一种密码子优化的霍乱肠毒素ctb基因及其霍乱核酸疫苗的制作方法

专利名称：：一种密码子优化的霍乱肠毒素ctb基因及其霍乱核酸疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及一种密码子优化的霍乱肠毒素CTB基因及其霍乱核酸疫苗。
背景技术：
：核酸疫苗(nucleicacidvaccine)又名基因疫苗(genevaccine)或腿疫苗(DNAvaccine),其本质是含有病原体保护抗原基因的真核表达载体，当它被导入动物机体后，可被动物细胞所摄取并表达病原体的抗原蛋白，从而诱导机体对该蛋白的免疫反应。作为近几年来新兴的一种疫苗，它以其独特的优点吸引着人们(l)抗原合成和递呈过程与病原的自然感染相似，通过MHCI类和II类分子直接递呈免疫系统。特别是特异性CD8+淋巴细胞(CTL)的免疫反应，这是灭活疫苗和亚单位疫苗不能比拟的；(2)免疫原的单一性，只有编码所需抗原基因导入细胞得到表达，载体本身没有抗原性。而重组的病毒载体疫苗除了目的基因表达外，还有庞大而复杂的载体蛋白；(3)易于构建和制备，稳定性好，成本低廉，适于规模化生产。但是目前用来构建核酸疫苗的目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而疫苗的研究和应用对象主要为真核生物，例如小鼠，猕猴或人类等高级哺乳动物。由于原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在差异，导致用来构建核酸疫苗的病原体基因在哺乳动物宿主体内不能有效表达，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用，这是导致目前核酸疫苗免疫原性较低的原因之一。
发明内容本发明的目的在于克服上述缺陷，设计一种密码子优化的霍乱肠毒素CTB基因及其霍乱核酸疫苗。.本发明的技术方案是-一种密码子优化的霍乱肠毒素CTB基因，序列为SEQIDNO.l。一种霍乱核酸疫苗，其特征在于该疫苗由序列为SEQIDNO.l的霍乱肠毒素CTB基因和真核表达载体组成。所述的真核表达载体可为任何一种DNA疫苗载体，本发明使用载体pJW4303，但本发明并不局限于此载体。本发明提供的密码子优化的霍乱核酸疫苗的构建包括如下步骤.-(1)密码子优化的CTB基因的设计和合成首先用基因软件MacVector7.2分析编码霍乱肠毒素的基因序列，找出其密码子使用偏好以及与哺乳动物密码子使用偏好和与大肠杆菌密码子使用偏好不同的密码子位点。对于哺乳动物和大肠杆菌使用偏好相同的密码子，用哺乳动物和大肠杆菌都偏好的密码子替代霍乱弧菌CTB基因中使用偏好不同的密码子位点，然后人工根据具体载体克隆需要，进一步调整基因顺序，设计出密码子优化的CTB基因序列，并经过基因公司的化学合成得到了密码子优化的CTB基因。此密码子优化的序列所编码的蛋白质氨基酸序列将与原有的CTB氨基酸序列保持一致。例如霍乱弧菌CTB基因组中编码异亮氨酸lie的三联体密码子主要是ATT，而在人类、小鼠等高级哺乳动物基因组中主要是ATC，在大肠杆菌中也主要是ATC，在密码子优化时会选用哺乳动物细胞和大肠杆菌都偏好的密码子ATC。优化后的目的基因序列为SEQIDNO.l，优化前的序列为SEQIDN0.2，编码的氨基酸序列为SEQIDN0.3。(2)对基因公司提供的含有目标序列的重组载体pUC18/CTB进行酶切，用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0，大连宝生物公司)回收纯化约375bp的目的片段。(3)将步骤(2)得到的CTB基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303/CTB。经对重组质粒pJW4303/CTB的纯化、酶切和测序鉴定后，确定得到了密码子优化后的CTB核酸疫苗。本发明的有益效果发明的优点和效果在于经密码子优化后的霍乱肠毒素B亚单位基因，不但可以用于构建核酸疫苗而且显著提高了该基因在哺乳动物宿主体内的蛋白表达量，所构建的核酸疫苗有效的刺激了宿主的免疫系统，使之产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应；而且由于在序列设计时相应地兼顾了大肠杆菌的密码子使用偏好，经计算机软件MacVector7.2以用于在大肠杆菌中表达CTB蛋白，可显著提高该基因在大肠杆菌中的蛋白表达水平，这为以后在原核生物大肠杆菌中进行蛋白表达奠定基础。图l野生型和密码子优化CTB基因的密码子偏好性比较图1A野生型和密码子优化CTB基因在哺乳动物细胞表达的偏好的比较(指数〉1为哺乳动物细胞所偏好)，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。左图为野生型CTB基因，右图为密码子优化的CTB基因。图1B野生型和密码子优化CTB基因在大肠杆菌表达偏好的比较(指数>1为大肠杆菌所偏好)，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。左图为野生型CTB基因，右图为密码子优化的CTB基因。图2CTB蛋白的Westernblot分析图2A用Westernblot分析免疫兔血清中CTB特异性抗体应答所用抗原为CTB蛋白，所用抗血清为免疫兔血清，稀释度为l:200。图2BWesternblot分析CTB蛋白在293T细胞中的表达CTB:CTBDNA疫苗；Vector:pJW4303，抗原为上述两种质粒转染293T细胞裂解液，所用抗血清为免疫兔血清，稀释度为l:200。图3Balb/c小鼠CTB特异性IgG抗体应答时间曲线箭头表示免疫时间点；左图CTBDNA疫苗组，共六条曲线，每条曲线代表一只小鼠的免疫应答时间曲线；右图空载体对照组，共五条曲线，每条曲线代表一只小鼠的免疫应答时间曲线。图4新西兰白兔血清CTB特异性IgG抗体应答时间曲线箭头表示免疫时间点，每条曲线代表一只新西兰白兔的免疫应答时间曲线。、■、A分别代表CTBDNA疫苗免疫的3只新西兰白兔，、□、A代表空载体免疫的3只新西兰白兔。图5乳鼠保护试验O标记的曲线表示免疫前兔血清l:l稀释霍乱弧菌进行的乳鼠保护试验的乳鼠存活率与时间的关系曲线；參表示免疫兔血清l:l稀释霍乱弧菌进行的乳鼠保护试验的乳鼠存活率与时间的关系曲线，曲线旁的女女表示该组与空载体组相比存活率有显著差异P〈0.01;A表示免疫兔血清l:10稀释霍乱弧菌进行的乳鼠保护试验的乳鼠存活率与时间的关系曲线，5曲线旁的女表示该组与空载体组相比存活率有显著差异P〈0.05;口表示免疫兔血清1:50稀释霍乱弧菌进行的乳鼠保护试验的乳鼠存活率与时间的关系曲线。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。实施例1.密码子优化的CTB基因的设计和合成首先用基因软件MacVectoi"7.2分析编码霍乱肠毒素B亚单位(CTB)的基因序列，找出其密码子使用偏好以及与哺乳动物密码子使用偏好和大肠杆菌不同的密码子位点。对于哺乳动物和大肠杆菌使用偏好相同的密码子,用哺乳动物细胞和大肠杆菌都偏好的密码子替代霍乱弧菌CTB基因中使用偏好不同的密码子位点，然后人工根据具体载体克隆需要，进一步调整基因顺序，设计出密码子优化的CTB基因序列。此密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列将与原有的CTB氨基酸序列保持一致。密码子优化的CTB基因由大连宝生物公司合成，装入载体pUC18，构建成重组质粒pUC18/CTB。经测序证实合成的序列正确。为了明确显示进行密码子优化的位点,现将CTB密码子优化后的核酸疫苗与密码子优化前的核酸疫苗目的基因序列进行对比。密码子优化后的核酸疫苗与密码子优化前的核酸疫苗基因序列比较如下(*为终止密码子)优化前ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATAT优化后ATGAT^AAATT卩GG卩GT&TT￡TT2AC^GT&CTQ,TCSGCCTAQ氨基酸MIKLKFGVFFTVLLSSAY优化前GCACATGGAACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACA优化后GCgCAGAC^CC￡CAQAA^AT￡AC￡GA￡￡TGTGgGCGGAQTACCACAACAC^氨基酸AHGTPQNITDLCAEYHNT优化前CAAATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGA优化后CA￡AT^CA^AC^CT&AA￡GA卩AA^AT^TT^T(^TA￡AC￡GAQTC^CTgGC&GG卩氨基酸QIHTLNDKIFSYTESLAG优化前AAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAA优化后AA&GAGATGATCATQAC￡TT^AAGAA卩GG￡GCgAC2TT^CAQGTQGAQ氨基酸KREMAIITFKNGATFQVE优化前GTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAG优化后GTQCCQGG￡AGSCA卩CA卩AT^GA￡TC^CAQAA&AAAGC￡AT2GAQATGAAG6氨基酸VPGSQHIDSQKKAIERMK优化前GATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAGTTATGTGTA优化后GAGACCCTGAT^GC^TAgCTCACgGAgGC￡AAgGTCGAgAAG,TG旦GT^氨基酸DTLRIAYLTEAKVEKLCV优化前TGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAATTAA优化后TGGAA￡AAQA(^CC2CA^GCgATgGCgGC^ATfAGgATGGCQAAfTAA氨基酸WNNKTPHAIAAISMAN*上述密码子优化的CTB基因与野生型比较发生了偏好性改变。从图1中可以看出，与野生型基因相比，密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子和大肠杆菌偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的CTB氨基酸序列不变，从而使其更适于在哺乳动物细胞和大肠杆菌中的蛋白表达。实施例2.CTBDNA疫苗构建将质粒pJW4303和pUC18/CTB(由大连宝生物公司合成)用PstI和BamHI分别进行双酶切。酶切反应体系为lOxBufferTango4pL，10xBSA4pL，质粒(pJW4303或pUC18/CTB)20pL,PstllpL，BamHIlpL，补水至40jxL。酶切产物经7g/L的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒(AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0，大连宝生物公司)分别回收纯化约375bp的目的片段和线性化的pJW4303。将电泳后琼脂糖凝胶置于紫外检测仪下，切下含目的DNA的凝胶，分析天平称胶块的质量，按lmg-lpL计算胶块的体积。加入3倍体积的011-IBuffer,置于75'C水浴中加热融化胶块，每隔2min混匀一次，直至胶块完全融化，加入1/2011-1811任61"体积的011-IIBuffer,充分混匀溶液。将离心吸附柱安置在收集管上，转移混合溶液至吸附柱中，静置2min，3600rpm，离心lmin。弃滤液，加入500pLRinseA液，3600rpm，离心30s。弃滤液，加入700ixLRinseB液，3600rpm，离心30s，重复洗涤一次。空柱12000rpm，离心lmin，将吸附柱安置在Ep管上，让乙醇完全挥发干净。在吸附膜的中央，加入25pL洗脱缓冲液，静置60s。12000rpm，离心lmin，此时Ep管中的洗脱液即为目的DNA溶液。测定DNA溶液的浓度，用10g/L琼脂糖凝胶电泳分析割胶纯化效果，洗脱液保存在-2(TC冰箱中备用。用T4DNA连接酶将约375bp的目的片段和线性化的pJW4303连接，构建pJW4303/CTB重组表达质粒。即为本文结果中提及的CTBDNA疫苗。连接反应体系为10xT4DNALigaseBufferlpL，线性化的pJW4303lpL,纯化目的片段7pL，T4DNALigaselpL，混匀，16'C放置16h。连接物转化HBIOI感受态细胞。实施例3.重组质粒pJW4303/CTB鉴定3.1pJW4303/CTB转化HB101感受态细胞1)将10pL连接物加入到装有lOOpLHB101感受态细胞的Ep管中，轻轻拍动管壁数次，充分混匀，冰浴30min。2)将Ep管置于42。C水浴中90s，立即转至冰浴，静置2min。3)向Ep管中缓慢加入LB培养基0.5mL,37°C，80rpm振摇，培养45min。4)将菌液涂布在含氨苄青霉素(O.lg/L)的LB平板上，37°C，培养过夜。3.2筛选阳性克隆随机挑取5个单菌落，分别接种于5只培养试管(含O.lg/L氨苄青霉素的LB培养基)中，37°C，250rpm振摇，培养过夜。3.3小量提取重组质粒pJW4303/CTB(质粒小量提取试剂盒QIAGENPlasmidMiniKit(50),Qiagen公司)1)将3.2中摇过夜的细菌在无菌超净台中缓慢吸到1.51111离心管中，培养试管中剩下少量菌液保存于4"C。2)离心管中菌液，常温下6000g，离心10min,弃上清，收集细菌。3)加入25(Hil重悬缓冲液于细菌沉淀，反复振摇，直至看不到细菌团块，细菌全部重悬于溶液中。4)加入250pl裂解缓冲液到上述菌体重悬液体中，温和颠倒5-6次，溶液呈均匀蓝色，静置5min。5)加入35(HU平衡缓冲液于(4)中得到的液体中，温和颠倒5-6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，室温静置2min。6)12000g，离心10min，吸取上清，转移至另一离心管。该条件下离心10min。7)将上清液加入到离心吸附柱中，12000g，离心lmin，弃滤液。8)吸附柱再12000g，离心lmin，弃去滤过液体。9)向离心吸附柱中加入洗涤缓冲液25pl，12000g，离心lmin，收集滤液。10)再将步骤9重复操作1次。811)两次收集的液体中即含有质粒。3.4小量提取质粒pJW4303/CTB进行酶切鉴定质粒pJW4303/CTB用万awiH单酶切，尸WI和Ba附/H进行双酶切，&cI单酶切。双酶切总反应体系(10nL):10xBufferTangolpL，10xBSAlpL，质粒(0.22mg/mL)2pL，户Wl0.25pL，5am//10.25pL，补水至10nL。单酶切体系(10pL):10xBufferTangolpL，质粒(0.22mg/mL)2pL，B"w/H或SacI0.5pL，补水至l(HtL。37°C孵育lh，加入1ixL10xLoadingbuffer终止酶切反应，10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果。将鉴定正确的细菌送上海生工测序，测序正确细菌划三次平板，保存两个单克隆细菌。实施例4.核酸疫苗的大量制备(质粒大提试剂盒为QIAGENPlasmidMegaKit(5)，Qiagen公司)1)吸取鉴定正确的细菌保存液5^iL接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C，200rpm，过夜生长。2)按l:500将1)中培养菌液接种于1000ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C，200rpm，过夜生长。3)第二天将细菌移到250ml离心瓶中，4°C、6000g离心15min，弃上清，收集细菌。4)50ml缓冲液Pl重悬细菌沉淀，反复振摇，直至看不到细菌团块，细菌全部重悬于溶液中。5)50ml缓冲液P2加入重悬液体于离心瓶，温和颠倒5-6次，溶液呈均匀蓝色，静置5min。6)50ml缓冲液P3加入上述混合液体中，温和颠倒5-6次，蓝色溶液消失，溶液分层，上层为结实的乳白色团块，下层为清亮液体，冰上放置30min。7)4'C，20000g，离心30min，保留上清，转移至另一离心瓶。该条件下再将上清液离心10min。8)平衡缓冲液QBT35ml湿润平衡提取柱。9)将(7)中得到的上清加入提取柱，自然过柱，弃去滤过液体。10)加入洗涤缓冲液QC200ml，自然过柱，弃去滤过液体。11)加入洗脱缓冲液QF35ml，自然过柱，收集滤过液体。12)向收集液体中加入24.5ml异丙醇，4。C，15000g，离心30min，弃上清。13)用7ml70。/。乙醇重悬离心管中沉淀，常温15000g离心10min，弃去上清。14)将有沉淀的离心管于超净台自然晾干，lml生理盐水溶解。915)紫外分光光度法(波长260nm280nm)定量质粒含量。16)加入洗脱缓冲液QF35ml，再将柱子洗脱l次。17)为提高吸附柱的利用率，第二天用自配的溶液按1-15的步骤再进行1次质粒大量提取。18)将两次提取的质粒混合，进行限制性内切酶酶切鉴定。实施例5.细胞转染293T细胞用含10。/。胎牛血清的含双抗DMEM高糖培养基37。C，5%(302饱和湿度培养箱内培养至对数生长期，用2.5g/L胰酶消化后，以1.0><106个细胞(6mL)接种于60mm培养皿中，待生长至80%融合时开始转染。依据PEI转染方法进行细胞转染，取PEI50nL，加入到93(HiL含双抗DMEM高糖培养基中，另取8.0吗pJW4303/CTB重组质粒加入到上述培养液中，轻轻混匀，室温，孵育15min，然后将lmlPEI/DNA复合物加到培养瓶中并轻轻摇动使混合均匀，同时以pJW4303空质粒转染细胞作为阴性对照，10h后可更换不含血清含双抗的DMEM培养液。继续培养72h后进行Westernblot分析。分析结果如图2B所示。图中显示CTBDNA疫苗转染293T细胞后可在裂解物提取液中检出特异性蛋白的表达。其单体的表观分子量约为13kDa，阴性对照空载体pJW4303转染293T细胞的裂解物没有特异性蛋白存在。印迹分析表明，CTBDNA疫苗可以在293T细胞内表达。转染细胞收获吸取细胞上清液，2500rpm，室温，离心10min，吸取上清-2(TC冻存。用PBS(浓度10mM，pH7.2)将细胞从培养皿中洗脱，收集细胞悬液，2500rpm，室温，离心10min，弃上清，加入裂解液(50mMTris-HClPh7.6，150mMNaCl，1。/。Triton，用前加入2%100mMPMSF(苯甲基磺酰氟))，冰上孵育20min，12000rpm，4°C，离心60min，收集上清液，-2(TC冻存。实施例6.密码子优化霍乱肠毒素B亚单位核酸疫苗的免疫原性的研究在密码子优化的CTB核酸疫苗构建和表达成功后，通过对试验动物(如小鼠、家兔等)进行核酸疫苗免疫，检测密码子优化的霍乱核酸疫苗的免疫原性。用ELISA和Westernblot检测CTB抗原特异的抗体免疫应答。本研究所用动物包括两种类型，Balb/c小鼠和新西兰兔。由于免疫家兔可以产生大量的免疫血清，可以足够进行抗体检测和抗体被动保护作用的研究，并且家兔肠段结扎试验10可以进行疫苗免疫主动保护作用的研究。因此，在本发明涉及免疫保护的研究中，将用家兔免疫作为动物模型。而小鼠饲养方便，免疫时单人容易操作，采血简单，因此选用小鼠为本实验另一种动物模型。用两种动物验证CTBDNA疫苗(pJW4303/CTB)诱导产生抗体具有普遍性，在多种动物免疫均有诱导抗体产生的作用。6.1Balb/c小鼠免疫，实验设计见表l:表1CTBDNA疫苗和空载体免疫Balb/c小鼠和分组<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用CTBDNA疫苗和空载体(pJW4303)对照各免疫一组Balb/c小鼠。肌肉注射、活体基因导入方式免疫，保证针头插入深度2mm，注入疫苗，观察注射局部隆起，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(技术参数电压50V，脉冲次数正反各3次，波宽30ms，频率30Hz)，以小鼠腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0和2周进行DNA免疫，于每次免疫前和末次免疫后两周采血及收集血清。用ELISA方法检测血清中CTB特异的IgG抗体反应，评价CTBDNA疫苗在小鼠动物模型中诱导产生体液免疫的能力。Balb/c小鼠CTB特异性IgG抗体应答时间曲线如图3所示。图中结果显示CTB组小鼠第一次免疫后两周，外周血中就可以检测到CTB特异性IgG抗体，第二次免疫后两周抗体水平显著升高，最高抗体滴度达到l:364500。空载体pJW4303免疫小鼠的血清未检测到CTB特异性抗体，结果证实CTB免疫后在小鼠体内产生抗原特异性的抗体应答。箭头表示免疫时间点，每条曲线代表一只小鼠，左图CTBDNA疫苗组，右图空载体对照组，空载体组的五条曲线几乎重叠。6.2新西兰兔免疫，实验设计见表2:表2CTBDNA疫苗和空载体免疫家兔和分组<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用CTBDNA疫苗和空载体(pJW4303)对照各免疫一组新西兰兔。肌肉注射、活体基因导入方式免疫，保证针头插入深度2mm，注射后立即于注射部位用WJ-2002活体基因导入仪进行体内电转染(技术参数电压100V，脉冲次数正反各6次，波宽60ms，频率60Hz)，以兔子腿部肌肉发生抖动视为电转染有效。于第0和2周进行DNA免疫，于每次免疫前和末次免疫后两周采血及收集血清和粪便。用ELISA方法检测血清和粪便中CTB特异的IgG抗体反应，评价CTBDNA疫苗在家兔动物模型中诱导产生体液和粘膜免疫的能力。新西兰白兔血清CTB特异性IgG抗体应答时间曲线如图4所示。图中显示CTBDNA疫苗和空载体pJW4303分别免疫3只新西兰兔，于0，2，4，8周免疫，免疫前和免疫后2周收集血清。第一次免疫后2周CTBDNA疫苗组3只兔子血清中均可检测到CTB特异性IgG，且随着免疫次数的增加，CTBDNA疫苗组兔血清CTB特异性抗体水平逐渐增高，第四次免疫后2周时抗体平均最高滴度为l:1093500，但3只空载体免疫兔子的血清未检测到抗体应答。箭头表示免疫时间点。实施例7.免疫应答检测7.1ELISA检测血清中和粪便中CTB特异性IgG:1)CTB抗原包被ELISA板(使用PBSpH7.2-7.4作为包被液,CTB蛋白浓度为lpg/ml)，每孔100pl，4°C，过夜。2)弃包被液，用1XPBST洗板5次(PBST构成为10mMPBS和0.05%Tween-20)。3)5%脱脂奶粉(PBS，0.05%Tween-20，5%脱脂奶粉)37°C,封闭1h，每孔200nl。4)弃封闭液，用1XPBST洗板5次。5)—抗为待检测血清，起始稀释度为1:500，再进行1:3倍比稀释。每孔加入100pl，37°C，孵育lh。(一抗稀释液4%乳清蛋白，0.5%Tween-20，PBS)。如果一抗为粪便上清，进行l:4稀释，37。C孵育lh，每孔加入100pl。6)弃一抗，用1XPBST洗板5次。7)生物素标记的羊抗鼠IgG(浓度为lmg/ml，1:1000),每孔加入100pl，37°C，孵育lh。(二抗稀释液:4%乳清蛋白，0.5%Tween-20，PBS)。8)弃二抗，用1XPBST洗板5次。9)HRP标记链亲和素(浓度为lmg/ml，1:2000)，每孔加入100pl，37°C，孵育1h。(稀释液:4°/。乳清蛋白，0.5%Tween-20，PBS)。10)弃HRP标记链亲和素，用1XPBST洗板5次。11)TMB显色(TMB溶液配方TMB片剂1片，O.IM磷酸枸橼酸缓冲液(pH值为5.0)5ml，双蒸水5ml，30%双氧水2^1)每孔加入100nl，室温，3.5min，每孔加入50pl121M的H2SCU终止显色。12)酶标仪测定并记录各孔A450值，计算复孔平均值，以免疫前血清OD值的2.1倍作为cut-off值，而且免疫后孔OD值小于0.05也去除。7.2Westernblot检测血清中特异性IgG:1)CTBDNA疫苗转染293T细胞裂解液上清，pJW4303转染293T细胞裂解液上清2(Vl(如果抗原为CTB蛋白，取5吗，稀释到20nl)，加入5x上样缓冲液5W，100°C，煮沸10min。2)首先制备15%的分离胶(7.5ml30%丙烯酰胺溶液，3.7mllMTris/ClpH8.8，150|xl10%SDS，150^110%过硫酸氨，6plTEMED)，灌胶，液面顶端加入水，室温下聚合2030min。3)倒弃水，再制备5%的积层胶(960^130%丙烯酞胺溶液，740^1lMTris/ClPH6.8，60|xl10%SDS，6(Hil10%过硫酸氨，5plTEMED)，在积层胶上插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿。4)将上述处理好的样品加入15%胶中进行电泳，20mA，lh，40mA，2h。5)胶上的蛋白转到PVDF膜上，100v，lh。6)转好的膜用5%脱脂奶粉封闭，37°C，lh。7)用lxPBST洗膜两次。8)将膜浸在l:500稀释的血清中，4°C，过夜。9)弃掉血清，用lxPBST洗膜6次，每次10min。10)弃掉洗液，加入l:10000稀释HPR标记的羊抗小鼠IgG，37°C，lh。11)弃掉二抗，用lxPBST洗膜6次，每次10min。12)发光剂加到膜上，暗室显影，结果见图2。实施例8.乳鼠保护实验研究8.1菌株分离霍乱弧菌由江苏省疾病控制中心提供，从其保留的霍乱流行株冻干粉挑选10株细菌，在无菌超净台将细菌溶解于生理盐水中，将细菌悬液接种于营养琼脂平板上，37°C，孵育过夜，再挑取单克隆划三次平板，取适量菌做玻片凝集试验，分离出01群Eltor霍乱弧菌4株，两株稻叶，分别为E.V.T220和391。两株小川，分别为丫48.65和^6。8.2霍乱弧菌毒素基因鉴定8.2.1模板的制备将待检菌株在普通营养琼脂平板上37'C培养18-24小时，刮取2-3个菌落于200^1灭菌去离子水中混匀，煮沸15-30min,冷却后10000rpm，离心2min，取上清用于PCR扩增。8.2.2Ol群毒素基因检测目的检测我们分离的霍乱弧菌所含有的毒力基因，鉴定毒力菌株。因为霍乱弧菌最重要的两个毒力基因为霍乱肠毒素A亚单位和毒素共调菌毛A亚单位，前者可引起水样腹泻，后者主要与细菌在肠道黏附有关，所以本研究中也主要检测霍乱肠毒素A亚单位和毒素共调菌毛A亚单位这两个毒力基因，鉴定出含这两种毒力基因的霍乱弧菌来进一步做攻毒试验。(1).引物序列霍乱肠毒素A亚单位基因(564bp)的上游引物序列为SEQIDN0.4;下游引物序列为SEQIDN0.5;毒素共调菌毛A亚单位基因(lkb)的上游引物序列为SEQIDN0.6，下游引物序列为SEQIDN0.7。(2).反应体系上游引物2ul下游引物2ul10Xbuffer5ul15mraolMgcl2110腸1d,s"1Taq酶(3U/ul)0.5u1模板1P1去离子水15ul总体系20ul实验体系以￡.co/z'HB101为阴性对照。(3).反应条件94。C5min94。C30秒、58°C30秒卜72°C60秒，72。C10min1430个循环通过以上PCR方法扩增毒力基因后发现我们选取的01群Eltor型霍乱弧菌两株稻叶(E.V.T220和391)和两株小川(分别为V格65和V56)均含有CTB和TcpA两种毒力基因。8.2.3确定50%致死量时所需要的霍乱弧菌的浓度1)出生35dCD-l乳鼠移离母鼠3h;2)通过灌胃注入50^d埃尔托型霍乱弧菌(菌量从2xl()Scfli/ml2xl0Scfu/ml)，将乳鼠置于3(TC的屏障中；3)每36h观察一次，直到48h;4)确定50%致死剂量的霍乱弧菌浓度。8.3乳鼠保护试验1)V格65型霍乱弧菌(江苏省疾病控制中心保存霍乱01群菌株)划平板，在普通营养琼脂平板上37-C培养18-24h，刮取菌落，将细菌悬液接种于LB培养基中，37"C培养16h，麦氏浊度仪调节细菌浓度为lxl08cfU/ml;2)霍乱弧菌分别与免疫前和免疫血清混合(将免疫前和免疫血清56'C,孵育30min灭活补体)37。C，孵育lh;3)向乳鼠胃内分别灌入5倍LD50的霍乱弧菌+热灭活免疫前血清液体，5倍LD50的霍乱弧菌+热灭活免疫血清液体，观察48h内每组中死亡的乳鼠量，记录各时间点乳鼠的数量，结果如图5所示。由图5可知CTB核酸疫苗免疫的家兔血清可以阻断霍乱弧菌的致病作用，对乳鼠产生有效的免疫保护。本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。实施例中所涉及的试剂信息如下表:Taq酶T4DNA连接酶DNAmarker(DL3000)限制性内切酶^mi/1，尸WI和SacIDNA凝胶回收试剂盒DMEM高糖培养基Promega公司Promega公司大连宝生物公司Fermentas公司大连宝生物公司Hyclone公司15RPM1640细胞培养液Hyclone公司胎牛血清Gibico公司质粒小量提取试剂盒Qiagen公司粒大量提取试剂盒Qiagen公司PEIInvitrogen公司HRP标记的羊抗鼠IgGBD公司HRP标记的链亲和素SouthemBiotech公司HRP标记的羊抗兔IgGSouthernBiotech公司生物素标记的羊抗鼠IgGSouthemBiotech公司生物素标记的羊抗兔IgGSouthernBiotech公司CTBproteinSigma公司TMB片剂Sigma公司16<110〉黄祖瑚、徐桂芳〈120〉一种密码子优化的霍乱肠毒素CTB基因及其霍乱核酸疫苗〈160〉7<210〉1〈211〉375〈212〉腿〈213〉人工序列<220>〈223〉密码子优化的CTB基因序列〈400〉1atgatcaagctgaaattcggggcaccccgcagaacatcacctgaacgacaaaatcttctcatcaccttcaagaacggcgctcccagaagaaagccatcgagccaaggtgg卿agctgtgagcatggcg3sctaa<210>2〈211>375〈212〉腿〈213〉天然序列来源于霍乱弧菌(Kz'力T7'oc力o7erae)<220〉<223>霍乱弧菌(Kz7^'oc力o7e/"3e)的CTB基因序列〈400〉2atgattaaattaaaatttggtgttttttttacagttttactatcttcagcatatgcacat60ggaacacctcaaaatattactgatttgtgtgcagaataccacaacacacaaatacatacg120ctaaatgataagateittttcgtatacagaatctctagctggaaaaagagagatggctatc180attacttttaagastggtgcaacttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatatagat240tcacaaaaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttactgaa300gctaaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgcaatt360agtatggcaaattaa375<210〉3〈211〉124<212〉PRT〈213〉天然序列来源于霍乱弧菌(K/6ri'oc力o7erae)<220>〈223〉霍乱肠毒素B亚单位基因编码的氨基酸序列cgtgttcttcaccgtgctgccgacctgtgcgccgagtaccctacaccgagtccctggcgggaccttccaggtggaggtgcgcgcatg肪ggacaccctgccgtgtgggiac朋caagEiccctgagctccgcctacgcccac60acaacacccagatccacacc120gcaagcgcgagatggccatc180cgggcagccagcacatcgac240gcatcgcctacctgaccgag300cgcacgccatcgcggccatc360375〈400〉3MetlieLys1SerAlaTyrLeuLysPheGlyValPhePheThrValLeuLeu510AlaHisGlyThrProGinAsnlieThrAspLeu2025AlaGluTyrHisAsnThrGinlieHisThrLeuAsnAspLys3540PheSerTyrThrGluSerLeuAlaGlyLysArgGluMetAla5055lieThrPheLysAsnGlyAlaThrPheGinValGluValPro6570SerGinHislieAspSerGinLysLysAlalieGluArgMet8085AspThrLeuArglieAlaTyrLeuThrGluAlaLysValGlu95100LeuCysValTrpAsnAsnLysThrProHisAlalieAlaAla110115Ser15Cys30lie45lie60Gly75Lys90Lys105lie120SerMetAlaAsn<210>4〈211〉22〈212〉廳〈213〉人工序列〈220〉〈223〉霍乱肠毒素A亚单位基因上游引物〈400〉4cgggcagattctagacctcctg22〈210〉5<211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列18〈220>〈223〉霍乱肠毒素A亚单位基因下游引物〈400〉5cgatgatcttggagcattcccac23<210>6〈211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉毒素共调菌毛A亚单位基因上游引物〈400〉6ccctctctatgtgaatgttgc21<210〉7<211>21<212〉DNA<213〉人工序列〈220>〈223>毒素共调菌毛A亚单位基因下游引物<400〉7ctctaactcccagcagcgacc2权利要求1、一种密码子优化的霍乱肠毒素CTB基因，序列为SEQIDNO.1。2、一种霍乱核酸疫苗，其特征在于该疫苗由序列为SEQIDNO.l的霍乱肠毒素CTB基因和真核表达载体组成。3、根据权利要求2所述的霍乱核酸疫苗，其特征在于所述的真核表达载体可为任何一种DNA疫苗载体。4、根据权利要求3所述的霍乱核酸疫苗，其特征在于所述的真核表达载体为pJW4303。全文摘要本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及一种密码子优化的霍乱肠毒素CTB基因及其霍乱核酸疫苗。该CTB基因兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好，所涉及的霍乱核酸疫苗由该CTB基因和真核表达载体pJW4303组成。经密码子优化后的CTB基因，不但可以用于构建核酸疫苗，显著提高该基因在哺乳动物宿主体内的蛋白表达量，所构建的核酸疫苗有效的刺激了宿主的免疫系统，使之产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应；而且该基因可以用于在大肠杆菌中表达CTB蛋白，为以后在原核生物大肠杆菌中进行蛋白提取或纯化奠定基础。文档编号A61K39/106GK101538574SQ20091003108公开日2009年9月23日申请日期2009年4月27日优先权日2009年4月27日发明者山卢,徐桂芳,王世霞,黄祖瑚申请人:黄祖瑚;徐桂芳