专利名称：一种组织工程化异种皮的制备方法
技术领域：
本发明属于组织工程学生物材料技术领域，具体涉及一种组织工程化异 种皮的制备方法。
背景技术：
严重的深度烧伤、皮肤缺损需要解决快速有效封闭创面的问题。目前临 床上治疗深度烧伤主要使用自体皮移植，这样就会增加新的创面。针对大面 积烧伤患者而言存在有自体皮源不足的问题，异体皮加自体微粒皮移植技术 是目前覆盖大面积深度烧伤创面最常用的有效手段，但是异体皮来源越来越 有限，那么研制一种皮肤替代物在大面积深度烧伤病人的救治中至关重要。 而严重创伤导致的大面积皮肤缺损也需面对上述问题。为了克服这些难题， 开展了多种在体外构建人工皮肤的研究。国外已经有成熟的人工皮肤产品上
巿,如Integra、 Alloderm、 Epicel、 Dermagraft、 Apligraft等的产品， 但由于价格昂贵、来源受限、制作时间长、保存时间短等多种原因影响，在 国内没有形成规模性应用。Integra作为一种人工合成真皮材料，已被较广 泛的应用于大面积烧伤的创面覆盖；其在一层硅膜的保护下，通过促进创基 毛细血管内皮细胞和纤维母细胞长入而"成活"，去掉硅膜，移植自体薄皮 片后可获得较好的功能和外观；缺点是需要二次自体皮移植治疗。Alloderm 是通过去除异体皮真皮层中的细胞成分而获得，也是促进创基毛细血管内皮 细胞和纤维母细胞长入而"成活"，其效果较好、免疫原性低，缺点是来源 受限、存在传播疾病的潜在可能。目前国内巿场上应用于临床的猪皮敷料主要有猪去细胞真皮基质、新鲜 猪皮、戊二醛猪皮、辐照猪皮、冻干猪皮。经动物实验和临床实践证明，猪 皮敷料存在有以下缺陷猪去细胞真皮基质缺乏表皮结构，应用时仍需自体
刃厚皮偿还覆盖，需要二次自体皮移植治疗，对患者形成新的损伤；新鲜猪
皮的抗原性较强，细菌污染率较高，用于切(削)痂创面后排斥较早，容易诱
发感染，创面裸露需二次手术；戊二醛猪皮的弹性较差，透水性高，应用于创 面后易干燥，不能与创面紧密粘附，皮肤新生血管生长缓慢；辐照猪皮和冻 干猪皮一样，粘附性差，无促进机体表皮细胞和真皮细胞的生长作用。这些 敷料虽能起到保护创面的作用，但均存在不同程度的缺点，尚不能取代异体 皮用于覆盖大面积深度烧伤切(削)痂创面，只能作为临时性覆盖物使用。 因此临床上迫切需要一种可供移植的皮肤替代物。其应具备'以下要求 1)良好的生物相容性和组织相容性；2)与正常皮肤两层结构相似，弹性好； 3)促进机体表皮细胞和真皮细胞生长，加快皮肤新生血管生长；4)有毛孔 便于引流，为促进自体表皮"穿过"真皮支架提供通道，实现自体表皮化； 5)安全可靠、无毒性，避免疾病传播；6)性状柔软湿润、粘附性好，便于 与创面紧密结合；7)真皮层支架永久性保留生长，防止因真皮层缺失而导 致瘢痕形成过重；8)价格低廉，适合于临床广泛应用。
发明内容
针对现有技术所存在的缺点，本发明的目的就是提出 一种组织工程化异 种皮的制备方法，使制备的异种皮能满足上述要求，适于临床治疗烧伤和创 伤引起的皮肤缺损。
本发明提出的组织工程化异种皮的制备方法，釆用来源丰富的仔猪为皮 源，经过取皮、表皮固定、切削、去除真皮层细胞、修饰三维胶原结构、改变物理性状、灭菌包装的步骤获得成品；具体操作包括以下步骤
步骤一，取检疫合格猪皮洗净，用0. 1%新洁尔灭浸泡15 30min,用水 充分清洗；再对猪皮表皮面单面釆用体积浓度为1~2%的戊二醛溶液固定 30 60min,用生理盐水充分冲洗，去除戊二醛残留；再去除真皮面多余脂 肪和结締组织，用片皮机从真皮面切削，切削时切除毛囊留毛孔，保留0. 2 ~ 0. 4mm厚度带表皮层和真皮层及毛孔的猪皮；最后用0. 1%新洁尔灭浸泡15 ~ 30min，灭菌水充分清洗；
步骤二，将经步骤一处理的猪皮的真皮面单面釆用生理盐水配制的 0.25 — 0. 5% (W/V)胰酶溶液浸泡，在37。C恒温摇床80 - 100转/分钟，消 化45 60min,超声波震荡30~60 min后，用灭菌水反复清洗；再置入含 有(V/V) 0. 5°/。硫酸庆大霉素的0. 5~1% TritonX-100(曲拉通)溶液中，于 37'C恒温摇床80 100转/分钟清洗24h,超声波震荡30 - 60 min去除残留 成分，用水充分清洗；再置入含有(V/V) 0. 5%硫酸庆大霉素的0. 5~1%SDS (十二烷基磺酸钠)溶液中，于37匸恒温摇床80 100转/分钟清洗24h, 超声波震荡30~60 min去除残留成分，用灭菌水清洗；再将其浸入0. 5 ~ 1 mol/LNaOH溶液中,于恒温摇床80 ~ 100转/分钟碱化处理15 min，去除残 留的成分，用灭菌水清洗；
步骤三，将经步骤二处理的猪皮双面浸泡于新鲜的体积浓度为0.2%的 戊二醛溶液中交联15 30min,生理盐水充分冲洗；通过该处理降低了免疫 原性，并使胶原原纤维再次交联融合恢复原有的三维胶原支架结构，修饰了 胶原的空间结构；再将猪皮放入柔化剂溶液中浸泡30 - 60 min进行柔化， 清洗后再放入保湿剂溶液中，37。C保湿处理30 60 min,生理盐水充分冲 洗去除残留；步骤四，将经步骤三处理得到的产品，根据临床需要裁剪为不同规格，
真空包装，钴60照射，在2-1(TC环境下可保存2年以上。
本发明所述对猪皮单面(表皮面/真皮面)的处理方法，可以釆用将猪
皮一面粘贴在平板上，放入处理液中，即可进行裸露面的处理，称为贴板法； 也可以釆用将猪皮对折，用夹子/卡子夹紧对折的敞口边，放入处理液中， 即可进行裸露面的处理，称为夹边法。
所述的柔化剂(用量为10~15%，同行熟知)可以选择十六烷基三甲基 氯化铵、或十六烷基三甲基溴化铵、或十七烷基-N氨乙基咪唑啉环氧丙烷 (柔软剂ES)、或十八烷基二甲基苄基氯化铵的任一种；所述的保湿剂(用 量为5~10%,同行熟知)可以选择丙三醇、或透明质酸(HA)吡咯烷酮羧 酸钠(简称PCA-NA)混合溶液、或天然二甲基氨酸脯氨酸、或十八烷基二 甲基氧化胺的任一种。
釆用本发明方法制备的组织工程化异种皮，通过动物实验和临床实践与 现有产品和技术相比，具有以下优点1)使用戊二醛完整固定表皮层使其 成为保护膜，能防止机体液体丟失；彻底脱除真皮层细胞使真皮层成为自体 皮生长的支架。2)在用片皮机切削猪皮的同时，可达到一并去除猪毛及毛 囊效果，利用猪皮天然的毛孔作为微孔可以促进自体表皮"穿过"真皮支架， 实现自体表皮化，加快皮肤新生血管的生长速度。在现有技术中人为地给异 体皮、人工复合皮、猪皮敷料打孔多釆用激光打孔，而激光对胶原结构产生 灼烧，形成微小的燋痂，使胶原原有的结构不完整，不利于细胞的生长；本 发明解决了激光打孔存在的弊端。3)猪皮的单面处理，在固定表皮层时可 避免戊二醛固定真皮层，在脱除真皮层细胞时可避免损伤表皮层，实现在完 整保留表皮层的同时去除真皮层细胞。4)通过脱除真皮层细胞、Triton和SDS清洗、以及两次戊二醛交联共同降低了免疫原性。5)使用柔化剂和保 湿剂增加本发明异种皮的柔软性和湿润性，与已有干、硬的猪皮敷料和现有 的人工皮肤相比，更便与创面粘附紧密，加快皮肤新生血管的生长速度，缩 短创面愈合时间。6)适用于烧伤、皮肤缺损，具有与自体皮结构相似的两 层结构，使用安全可靠、无毒，避免疾病传播；真皮支架永久性保留，可避 免因真皮层缺失而导致瘢痕形成过重，同时加快皮肤新生血管生长速度，缩
短创面愈合时间。7)本发明制备的产品生产周期短、保存时间长、而且价
格低廉，适合于临床广泛应用。
具体实施例方式
以下通过具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。
步骤一，选纯品系生物级别饲养3个月大小、体重30 50Kg的仔猪作 为皮源。取检疫合格(不含有猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒、流 行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、口蹄疫病毒)的猪皮剃毛洗净， 用0. 1%新洁尔灭(北京四环卫生药械厂生产)浸泡25min，用水充分清洗； 对猪皮表皮面(釆用贴板法)进行单面处理，将猪皮的表皮面浸泡入新鲜配制 的2%戊二醛溶液中交联固定40min (最好在搅拌条件下进行)，用生理盐水 冲洗(从贴板取下)，洗去戊二醛残留。之后去除真皮面多余脂肪和结締组织， 用片皮机均一地从真皮面切削，切削时一并切除毛囊留毛孔，保留0. 3mm厚 度带表皮层和真皮层及毛孔的猪皮。最后用0. 1%新洁尔灭浸泡25min后， 用灭菌注射用水清洗。
步骤二，经步骤一处理的猪皮(釆用夹边法)，将真皮面单面釆用生理 盐水配制的0. 3% (V/W)胰酶溶液浸泡，在37r水浴恒温摇床中100转/分 钟，消化50min，超声波震荡40 min后，用灭菌注射用水反复清洗；再置入含有(V/V) 0. 5%硫酸庆大霉素的1% TritonX-lOO溶液中，于37匸水浴 恒温摇床中80转/分钟清洗24h,超声波震荡50 min去除残留成分，用水 充分清洗；再置入含有(V/V) 0. 5%硫酸庆大霉素的0.8MSDS溶液中，防止 处理过程中细菌污染，于37。C水洛恒温摇床80转/分钟清洗24h，超声波震 荡40min去除残留成分，用灭菌水清洗；再将其浸入1 mol/L NaOH溶液中， 于恒温摇床80转/分钟碱化处理15 min，去除残留的成分，用灭菌注射用 水清洗(打开夹边)。
步骤三，将经步骤二处理的猪皮双面浸泡于新鲜配制的体积浓度为Q. 2% 的戊二醛溶液中交联20min,用生理盐水充分冲洗，洗去戊二醛残留液；通 过该处理降低了免疫原性，并使胶原原纤维再次交联融合恢复原有的三维胶 原支架结构，修饰了胶原的空间结构；再将猪皮放入10% (十六烷基三甲基 氯化铵)的柔化剂溶液中浸泡40 min进行柔化，清洗后再放入8%的(透明 质酸吡咯烷酮羧酸钠混合溶液)保湿剂溶液中，37'C保湿处理30min,最后 用生理盐水充分冲洗去除残留。
步骤四，将经步骤三处理得到的产品，根据临床需要裁剪为不同规格， 抽真空包装，U5 25KGy)钴60照射，在2 ~ l(TC环境下可保存2年以上。
经动物实验和临床实践证明，所制备的异种皮解决了已有人工皮肤产品 的价格昂贵、来源受限、制作时间长、保存时间短、二次植皮为机体带来损 伤的缺点；也解决了猪皮敷料缺乏表皮结构、抗原性较强、应用时仍需二次 自体皮移植又形成新的损伤、细菌污染率较高、用于创面后排斥较早形成创
面裸露、易干燥、容易诱发感染、弹性较差、透水性高，不能与创面紧密粘 附，无促进机体表皮细胞和真皮细胞生长、和皮肤新生血管生长缓慢的缺点。
权利要求
1、一种组织工程化异种皮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤一，取检疫合格猪皮洗净，用0.1％新洁尔灭浸泡15～30min，用水充分清洗；再对猪皮表皮面单面采用体积浓度为1～2％的戊二醛溶液固定30～60min，用生理盐水充分冲洗；再去除真皮面多余脂肪和结缔组织，用片皮机从真皮面切削，切除毛囊留毛孔，保留0.2～0.4mm厚度带表皮层和真皮层及毛孔的猪皮；最后用0.1％新洁尔灭浸泡15～30min，灭菌水清洗；步骤二，将经步骤一处理的猪皮的真皮面单面，采用生理盐水按重量体积比配制的0.25～0.5％胰酶溶液浸泡，在37℃恒温摇床80～100转/分钟，消化45～60min，超声波震荡30～60min后，用灭菌水反复清洗；再置入含有体积比0.5％硫酸庆大霉素的0.5～1％ TritonX-100溶液中，于37℃恒温摇床80～100转/分钟清洗24h，超声波震荡30～60min，用水充分清洗；再置入含有体积比0.5％硫酸庆大霉素的0.5～1％SDS溶液中，于37℃恒温摇床80～100转/分钟清洗24h，超声波震荡30～60min，用灭菌水清洗；再将其浸入0.5～1mol/L NaOH溶液中，于恒温摇床80～100转/分钟碱化处理15min，用灭菌水清洗；步骤三，将经步骤二处理的猪皮双面浸泡于新鲜的体积浓度为0.2％的戊二醛溶液中交联15～30min，生理盐水充分冲洗；再将猪皮放入柔化剂溶液中浸泡30～60min进行柔化，清洗后再放入保湿剂溶液中，37℃保湿处理30～60min，生理盐水充分冲洗；步骤四，将经步骤三处理得到的产品，根据临床需要裁剪，真空包装，钴60照射，在2～10℃环境下保存。
2、 根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于，所述对猪皮单面的处理釆用贴板法、或夹边法。
3、 根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的柔化剂为十六烷基三甲基氯化铵、或十六烷基三甲基溴化铵、或十七烷基-N 氨乙基咪唑啉环氧丙烷、或十八烷基二甲基节基氯化铵的任一种。
4、 根据权利要求l所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的保湿 剂为丙三醇、或透明质酸吡咯烷酮羧酸钠混合溶液、或天然二甲基氨酸脯氨 酸、或十八烷基二甲基氧化胺的任一种。
全文摘要
一种组织工程化异种皮的制备方法，本发明采用来源丰富的仔猪为皮源，经过取皮、表皮固定、切削、去除真皮层细胞、修饰三维胶原结构、改变物理性状、灭菌包装的获得成品，在2～10℃环境下可保存2年以上。本发明制备的组织工程化异种皮，应用于深度烧伤、皮肤缺损，具有免疫原性低、与创面粘附紧密、保湿的功能特点，既可以作为人体暂时性的创面覆盖物保护创面，又可以永久性的保留真皮支架生长修复创面；解决了已有人工皮肤产品的价格昂贵、来源受限、制作时间长、保存时间短、二次植皮为机体带来损伤的缺点。本发明制备的产品材料来源广、生产周期短、保存时间长、价格低廉，适合于临床广泛应用。
文档编号A61L27/36GK101537207SQ20091002225
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月28日 优先权日2009年4月28日
发明者孙天骏, 张勇杰, 杨红明, 柴家科, 鹏 苏 申请人:中国人民解放军总医院第一附属医院;陕西艾博生生物工程有限公司