专利名称：Csk结合蛋白抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；具体地说，本发明涉及Csk结合蛋白抑制剂及其应用。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，成为造成人类死亡的第二大病因。据统计， 我国死于恶性肿瘤前五位癌症依次为胃癌、肝癌、肺癌、食管癌和大肠癌。肾细胞癌在所有 人类恶性肿瘤中位于第七。大约占成人恶性肿瘤的3%，在常见的泌尿系肿瘤中是最致命 的。肿瘤是一种细胞的异常增生。癌细胞不受控制地生长繁殖，侵犯临近正常组织并转移 到远处地组织器官。癌的发生是一个多因素、多阶段的复杂渐进过程。正常细胞的癌变与其改变了的遗传特性有关。通常细胞内有两类肿瘤相关基因。 一类与调节细胞繁殖和转化的，称原癌基因。另一类是正常细胞内抑制细胞转化和肿瘤发 生的，称抑癌基因。两类基因的突变紊乱或表达量的改变等会使细胞无限增殖，使机体发生 癌变。目前，早期诊断和早期治疗仍是治疗癌症的重要途径。原癌基因、抑癌基因及其产 物已成为肿瘤的基因标志物。由于肿瘤基因突变和表达异常能反映细胞处于癌前启动阶段 的变化，有利于临床监视的早期诊断。例如，至今已证实在51种不同类型肿瘤中都存在p53 抑癌基因突变。在结肠癌病例中，约70%发生p53突变，肺癌为50%，乳癌为40%。血液系 统肿瘤和淋巴系统肿瘤也有较高的突变率。因此，从食管癌、胃癌及肺癌等脱落细胞中检测 P53点突变，已为上述肿瘤的临床诊断、预后判断和治疗指出了新的途径。肿瘤的发生、发展与细胞增殖、迁移、恶性转化以及细胞凋亡等信号转导通路中 许多环节的异常密切相关。原癌基因Src通过高表达和点突变等方式广泛参与了各种 癌症的发生和发展过程。不仅如此，许多调节Src活力的蛋白和Src激酶的底物蛋白 也在不同的癌症组织中出现异常表达。Csk结合蛋白(Cbp)是一个调节Src家族蛋白 激酶活性的跨膜接头蛋白，又称作鞘糖脂富集微结构域(PAG)相关的磷蛋白，在跨膜区 域广泛分布。人们已经对人及大鼠的Cbp基因序列有了十分详细的了解(Brdicka T， Pavlistova, et al. Phosphoproteinassociated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novelubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosinekinase csk and is involved in regulation of T cell activation. J Exp Med,2000,191(9) 1591-604 ；Kawabuchi Μ, Satomi Y, et al. Transmembrane phosphoproteinCbp regulates the activities of Src-family tyrosine kinases. Nature, 2000,404 (6781) :999_1003)。过去的研究结果表明，磷酸 化的Cbp上的Tyr314位点能与Src的抑制分子Csk结合(Kawabuchi M，Satomi Y，et al.Transmembranephosphoprotein Cbp regulates the activities of Src-family tyrosine kinases. Nature, 2000,404 (6781) :999_1003)。它通过招募 Csk 到细胞膜附近行 使其负向调节功能来抑制Src的活力。近年来也有一些研究表明Cbp在某些特定的癌症种 类中能够抑制肿瘤的发生。
但是，Cbp在癌症组织中的表达谱和它在特定癌症中的功能还有很多问题没有解 决。
发明内容
本发明的目的在于提供Csk结合蛋白抑制剂及其应用。在本发明的第一方面，提供一种Csk结合蛋白抑制剂的用途，用于制备抑制(包括 预防或治疗)肾细胞癌(RCC)的组合物。在一个优选例中，所述的组合物用于抑制肾细胞癌的细胞增殖；抑制肾细胞癌的细胞迁移；或抑制肾细胞癌的细胞侵袭。在另一优选例中，所述的Csk结合蛋白抑制剂选自特异性干扰Csk结合蛋白基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与Csk结合蛋白结合的抗体或配体。在另一优选例中，所述的Csk结合蛋白抑制剂是(a) SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示的小干扰RNA分子；和/或(b)序列与 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 互补的分子。在另一优选例中，所述的Csk结合蛋白抑制剂是SEQ ID NO 1所示的小干扰RNA 分子；和/或序列与SEQ ID NO 1互补的分子。在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肾细胞癌的小干扰RNA分子，所述的小 干扰RNA分子是(a) SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示的小干扰RNA分子；和/或(b)核苷酸序列与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2互补的分子。在本发明的另一方面，提供一种可抑制Csk结合蛋白表达的表达载体，所述的表 达载体含有以下结构Seq正向-X-Seq反向，式 I，式I中，Seq正自为与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示序列互补的核苷酸序列， Seqfi自为与Seq1自基本互补的核苷酸序列，X为位于Seq1^P 之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1^P Seq反向 不互补，式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构 Sieq 正向。 IiX式 II，
Seq 反向““‘式II中，SeqM、Seq反向和X的定义如上述，I I表示在Seq1^P Seqfi自之间形成的氢键。在一个优选例中，所述的表达表达载体是pSilencer载体。在另一优选例中，X具有4-20个核苷酸，优选的具有5-15个核苷酸，更优选的具 有6-9个核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肾细胞癌的组合物，所述的组合物含有(1)有效量的所述的小干扰RNA分子或所述的表达载体；和(2)药学上可接受的载体。在本发明的另一方面，提供一种特异性识别Csk结合蛋白或其基因的试剂的用 途，用于制备检测肾细胞癌的试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的肾细胞癌选自透明细胞癌亚型的肾细胞癌(透明细胞 肾细胞癌)。在另一优选例中，所述的特异性识别Csk结合蛋白或其基因的试剂选自特异性扩增Csk结合蛋白基因的引物；特异性识别Csk结合蛋白基因的探针；或特异性结合Csk结合蛋白的抗体或配体。在另一优选例中，所述的特异性扩增Csk结合蛋白基因的引物具有SEQ IDNO :3和 SEQ ID NO 4所示的序列。在本发明的另一方面，提供一种检测肾细胞癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有特 异性识别Csk结合蛋白或其基因的试剂。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1、Cbp在肾细胞癌中过量表达。自41个肾细胞癌患者中取RCC标本和非癌组 织标本，其中包括27对蛋白样本和14对mRNA样本。所有的组织在切除后立即置于液氮中。 KC表示肾细胞癌。(A)将RCC样本中的Cbp mRNA标记为T，非癌组织标记为N，做Northernblot，选 取具有代表性的结果。(B) 14对RCC样本的Cbp mRNA做Northern blot，其结果用β -actin标准化后进 行定量分析。(C) RCC标本T和非癌组织N的Cbp蛋白做Western blot。(D)用 Western blot 测定非癌组织(分别为 KC27N, KC34N, KC25N)和 4 个 RCC 细胞株(分别为786-0，769-P，A498，Caki-I)中Cbp的表达量。所用细胞株来自Prof. Axel Ullrich(Martinsried，Germany)。所有的细胞培养液都添加了 10%胎牛血清(FBS， Invitrogen, Carlsbad, CA)。786-0 细胞和 769-P 细胞保存在 RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA)中，其中含有2mM L-谷氨酸盐，1. 5g/l重碳酸钠，4. 5g/l葡萄糖，IOmM HEPESdP IOmM 丙酮酸钠。A498 细胞保存在 MEM (Invitrogen，Carlsbad, CA)溶液中，其中 含有不重要的氨基酸。Caki-I细胞保存在McCoy’ s 5A(Invitrogen, Carlsbad, CA)溶液 中。所有细胞在37°C，5% C02/95%空气中孵育。以上各图均设置β肌动蛋白(β -actin)为对照。抗β -actin抗体购自 Sigma-Aldrich, St Louis, M0, USA。图2、Cbp敲除抑制细胞增殖。(A)通过siRNA敲除Cbp。用Western blot评估Cbp的敲除效率。设置SCRBL(Cbp-Ri-3 的 scrambled siRNA)为阴性对照。该段 scrambled siRNA 与 Cbp-Ri-3 的 siRNA成分相同，但碱基顺序不同。用抗Cbp单克隆抗体检测Cbp。用常规的人Cbp(氨基 酸261 432)的兔单克隆抗体。(B)在Cbp稳定敲除的细胞中Cbp的敲除效率。其中，786-0为野生型，786-0/U6 假转染。786-0/B5和786-0/B6为Cbp高效抑制的两个细胞株。用抗Cbp单克隆抗体检测 Cbp0设置β-actin为对照。(C)细胞用Cbp siRNA短暂转染，48小时后做MTT实验。细胞培养3天所得结果。(D)在Cbp稳定敲除的细胞中做MTT实验。细胞培养5天所得结果。以上两个图 横坐标为培养天数，纵坐标为OD值为570nm的吸光率。图3、Cbp敲除后细胞运动性受到破坏。(A)将siRNA处理的Cbp及对照Cbp短暂转染到786_0细胞，48小时后做创伤修 复实验。用吸液管尖端破坏细胞得到一道伤痕，12小时后观察伤痕的修复情况。(B)在Cbp稳定敲除的细胞中做创伤修复实验。对照细胞(786-0及786-0/U6)和 Cbp敲除细胞(786-0/B5及786-0/B6)生长聚集，然后用移液管尖端破坏细胞。对细胞的迁 移情况进行10小时监控。(C)细胞迁移实验，将能从Transwel 1 Chamber的上层迁移到下层的细胞染色，拍 照并计数。(D)对照细胞和Cbp敲除的786-0细胞在ECM包裹的Transwell Chamber中的侵 袭性。具体操作同(C)0图4在裸鼠的786-0细胞中敲除Cbp抑制贴壁不依赖生长和肿瘤形成。(A)软琼脂培养实验。细胞在软琼脂上培养10天，在显微镜下观察菌落的生长情 况。上放大倍数为40倍。下放大倍数为1000倍。右图即为菌落数。(B)用Western blot分析指定细胞中Cbp的表达水平。(C)裸鼠中肿瘤的形成。同等数量的细胞皮下接种到5周大的母裸鼠中。用以下 公式估计肿瘤的容积容积V= (1/2) X (最大直径)X (最小直径)2。平均值士SD值来自 每组的四个动物。图5、Cbp对RhoA活性的调控。(A)在Cbp敲除细胞中对有活性的RhoA做GST-RBD Pull Down实验。左边用 Western blot检测Cbp敲除细胞中有活性的RhoA，结果显示Cbp沉默后RhoA活性受到显 著抑制。右边对照细胞和Cbp敲除细胞中，对有活性的RhoA的统计学分析。(B)对 Cbp 敲除细胞中 Racl 及 Cdc42 做 GST-PBD Pull Down 实验。在 786-0 野生 型细胞及Cbp敲除细胞中做GST-PBD Pull Down实验。与GST-PBD相结合的Racl和Cdc42 分别代表Racl和Cdc42的活性形式。(C)在siRNA短暂转染的细胞中，对有活性的RhoA做GST-PBD Pull Down实验。 用lipofactamine2000将指定的siRNA转染至786-0细胞，48小时后检测RhoA活性。⑶Cbp通过其PDZ区域结合模体增加RhoA的活性。用电穿孔的方法将指定的质粒 (pRK5质粒)短暂转染到786-0细胞中。48小时后，在CLB缓冲液中裂解细胞，用GST-PBD Pull Down的方法检测有活性的RhoA。Vec :pRK5质粒。WT :Cbp在pRK5中的野生型小鼠 (对照)。DC :PRK5中缺乏PDZ结合模体的突变小鼠(与WT的区别在于转染了 PRK5质粒
6的小鼠没有 PDZ 结合模体)。RhoA 抗体购自 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)。图6、Cbp稳定敲除的细胞株src，Erkl/2，Akt的活性。(A)Cbp稳定敲除的细胞株中src的活性；(B) Cbp稳定敲除的细胞株中FAK和Paxillin的磷酸化；(C) Cbp稳定敲除的细胞株Erkl/2，Akt的活性；(D)Cbp瞬转siRNA的细胞株中src的活性。图7、Cbp敲除后，细胞形态及压力纤维形成的改变。(A)Cbp敲除的细胞形态变化，箭头所示为Cbp敲除后出现的长分叉；(B)Cbp敲除细胞和对照细胞的F-actin。染色所示即为压力纤维。图8、0^和冊 50之间的联系。(A) 786-0细胞株中内源性Cbp与EBP50之间的相互作用；(B) Cbp的DC突变株与EBP50之间不再有相互作用。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示Csk(C端Src激酶， Carboxyl-terminus Src kinase)结合蛋白(Cbp)在肾细胞癌中高表达，并且Cbp的异常表 达或活化与肾细胞癌的发生和发展密切相关。Cbp的表达可促进癌细胞的生长，而抑制Cbp 的表达可抑制癌细胞的生长、迁移和侵袭。因此，Cbp是一种在肾细胞癌中发挥重要功能的 基因，不仅可作为肾细胞癌的诊断标志，还可作为靶点开发预防或治疗肾细胞癌的药物。CbpCbp是一种调节Src家族蛋白激酶活性的跨膜接头蛋白，又称作鞘糖脂富集微结 构域(PAG)相关的磷蛋白，在跨膜区域广泛分布。Cbp蛋白的氨基酸序列及其编码基因例如 参见SEQ ID NO :6所示的序列。本发明人出乎意料地发现，Cbp在肾细胞癌中出现了异常的高表达。抑制Cbp的 表达可以使得肾细胞癌细胞株的增殖、迁移和成瘤能力都受到显著的抑制。这为临床诊断 肾细胞癌提供了新的依据，并为治疗肾细胞癌提供了潜在的治疗肾细胞癌的方法。Cbp的抑制剂基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种Cbp基因或蛋白的抑制剂的用 途，用于制备预防或治疗肾细胞癌的组合物。如本文所用，所述的Cbp基因或蛋白的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻 断剂等。所述的Cbp基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低Cbp蛋白的活性、降低Cbp基因 或蛋白的稳定性、下调Cbp蛋白的表达、减少Cbp蛋白有效作用时间、或抑制Cbp基因的转 录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Cbp有用的物质，从而可用于预 防或治疗肾细胞癌。例如，所述的抑制剂是特异性干扰Cbp表达的小干扰RNA分子或反义 核苷酸；或是特异性与Cbp蛋白结合的抗体或配体。作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂是一种Cbp基因特异性的小干扰RNA 分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA (small interferingRNA, siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程 就是 RNA 干扰(RNA interference)过程。作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的小干扰RNA分子，所述的 小干扰RNA分子可特异性地干扰Cbp基因的表达，与其它的人类核酸序列没有显著的同源 性；并且经验证，其具有良好的干扰Cbp表达的效果。所述的小干扰RNA分子是选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示RNA分子的一种或两种。本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于化学合成法，体 外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了本发明所提供的siRNA的序列以后，可以以 各种途径方便地制备或表达所述的小干扰RNA。例如，在本发明的一种优选例中，所述的小 干扰RNA是化学合成的。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两 条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链 来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生 合成的双链RNA复合物。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领 域已知的多种技术被输送到细胞内。此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链 的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录 物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂是一种可在胞内形成“发夹”结构的 RNA( "shRNA")的构建物，所述的“发夹”结构包含一条反义链和一条正义链，通过一个间 隔序列相连。shRNA有互补结构区，在杂交条件下形成“发夹”构象，在其中互补的正义链和 反义链相连接，例如，通过一个1-20个核苷酸的核苷酸序列连接。如上述，shRNA可以由编码需要的转录物的双链DNA模板来表达。编码需要的转 录物的双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一 个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子， 从而进入RNAi途径。“构建物”或“载体”在这里是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列(例如 与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示序列互补的核苷酸序列)，这个序列编码一个siRNA 或shRNA ；这个DNA分子还包含转录在体外或体内可操作的连接编码序列所必需的或预期 的适合的调控元件。“调控元件”在这里指的是可一定程度上控制核酸序列表达的核苷酸序 列。可作为典范的调控元件包括增强子，内核糖体进入位点(IRES)，复制起点，多腺苷酸化 信号，启动子，转录终止序列，以及上游调节区，这些调控元件有助于核酸的复制、转录、转 录后修饰等。组合物本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ；较佳的 0.00001-20衬％;更佳的，0.0001-10wt% )的所述的Cbp基因或蛋白的抑制剂，以及药学上 可接受的载体。任何前述的Cbp基因或蛋白的抑制剂均可用于组合物的制备。作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于预防或治疗肾细胞癌的组合物，所述的组合物含有有效量的本发明所述的小干扰RNA分子，以及药学上可接受的载体。作为本发明的一种优选方式，提供了一种用于预防或治疗肾细胞癌的组合物，所 述的组合物含有有效量的本发明所述的可在胞内形成“发夹”结构的RNA( “shRNA”)的构 建物(如表达载体)，以及药学上可接受的载体。如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和 /或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋 形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没 有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的 载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充 剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染 试齐LU在得知了所述Cbp基因或蛋白的抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方 法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于皮下 注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给 予的。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将Cbp的抑制剂通过诸如注射 等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带Cbp的抑制剂的表达单位(比如表达 载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的Cbp抑制剂，具体情况需视所述 的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。本发明所述的Cbp基因或蛋白的抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾 病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来 确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于所述的Cbp基因或蛋白的抑制剂 的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患 者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的Cbp基因或蛋白的抑制剂每 天以约0. 00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0. 0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予， 能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或 将剂量按比例地减少。检测肾细胞癌的试剂或试剂盒基于本发明人的上述新发现，可以将Cbp作为诊断肾细胞癌的标志物(i)进行肾 细胞癌的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的肾细胞癌治疗药物、药 物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群肾细胞癌患病风险，早 期监测早期防治。比如，可分离出由Cbp基因表达异常而导致肾细胞癌的人群，从而可进行 更有针对性地治疗。因此，本发明提供了 Cbp基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)肾细胞癌的 试剂或试剂盒。可采用各种本领域已知的技术来检测Cbp基因的存在与否以及表达情况，这些技 术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列 分析、PCR等，这些方法可结合使用。本发明还提供了用于在分析物中检测Cbp基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增Cbp的引物；或特异性识别Cbp的 探针来确定Cbp基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合Cbp编码 的蛋白的抗体或配体来确定Cbp蛋白的表达情况。作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出Cbp基因或基因 片段。更优选的，所述的引物具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的序列。该引物扩增 获得的扩增产物具有合适的长度，且特异性高，对于复杂体系的扩增也具有良好的特异性。针对Cbp基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探 针，其可与Cbp基因上特定位点发生特异性结合，而不与Cbp基因以外的其它基因特异性结 合，且所述探针带有可检测信号。利用特异性结合Cbp蛋白的抗体来检测分析物中Cbp蛋白表达情况的方法也是本 领域人员熟知的技术。本发明还提供了用于在分析物中检测Cbp基因的存在与否以及表达情况的试剂 盒，该试剂盒包括特异性扩增Csk结合蛋白的引物；特异性识别Csk结合蛋白的探针；或 特异性结合Csk结合蛋白编码的蛋白的抗体或配体。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂， 包括但不限于抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。药物筛选在得知了 Cbp的高表达可促进肾细胞癌的癌细胞的生长、迁移或侵袭，而抑制Cbp 的表达可抑制肾细胞癌的癌细胞的生长、迁移或侵袭这一特征后，可以基于该特征来筛选 抑制Cbp的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于预防或治疗肾细胞癌真正有用 的药物。因此，本发明提供一种筛选抑制淀粉样蛋白产生的潜在物质的方法，所述的方法 包括用候选物质处理表达Cbp的体系；和检测所述体系中Cbp的表达或活性；若所述候选 物质可抑制Cbp的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗肾细胞癌的潜在物质。所 述的表达Cbp的体系较佳的是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达 Cbp的细胞；或可以是重组表达Cbp的细胞。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Cbp的表达或活性的 改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达Cbp的体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细 胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防或治疗肾细胞癌真正有用的物质。本发明的主要优点在于(1)本发明阐明了 Cbp基因在肾细胞癌中的特异性高表达以及其在各种不同亚型 的肾细胞癌中的表达谱，从而为肾细胞癌的诊断和分型提供了可靠的途径。(2)本发明还公开了特异性抑制Cbp表达的RNAi序列，所述序列干扰Cbp表达的 效果良好，从而为肾细胞癌治疗提供了可行、有效的治疗手段。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory
10Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和
份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法Northern blot从肾细胞癌(RCC)样本及非癌组织中提取CBP mRNA。常规方法选择涵盖CBP基因 的全部编码区域的CBP特异性探针，用Northern blot检测Cbp。设置人β-actin作为内参。Western blot将所培养的细胞在2 % ODG 缓冲液(50mM Tris-HCl, pH7. 4，ImM EDTA, 2 % 0DG, 1 % NP-40,5mM β-巯基乙醇，150mM NaCl, IOmM NaF, ImMNaVO4, ImM PMSF)中裂 解。Octyl-D-glucoside (ODG)购自 Sigma-Aldrich (StLouis，M0, USA)。将裂解产物冰 浴10分钟后，以12000rpm离心10分钟。取上清做分析。对RCC样本，按照产品说明书用 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA)将蛋白分离后，按标准Western blot程序检测指定的 蛋白。小干扰RNA (siRNA)沉默 Cbp选择人Cbp mRNA 269 289 位点(GGGACAUUCUUUCAGAGGACA (SEQ ID N0: 1))和 1163 1183 位点(AAGCGAUACAGACUCUCAACA(SEQ ID NO 2)),用 siRNA 将其沉 默。前者称作 Cbp-Ri-3，后者称作 Cbp-Ri-5。设置 Cbp-Ri_3 的 scrambled siRNA(序 列 CUAUAGGAUGAUCUGGCGAAC (SEQ ID N0:3))作为阴性对照。用 Iipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)将 siRNA 短暂转染到 786-0 细胞(获自 Max Plank Institute ofBiochemistry)中。转染后48小时后进行进一步的实验。质粒构建合成对应于Cbp-Ri-3的多核苷酸，将其插入pSilencerl.0-U6小干扰RNA质粒 (Ambion, Austin, TX)的多克隆位点中。用BamHI切阳性质粒，得到含TO启动子和小干扰 RNA序列的片段。后者插入到pCDNA3质粒(Invitrogen，Carlsbad, CA)中，得到pCDNA3/ Cbp-RNAi质粒。用BamHI-BgIII切阳性质粒。用同样的方法建立ρ⑶NA3/TO对照质粒，其 含有TO启动子，但不含RNAi靶序列。从小鼠脑RNA文库中扩增Cbp cDNA,用BamHI和Xbal 位点，将其插入到PRK5表达质粒(BD bioscience, San Jose, CA, USA)中，构建小鼠Cbp质 粒。扩增小鼠Cbp的引物如下小鼠Cbp 正向CGGGATCCATGGGACCTGCAGGAAGC(SEQ ID NO 4)；小鼠Cbp 反向GCTCTAGACTAGAGCCTGGTGACATCCCTC(SEQ ID NO 5)。细胞转染及短发夹RNA (shRNA)稳定沉默Cbp用 gene pulser Xcell electroporation system(Bio-Rad laboratories Inc., Hercules, CA)，按照其产品说明书将DNA (每个指定质粒含15 μ g)短暂转染到786-0细胞 中。用 Iipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)将 pCDNA3/Cbp-RNAi 及 pCDNA3/ U6质粒转染到786-0细胞中，建立稳定的Cbp稳定敲除的细胞系。用400 μ g/ml G418选择
11转染细胞2周。阳性细胞就保存在100 μ g/ml G418中。这样就选择出稳定表达Cbp siRNA 的克隆，用抗Cbp单克隆抗体做Western blot，检测Cbp的表达量。
细胞增殖实验 将指定细胞分放于96孔板中，每孔500个细胞。siRNA转染的细胞培养3天，Cbp稳 定沉默的细胞培养5天后，每个孔中加入20 μ 1 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-yl) -3, 5-di-phenytetrazoliumromide (MTT, 5mg/ml)。3 小时后，弃去培养液，避光环境下在 50 μ 1 二甲基亚砜(DMSO)中浸泡30分钟溶解紫色晶体。用microplate reader (Bio-Rad laboratories Inc. ,Hercules, CA)测量570nm下的吸光度，以此定量检测颜色的亮度。设 置DMSO为对照。细胞运动性实验指定细胞生长聚集后做创伤修复实验。用200μ 1的移液管尖端刮细胞的单 层，导致细胞的损伤，得到一道刮痕。再用培养液将细胞细3次，孵育一定时间后拍照。 细胞迁移实验指定细胞在缺乏血清的情况下20小时后，1. 5Χ IO4细胞置于Transwell Chamber (Coring incorporated, NY)(孔洞大小为8 μ m的聚碳酸酯膜，直径为6. 5mm)的 上层培养，其中含100μ 1 RPMI-1640培养液，不含血清。Chamber的下层加入600 μ 1含有 10%FBS的培养液。24小时后，用棉签擦去位于上层的细胞。用PBS洗移动到下层的细胞， 在室温下固定在3. 7%的多聚甲醛溶液中，在2%的乙醇中用0. 2%的结晶紫染色。在显微 镜下拍照并计数。取平均值士标准偏差表示迁移的细胞数量。活体中的细胞侵袭性实验Transwell 上层涂上一层 50μ1(1μβ/μ1)生长因子 reduced matrigel(BDbiosciences, San Jose, CA, USA)在细胞加入到上层之前，将 matrigel 置于 37°C的5% CO2孵育箱中硬化。其余步骤同细胞运动性实验。软琼脂培养基上菌落形成2mM 0.5%的琼月旨(Sigma，St. Louis，M0)，其中含有 RPMI-1640，及 10% FBS，加入 到6孔板中。每个孔中，加入2ml RPMI-1640及FBS，0.25%琼脂，其上培养IX IO4个细胞。 细胞溶液在室温下放置30分钟后，转到37°C，5% CO2孵育箱。10天后计数软琼脂培养基 上的菌落数并拍照。活体中的肿瘤形成实验每个细胞株中，6X IO6个细胞在预热后的PBS中重悬浮，皮下注入四只裸鼠的左 肋。每周测量所形成的肿瘤的最大直径和最小直径，用下述公式计算肿瘤的体积体积= (1/2) X (最大直径)X (最小直径)。所做实验都严格按照研究院所定的动物实验规程进 行。RhoA，Racl 及 Cdc42 做 GST-PBD Pull Down细胞在CLB 缓冲液(50mM Tris, PH7. 4, IOmM NaCl, 2mM Na3VO4I % NP-40，10%甘 油，ImM PMSF)中裂解。等量的细胞裂解产物与40 μ gGST-RBD (GST与Rhotekin的RhoA结 合区域融合，其中GST位于Rhotekin的RhoA结合区域之前的1 69位氨基酸)及谷胱甘 肽琼脂糖颗粒(AmershamBiosciences，Piscataway, NJ)在4°C孵育1小时后，将谷胱甘肽 琼脂糖颗粒用CLB缓冲液洗三次。用12% SDS-PAGE分离融合蛋白，用抗Rho A的抗体做免 疫印迹。
细胞裂解产物中的Rho A总量标准化后，检测有活性的Rho A的水平。步骤同RhoA Pull Down,唯一不同之处在于细胞溶解产物用GST-PBD (GST融入Cdc42和PAKl的Racl结 合区)融合蛋白孵化，bound蛋白(有活性的Cdc42或Racl)用Cdc42和Racl抗体做免疫 印迹。统计学分析用校准的显像密度计(Bio-Radlaboratories Inc. Hercules，CA)扫描 GS-800 放射能照相图片和 Western blot。用 Quantity One 软件(Bio-Rad laboratorieslnc. Hercules, CA)定量分析条带密度。T检验分析组别之间的区别。P < 0. 05则认为有统计
学意义。II.实施例实施例1、Cbp在肾细胞癌中高表达为研究Cbp在不同的癌症中的表达谱和功能，本发明人对3种不同的癌症(包括 肾癌，肝癌，肺癌)组织进行了实时PCR的检测。与预期不同的是，本发明人发现，Cbp在肾 细胞癌中出现了特异性高表达。为验证上述结果，本发明人应用了 Northern Blot (图1A-B)和Western Blot (图 1C)的方法分别在mRNA和蛋白水平上对Cbp的表达进行了检测。结果表明，Cbp在大于70% 的肾细胞癌的样品中出现了特应性高表达。与上述结果相似，Cbp的高表达也同样出现在肾细胞癌的细胞株786-0，769-P， A498，Caki-1(均获自 Max Plank Institute of Biochemistry)中(图 ID)。此外，本发明人对Cbp的高表达与不同的肾细胞亚型间的关系进行了分析，结果 表明，Cbp的高表达与透明细胞癌亚型的肾癌相关(表1)。表1.不同肾细胞亚型中Cbp的差别表达
Cbp上调的百分数 (上调病例/总病例) (以免疫印迹(IB)和RT-PCR验证) P值
组织学分类
0.028*
透明细胞肾细胞癌 非透明细胞肾细胞癌 乳头状肾细胞癌 Chromophobe肾细胞癌 Granullar肾细胞癌
83% (10/12) 20% (1/5) 0% (0/1) 100% (1/1) 0% (0/1)
Transitional cell carcinoma _in renal pelvis_
0% (0/2) *P值用Fisher，s Exact Test计算，P < 0. 05认为有显著差异。
实施例2、Cbp能促进细胞增殖为研究Cbp的表达在透明肾细胞癌中的功能，本发明人采用了 RNA干扰(RNAi)的 技术降低其在肾细胞癌细胞株786-0中的表达并研究786-0的恶性表型与Cbp表达之间的 关系。从干扰效率而言，cbp-Ri-3的效果较之cbp-Ri-5的效果更好一些。通过质粒转染和G418筛选，本发明人得到了稳定的Cbp表达显著降低的细胞克隆 786-0/B5 和 786-0/B6(图 2A-B)。通过MTT的试验发现，Cbp表达的降低会显著抑制细胞的增殖。与此结果相一致， 786-0/B5和786-0/B6细胞株相较对照细胞株786-0和786-0/TO也显示出明显的增殖较少 (图2C-D)，这说明Cbp能促进RCC细胞增殖。实施例3、Cbp的表达对细胞运动性及侵袭性的影响为研究Cbp的表达对RCC细胞运动性及侵袭性的影响，本发明人采用了创伤修复 实验。用200 μ 1的移液管尖端刮细胞的单层，得到一道伤痕。本发明人发现，通过SiRNA 方法抑制Cbp表达的克隆或是稳定的Cbp表达显著降低的克隆，创伤修复程序相较亲代细 胞都受到抑制(图3Α-Β)。为定量测定Cbp对细胞迁移的影响，本发明人在稳定的转染产物及亲代细胞中做 Transwell迁移实验。结果显示，野生型细胞与质粒转染细胞迁移到Transwell膜的下层的 数目相差不多。但是，敲除了 Cbp的细胞则显示细胞运动受到显著抑制，只有42%及21% 的细胞迁移(图3C)。在研究Cbp对RCC细胞的侵袭能力的影响上，本发明人用InvasionChamber的方 法。结果发现，同对照细胞株形成鲜明的对比，Cbp敲除的细胞侵袭能力显著下降。具有侵 袭性的786-0/B5和786/B6细胞的数量分别是对照细胞的33%和42% (图3D)。因此，本发明人得出结论，Cbp的表达同RCC细胞的运动和侵袭能力相关。实施例4、Cbp对肾细胞癌肿瘤生成的影响为研究Cbp对肾细胞癌肿瘤生成的影响，本发明人用软琼脂培养实验来证实Cbp 对RCC细胞恶性程度的作用。结果显示，Cbp敲除的细胞基本停止了生长，只形成很小的克 隆，其中绝大部分都是由2 3个细胞组成；而对照细胞则形成很大的肉眼可见的克隆，至 少有50个细胞。通过对菌落数目的统计学分析，显示对照细胞和Cbp敲除细胞有统计学差 异(图4A)。上述结果说明，Cbp的表达可能与肾细胞癌的恶性程度有关。为进一步研究在活体 内Cbp的表达对肿瘤生成的影响，本发明人用异种移植肿瘤模型小鼠来评估肿瘤的生长。 结果显示，786-0/Ri-3细胞所形成的肿瘤的大小明显小于对照细胞所形成的肿瘤大小(图 4B-C)。786-0细胞在活体内的生长同Cbp的表达水平紧密相关，说明Cbp在肾细胞癌的肿 瘤生长过程中起正性作用。实施例5、Cbp在RCC细胞中发挥功能的机制为阐明Cbp在RCC细胞中发挥功能的机制，本发明人检测了细胞内一些Cbp调控 的重要的信号转导因子如c-Src，Erkl/2，Akt的活性。得出的结果表明，在RCC细胞中，Cbp 的沉默对c-Src信号转导途径并无影响(图6A)。与此一致的是，SiRNA导致的Cbp短暂沉默也并不改变Src的活性(图6D)。这些数据显示，在RCC786-0细胞中，Cbp对c_Src的调控，细胞的迁移及增殖并不起重要作用。提示有Cbp介导的其他信号转导途径与RCC的致癌作用有关。在研究过程中，本发明人发现，在Cbp稳定敲除的细胞中，Cbp的抑制诱导细胞表 型及细胞骨架的肌动蛋白的组成的改变(图7)。由于小RhoGTP酶对细胞表型和细胞骨架 的肌动蛋白的调控有关，本发明人假设RhoGTP酶家族可能跟这些改变有关。用Pull-down 实验来检测RhoA，Cdc42，Racl的活性。与预期结果一样，在786-0/B5及786-0/B6细胞中， RhoA活性显著降低(图5A)。但在Cbp敲除的转染细胞中，Cdc42及Racl的活性保持不变 (图 5B)。为进一步证实Cbp的沉默对RhoA的抑制，本发明人又在786-0细胞中用siRNA短 暂沉默了 Cbp。与预期结果一样，RhoA的活性受到抑制(图5C)。此外，786-0细胞中Cbp 的过量表达显著增加RhoA的活性。Cbp中有一个PDZ结合模体，PDZ区域所含的蛋白与细胞骨架的调控有关。本发 明人检测了 Cbp的PDZ结合模体对RhoA活性的影响。跟预期的一样，786-0细胞中，缺少 PDZ结合模体的Cbp突变体，相较野生型Cbp，并不能显著增加RhoA活性(图5D)。这说明 Cbp能增加RhoA的活性。RhoA是一个原癌基因，在某些癌症，在RCC中表达上调。但结合 到Cbp的C端PDZ结合模体上来介导RhoA活化的分子尚未知。已知仅有的同Cbp相互作 用的含蛋白的PDZ区域是EBP50。在体内实验中，本发明人也发现在786-0细胞中，Cbp与 EBP50的相互作用(图8A)。敲除Cbp的PDZ结合模体，该相互作用即受到阻碍(图8B)。 由于EBP50与ERM的结合与RhoA的活化有关，故这些结果提示Cbp通过与EBP50相互作用 来调控RhoA的活化。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范
围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>Csk结合蛋白抑制剂及其应用
<130)093499
<160>6
<170>PatentIn version 3. 3
<210>1
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>寡核苷酸
<400>1
gggacauucu uucagaggac a 21
<210>2<211>21 <212>RNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>寡核苷酸 <400>2
aagcgauaca gacucucaac a 21 <210>3 <211>21 <212>RNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <223>寡核苷酸 <400>3
cuauaggaug aucuggc gaa c 21
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>4
cgggatccat gggacctgca ggaagc26
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <223>引物 <400>5
gctctagact agagcctggt gacatccctc 30
<210>6
<211>1299
<212>DNA
<213> 智人(Homo Sapiens)
CN
7 28
29
30
31385
acc
Thr
tac
Tyr
tag
390395400
ctg ggg acc aat ggc cac cac ggt ctc gtc cca aag gag aac gac Leu Gly Thr Asn Gly His His Gly Leu Val Pro Lys Glu Asn Asp
405410415
gag age ata agt gac ttg cag caa ggc aga gat att acc agg ctc Glu Ser lie Ser Asp Leu Gln Gln Gly Arg Asp lie Thr Arg Leu 420425430
1248
1296
1299
权利要求
一种Csk结合蛋白抑制剂的用途，用于制备抑制肾细胞癌的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于 抑制肾细胞癌的细胞增殖；抑制肾细胞癌的细胞迁移；或 抑制肾细胞癌的细胞侵袭。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Csk结合蛋白抑制剂选自 特异性干扰Csk结合蛋白基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与Csk结合蛋白结合的抗体或配体。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Csk结合蛋白抑制剂是(a)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示的小干扰RNA分子；和/或(b)序列与SEQID NO :1或SEQ ID NO 2互补的分子。
5.一种用于抑制肾细胞癌的小干扰RNA分子，其特征在于，所述的小干扰RNA分子是(a)SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2所示的小干扰RNA分子；和/或(b)核苷酸序列与SEQID NO :1或SEQ ID NO 2互补的分子。
6.一种可抑制Csk结合蛋白表达的表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有以下 结构Seq正向 _X_Seq反向， ζ I，式I中，Seqra为与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示序列互补的核苷酸序列，Seqfi @为与基本互补的核苷酸序列，X为位于Seq1^P Seqg之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1^P Seqfi自不互补，式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构
7.一种用于抑制肾细胞癌的组合物，其特征在于，所述的组合物含有(1)有效量的权利要求5所述的小干扰RNA分子或权利要求6所述的表达载体；和(2)药学上可接受的载体。
8.一种特异性识别Csk结合蛋白或其基因的试剂的用途，用于制备检测肾细胞癌的试 剂或试剂盒。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别Csk结合蛋白或其基因的 试剂选自特异性扩增Csk结合蛋白基因的引物； 特异性识别Csk结合蛋白基因的探针；或 特异性结合Csk结合蛋白的抗体或配体。
10.一种检测肾细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有特异性识别Csk 结合蛋白或其基因的试剂。
全文摘要
本发明涉及Csk结合蛋白抑制剂及其应用。本发明阐明了Csk结合蛋白基因在肾细胞癌中的特异性高表达以及其在各种不同亚型的肾细胞癌中的表达谱，从而为肾细胞癌的诊断和分型提供了可靠的途径。本发明还公开了特异性抑制Csk结合蛋白表达的抑制剂，所述序列干扰Cbp表达的效果良好，从而为肾细胞癌治疗提供了可行、有效的治疗手段。
文档编号A61P13/12GK101940794SQ20091005446
公开日2011年1月12日 申请日期2009年7月7日 优先权日2009年7月7日
发明者冯秀晶, 陈正军, 雷蕾 申请人:中国科学院上海生命科学研究院