底物的9-酮，11 α羟基形式 的产物；和测定在含有受试物质情况下产物生成的水平，与不含受试物质时的产物生成的对照水 平相比，其中与所述对照水平相比，含有受试物质时的产物生成的更低水平表明该受试物质是 用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。
39.根据权利要求38的方法，包括与对照水平相比，测定含有受试物质时的产物生成 的更低水平，从而鉴定受试物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。
40.根据权利要求35的方法，包括将EP3R的多肽与受试物质和EP3R激动剂相接触，在不含受试物质的情况下，EP3R激 动剂会活化EP3R多肽；和测定含有受试物质时的EP3R多肽活化水平，与不含受试物质时的EP3R多肽活化的对 照水平相比，其中与所述对照水平相比，含有受试物质时的EP3R多肽活化的更低水平表明该受试 物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。
41.根据权利要求40的方法，包括与对照水平相比，测定含有受试物质时的EP3R多肽 活化的更低水平，从而鉴定该受试物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。
42.一种鉴定用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质的方法，包括将受试物质给予受试哺乳动物，其中受试物质是EP3R抑制剂，mPGES-Ι抑制剂和/或 C0X-2选择性抑制剂；和与未给予受试物质的对照哺乳动物的指标或症状相比，测定受试哺乳动物呼吸障碍的 指标或症状的严重程度，其中与对照哺乳动物相比，受试哺乳动物中呼吸障碍的指标或症 状更低的严重程度，表明测试物质是用于治疗哺乳动物呼吸障碍的物质。
43.根据权利要求42的方法，其中所述指标和症状选自呼吸抑制，呼吸频率降低，潮 气量减少和对缺氧的喘气反应减少。
44.根据权利要求42或43的方法，包括在测定指标或症状的严重程度前给予IL-Iβ 或 LPS。
45.根据权利要求35至44任意一项的方法，其中受试物质被鉴定为用于治疗哺乳动物 呼吸障碍的物质，和其中该方法进一步包括将该受试物质制备成含有药学上可接受的赋形 剂的组合物。
46.一种评估人类受试者缺氧和/或呼吸暂停的存在和/或严重程度的方法，包括 在获自受试者尿液试样中检测一种或多种PGE2代谢产物的水平，和对比试样中和对照品中所述一种或多种PGE2代谢产物的水平， 其中试样中所述的一种或多种PG&代谢产物的水平，与对照品中所述的一种或多种 PG&代谢产物的水平相比，超出至少为20%、至少为50%、至少为100%或至少为200%以 上，表明受试者缺氧和/或呼吸暂停存在和/或更严重。
47.根据权利要求46的方法，其中人受试者患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)， 自主神经功能障碍诸如帕-魏二氏综合征，先天性低通气综合征或雷特氏综合征。
48.根据权利要求46或47的方法，其中受试人的年龄大于16岁。
49.根据权利要求46或47的方法，其中受试人的年龄介于1至16岁之间。
50.根据权利要求46或47的方法，其中受试人的年龄介于0至1岁之间。
全文摘要
本申请披露了通过在哺乳动物受试者中抑制诱导PGE2通路来治疗呼吸障碍的方法；通过检测来自受试者的试样并与对照水平相比，所述试样中PGE2或其代谢物升高的水平来评估呼吸暂停、缺氧缺血性脑病或围产期窒息的方法；和体内和体外筛选用于治疗呼吸障碍的药物的方法。
文档编号A61K31/18GK102036713SQ200880124409
公开日2011年4月27日 申请日期2008年11月12日 优先权日2007年11月12日
发明者A·霍夫施泰特罗森, E·赫勒尼斯, P-J·雅各布森 申请人:圣莎拉医学股份公司