专利名称：：一种木瓜总酚酸提取物及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是木瓜的总酚酸提取物及其在制备抗炎药物或食品中的应用。
背景技术：
：木瓜为常用中药，具有平肝舒筋、和胃化湿等功效，《中国药典》2005年版一部收载木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠"ae/7，e几sspecial(Sweet)Nakai的干燥近成熟果实，皱皮木瓜是其果实加工而形成的产品。另外还有两种蔷薇科植物也广泛作木瓜使用光皮木瓜为蔷薇科植物棋楂Cw'/7e/7Si's(Thouin)Koehen的果实；木瓜海棠为蔷薇科植物毛叶木瓜C.cs^3"/7si5(Hemsl)Schneid的果实。木瓜主产安徽、山东、浙江、湖北、云南、贵州、四川等地，主要含有机酸、三萜类、黄酮类、多糖等成分。据报道木瓜总苷对大鼠免疫性关节炎模型具有较强的防治作用，药理实验表明，佐剂性关节炎大鼠经木瓜总苷(30，60，120mg/kg)灌胃后，明显降低模型大鼠异常升高的全血浆黏度、红细胞的聚集性和纤维蛋白原含量；且具有对抗模型大鼠凝血时间縮短的作用(中国中医药信息杂志，2002，12(9):202H，但至今未见有关从木瓜中提取总酚酸以及木瓜总酚酸提取物用于抗炎方面的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种木瓜总酚酸提取物及其用于制备抗炎药物或食品的用途。本发明木瓜总酚酸提取物的制备方法如下1.制备木瓜提取液按常规将木瓜果实粉碎后，以30%-80%含水乙醇常温下浸泡24-48小时，得浸泡液，再于常温下用30%-80%含水乙醇渗漉提取2-5次，合并浸泡液和渗漉液，即为木瓜提取液；2.纯化将上述木瓜提取液浓縮后离心或过滤，弃沉淀，将上清液或滤液用聚苯乙烯多孔性大孔树脂吸附，以蒸馏水淋洗去除杂质，然后再以5%-20%含水乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓縮至无醇味，按同法再用大孔树脂吸附和洗脱，合并洗脱液并浓縮至无醇味，干燥后即为木瓜总酚酸提取物。经成分分析，本发明木瓜提取物主要成分为原儿茶酸、氯原酸等多种酚酸类化合物，其中含原儿茶酸30-35%，含氯原酸20-25%，酚酸类化合物占木瓜提取物的50-60%，故称为木瓜总酚酸提取物。本发明木瓜总酚酸提取物经如下动物实验，说明其具有抗炎活性。1.通过二甲苯所致小鼠耳廓肿胀模型，观察木瓜总酚酸提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响。木瓜总酚酸提取物低、中、高三个剂量组(按体重给药剂量分别为100mg/kg，200rag/kg，400mg/kg)与模型对照组比较，均对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有明显的抑制作用，且高剂量组的肿胀率低于阳性对照组，表明木瓜总酚酸提取物有显著的抗炎作用。2.通过冰醋酸诱发小鼠腹腔毛细血管通透性增加，观察木瓜总酚酸提取物的抗炎作用。木瓜总酚酸提取物的三个剂量组(同上)与模型对照组比较，均能显著的抑制腹腔毛细血管通透性增加，且木瓜总酚酸提取物高剂量组抗炎强度与阳性对照组相近，表明木瓜总酚酸提取物通过抑制毛细血管的扩张，降低通透性，使渗出减少以达到抗炎作用3.通过建立大鼠的慢性炎症模型-棉球肉芽肿，观察木瓜总酚酸提取物的抗炎作用。木瓜总酚酸提取物的三个剂量组(按体重给药剂量分别为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg)与模型对照组比较，均能明显抑制大鼠棉球肉芽肿增生，表明木瓜总酚酸提取物各剂量组对棉球肉芽肿有明显的抑制作用，因此有显著的抗炎效果。4.通过冰醋酸所致小鼠炎症疼痛模型，观察木瓜总酚酸提取物对小鼠的镇痛作用。木瓜总酚酸提取物的三个剂量组(按体重给药剂量分别为100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg)与模型对照组比较，均能显著降低冰醋酸诱发的小鼠扭体反应次数，表明木瓜总酚酸提取物具有较强的镇痛抗炎作用。本发明木瓜总酚酸提取物制备方法简便，具有明显的抗炎活性，因此可用于制备抗炎药物或食品。本发明为寻求新的抗炎药物提供了一个新途径。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步描述。实施例1制备木瓜总酚酸的提取物取100kg皱皮木瓜干燥药材，粉碎后过10目筛，投入提取罐，以70%含水乙醇200L常温下浸泡24h，收集浸泡液，药材于常温下再用70%含水乙醇1500L渗漉提取3次，收集渗漉液，合并浸泡液及渗漉液并浓縮至50L，过滤，将滤液按常规用聚苯乙烯多孔性大孔树脂吸附，柱内大孔树脂装量为200L，以1500L蒸馏水淋洗去除杂质，然后再以2000L10。/。含水乙醇进行洗脱，收集洗脱液并浓缩至无醇味，再用同法进行二次大孔树脂吸附、洗脱，干燥后即得棕褐色粉末状木瓜总酚酸提取物0.25kg。按生药投药量计算，木瓜总酚酸提取物得率为0.25%。成分分析取实施例1制得的木瓜总酚酸提取物2g，用50。％甲醇溶解后上SephadexLH-20凝胶柱，用50%甲醇洗脱，洗脱过程中用薄层层析法监测，将收集的相同洗脱液部分合并，经ESI-MS、丽R等光谱技术和化学方法鉴定，主要为两个酚酸类单体化合物，即原儿茶酸和氯原酸。再用高效液相色谱法检测木瓜提取物中原儿茶酸和氯原酸的含量，分别为30-35%、20-25%，酚酸类化合物占木瓜提取物的50-60%以上，因此称作木瓜总酚酸提取物。原儿茶酸和氯原酸ESI-MS、丽R等光谱技术和化学方法检测数据原儿茶酸无色针晶(甲醇)，mp:199201。C.ESI-MSm/z:153[M-H]—。'H-丽R(600MHz，DMSO-cOS:7.326(1H，d，/:DHz，H-2)，7.27(1H'dd，/二&《2.0Hz，H-6)，6.763(1H，d，/二《.ZHz，H-5).13C-NMR(150MHz，DMSO-d)S:167.29(CO)，149.99(C-4)，144.87(C-3)，121.89(C-6)，121.67(C-l)，116.56(C-2)，115.15(C-5).以上数据与文献报道一致，鉴定化合物为原儿茶酸(中国中药杂志，2005，30(20):1591-1593)。绿原酸白色粉末(Me0H),mp207209。C。ESI-MSm/z:355[M+H]+。'H-丽R(DMS0-d)5:1.790(4H，m,H-2，6)、3.894(1H，H-4)、3.457(1H，d，/二7.8Hz，H-5)、5.161(1H,H—3)、6.213(1H,d,/=16.3Hz,a-H)、6.744(1H，d，/二7.8Hz，H-5，)、6.956(1H，d，7.8Hz，H-6，)、7.055(1H，H-2，)、7.433(1H，d，/二16.3Hz,H)。'3C—丽R(DMS0-o9:75.23(C—1)、39.51(C—2)、71.59(C—3)、73.29(C-4)、71.42(C—5)、38.01(C-6)、114.53(C-a)、144.63(C-化125.43(C-1')、U5.80(C-2')、145.75(C-3')、148.57(C-4')、114.68(C-5，)、121.68(C_6，)、176.52(C-7)、166.32(08)。MS、1H-醒R和13C-丽R谱数据与文献报道基本一致，故该化合物被鉴定为绿原酸(中药化学对照品工作手册，1999.154-155)。6木瓜总酚酸提取物抗炎动物实验(一)木瓜总酚酸提取物对耳壳炎症小鼠的治疗通过给小鼠灌胃给予不同剂量的木瓜总酚酸提取物，观察其对耳壳炎症的改善和治疗作用。材料1)木瓜总酚酸提取物木瓜总酚酸提取物由实施例l制备，用0.8%羧甲基纤维素钠配成所需浓度的木瓜总酚酸提取物溶液。2)二甲苯广东光华化学厂有限公司批号20060908。3)阿司匹林SIGMA公司批号88H4012实验动物昆明种小鼠南方医科大学动物中心(清洁级，合格证号2006A042)实验方法昆明种小鼠50只，体重18土2g，雌雄各半，随机分成5组，即模型对照组、阳性对照组、木瓜总酚酸提取物低、中、高剂量组，每组10只小鼠。按小鼠体重，给药剂量分别为阳性对照组，其推荐临床平均阿司匹林剂量为15mg/Kg/人/日(人按60Kg体重计算)，转换为小鼠剂量为180mg/kg;木瓜总酚酸提取物组，根据预实验结果，木瓜总酚酸提取物配制成相应浓度，每鼠按体重以10ml/kg灌胃，使低、中、高剂量组给药剂量分别为100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg;模型对照组给予等量生理盐水。各组按上述给药剂量连续灌胃给药五天，每天一次，第六天给药后30min，按常规将0.05ml二甲苯涂于小鼠右侧耳壳，左侧不涂作为对照。致炎30min后处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径6mm的打孔器打下左右耳同一部位的圆片，在分析天平上称重，以耳廓肿胀率比较药物的抗炎作用。肿胀率(%)=(右耳重量-左耳重量)/左耳重量X100。/。；肿胀抑制率(％)二(给药组肿胀率-模型对照组肿胀率)/模型对照组肿胀率X100%实验数据采用SPSS13.0进行统计分析，组间多项数据比较采用单因素方差分析，数据以(Hs)表示，尸<0.05作为显著性差异。实验结果结果见表l。表l.木瓜总酚酸提取物对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响组别肿胀率(％)肿胀抑制率(％)模型对照组51.1±23.1阳性对照组23.3±10.1"54.4低剂量组38.7±12.8*24.3中剂量组22.9±9.8**55.2高剂量组12.8±4.6"75.0与模型对照组相比**尸<0.01;*尸<0.05由表1可见，本发明提取物三个剂量组与模型对照组相比，均能显著降低小鼠耳廓肿胀程度0°<0.01、尸<0.05)，高剂量组的肿胀率甚至低于阳性对照组，表明木瓜总酚酸提取物有显著的抗炎作用。(二)木瓜总酚酸提取物对冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响。通过给小鼠灌胃给予不同剂量的木瓜总酚酸提取物，观察其对冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响。材料与方法木瓜总酚酸提取物、阿司匹林、实验动物来源以及木瓜总酚酸提取物、阿司匹林的给药剂量同实验(一)；伊文思蓝上海新中化学厂产品，批号1-64-10-16，用生理盐水配成0.5%伊文思蓝溶液；冰醋酸汕头市光华化学厂产品，批号20060525，用生理盐水配成0.7%冰醋酸溶液。各组按上述给药剂量连续灌胃给药7d，每天一次。各组末次给药后lh，于小鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液，按小鼠体重给药剂量为0.lml/10g，随后立即腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.lml/只，20min后脱颈椎处死，腹腔注入5ml生理盐水，轻揉腹部lmin后剪开腹部，收集腹腔洗出液5ml，1500r/min离心10min，取上清液用722型光栅分光光度计于590nm波长下比色测定0D值。抑制率(%)=(给药组0D值-模型对照组0D值)/模型对照组0D值X100%。实验数据采用SPSS13.0进行统计分析，组间多项数据比较采用单因素方差分析，数据以(^s)表示，尸<0.05作为显著性差异。实验结果结果见表2.表2.木瓜总酚酸提取物对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响组别OD值抑制率(％)0.044±0.0090.Oll士O.006"750.032±0.008*27.30.020±0.007"54.5模型对照组阳性对照组低剂量组中剂量组高剂量组0.014±0.005"68.2注与模型对照组相比**尸<0.01;*尸<0.05由表2可见，与模型对照组比较，木瓜总酚酸提取物各剂量组均能显著抑制小鼠腹腔毛细血管通透性的增加(尸<0.01、尸<0.05)，且高剂量组抗炎强度与阳性对照组相近。木瓜总酚酸提取物对毛细血管渗出的抑制是抗炎作用的一个方面，说明其具有抗炎作用。(三)木瓜总酚酸提取物对大鼠慢性炎症模型-棉球肉芽肿的作用通过给大鼠灌胃给予不同剂量的中药木瓜总酚酸提取物，观察其对大鼠慢性炎症模型-棉球肉芽肿的作用。材料1)木瓜总酚酸提取物同实验(一)2)水合氯醛中国医药集团上海化学试剂公司，批号20030227实验动物SD大鼠南方医科大学动物中心(清洁级，合格证号2006B023)实验方法SD大鼠50只，体重(160土20)g，雌雄各半，随机分成5组，即模型对照组、阳性对照组、木瓜总酚酸提取物低、中、高剂量组，每组10只大鼠。按大鼠体重，给药剂量分别为-阳性对照组，其推荐临床平均阿司匹林剂量为15mg/Kg/人/日(人按60Kg体重计算)，转换为大鼠剂量为90mgZkg;木瓜总酚酸提取物组，根据预实验结果，木瓜总酚酸提取物低、中、高剂量组分别为50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg;模型对照组给予等量生理盐水。各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹部剪毛并用碘酒消毒，再用75%酒精脱碘。于腹中线切开皮肤约lcm长，止血钳扩充皮下组织至双侧腹股沟皮下并植入灭菌棉球(每个棉球10mg，高压灭菌)，随即缝合皮肤。从手术当天开始各组灌胃给予相应药物，连续给药七天，每天一次，按大鼠体重给药剂量为0.lml/100g。第八天处死大鼠，将棉球连同结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，称湿重，置6(TC烘干12h，称湿、干重。按mg/100g体重表示，计算抑制率(％)，进行组间比较。肉芽肿净湿重=(棉球肉芽肿总湿重一原棉球净重)/大鼠体重X100肉芽肿净干重二(棉球肉芽肿总干重一原棉球净重)/大鼠体重X100湿重抑制率(％)=(给药组肉芽肿净湿重—模型对照组肉芽肿净湿重)/模型对照组肉芽肿净湿重X100%千重抑制率(％)=(给药组肉芽肿净干重一模型对照组肉芽肿净干重)/模型对照组肉芽肿净干重xio(m实验数据采用SPSS13.0进行统计分析，组间多项数据比较采用单因素方差分析，数据以(m)表示，尸<0.05作为显著性差异。实验结果结果见表3。表3木瓜总酚酸提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响级别肉芽肿净湿重(mg/100g)湿重抑制率(%)肉芽肿净干重(mg/100g)干重抑制率(%)模型对照组0.072±0.0120.016±0.002阳性对照组0.051±0.007**29.20.011±0.002*31.3低剂量组0.062±0.018*13.90.015±0.002"6.2511中剂量组0.056±0.Oil**22.20.012±0.002*25.0高剂量组0.052±0.008"27.80.011±0.002*31.3注与模型对照组相比**尸<0.01;*尸<0.05由表3可见，与模型对照组比较，木瓜总酚酸提取物组各剂量组均能显著抑制小鼠腹腔毛细血管通透性的增加(尸〈0.01、尸<0.05)，且高剂量组抗炎强度与阳性对照组相近。结果表明木瓜总酚酸提取物各剂量组对大鼠棉球肉芽肿有明显的抑制作用，说明木瓜总酚酸提取物有显著的抗炎作用。(四)木瓜总酚酸提取物对冰醋酸所致小鼠炎症疼痛的影响通过给小鼠灌胃给予不同剂量的木瓜总酚酸提取物，观察其对冰醋酸所致小鼠炎症疼痛的影响。材料与方法冰醋酸油头市光华化学厂产品，批号20060525;木瓜总酚酸提取物、阿司匹林、实验动物来源以及木瓜总酚酸提取物、阿司匹林的给药剂量同实验(一)。连续灌胃给药五天，每天一次，第六天给药后30min，每组按体重均腹腔注射0.6%冰醋酸0.lml/10g，并在注射冰醋酸5min后观察并记录10min内各组小鼠的扭体次数及计算各药物组的扭体抑制率，进行组间比较。抑制率(%)二(给药组小鼠扭体次数-模型对照组小鼠扭体次数)/模型对照组小鼠扭体次数X100%实验数据采用SPSS13.0进行统计分析，组间多项数据比较采用单因素方差分析，数据以(7±^)表示，尸<0.05作为显著性差异。实验结果结果见表4.表4.木瓜总酚酸提取物对冰醋酸诱发小鼠扭体反应的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>与模型对照组相比**户<0.01由表4可见，木瓜总酚酸提取物的三个剂量组与模型对照组比较，均能显著降低冰醋酸诱发的小鼠扭体反应次数(户<0.01)，且高剂量组与阳性对照组基本一致，表明木瓜总酚酸提取物具有明显的镇痛作用。鉴于上述动物实验结果，本发明木瓜总酚酸提取物具有抗炎活性，因此可用于制备抗炎药物或食品。权利要求1.一种木瓜总酚酸提取物的制备方法，步骤如下按常规将木瓜果实粉碎后，以30％-80％含水乙醇常温下浸泡24-48小时，得浸泡液，再于常温下用30％-80％含水乙醇渗漉提取2-5次，合并浸泡液和渗漉液，即为木瓜提取液。2.纯化将上述木瓜提取液浓縮后离心或过滤，弃沉淀，将上清液或滤液用聚苯乙烯多孔性大孔树脂吸附，以蒸馏水淋洗去除杂质，然后再以5%-20%含水乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓縮至无醇味，按同法再用大孔树脂吸附和洗脱，合并洗脱液并浓縮至无醇味，干燥后即为木瓜总酚酸提取物。3.权利要求l所述方法制得的木瓜总酚酸提取物。4.权利要求2所述木瓜总酚酸提取物在制备抗炎药物或食品中的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，是木瓜的总酚酸提取物及其在制备抗炎药物或食品中的应用。本发明用木瓜果实制备木瓜总酚酸提取物，经成分分析，本发明木瓜提取物主要成分为原儿茶酸、氯原酸等多种酚酸类化合物，其中含原儿茶酸30-35％，含氯原酸20-25％，酚酸类化合物占木瓜提取物的50-60％，故称为木瓜总酚酸提取物。经动物实验，木瓜总酚酸提取物具有显著的抗炎活性，因此可用于制备抗炎药物或食品。本发明为寻求新的抗炎药物提供了一个新途径。文档编号A61K36/732GK101450127SQ200910045169公开日2009年6月10日申请日期2009年1月12日优先权日2009年1月12日发明者孙连娜,霞李,杨颖博,彦邱,陈万生申请人:中国人民解放军第二军医大学