青蒿素及其衍生物对化疗剂的协同作用的制作方法

专利名称：青蒿素及其衍生物对化疗剂的协同作用的制作方法
技术领域：
本申请涉及医疗领域，具体说，是青蒿素及其衍生物在化疗中作为增效剂的用途。
背景技术：
青蒿属菊科又名黄花蒿(Artemisia anaua L)是1年生草本植物。青蒿素是我国 药学工作者于20世纪70年代初从中药青蒿中提取的倍半萜内酯类抗疟药物，并在此结构 基础上又相继合成、半合成出一系列具有抗疟活性的衍生物，如双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿 甲醚、双氢蒿甲醚、蒿乙醚等(Ringwald P，Bickii J, Basco LK.等双氢青蒿素针对喀麦隆 雅温德的恶性疟原虫临床分离物的体外活性(In vitroactivity of dihydroartemisinin against clinical isolates of Plasmodiumfalciparum in Yaounde, Cameroon.)美国 热带医学卫生杂志(Am J Trop Med Hyg) 1999 ；61 187-92 ；Kokwaro GO.青蒿素衍生物在 治疗疱疾中的用途(Use ofartemisinin (qinghaosu) derivatives in the treatment of malaria.)非洲健康科学杂志(Afr J Health Sci) 1998 ；5 :8_11 ；Haynes RK，ChanWC，Lung CM，等，青蒿酮和其他青蒿素的Fe3+介导的降解，PfATP6结合，和抗疟疾活性C_中心基团作 为生物活性中间物的不可能性(The Fe2+- mediated decomposition,PfATP6binding,and antimalarial activities of artemisone and other artemisinins :the unlikelihood of C-centered radicals as bioactive intermediates. ) U 学医学 U 学(Chem Med Chem)2007；2 1480-97.)。青蒿素及其衍生物的抗疟活性已得到世界公认，具有起效快、药效高、毒副作用低 等优点。除广泛应用于抗疟治疗外，青蒿素类药物还具有其它多种药理作用，如抗血吸虫 作用，抗心律失常、平喘，抗内毒素，抗变态反应、红斑狼疮、免疫抑制等作用。随着对青蒿 素及其衍生物活性研究的不断深入，揭示了该类化合物还具有一定的抗肿瘤作用，对多种 肿瘤细胞的生长具有抑制作用。Efferth等(EfferthT，Olbrich A, Bauer R.，人肿瘤细 胞系对抗疟疾药物青蒿琥酯、蒿乙醚、和蒿甲醚响应的mRNA表达模式(mRNA expression profiles for the response of humantumor cell lines to the antimalarial drugs artesunate, arteether, andartemether) LUfl^f (Biochem Pharmacol. ) 2002 Aug 15 ；64 617-23)研究了青蒿琥酯、蒿乙醚及蒿甲醚对55种肿瘤细胞的细胞毒作用，结果 显示三种化合物对55种肿瘤细胞的增殖均有抑制作用，青蒿琥酯作用最为显著，平均半 抑制浓度IC50是12.3 μ M，对包括白血病、结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、 乳腺癌、宫颈癌、人低分化鳞状上皮鼻炎癌等在内的多种肿瘤细胞有选择性杀伤作用，青 蒿琥酯对白血病细胞和直肠癌细胞有明显的细胞毒作用，其半抑制浓度(IC50)分别为 1. 11 士0. 56 和 2. 13 士0. 74 μ M。Efferth 等(Efferth T, OlbrichA, Bauer R.，人肿瘤细 胞系对抗疟疾药物青蒿琥酯、蒿乙醚、和蒿甲醚响应的mRNA表达模式(mRNA expression profiles for the response of human tumor cell linesto the antimalarial drugs artesunate, arteether, and artemether) ^L it M (Biochem Pharmacol. )2002 Aug 15 ；64 617-23)分析了青蒿琥酯、蒿乙醚及蒿甲醚作用前后464个药物活性相关基因(包括耐药基因，DNA损伤修复基因，凋亡调节基因，增殖相关基因，原癌基因，抑癌基因 及细胞因子)的表达谱，发现208个基因与三种青蒿素类药物抗肿瘤活性相关，主要涉及 增殖相关基因、癌基因及抑癌基因，如过氧化氢酶、谷胱氨酸合成酶、硫氧还蛋白过氧化物 酶以及硫氧还蛋白还原酶等。Singh NP和Nam W等(Singh NP, Lai HC.，青蒿素诱导人 癌细胞的凋亡(Artemisinin induces apoptosis in human cancer cells.)抗癌石if究 (Anticancer Res) 2004 ；24 2277-80 ；Nam W, Tak J, Ryu JK，等，青蒿素及其衍生物对口 腔癌细胞的生长抑制和凋亡的作用(Effects of artemisinin and itsderivatives on growth inhibition and apoptosis of oral cancer cells.)头颈杂志(Head Neck) 2007 ； 29 :335-40.)研究发现，青蒿素类药物可以诱导肿瘤细胞凋亡，但其抑癌作用的分子机制 仍不清楚。Dell’ Eva R等发现青蒿琥酯能够抑制卡波氏肉瘤细胞的生长，其抑癌作用 也是通过诱导细胞凋亡实现的，并且发现青蒿琥酯在体内能够明显降低肿瘤组织血管生 成，由此推断抑制血管生成是青蒿素类药物发挥抗肿瘤作用的机制之一(D ell’ Eva R， Pfeffer U, VeneR,.等，抗疟疾药物蒿琥酯对卡波济肉瘤移植肿瘤的体内血管生成和生 长的抑制(Inhibition ofangiogenesis In Vivo and growth of Kaposi' s sarcoma xenograft tumors by theanti-malarial artesunate. ) LUfl^iljf^^·^ (Biochem Pharmacol) 2004 ；68 =2359-66.)。Huang等发现双氢青蒿素能够显著抑制大鼠C6胶质瘤 细胞的增殖并诱导细胞凋亡，双氢青蒿素作用后，Hif-Ia及下游基因VEGF表达均降低 (Huang XJ, Ma ZQ, Zhang WP, Lu YB, Wei EQ.，双氢青蒿素在C6胶质瘤细胞中产生细胞毒 性作用，并抑制缺氧诱导因子-1 α 活化(Dihydroartemisinin exertscytotoxic effects and inhibits hypoxia inducible factor-lalpha activationin C6 glioma cells.) 物药物学杂志(J Pharm Pharmacol) 2007 ；59 =849-56.)。双氢青蒿素能够有效抑制卵巢癌 细胞的生长，其抑制作用是正常卵巢细胞的5-10倍，进一步研究发现该药物能够诱导卵巢 癌细胞凋亡及细胞周期G2期阻滞(Jiao Y，Ge CM, Meng QH，Cao JP,Tong J，Fan SJ.双氢 青蒿素是卵巢癌细胞生长的抑制剂(Dihydroartemisinin is an inhibitor of ovarian cancer cell growth.)中国药理学报(Acta Pharmacol Sin) 2007 ;28 :1045-56.)，该化合 物对人淋巴母细胞性白血病细胞系Molt-4也有一定的细胞毒作用(Lai H，Singh NP.接 触双氢青蒿素和含铁转铁蛋白引起的选择性癌细胞细胞杀伤作用(Selective cancer eel !cytotoxicity from exposure to dihydroartemisinin and holotransferrin·)癌症 通信(Cancer Lett) 1995 ；91 :41_6.)。青蒿素分子内的过氧基团在血红素铁介导下分解产 生自由基，进而破坏蛋白质等生物大分子，引起一系列细胞反应，导致细胞凋亡。由于肿瘤 细胞内铁浓度较正常细胞高出许多，所以对青蒿素类化合物的细胞毒作用更为敏感。研究 发现，双氢青蒿素与含铁转铁蛋白(holo-transferrin)联合应用能够选择性杀伤人急性 淋巴母细胞白血病细胞Molt-4，而对人正常淋巴细胞的细胞毒作用较低，但青蒿素类药物 对肿瘤细胞具体作用靶点、信号通路及作用机制还有待进一步研究。青蒿素类化合物的主 要代谢产物是双氢青蒿素，因此双氢青蒿素显示出了比原型药更好的活性，但不同的肿瘤 对不同青蒿素类药物敏感性不同。以下是本领域几种已知的青蒿素和青蒿素衍生物的化学式 在肿瘤和癌症治疗中，寻找有效的治疗方案，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性， 和克服肿瘤的耐药性是研究人员和临床实践人员长期以来的目标。例如，卵巢癌是全世界 的妇女健康的重要威胁。在美国，它已成为第四大致死性女性癌症(Jemal A，Siegel R， Ward Ε, Murray Τ, Xu J, Thun MJ.癌症统计学(Cancerstatistics)，2007.加拿大癌症 临床杂志(CA Cancer J Clin.) 2007 ;57 :43_66)。被诊断于病发早期的卵巢癌患者的5 年存活率达80% -90%，相比之下，被诊断为晚期的卵巢癌患者存活率却只有不到25% (Mutch DG.卵巢癌的吉西他宾组合化疗(Gemcitabine combination chemotherapy of ovarian cancer.)妇产科癌症(Gynecol Oncol.) 2003 ;90 :S16_20)。而且不幸的是，大 多数卵巢癌患者在诊断出是卵巢癌是已至晚期(Mutch DG.卵巢癌的吉西他宾组合化疗 (Gemcitabinecombination chemotherapy of ovarian cancer.
)妇产科癌症(Gynecol
Oncol.) 2003 ；90 :S16_20)。虽然卵巢癌患者的死亡率在过去的数十年并没有发生太大 的改变，但是患者的生存期却是得到了稳定的延长改善，这其中大部分的原因要归功于大 量新的、更有效的作为手术后辅助性治疗的化疗药物的临床应用(Mutch DG.卵巢癌的吉 西他宾组合化疗(Gemcitabine combination chemotherapy of ovariancancer.)妇产 科癌症(Gynecol Oncol.) 2003 ；90 :S16-20 Johnston S R.卵巢癌英国国家临床技术 研究院(NICE)指导推荐的综述(Ovarian cancer :review of theNational Institute for Clinical Excellence(NICE)guidancerecommendations.)癌症 i周查(Cancer Invest.) 2004 ；22 :730_42)。例如，卡钼(CBP)便是其中一种很重要的用来治疗早期卵巢癌 和癌症转移的辅助化疗药物(Sorenson CM, Eastman Α.，顺二胺二氯钼(II)诱导的细胞毒 性机制G2停滞和DNA双链断裂的作用(Mechanism of cis-diaminedichloroplatinum(II )-inducedcytotoxicity :role of G2 arrest and DNA double-strand breaks.)癌症研究 (Cancer Res.) 1988 ；48 :4484_8)。卡钼的主要作用机制是促使细胞内DNA加合物的形成， 导致癌细胞周期阻断在G2期并引起随后细胞调亡。虽然卡钼的疗效很好，但其仍不可避免 地会产生诸如神经毒性和肾毒性在内的负作用(Pavelka M，Lucas MF, Russo N.关于第二代抗癌药物卡怕的水角军机制(On the HydrolysisMechanism of the Second-Generation Anticancer Drug Carboplatin.) it ψ (Chemistry.)2007 ；13 10108-101165-7 ； 6. Agarwal R, Kaye SB.卵巢癌克月艮化疗抗性的策略(Ovarian cancer strategies for overcoming resistance tochemotherapy.)癌症国家研究(Nat Rev Cancer. ) 2003 ；3 502-16)。因此，仍然需要能够减少负作用的化疗方案。肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的高发区，其发病率已上升到恶性肿 瘤的第二位(McCracken M, Olsen M, Chen MS Jr，等中国、菲律宾、越南、韩国、和日本人种的 亚裔美国人中的癌症发生率、死亡率、和相关危险因素(Cancerincidence，mortality, and associated risk factors among Asian Americans ofChinese, Filipino, Vietnamese, Korean, and Japanese ethnicities.) CA 临床癌症杂志(CA Cancer J Clin) 2007 Jul-Aug ; 57:190-205.)。肝癌的发生与乙型肝炎病毒(h印atitis B virus，HBV)和丙型肝炎病 毒(hepatitis C virus, HCV)感染密切相关，此外环境因素如黄曲霉素、酒精、硒元素缺 乏等也是导致肝癌发生的重要因素。由于肝癌早期症状不明显，确诊的大多数病人已处 于中、晚期。原发性肝癌的首选治疗是手术切除，随着治疗技术的提高，目前术后5年生 存率已提高至50 % -60 %，但由于手术切除只适用直径不超过5cm，且癌灶数目不超过3 个的小肝癌(Ryder SD，英国胃肠道病学会，肝细胞肝癌(HCC)在成年人中的诊断和治疗 (British Society of Gastroenterology. Guidelines for the diagnosisand treatment of hepatocellular carcinoma (HCC) in adults.)胃肠道病学杂志(Gut) 2003 ;52 增刊 3 iiil-8.)，此外，是否适合直接手术切除还取决于癌灶部位的血管富集程度及病人个体差 异，这些限制导致90%左右的肝癌不适合手术治疗，因此非手术治疗方法是不可或缺的，即 使是可切除肝癌，术后实施以介入化疗为主的综合性治疗也是必要的。在肝癌的综合治疗中，化疗是最基本的治疗方法，以往对肝癌的化疗药物评价不 高，鲜有药物能够有效抑制肝癌的生长和进一步恶化，肝癌对传统化疗药物的反应率低及 毒副作用显著是制约抗肿瘤药物临床应用的主要原因。肝癌耐药性与多种耐药基因的表 达密切相关，MDRU MRP、LRP、GSTPl和Topo II α等耐药基因在肝癌中高表达(Ryder SD, 英国胃肠道病学会，肝细胞肝癌(HCC)在成年人中的诊断和治疗(British Society of Gastroenterology. Guidelines for the diagnosis andtreatment of hepatocellular carcinoma (HCC) in adults.)胃肠道病学杂志(Gut) 2003 ;52 增刊 3 :iiil_8.)。目前肝 癌化疗药物的反应率基本在10%左右，即使联合化疗也不能有效提高反应率，鲜有药物能 够明显延长肝癌病人存活期(GuoWJ，Yu EX.化疗栓塞和辐射联合治疗对大肝细胞癌的评 ^古(Evaluation ofcombined therapy with chemoembolization and irradiation for largehepatocellular carcinoma.)英国放射医学杂志(Br J Radiol) 2000 ；73 1091-7 ； Aguayo A, Patt YZ.肝细胞癌的非手术治疗(Nonsurgical treatment ofhepatocellular carcinoma).癌症专题(Semin Oncol) 2001 ;28 :503_13.)。此外，因肝癌病人大多合并肝 硬化，使肝脏代谢药物的能力变差，增添治疗的困难性。因此，有必要开发新的高效低毒药 物，增加化疗药物的敏感性和选择性，降低或逆转耐药效应，从天然产物中寻找抗肿瘤活性 成分和耐药逆转剂是当前抗肿瘤药物研究的重要发展战略之一(Notas G,Nifli AP5Kampa M,Vercauteren J,KouroumalisE,Castanas E.白藜芦醇对IfepG2肝细胞癌细胞通过诱导细 胞周期停滞和NOS活化发挥其抗增殖作用(Resveratrol exerts its anti-proliferativeeffect onHepG2 hepatocellular carcinoma cells, by inducing cell cycle arrest, andNOS activation.)生物化学生物物理学报(Biochem Biophys Acta) 2006 ； 1760 1657-66 ；Varghese L, Agarwal C, Tyagi A, Singh RP, Agarwal R. HIH )(寸入月干_— 的作用(Silibinin Efficacy against HumanHepatocellular Carcinoma.)丨临床癌症石if 究(Clin Cancer Res) 20051 ；11 :8441_8·)。近年来，随着吉西他宾(gemcitabine)等新 药的出现，肝癌药物治疗已取得一定进展，原发性肝癌的药物反应率已升至15-20%，但是 仍然较低。目前的化疗药物难以满足单药化疗的要求，因此多药物联合化疗的治疗方案仍 然是肝癌治疗的主要研究方向。吉西他宾是一种新型人工合成嘧啶核苷类药物，具有广谱 的抗肿瘤活性，术后应用能够提高肝癌的治疗效果，降低复发率和转移率，患者中位生存时 间可延长至34周(Yang TS, Lin YC, Chen JS, Wang HM, Wang CH.吉西他宾对患有恶化肝 细胞癌的病人的二其月研究(Phase II study of gemcitabine inpatients with advanced hepatocellular carcinoma.)癌症杂志(Cancer) 2000 ；89 :750_6 ；Ulrich-Pur H, Kornek GV, Fiebiger W, Schull B, Raderer Μ, Scheithauer W.双周一次的高剂量吉西他宾对恶 VcWf^MM^aff (Treatment ofadvanced hepatocellular carcinoma with biweekly high-dose gemcitabine.)癌症学(Oncology) 2001 ；60 :313_5·)。然而，吉西他宾的药物反 应率仍然不够理想，还需要寻求与其它药物联合应用，提高肝癌治疗效果的方案。
因此，对于肿瘤化疗来说，还需要寻求更好的化疗增效剂和更好的治疗方案，从而 提高肿瘤对化疗的敏感度并降低其对化疗的耐药性。目前，尚没有对于青蒿素及其衍生物与化疗剂联用治疗肿瘤的任何报道。

发明内容
因此，本发明在此提供了青蒿素及其衍生物用于制备化疗增效剂的用途。优选青蒿素衍生物是那些具有青蒿素相同或相当活性的衍生物。更优选的，选自 双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢蒿甲醚、和蒿乙醚。在本发明的一个方面，化疗增效剂与化疗剂联用。优选化疗剂是本领域已知的化 疗中使用的制剂，更优选选自卡钼、吉西他宾、甲二氯二乙胺(ΝΗ2)、环磷酰胺、异环磷酰胺、 苯丙氨酸氮芥(L-苯基丙氨酸氮芥)、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰胺、硫替派、二甲磺酸丁酯、 亚硝脲氮芥(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、甲基环己亚硝脲(甲基-CCNU)、链脲菌素(链脲霉 素)、氮烯唑胺(DTIC二甲基三氮烯基咪唑羧酰胺)、氨甲喋呤(甲氨喋呤)、氟尿嘧啶(5-氟 尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)、吉西他宾、 巯基嘌呤(6-巯基嘌呤；6-ΜΡ)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)、喷司他丁(2-去氧助间型霉 素)、长春花碱(VLB)、长春花新碱、表鬼白毒素吡喃葡糖苷、更生霉素(放线菌素D)、红必霉 素(柔红霉素；红比霉素)、阿霉素、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)、丝裂霉素C、L-天门 冬酰胺酶、干扰素、顺钼(cis-DDP)、卡钼、米托蒽醌、羟基尿素、甲基苄胼(N-甲基胼，MIH)、 米托坦(ο，p' -DDD)、氨鲁米特、强的松、己酸孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、己烯雌酚、乙炔雌二 醇、它莫西芬、丙酸睾酮、氟羟甲睾酮、氟他胺、醋酸亮丙瑞林。在该方面的一个优选例中，化疗剂是卡钼，青蒿素衍生物是双氢青蒿素。在该方面的另一个优选例中，化疗剂是吉西他宾，青蒿素及其衍生物选自青蒿素 和双氢青蒿素。
在该方面的还有一个优选例中，化疗剂用于治疗肿瘤。优选肿瘤选自卵巢癌、肝 癌、霍奇金病、急性和慢性淋巴细胞白血症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成 神经细胞瘤、乳房癌、卵巢癌、肺癌、Wilms肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、软组织肉瘤、原发性巨球蛋 白血病、膀胱癌、慢性粒细胞性白血病、原发性脑肿瘤、小细胞性肺癌、胃癌、结肠癌、恶性胰 岛素细胞瘤、恶性类癌瘤、恶性黑色素瘤、急性淋巴细胞白血病、绒毛膜癌、蕈样霉菌病、头 颈肿瘤、肺癌、骨原性肉瘤、胰腺癌、毛细胞白血病、横纹肌肉瘤、、成神经细胞瘤、皮肤多发 性出血性肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织、骨和其它肉瘤、泌尿生殖系统癌、甲状腺癌、食道癌、皮 肤癌、恶性高钙血症、类癌、肾细胞癌、子宫粘膜癌、真性红细胞增多症、血小板本质增多症、 恶性黑色素瘤、和肾上腺皮质癌。更优选的，肿瘤是卵巢癌或肝癌。


图IA-E显示了四种青蒿素类化合物对人肝癌细胞具有选择性杀伤作用。图IA-E 分别是人肝癌细胞 ifepG2 (A)，Hep3B (B)，Huh-7 (C)，BEL-7404 (D)及人正常肝细胞 7702 (E)。图2显示了青蒿素和双氢青蒿素抑制人肝癌细胞增殖，并对吉西他宾的抗肝癌活 性的增效作用。图3显示了青蒿素和双氢青蒿素诱导人肝癌细胞凋亡，并对吉西他宾的抗肝癌活 性的增效作用。图4显示了青蒿素和双氢青蒿素联合吉西他宾对于裸鼠人肝癌移植瘤的协同抑 制作用。图4A显示了荷H印G2移植瘤裸鼠用50mg/kg青蒿素联合80mg/kg吉西他宾进行 治疗，图4B显示了荷!fep3B移植瘤裸鼠用50mg/kg青蒿素联合80mg/kg吉西他宾治疗，图 4C显示了 H印G2移植瘤裸鼠用50mg/kg双氢青蒿素联合80mg/kg吉西他宾治疗，图4D显示 了荷!fep3B移植瘤裸鼠用50mg/kg双氢青蒿素联合80mg/kg吉西他宾进行治疗。图5显示了青蒿素和双氢青蒿素以及联合吉西他宾的体内毒副作用示意图。其中 (A)显示了荷H印G2移植瘤裸鼠用50mg/kg、100mg/kg青蒿素单药治疗，及青蒿素联合吉西 他宾治疗，各组裸鼠体重变化趋势，(B)显示了荷H印3B移植瘤裸鼠用50mg/kg、100mg/kg青 蒿素单药治疗，及青蒿素联合吉西他宾治疗，各组裸鼠体重变化趋势，(C)显示了荷H印G2 移植瘤裸鼠用双氢青蒿素单药或与吉西他宾联合治疗，裸鼠体重变化情况，(D)显示了荷 Hep3B移植瘤裸鼠用双氢青蒿素单药或与吉西他宾联合治疗对裸鼠体重的影响。图6显示了 DHA与CBP联合给药对于卵巢癌的作用。图6A显示了 DHA与CBP联 用时对于卵巢癌细胞的杀伤作用。图6B显示了 DHA与CBP联用时对于卵巢癌细胞的生长 抑制作用。图6C显示了流式细胞计数中用Armexin-V进行染色并对凋亡细胞进行的流式 细胞计数。图6D显示了两种癌细胞的凋亡指数。图7A和图7B分别显示了用DHA、CBP单独、DHA和CBP联合治疗A2780和0VCAR-3 卵巢癌裸鼠肿瘤的效果。左栏是肿瘤重量对天数作图，右栏是裸鼠的体重对天数作图。
具体实施例方式本发明的青蒿素及其衍生物可作为化疗增敏剂，提高化疗的效率，同时保证化疗 的安全性。下面的实施例给出了截然不同的两种化疗剂和治疗不同肿瘤的效果。本发明的 青蒿素具有广谱的化疗增敏作用。
为了将本发明与另一化疗试剂联用，可将联合另一化疗剂的青蒿素或其衍生物给予动物，采用的形式要能在动物中有效发挥它们的联合抗肿瘤作用。因此以有效剂量提供 这些试剂，并且在一段时间内让它们在肿瘤脉管系统和肿瘤环境中有效发挥联合作用。为 了实现这一目的，可将单一组合物或两种不同的组合物用不同的给药途径，同时对动物给 予青蒿素和化疗剂。另外，青蒿素或其衍生物的给药可在化疗前或后(间隔范围从几分钟到几周)进行。在分别向动物给药的实施例中，一般要确保各次递药的时间间隔不是很长，这样化疗剂 和青蒿素或其衍生物依旧能够发挥良好的联合抗肿瘤作用。在这种情况下，考虑两种试剂 接触肿瘤的时间为每种约5分钟到约1周，较佳的是约12-72小时(每种)，延长时间较佳 的是24-48小时。在一些情况中，可能需要显著地延长治疗时间，在各次给药之间的时间间 隔为几天(2、3、4、5、6或7)或几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。可想象化疗剂或青蒿素给药一 次以上是需要的。为了实现肿瘤的消退，可将两种试剂联合都以有效剂量给药以抑制肿瘤 的生长，而不考虑给药的时间。许多制剂适合用于本文所述的联合治疗。可考虑的化疗剂包括，如吉西他宾、卡 钼、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、喜树碱、放线菌素-D、丝 裂霉素C和顺氯钼氨(CDDP)等。如本领域的普通技术人员所知，化疗剂的适合剂量一般是单独给予化疗或与其它 化疗剂联合给药的临床治疗中所用量的上下。其它有用的制剂包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这些化 疗化合物包括阿霉素(也称为亚德利亚霉素)、表鬼白毒素吡喃葡糖苷、异搏定、鬼臼霉 素等。这些化合物被广泛用在临床治疗肿瘤，通过丸剂静脉注射给药，剂量范围为阿霉素 25-75mg/m221天间隔，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷35-50mg/m2静脉注射或以两倍静脉剂量口 服。也可用扰乱多核苷酸前体合成和保真性的制剂。特别有用的制剂是那些经历过广 泛测试和易于获得的的制剂。制剂如5-氟尿嘧啶(5-FU)优选地用于肿瘤组织，该试剂对 靶向肿瘤细胞特别有效。虽然有毒，但5-FU可配制在各种载体中应用，包括局部应用，一般 用的静脉注射剂量范围为3-15mg/kg/天。表1中列出了用于联合治疗的示范性化疗剂。本文所列出的每种制剂仅是举例 不起任何限制。从这一角度说，本领域技术人员可参见“Remington，sPharmaceutical Sciences"第15版，33章，624-652页。不同的剂量应取决于治疗对象的状况。负责给药 的人在任何时候都应确定每个患者的适合剂量。另外，对人给药，制剂应满足无菌、致热原 性(pyrogenicity)、一般安全和纯度标准(如 FDAOff ice of Biological Standards 所要 求的)。表1用于肿瘤疾病的化疗剂 本文所述的“青蒿素衍生物”除了文中提到的那些以外，还包括本领域技术人员能 够通过简单的化学方法，例如取代、还原等方法对于骨架上的侧链基团进行修饰，而仍然保 留青蒿素活性的那些衍生物。这些衍生物的合成方法可以参考现有技术中的教科书。同时， 青蒿素衍生物还包括其各种酸碱形式的盐、水合物、光学异构体等。下文所述的实施例是为了更好的理解本发明，而不起限制作用。实施例实施例1青蒿素及其衍生物对肝癌细胞的杀伤作用本实验采用了 4种p53遗传背景不同的肝癌细胞系用于药物活性体外筛选，分别 是表达野生型P53的H印G2细胞，p53缺失的H印3B细胞，以及p53突变的BEL-7404和Huh_7 细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资 源中心)，对青蒿素(ART)、双氢青蒿素(DHA)、蒿甲醚(ARM)和青蒿琥酯(ARS)(浙江义乌高 登精细化工有限公司)的细胞毒作用进行筛选。四种青蒿素类化合物ART、DHA、ARM及ARS分别作用于人肝癌细胞H印G2(图1A)， H印3B (图1B)，Huh-7 (图1C)，BEL-7404 (图1D)及人正常肝细胞7702 (图1E)。细胞接种于 96孔板，加入不同浓度青蒿素类化合物ART、DHA、ARM及ARS (0，1，5，10，25，50，和100 μ mol/ L)，并设相同浓度的DMSO对照和不加细胞的空白对照。药物作用48小时后，吸去培养液加 入MTT于37°C温育3小时，然后吸去培养液，加入100 μ 1 DMS0，振荡使结晶充分溶解，读取 540nm光密度值(0D值)，结果来自三次独立实验。*，ρ < 0. 05对对照；**，ρ < 0. 01对对 照。结果显示，青蒿素(ART)对4种人肝癌细胞H印G2、H印3B、BEL-7404和Huh_7均具有显著抑制作用，半数抑制浓度IC50分别是13. 98 μ M、10. 4 μ M、8. 9 μ M和9. 9 μ Μ,而对 人正常肝细胞7702没有明显杀伤作用，半数抑制浓度IC50为60. 9 μ Μ,青蒿素对肝癌细胞 的杀伤作用是正常肝细胞的6倍。！fepG2细胞经不同浓度ART(1-100 μ Μ)作用48小时后， 细胞存活率从84. 7%降至15. 5% (ρ < 0.01)，相同条件下，青蒿素对H印3Β、BEL-7404和 Huh-7细胞也有明显的细胞毒作用。
对双氢青蒿素、蒿甲醚和青蒿琥酯三种青蒿素衍生物体外抗肝癌活性检测发现， 构型差异对化合物的抗肿瘤活性影响较大。双氢青蒿素DHA对人肝癌细胞有显著的生长 抑制作用，对肝癌细胞H印G2、H印3B、BEL-7404和Huh_7的抑制程度与青蒿素相当，但对正 常肝细胞的细胞毒性低于青蒿素，其半数抑制浓度高达167. 7 μ Μ，表明双氢青蒿素能够特 异性的抑制肝癌细胞的生长而对正常肝细胞没有明显杀伤作用。青蒿琥酯(ARS)对人肝 癌细胞!fepG2和!fep3B生长抑制作用较青蒿素和双氢青蒿素弱，半数抑制浓度IC50分别 为20. 5 μ M和39. 4 μ Μ，但对Huh_7和BEL-7404细胞显示出较强的生长抑制作用，药物作 用48小时后，半数抑制浓度分别为9. 22 μ M和15. 0 μ Μ,而对正常肝细胞7702的细胞毒性 甚微(IC50 > 500 μ Μ)。蒿甲醚(ARM)对人肝癌细胞的生长抑制作用较差，作用于H印G2、 Hep3B,BEL-7404 和 Huh-7 细胞后半数抑制浓度 IC50 分别为 54. 8 μ Μ、51· 5 μ Μ、31· 4 μ M 和 31. 8 μ Μ，其对正常肝细胞的杀伤作用较弱，IC50为492 μ Μ。四种青蒿素类化合物的20%、 50%、80%抑制浓度见表1。表1青蒿素及其衍生物双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚对人肝癌细胞H印G2、 H印3Β、BEL-7404、Huh-7及正常肝细胞7702生长的抑制率
细胞系抑制浓度(μΜ)ART DHA ARM ARS 比较四种青蒿素类化合物的半数抑制浓度(图2A-D)可见，青蒿素和双氢青蒿素 对肝癌细胞的生长抑制活性最高，且对正常肝细胞均无明显杀伤作用；青蒿琥酯次之；蒿 甲醚对肝癌细胞的细胞毒作用最弱。青蒿素及其衍生物对四种肝癌细胞的平均半数抑制浓 度分别为10. 8 μ M (ART)，10. 6 μ M (DHA) ,21. ΟμΜ (ARS)及 42. 3 μ M (ARM)，而四种青蒿素类 化合物对人正常肝细胞的半数抑制浓度在60. 9-500 μ M之间。
实施例2青蒿素及其衍生物联合吉西他宾(gemcitabine)对人肝癌细胞生长的抑 制作用如实施例1所示，青蒿素及双氢青蒿素体外单独应用均能够显著抑制肝癌细胞的 增殖，我们对其是否具有化疗增敏作用进行了检测，青蒿素及双氢青蒿素分别联合吉西他 宾作用于人肝癌细胞ifepG2和H印3B，观察联合用药对细胞生长的抑制作用。IfepG2细胞分别用10 μ mol/L ART (A)及10 μ mol/L DHA(B)单独处理不同时间(0， 24，48，72，96小时)，然后加入《17，读取不同作用时间的00值，绘制细胞生长曲线，相同条 件H印3B细胞分别用10 μ mol/L ART (C)及10 μ mol/LDHA (D)。10 μ mol/L青蒿素及双氢青 蒿素与10 μ g/L吉西他宾联合作用于H印G2和H印3B细胞(0，24，48，72，96小时)，用MTT 法进行检测。结果来自三次独立实验。*，P < 0. 05对对照；**，P <0.01对对照。图2显示了实验结果。结果显示，青蒿素对!fepG2细胞的生长抑制作用，至少部分是通过抑制细胞增殖 实现的药物处理24小时的生长抑制率已经达到69% (ρ < 0. 05)，作用48小时后的 生长 抑制率为92% (ρ < 0.05)，作用72小时后的抑制率为96% (ρ < 0.05)(见图2Α)；双氢 青蒿素也能够有效抑制HepG2细胞的增殖药物作用不同时间点的抑制率分别为，24小时 74% (ρ < 0. 05)、48 小时 93% (ρ < 0. 05)、72 小时 97% (ρ < 0. 05)(见图 2Β)，双氢青蒿 素对HepG2细胞增殖的抑制作用略高于青蒿素。青蒿素对H印3B细胞增殖也具有抑制作用，相同条件下，药物作用24小时的抑 制率为74% (ρ < 0.05)，48小时抑制率为81% (ρ < 0. 05)，72小时抑制率为94 % (ρ
<0. 05), 96小时抑制率达到98% (ρ < 0.05)(见图2C)；双氢青蒿素对H印3Β细胞增 殖抑制作用与青蒿素相当，24小时抑制率为71% (ρ <0.05)、48小时抑制率为84% (ρ
<0. 05)、96小时抑制率为99% (ρ < 0. 05)(见图2D)。以上结果表明青蒿素及双氢青蒿 素能够显著抑制人肝癌细胞增殖，对H印G2(p53WT)和H印3B(p53 null)细胞具有相同程度 的抑制作用，两种化合物的抑制作用无显著差异。因此，青蒿素及双氢青蒿素对人肝癌细胞 的抑制作用至少部分是通过抑制细胞增殖实现的。在与吉西他宾的协同作用上，发明人比较了吉西他宾单用和与青蒿素及其衍生物 联用的效果。吉西他宾单药作用于H印G2细胞显示出一定的生长抑制效应(见图2A)，青蒿素联 合吉西他宾对H印G2细胞具有显著生长抑制作用，两药联合表现出协同作用24小时的生 长抑制率为74% (p<0. 05)，48小时后的生长抑制率为95% (ρ < 0. 05)，处理72小时后的 抑制率为98% (ρ <0.05)，96小时后则完全抑制(100%，？<0.05)(见图2八)。双氢青蒿 素联合吉西他宾作用，在不同时间点均显示出最大的抑制活性，其对细胞增殖的抑制作用 不仅高于单药，还优于青蒿素与吉西他宾联合24小时的生长抑制率为76% (ρ < 0. 05)， 48小时后抑制率为95% (ρ <0.05)，处理72小时后抑制率为99% (ρ < 0. 05)，96小时后 抑制率达到100% (ρ < 0. 05)(见图2Β)。吉西他宾单独作用于H印3Β细胞也显示出较强的生长抑制效应(见图2C)，青蒿 素联合吉西他宾对Hep3B细胞增殖的抑制作用加强药物联合处理24小时的生长抑制率 为68% (ρ < 0. 05)，处理48小时后的生长抑制率为85% (ρ < 0. 05)，处理72小时后的抑 制率为96% (ρ < 0.05)，96小时抑制99% (ρ < 0. 05)(见图2C)。双氢青蒿素联合吉西他宾处理H印3B细胞，24小时的生长抑制率为73% (ρ < 0. 05)，作用48小时后抑制率为 87% (ρ < 0.05)，处理72小时后抑制率为99% (ρ < 0. 05)，96小时后抑制率为100% (ρ
<0. 05)(见图2D)，不同时间点的抑制作用均强于吉西他宾单药作用。吉西他宾单药对!fepG2细胞增殖抑制作用略强于!fep3B细胞，青蒿素联合吉西他 宾对HepG2细胞的增殖抑制作用也略强于Hep3B细胞。双氢青蒿素联合吉西他宾作用于两 种肝癌细胞，对IfepG2的抑制作用更为显著。比较青蒿素和双氢青蒿素对吉西他宾的增效 作用发现，在H印G2和Hep3B细胞中，双氢青蒿素联合吉西他宾均显示出最强的抑制增殖作 用，其活性高于双氢青蒿素单药、吉西他宾单药以及青蒿素联合吉西他宾。因此，青蒿素和 双氢青蒿素在体外均能增加吉西他宾的细胞毒作用，尤其是双氢青蒿素对吉西他宾具有更 强的化疗致敏作用，其高效低毒的特点使之有望作为化疗增敏剂，应用于肝癌的临床联合 化疗。实施例3青蒿素及双氢青蒿素联合吉西他宾诱导人肝癌细胞凋亡
发明人研究了青蒿素和双氢青蒿素对人肝癌细胞生长抑制作用与细胞凋亡的关 系，具体实验如下。结果如图3所示青蒿素及双氢青蒿素诱导人肝癌细胞H印G2 (A)和H印3B(B)发生凋亡处于对数 生长期的ifepG2和H印3B细胞分别用0，1，10，25，50 μ mol/L的青蒿素或双氢青蒿素处理48 小时，收集贴壁细胞及死亡细胞，进行Armexin V/PI双染色，流式细胞仪定量检测凋亡细胞 比例，早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞合并作为评估凋亡指数。青蒿素及双氢青蒿素对吉西他宾的增效作用!fepG2(C)和H印3B(D)细胞用 10 μ mol/L青蒿素或双氢青蒿素单独处理或联合10 μ g/L吉西他宾处理48小时，按上述方 法进行细胞凋亡定量检测。结果来自三次独立实验。*，ρ < 0. 05对对照；**，ρ < 0.01对 对照。青蒿素能够诱导肝癌细胞H印G2发生凋亡，且存在一定的量效关系对照组的凋 亡细胞数比例为7%，1 μ mol/L青蒿素作用后细胞凋亡率为9% (ρ < 0. 05)，10 μ mol/L时 凋亡率升至 14. 95% (ρ <0.01)，25 μ mol/L 时为 15. 45% (ρ < 0. 01)，50 μ mol/L 时凋亡细 胞比例最高(16. 45%，p<0.01)(图3A)。相同条件下用双氢青蒿素处理H印G2细胞，不同 浓度下凋亡指数为10 μ mol/L 时为 7. 45%，25 μ mol/L 为 14. 55%，50 μ mol/L 为 17. 70%, 凋亡指数显著高于对照细胞(P < 0. 01)(图3A)。Hep3B细胞经青蒿素作用后，凋亡细胞明显增多并呈现量效关系对照组凋亡指 数为0. 80%，1 μ mol/L青蒿素作用后凋亡指数有所升高(2. 25%，P < 0. 05), 10 μ mol/L 时凋亡指数为 2.65% (ρ <0.01)，25 μ mol/L 时凋亡指数为 4. 8% (ρ < 0. 01), 50 μ mol/ L时凋亡细胞比例最高(25. 35%, ρ < 0. 01)(图3B)。相同条件下双氢青蒿素也能够显著 诱导H印3B细胞发生凋亡1 μ mol/L双氢青蒿素作用后凋亡指数为(2. 15%，ρ < 0. 05)， 10 μ mol/L 时凋亡指数为 12. 90 % (ρ < 0.01), 25 μ mol/L 时凋亡指数为 28. 75 % (ρ
<0.01), 50 μ mol/L DHA 作用后多数细胞发生凋亡(31. 05%，ρ < 0.01)(图 3Β)。青蒿素和双氢青蒿素均能诱导肝癌细胞凋亡，凋亡指数呈现浓度梯度依赖型增 力口。两种药物诱导HepG2细胞凋亡的能力基本一致，但作用于H印3B细胞时双氢青蒿素较 青蒿素显示出更强的诱导凋亡作用，说明不同肝癌细胞对青蒿素类药物诱导凋亡的敏感性 存在差异，而且青蒿素类化合物对P53缺失的Hep3B细胞具有较强的诱导凋亡作用，提示该类化合物可以通过非P53依赖方式诱导细胞凋亡。细胞生长曲线显示，青蒿素及双氢青蒿素能够增强吉西他宾的细胞毒作用，为深入了解青蒿素类药物的增敏作用及其机制，我们检测了青蒿素及双氢青蒿素联合吉西他 宾对肝癌细胞凋亡的影响。吉西他宾单药处理HepG2细胞48小时，细胞的凋亡率均明显 高于对照组对照组凋亡率为6. 95%，吉西他宾单药作用后凋亡率显著升高(34. 2%，ρ < 0. 01)，与青蒿素联合处理!fepG2细胞，诱导凋亡能力增强联合用药组凋亡率则显著 增加至55. 5% (ρ < 0.01)，明显高于吉西他宾单药组(34.2%，ρ < 0.01)及青蒿素单药 组(14.95%，ρ <0.01)(图3C)。双氢青蒿素联合吉西他宾作用则表现出更强的诱导凋 亡作用，其凋亡率为61. 0%，显著高于对照细胞(6. 95%，ρ < 0. 01)、双氢青蒿素单药组 (7.45%，ρ < 0.01)、吉西他宾单药组(34.2%，ρ < 0.01)以及青蒿素联合吉西他宾组 (55. 5%，ρ < 0. 01)(图 3C)。在相同条件下，青蒿素及双氢青蒿素联合吉西他宾作用于Hep3B细胞也显示 出较强的诱导凋亡作用对照组凋亡率为0.8%，吉西他宾单药作用后凋亡率显著升高 (14. 7%,p<0.01),青蒿素联合吉西他宾作用后细胞凋亡率则升至31. 9% (ρ < 0. 01)(图 3D)，双氢青蒿素联合吉西他宾显示出更强的诱导凋亡作用，凋亡率为42. 25% (ρ < 0. 01) (图3D)。在H印3B细胞中，青蒿素及双氢青蒿素均显示出较强的增敏作用，显著提高吉西 他宾诱导肝癌细胞凋亡的能力，表现出一定的协同作用。双氢青蒿素与吉西他宾联合应用 显示出最强的诱导凋亡作用，与青蒿素比较，双氢青蒿素的增敏作用更强，再次证明了青蒿 素类药物体外具有化疗增敏作用。实施例4青蒿素及其衍生物化疗增敏作用的体内实验如上所述，发明人通过细胞实验证明青蒿素以及双氢青蒿素在体外都显示出对于 吉西他宾处理癌细胞的杀伤和诱导凋亡的增敏作用。在本实施例中，发明人通过裸鼠实验 进一步证明它们对于体内肿瘤的化疗也一样有效。实验方案人肝癌细胞!fepG2和H印3B分别接种于BALB/c裸鼠皮下，建立人肝癌移植瘤模 型，待肿瘤长至一定大小，根据不同组别用药。每隔两天测量肿瘤大小，治疗4周后，停止用 药，用药情况为1.对照组灌胃0. 2ml生理盐水/天。2.吉西他宾单药组开始治疗起第7、11、15天，腹腔注射吉西他宾，单次用量为 80mg/kgo3.青蒿素联合吉西他宾组灌胃ART 50mg/kg/day，第7、11、15天，腹腔注射吉西 他宾单次用量为80mg/kg。4.双氢青蒿素联合吉西他宾组灌胃DHA 50mg/kg/day，第7、11、15天，腹腔注射 吉西他宾单次用药量80mg/kg。每隔两天测量肿瘤大小，治疗4周后停止用药，根据不同时间点每组肿瘤大小平 均值绘制肿瘤生长曲线。2.实验结果如图4所示。荷H印G2移植瘤裸鼠经腹腔注射吉西他宾后肿瘤生长受到抑制，单药抑制率为34.9%，青蒿素联合吉西他宾治疗后抑瘤率明显提高(62. 3%，p <0.01)，高于吉西他宾单 药治疗及青蒿素单药治疗(30. 0%，p< 0.01)，二者表现出协调作用(见图4A)。青蒿素联 合吉西他宾对H印3B裸鼠移植瘤的生长抑制作用也强于单药治疗吉西他宾单药治疗的抑 瘤率为34. 9%，与青蒿素联合后抑瘤率提高至59. 1% (p<0. 01)，联合用药的抑瘤效果优 于吉西他宾单药治疗及青蒿素单药治疗(29. 4%,p<0. 01)(见图4B)，因此青蒿素在体内 能够增加吉西他宾的抗肝癌作用。双氢青蒿素联合吉西他宾应更能有效抑制肿瘤生长，对!fepG2裸鼠移植瘤的抑 制率高达78 .4%，明显高于吉西他宾单药治疗(34.9%，ρ < 0.01)、双氢青蒿素单药治疗 (36. 1%,ρ <0.01)以及青蒿素联合吉西他宾治疗(62.3%，p <0.01)(见图4C)。双氢青 蒿素联合吉西他宾对Hep3B裸鼠移植瘤的生长抑制率也高达70. 1 %，抑癌作用明显强于单 药治疗(吉西他宾34.9%，ρ < 0.01 ；DHA 34. 2%,p < 0.01)及青蒿素联合吉西他宾治疗 (59. 1%, ρ < 0. 01)(见图 4D)。结果表明，青蒿素和双氢青蒿素单药体内均具有抗肿瘤作用，双氢青蒿素的抑癌 作用强于青蒿素。青蒿素及双氢青蒿素均能增加吉西他宾的抑癌作用，联合吉西他宾治疗 效果优于单药，尤其是双氢青蒿素表现出显著的化疗致敏作用。实施例5青蒿素和双氢青蒿素联合吉西他宾治疗的体内毒副作用为了研究试验动物受化疗的毒性影响，发明人在药物治疗的过程中监测了裸鼠体 重变化情况。人肝癌细胞ifepG2和!fep3B分别接种于BALB/c裸鼠皮下，建立人肝癌移植瘤 模型，对青蒿素及双氢青蒿素不同剂量治疗组，及联合吉西他宾治疗组裸鼠体重进行监测， 每隔两天测量裸鼠体重，直至4周后停止用药。试验结果显示青蒿素和双氢青蒿素治疗过程中，动物身体无明显异常，与对照组 比较，青蒿素(图5A)和双氢青蒿素作用(图5B)的毒性均低于吉西他宾，各组小鼠体重略 有下降，但没有显著性差异，联合用药并未增加药物的毒副作用。荷IfepG2移植瘤裸鼠在药 物治疗前后，各组体重变化情况见表二，Hep3B移植瘤治疗前后各组体重见表三。表2!fepG2荷瘤裸鼠药物治疗前后体重变化情况 表3H印3B荷瘤裸鼠药物治疗前后体重变化情况 实施例6双氢青蒿素对于卡钼(CBP)处理卵巢癌细胞的增敏作用将人卵巢癌细胞系(来源于美国ATCC菌种保藏中心)A2780(p53正常)和 0VCAR-3 (p53突变型)以及永生化的人卵巢表面上皮细胞系I0SE144以一定密度(3000细 胞/孔)接种于96孔板，过夜后加入不同浓度的CBP (图6A 细胞存活抑制实验0、1、10、 50、100* 500ymol/L CBP ；图6B 细胞增殖活力抑制实验10 μ mol/L CBP)，同时每个CBP 浓度加入lymol/L的DHA ；并以加有DMSO (< 0. )但无药物处理的细胞为空白对照。药 物处理(37°C、5%的CO2)培养一定时间(图6A 细胞存活抑制实验培养48小时；图6B 细 胞增殖活力抑制实验培养0、24、48和72小时；)，吸去培养液加入MTT于37°C孵育3小时； 之后吸去培养液，加入100 μ 1 DMS0，振荡使结晶充分溶解，读取570nm光密度值(0D值)。 结果均来自三次独立实验。)试验结果如图6所示。如图6A和6B，当与DHA联用时，CBP非常显著地抑制了卵 巢癌细胞的活力。事实上，当细胞暴露于1 μ M CBP和1 μ M DHA时，Α2780细胞的存活率就 降低了 69%，而0VCAR-3细胞存活则减少了 72%。相比之下，I0SE144细胞则显得对治疗 较不敏感，两种药物均以1 μ M合用时存活率只降低了约28% (图6Α，P < 0. 05)。实施例7双氢青蒿素对于卡钼处理卵巢癌细胞的凋亡作用的增效作用将Α2780和0VCAR-3细胞以一定密度(5 X IO5)接种于6cm细胞培养皿；培养过夜 后加入0或500 μ mol/L的CBP、0或1 μ mol/L的DHA单独或联合(CDP+DHA)处理24小时； 收集细胞培养皿内贴壁细胞及上清悬浮细胞，进行Armexin-V/PI双染色；以流式细胞仪定 量检测收集细胞中凋亡细胞比例，早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞数所占细胞总数百分比作 为评估凋亡指数。DHA和CBP联合用药24小时后对0VCAR-3细胞凋亡有增效促进作用(图6C)。 用ΙμΜ DHA联合500 μ M CBP(1155% )作用后的细胞凋亡率显著高于单独用ΙμΜ DHA(266% )或500μΜ CBP(528% )的细胞凋亡率，而且超过了两种化合物的凋亡累加效 应，显示出的是一种潜在的增效作用。然而，Α2780细胞对联合治疗则显示的是累加效应而不是增效效应。这可能是由于它们对DHA化合物的敏感度较低的缘故(图6D，P < 0. 05)。 更长时间的作用可能产生更好的效果。实施例8双氢青蒿素对于卡钼治疗体内肿瘤的增效作用建立了 A2780和0VCAR-3卵巢癌裸鼠异体移植瘤模型来检测DHA是否能在体内 发挥其抗肿瘤效果。将人卵巢癌细胞A2780和0VCAR-3分别接种于BALB /c裸鼠(来源于 上海斯莱克实验动物中心)腹股沟皮下，建立人卵巢癌小鼠移植瘤模型；待肿瘤长至可触 摸大小时开始，根据不同处理(对照组、DHA10mg/kg组、DHA25mg/kg组、CBP120mg/kg组及 DHA25mg/kg+CBP120mg/kg组)组别对荷肿瘤小鼠进行用药治疗。治疗组小鼠每周给DHA治 疗5天(次)。CBP于第0天一次性给单一剂量(120mg/kg)。通过每天测量肿瘤的生长来 评价药物的治疗效果。图7显示了其治疗结果。如图7A(左栏)、B (左栏)所示，DHA(剂量为10和25mg/ kg)分别导致A2780异体移植肿瘤24%和41%的生长抑制(与给生理盐水的对照组相比) (P < 0. 05)，0VCAR-3模型14%和37%肿瘤生长抑制(P < 0. 05)；只给单一 CBP的治疗组肿 瘤生长被抑制了 56% (A2780)和46% (0VCAR-3)。联合用药(25mg/kg DHA)组则在A2780 和0VCAR-3动物肿瘤中均产生70%肿瘤生长抑制(P < 0. 05)。同时，基于对体重的(图7A 右栏和图7B右栏)观察，实验当中只有接受CBP治疗的小鼠有轻微的体重减少，也没有观 察到其他的药物宿主毒性。因此，CBP和DHA联合使用对于小鼠并没有显著的毒性作用，是 安全可靠的。
权利要求
青蒿素或其衍生物用于制备用于化疗增效剂的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述青蒿素衍生物选自双氢青蒿素、青蒿琥 酯、蒿甲醚、双氢蒿甲醚、蒿乙醚。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述化疗增效剂与化疗剂联用。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述化疗剂选自卡钼、吉西他宾、甲二氯二 乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、L"苯基丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、六甲三聚氰 胺、硫替派、二甲磺酸丁酯、亚硝脲氮芥、环己亚硝脲、甲基环己亚硝脲、链脲菌素、氮烯唑 胺、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、吉西他宾、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司 他丁、长春花碱、长春花新碱、表鬼白毒素吡喃葡糖苷、更生霉素、红必霉素、阿霉素、博来霉 素、普卡霉素、丝裂霉素C、L-天门冬酰胺酶、干扰素、顺钼、卡钼、米托蒽醌、羟基尿素、甲基 苄胼、米托坦、氨鲁米特、强的松、己酸孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、己烯雌酚、乙炔雌二醇、它莫 西芬、丙酸睾酮、氟羟甲睾酮、氟他胺、醋酸亮丙瑞林。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述化疗剂是卡钼，所述青蒿素衍生物是双 氢青蒿素。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述化疗剂是吉西他宾，所述青蒿素及其衍 生物选自青蒿素和双氢青蒿素。
7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述化疗剂用于治疗肿瘤。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自卵巢癌、肝癌、霍奇金病、急 性和慢性淋巴细胞白血症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳房 癌、卵巢癌、肺癌、Wilms肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、软组织肉瘤、原发性巨球蛋白血病、膀胱癌、 慢性粒细胞性白血病、原发性脑肿瘤、小细胞性肺癌、胃癌、结肠癌、恶性胰岛素细胞瘤、恶 性类癌瘤、恶性黑色素瘤、急性淋巴细胞白血病、绒毛膜癌、蕈样霉菌病、头颈肿瘤、肺癌、骨 原性肉瘤、胰腺癌、毛细胞白血病、横纹肌肉瘤、、成神经细胞瘤、皮肤多发性出血性肉瘤、横 纹肌肉瘤、软组织、骨和其它肉瘤、泌尿生殖系统癌、甲状腺癌、食道癌、皮肤癌、恶性高钙血 症、类癌、肾细胞癌、子宫粘膜癌、真性红细胞增多症、血小板本质增多症、恶性黑色素瘤、和 肾上腺皮质癌。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是卵巢癌。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是肝癌。
全文摘要
提供了青蒿素及其衍生物用于制备化疗增效剂的用途。化疗增效剂与化疗剂联用，用于治疗肿瘤。
文档编号A61K31/7068GK101856352SQ20091004909
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月10日 优先权日2009年4月10日
发明者侯俊梅, 李绵, 王慧, 陈涛 申请人:中国科学院上海生命科学研究院