专利名称：：hCRF及其衍生物在制备治疗格林巴利综合征药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及hCRF及其衍生物在制备治疗格林巴利综合征药物中的应用。
背景技术：
：格林巴利综合征(Guillian-BarreSyndrome)又称急性特发性多祌经炎或对称性多神经根炎，是常见的脊神经和周围神经的脱髓鞘疾病，1916年由Guillian和Barre两位学者首先报告而得名，临床上表现为进行性上升性对称性麻痹、四肢软瘫以及不同程度的感觉障碍。患者成急性或亚急性临床经过，多数可完全恢复，少数严重者可引起致死性呼吸麻痹和双侧面瘫。国内文献报导格林巴利综合征死亡率为14%-42%(白法毅，王维平，等.格林巴利综合征综合征1287倒分析(摘要).中华神经精神科杂志.1992:(1):30.)。其中呼吸肌无力引起的通气障碍性呼吸衰竭是格林巴利综合征致死的主要原因。因此加强呼吸道管理，保证呼吸功能，降低死亡率是格林巴利综合征治疗的一个重要方面。目前认为通过呼吸机辅助呼吸，并进行呼吸道管理，保证呼吸通畅是最有效的治疗措施，但是人工气道建立后，呼吸道加湿加温功能丧失，纤毛运动功能减弱，会造成分泌物排出不畅，引起呼吸道'痰液贮留、肺不张，也会增加呼吸道感染的机会，其中机械通气相关性肺炎是呼吸机辅助呼吸中常见的引发肺部感染。同时因患者长期活动受限，机械通气时，不能进行交流，不能经口进食，导致病人产生焦虑和孤独感，对机械通气产生依赖，丧失对疾病治疗的信心。hCRF即人促肾上腺皮质激素释放因子，是一种含41个氦基酸的多肽，其氨基酸序列为Ser-Glu-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Ala-Arg-Ala-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Met-Glu-Ile-Ile-NH2。其在协同大脑和大脑周边作用的整个应激反应方面起重要作用。在大脑中，CRF主要由丘脑下核旁室的小细胞性神经元产生和分泌，CRF-含有的神经元发射到正中隆起的毛细管入口区并刺激促肾上腺皮质激素(ACTH)、e-内啡肽和其它的来自脑垂体的阿黑皮素的分泌。随后ACTH-诱导的糖类肾上腺皮质激素的释放代表了在下丘脑-脑垂体-肾上腺轴(HPA)的最后阶段，调节内分泌应激反应。除了它的神经内分泌作用，CRF也具有神经传导和神经调节功能，引发生理学刺激、药理学刺激和病理学刺激的自发反应、行为反应和免疫反应。临床研究表明，CRF分泌过多与多种疾病有关，如严重抑郁症、焦虑相关的疾病、饮食紊乱和炎症性紊乱。在Alzheimer疾病、痴呆、肥胖和许多内分泌疾病中观察到了低水平的CRF。因此，与高水平或低水平CRF有关的相反影响策略，提供了治疗与异常CRF水平有关的疾病的药物设计的根据。现有技术中已有将hCRF用于脑水肿治疗的研究，但尚未有将hCRF及其衍生物用于制备治疗格林巴利综合征药物的研究和报道。
发明内容针对上述现有技术，本发明提供了hCRF及其衍生物在制药中的一种新用途。本发明实质上是hCRF及其衍生物在制备治疗格林巴利综合征药物中的应用。所述hCRF的有效剂量为1100iig/Kg体重，优选210ug/kg.体重。所述衍生物为hCRF的天然氨基酸取代衍生物。所述衍生物为hCRF的非天然氨基酸取代衍生物。所述衍生物为hCRF的PEG化修饰衍生物。所述衍生物为hCRF的PLA化修饰衍生物。、上述衍生物通过对hCRF的取代和修饰可以增强hCRF疗效，改善hCRF的生物利用度和药物代谢动力学特征，这对本
技术领域：
的技术人员而言是显而易见的。使用时，将hCRF及其衍生物制成注射剂注入动物体内即可。本申请的发明人经实验证明，hCRF及其衍生物是非常高效的呼吸兴奋药，对格林巴利综合征呼吸机能有明显的改善作用。与使用呼吸机辅助呼吸的方法相比不仅可以保持和提高纤毛运动功能，减少分泌物排出不畅引起的呼吸道痰液贮留、肺不张，并降低增加呼吸道感染的机会。本发明通过利用hCRF及其衍生物对呼吸机能的调节作用所产生的呼吸兴奋，从而改善格林巴利综合征呼吸无力的症状，降低格林巴利综合征死亡率，具有良好的应用前景。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明范围。'实施例l:hCRF对兔呼吸作用的影响新西兰大耳白兔20只，6-12月龄，体重3-4kg。随机分为两组，每组10只。对照组给予0.9%生理盐水2ml，试验组静脉注射hCRF4ng/kg。给药前hCRF溶于2ral无菌生理盐水中。用呼吸速率描记仪连续测定通气量(呼吸频率和潮气量)。各组动物呼吸达到稳态后开始测量呼吸频率和潮气量，测定期为40min。实验结果釆用T检验进行比较分析，P<0.05认为差别4有显著意义，结果如表l所示。表lhCRF对兔呼吸频率和潮气量的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*与对照组相比P〈0.01。由以上实验结果可见hCRF对新西兰大耳白兔的呼吸功能尤其是潮气量有明显的刺激作用。实施例2:hCRF呼吸兴奋作用的机理研究一家兔用乌拉坦麻醉，切断迷走神经，使之麻痹，进行机械通气。将hCRF通过注入其第四脑室。记录其神经元潮气量nVt变化状况。发现nVt增加，但对呼气期持续时间没有影响。采用显微注射法将hCRF注入脑桥臂旁区腹侧，记录器呼气状态，发现nVt及呼吸频率均降低。用四氯吲哚胺阻断祌经节传导后，hCRF的作用未收到显著影响。以上结果表明，hCRP可能通过中枢神经调节呼吸运动，起到呼吸兴奋作用。实施例3:hCRF对格林巴利综合征模型动物的药效学研究猎熊犬，8只，体重28-33kg，雌雄不拘。随机分为两组，每组4只。各组动物按照5mg/kg剂量静脉注射氯胺酮麻醉，皮下注射莞熊唾液分泌物2ml。用呼吸速率描记仪连续测定呼吸'频率和潮气量。用对照组给予0.996生理盐水2ml，实验组给予5ug/kghCRF，给药前hCRF溶于2ml无菌生理盐水中。安慰剂及药物均在皮下注射莞熊唾液分泌物后迅速给予，待猎熊犬-苏醒后在第O、2、4、8、16、32天测量呼吸频率和潮气量。同时用肝素液湿润全部内壁的一次性注射器采集后肢动脉血样，立即将注射器针头插入带有肝素生理盐水的一次性针头帽里以隔绝空气。血样本用英国CIBACORNING238型血气分析仪测定动脉血氧分压(PaO)、动脉血二氧化碳分压(PaC02)，并观察其观察兔精神状态、肢瘫、腱反射、饮食、尿便失禁、体重等体征。记录其呼吸频率、潮气量、死亡率，结果见表2。结果各组动物皮下注射莞熊唾液分泌物后均出现精神萎糜、饮食差、四肢无力、双后肢为著、腱反射减弱，并出现呼吸困难症状，对照组动物死亡率为25%(1/4),实验组死亡率为0%。死亡原因均为呼吸衰竭。对照组及实验组动物呼吸频率(次/分)分别为18±2vs23±5;潮气量(ml)分别为321±4vs601±9。动脉血氧分压(mmHg)分别为20.03±2.62vs48.55士3.67;动脉血二氧化碳分压(mmHg)分别为45.32±1.26vs23.64±1.43.两组动物在-潮气量、动脉血氧分压、动脉血二氧化碳分压上有显著差异，表明hCRF可明显提高格林巴利综合征模型动物的潮气量和动脉血氧分压，而降低动脉血二氧化碳分压，有利于改善格林巴利综合征的呼吸障碍。从而降低格林巴利综合征的死亡率。表2hCRF对格林巴利综合征模型动物的药效学研究死亡率呼吸频率潮气量动脉血氧分动脉血二氧化碳分压压对照组25%18±2321±420.03±2.62.45.32土1.26实验组0%23±5601±9*48.55±3.6723.64±1.43**与对照组相比P〈0.01实施例4:hCRF聚乙二醇化衍生物的制备I.Oml含20mghCRF的缓冲液，按lmolhCRF使用51mol聚乙二醇(10kDa)的比例加入聚乙二醇的丁醛，向混合物中加入10%(V/V)的氰基氢硼化钠，室温下搅拌4小时，用离子交换层析纯化反应混合物中的聚乙二醇化的hCRF。实施例5:hCRFPLA化衍生物的制备取0.5gPLA-COOH和30mghCRF,预先冻干2小时，在氮气保护下，加入50ml的圆底烧瓶中，用20ml氯仿溶解，再加入0.6ml吡啶和0.3ml苯氧基磷酸氯，室温下磁力搅拌反应24小时，反应完全后用1N盐酸冲洗，每次用25ml，冲洗2次，减压浓縮即得hCRFPLA化衍生物。实施例6:hCRF氨基酸取代衍生物的制备采用多肽合成仪，从C端(羧基端)向N端(氨基端)逐步合成，所用氨基酸为hCRF序列所含氨基酸及"甲基化氨基酸、Na-O环化氨基酸、d，a'-二烷基甘氨酸和a-氨基环烷羧酸、"-氨基酸、Na-甲基化氨基酸、a，e-不饱和氨基酸、e-和Y-氨基环烷羧酸、e，P-二甲基和e-甲基氨基酸、P-置换-2，3-亚甲基氨基酸、Glu-Glu、Lys-Lys、Ser-Gly-Ser中的一种或几种，取代其原序列中的一种或几种氮基酸，即可得到hCRF氨基酸取代衍生物。保护基采用Fmoc保护，以TFA脱保护。权利要求1.hCRF及其衍生物在制备治疗格林巴利综合征药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述hCRF的有效剂量为1100ug/kg体重。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述hCRF的剂量为210ug/kg体重。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述衍生物为hCRF的天然氨基酸取代衍生物。5.根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述衍生物为hCRF的非天然氨基酸取代衍生物。6.根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述衍生物为hCRF的PEG化修饰衍生物。7.根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述衍生物为hCRF的PLA化修饰衍生物。全文摘要本发明公开了hCRF及其衍生物在制药中的一种新用途，即hCRF及其衍生物在制备治疗格林巴利综合征药物中的应用。其有效剂量为1～100μg/Kg体重，优选2～10μg/kg体重。发明人经实验证明，hCRF及其衍生物是非常高效的呼吸兴奋药，对格林巴利综合征呼吸机能有明显的改善作用。与使用呼吸机辅助呼吸的方法相比不仅可以保持和提高纤毛运动功能，减少分泌物排出不畅引起的呼吸道痰液贮留、肺不张，并降低增加呼吸道感染的机会。文档编号A61K47/48GK101502643SQ20091001463公开日2009年8月12日申请日期2009年3月3日优先权日2009年3月3日发明者厉保秋申请人:山东大学