专利名称：一种包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种配制药品，尤其是涉及一种包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的
制备方法。
背景技术：
奥沙利铂(Oxaliplatin， L-0HP)是用于结直肠癌、卵巢癌等多种肿瘤化疗的主 要核心药物，是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类化合物，国际通用名为草酸铂，分子式为 C8H14N204Pt，分子量为397. 3. L-0HP抗癌活性高，抗癌谱广，有独特的细胞内靶分子作用 机制和更强的细胞毒作用。比顺铂、卡铂抑制DNA作用更强，与5-Fu具有协同作用，与其他 铂类无交叉耐药，对5-Fu、顺铂、伊立替康等耐药的肿瘤也有效，且毒副反应轻。大量的国际 多中心研究均证实其具有优良的抗癌效果，对于结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、非小细 胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌等均有较好的疗效。但是，传统的奥沙利铂制剂均为冻干 粉剂型，将其配置为水溶液后用于化疗仍然存在着明显的缺点，在相关的药物说明书叙述 道"给予奥沙利铂130mg/m2，静脉输注2h结束后，15%的铂存在于体循环中，剩余的85% 迅速扩散到组织内或随尿排出；2h结束后血浆超滤物中检测不到完整的药物"。因此，可见 药物代谢快，作用时间有限，缓释性差。快速代谢的特点与分子量较小的特点相结合，又可 导致其组织沉积和淋巴导向等性能较差，从而致使针对肿瘤、肝脏、淋巴系统等重要靶器官 的靶向性不够；也引起对全身非靶器官组织的毒副作用相对增大。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术不足之处而提供一种不改变奥沙利铂的分子结构、 能保护药物缓释、减慢分解代谢、并增加药物体积和重量的包载奥沙利铂的人血白蛋白纳 米粒的制备方法。 本发明的目的是通过以下措施来实现一种包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的 制备方法，其特殊之处在于 包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒，由奥沙利铂原料药和人血白蛋白HSA组成； 在制备过程中用到注射用水、无水乙醇、戊二醛和氢氧化钠；其中奥沙利铂原料药与白蛋 白的质量比为10-25%，白蛋白水溶液的浓度为1-2. 5% (g/ml)，沉淀剂无水乙醇与白蛋白 水溶液的体积比为2 : 1-3 : 1 ;交联剂戊二醛与白蛋白的氨基摩尔比为75-200%，氢氧化 钠适量； 其制备经过下列步骤
步骤一，直接载药与去溶剂 常温下，以质量比为5_12.5%称取奥沙利铂、人血白蛋白，用注射用水配制成 1-2. 5%白蛋白水溶液，以适量氢氧化钠调节其pH至8. 8 9. 2，在300-2000转/min搅拌 下采用滴加法加入与前述白蛋白水溶液体积比为1:2 1:3的无水乙醇，得到蓝色乳 光胶体溶液，继续搅拌；
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步骤二，吸附载药与交联 常温下，另取与前述等量奥沙利铂，以纯水配制成10mg/mL溶液，并以适量氢氧化 钠调节pH至8. 3 8. 7，在300-2000转/min搅拌下加入到步骤一所得蓝色乳光胶体溶液 中，搅拌30min后加入戊二醛，所述戊二醛与人血白蛋白的氨基摩尔比为75 200%，搅拌 一定时间； 步骤三，旋转蒸发 利用旋转蒸发仪，将步骤二得到的纳米粒胶体溶液于4(TC旋转蒸发除去乙醇；
步骤四，离心沉淀 利用高速离心机，将步骤三得到的除去乙醇的纳米粒混悬液于14000转/min速度
下，离心20min ; 步骤五，冷冻干燥 沉淀的纳米粒注入20mL的注射用水混悬后在低温条件下冷冻干燥，获得包载奥
沙利铂的人血白蛋白纳米粒冻干粉，完成制备。 所述适量氢氧化钠为保持制备溶液pH值在给定范围内。 所述步骤一滴点法为以lmL/min速率加入无水乙醇。 所述步骤二交联剂戊二醛与白蛋白的氨基摩尔比较优比例为100%。 所述步骤二搅拌一定时间为6小时。 所述步骤五在低温条件下其低温为_70°C。 与现有技术相比，本发明具有如下优点1)保留奥沙利铂的抗肿瘤效力，改变其 代谢快、分子量小的局限性；增加制剂的体积和质量，提高药物缓释性。2)以人血白蛋白为 骨架材料，人体相容性好，安全无毒，可生物降解，可增加淋巴循环药物浓度。3)可有效防 止淋巴转移和肝转移淋巴转移和肝转移是恶性肿瘤最常见的转移方式，纳米粒具有肝脏 浓集和淋巴引流的特性，白蛋白易于经淋巴道吸收。4)纳米粒可通过肿瘤组织的EPR效应 (Enhancedpermeability and retention effect,渗透潴留效应)、微循环滞留、肿瘤细胞 吞噬等效应增加肿瘤靶向性。5)提高靶向性的同时，减少全身非靶器官的毒副作用。
图1为奥沙利铂HSA纳米粒的电镜照片 图2为奥沙利铂HSA纳米粒的体外药物释放曲线 图3奥沙利铂HSA纳米粒对LS174T细胞株的抑制率 一 给药浓度曲线
具体实施例方式
本发明包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒由奥沙利铂原料药和人血白蛋白HSA 组成，制备过程用到注射用水、无水乙醇、戊二醛和氢氧化钠。其中奥沙利铂原料药与白蛋 白的质量比为20%，白蛋白水溶液的浓度为2%，沉淀剂无水乙醇与白蛋白水溶液的体积 比为2. 5 : 1 ;交联剂戊二醛与白蛋白的氨基摩尔比为100%，氢氧化钠的浓度为1M。
其制备经过下列步骤制备
(1)直接载药与沉淀 称取HSA 200mg，奥沙利铂20mg，以纯水配制成2%白蛋白溶液，以1M氢氧化钠调节pH至9. O，在2000转/min搅拌下以ImL/min速度滴加法加入25mL无水乙醇，得到蓝色
乳光胶体溶液，继续搅拌； (2)吸附载药与交联 另取与前述等量的奥沙利铂20mg，以纯水配制成10mg/mL溶液，并以1M氢氧化钠 调节pH至8. 5，在2000转/min搅拌下加入到步骤一所得蓝色乳光胶体溶液中，搅拌30min 后加入戊二醛，所述戊二醛与白蛋白氨基摩尔比为100% ，搅拌6h ; [OO32] (3)旋转蒸发 利用旋转蒸发仪，将步骤二得到的纳米粒胶体溶液于4(TC旋转蒸发除去乙醇；
(4)离心沉淀 利用高速离心机，将步骤三得到的除去乙醇的纳米粒混悬液于14000转/min速度
下，离心20min ; (5)冷冻干燥 沉淀的纳米粒注入10mL注射用水混悬后在低温_701:条件下冷冻干燥，获得包载 奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒冻干粉，完成制备。 上述奥沙利铂HSA纳米粒的制剂工艺参数是在经历了大量的试验数据整理后得 出的，现将影响因素分析如下 通过多个因素的单因素和多因素考察进行处方的优化。采用lM氢氧化钠调节pH 分别为6. 0、7. 4、8. 0、9. 0、10. 0、12. 0，结果表明随着pH的升高，粒径逐渐减小，而得率下 降。乙醇的加入体积对纳米粒得率和粒径影响显著，随着乙醇体积比的增加，纳米粒粒径急 剧增大，当体积比达到4 : 1时，纳米粒粒径可达300-400nm。乙醇加入速度对粒径有一定 影响，但速度小于ImL/min时粒径变化不明显；乙醇加入速度对得率无明显影响。固定其 它因素，戊二醛交联时间分别为6、12、16h时进行纳米粒制备，结果提示随着交联时间的延 长，纳米粒粒径增大，得率降低。随着白蛋白浓度的增加，粒径有增大的趋势。随着投药量 增大，粒径也有增大的趋势。随着交联剂用量的增加，得率起初变化不大，继后出现下降趋 势。吸附载药尽管可以达到较高的载药量，但释放过快，而直接载药和结合直接和吸附两种 工艺的载药方式的释放速度相似，且后者更慢些，考虑到结合工艺的载药量较高，因此载药 方式选定为结合工艺。本发明给出的相关参数为最优化参数。
包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的检测指标如下
1)粒径和Zeta电位测定 样品用生理盐水配制成浓度为lmg/mL的胶体溶液。粒径分布和Zeta电位采用动 态光散射及Zeta电位分析仪测定。测试条件温度25t:，散射角度90度，以散射强度为权 重的平均粒径作为粒径指标；测试Zeta电位的场强IOV。
2)包封率和载药量测定 取制备过程中离心沉淀纳米粒后的上层溶液，置于lOmL容量瓶中加纯水定容，采
用高效液相法测定溶液中的奥沙利铂含量，按下式计算纳米粒的包封率 包封率=(投药量-溶液中药物浓度X 10)/投药量X 100% 称取定量纳米粒，置于10mL容量瓶中，加纯水至刻度，大功率超声30min，溶液过
0. 22ym滤膜，采用高效液相色谱法测定奥沙利铂的含量，按下式计算纳米粒的载药量载
药量=纳米粒中药物含量/纳米粒质量X 100%
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3)电镜检测 利用透射电子显微镜检测纳米粒的形态将样品分散液滴在铜网上，室温干燥，在
透射电子显微镜下观察样品并拍照。 4)体外释放度考察 定量称取纳米粒，置于一定体积的等渗PBS pH 7.4中，涡旋2min分散均匀后，配 制成含奥沙利铂为lmg/mL纳米粒悬浊液，取500ii L置透析袋中。将透析袋置于25mL等 渗PBS pH 7. 4释放介质中，37t:水浴振荡，分别于0. 5、 1、2、4、6、8、 10、 12、 14、 16h取释放液 0. 5mL，取后回补0. 5mL空白释放介质，过0. 22 y m滤膜后，采用高效液相色谱法测定其中奥 沙利铂含量。以时间为横坐标，奥沙利铂累积释放度为纵坐标，绘制释放曲线。
5)体外稳定性考察 将同一批制备的纳米粒冻干粉末于4t:放置6个月，然后测定其粒径、zeta电位和 载药量，对比测定值的差异。 依据本发明制成的包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒实测得如下数据 奥沙利铂HSA纳米粒平均粒径为102±3. 5nm，主体位于50_200nm范围内，Zeta电
位为-22. 6±2. 09mV ;载药量达9. 06%，包封率达70. 57% ;达到了同类纳米粒载药的较高
水平，见下表l。奥沙利铂HSA纳米粒的冻干粉为白色蓬松状，水溶液为悬浊状。透射电镜
下进行观察，纳米粒呈圆球形，边缘光滑，彼此之间分散良好，粒径大体观尚属匀称，如图1。 表1奥沙利铂HSA纳米粒的部分表征参数
平均粒径粒径范围包封率(％)载药量(％)Zeta电位缓释时间突释率(％)
102±3.5nm50-200nm70.579.06-22.6 ± 2.09mV10h25.87 奥沙利铂白蛋白纳米粒的体外释放曲线如图2所示在0. 5h内，奥沙利铂有一个 突释的过程，其后开始缓慢的持续释放；在10h进入平台期，达到96. 4%的累积释放率，因 此认为其药物缓释时间为10h。 将同一批制备的纳米粒冻干粉于4t:放置6个月，然后测定其的粒径、zeta电位和 载药量。结果提示与6个月前的测定结果差别不大，说明奥沙利铂HSA纳米粒冻干粉体外 放置具有较好的稳定性。 奥沙利铂白蛋白纳米粒在治疗直肠癌疾病中的应用，其特殊给药方式如下
腹腔留置化疗导管6个月或以上，奥沙利铂白蛋白纳米粒由导管给药2-3周/次 *6_8次，经腹腔腹膜及肿瘤灶等组织——区域淋巴结——远处淋巴结，由中心向外周导向 化疗。开腹手术前或者不准备采取手术治疗的患者可以采用局麻下微创置管，采取手术治 疗的患者可在关腹前留置药物同时置管，腹水患者可以直接腹腔注射。奥沙利铂白蛋白纳 米粒可单用，也可与5-FU、 CF、伊立替康等药物的冻干粉水溶液或者纳米制剂合用；同时可 以合用防粘连制剂等药物。经腹腔淋巴导向化疗可与静脉化疗、介入化疗等传统化疗方法 配合。
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采用这样的给药方法的优越性和创新性如下 ①奥沙利铂白蛋白纳米粒是奥沙利铂的新剂型，保留了奥沙利铂的抗肿瘤活性，
改变了奥沙利铂分子量小，易于进入血液循环，不易进入淋巴循环的特点，并且大大提高了 药物缓释性。②以白蛋白为骨架材料制作纳米粒，生物相容性好，安全无毒，可生物降解；更
重要的是，组织内白蛋白主要经淋巴途径而不是血液途径参与循环。③腹腔置管实现了长 期化疗，可以进行6-8次化疗或者更多，操作实用性接近传统的静脉化疗，而疗效胜于传统 化疗。④腹腔内、肿瘤周围存在着大量的淋巴管和淋巴结，淋巴管内皮细胞间连接松散，常 有许多开放的间隙存在；腹腔给药后，小分子主要通过毛细血管进入门静脉系统，而白蛋白 纳米粒则通过淋巴管内皮细胞间隙和内皮细胞的胞饮及吞噬作用进入毛细淋巴管内，然后 通过淋巴引流到达区域淋巴结，进入淋巴循环。⑤结直肠癌术后患者腹腔内有较多创面，为 纳米粒进入淋巴循环的一个特殊的有利途径。⑥事实上同时进行了腹腔化疗和静脉化疗， 纳米粒早期释放出来的奥沙利铂分子可以杀灭肿瘤局部区域的残存细胞，也可由毛细血管 吸收进入血循环。⑦可以有效防止肝转移肝转移是结直肠癌等腹腔肿瘤除淋巴转移以外 的第二个重要转移方式，奥沙利铂白蛋白纳米粒反复腹腔给药可以经血行方式和吞噬细胞 运载方式由门脉系统进入肝脏。⑧结直肠癌术后腹腔内肠吻合口少，特别是直肠癌miles 术后没有肠吻合，经腹腔给药淋巴导向化疗的安全性比胰腺癌、胃癌等高。⑨白蛋白纳米 粒同时可以通过可通过月中瘤组织EPR效应(俄Enhanced permeability and retention effect)、循环滞留、肿瘤细胞吞噬等效应增加肿瘤靶向性。⑩增加淋巴循环药量，减少血循 环和其它脏器组织的药物分布，提高了靶向性并减少了毒副作用。 下面进一步说明本发明制备的包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的体内外抗肿 瘤药效实验研究 1)奥沙利铂HSA纳米粒对大肠癌细胞株的体外抑制试验 通过MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)，检测奥沙利铂HSA纳米粒相 对于奥沙利铂原料药和空白纳米粒对结直肠癌细胞的抑制效应是否具有差别，纳米粒的制 备过程是否有药效减损，纳米粒在细胞水平的生物相容性如何。选择ATCC人大肠癌癌细 胞株LS174T ;设置奥沙利铂HSA纳米粒、空白HSA纳米粒、奥沙利铂原料药、培养液共4组； 0. 001、0. 01、0. l、l、10、100ii g/ml共6个浓度；48小时、96小时两个时间点，6个复孔。
图3给出了奥沙利铂HSA纳米粒对LS174T细胞株的抑制率 一 给药浓度曲线。其 结果显示奥沙利铂纳米粒对细胞增殖的抑制率超过原料药，特别是给药后96h有显著的优 势；而空白纳米粒对细胞增殖没有明显的影响。提示载药纳米粒组具有更好的体外药效，且 生物相容性良好。 2)奥沙利铂HSA纳米粒对大肠癌细胞株裸鼠腹腔种植瘤和淋巴转移的抑制试验
该部分通过初步的裸鼠大肠癌腹腔种植瘤模型体内试验，检测奥沙利铂HSA纳米 粒相对于奥沙利铂纯原料药和空白HSA纳米粒对裸鼠腹腔种植瘤的生长和淋巴转移的抑 制是否更为有效， 4周龄雄性裸小鼠裸小鼠32只，左下腹腹腔注射种植1 X 107ml的ATCC人大肠癌 癌LS174T细胞0. 2ml建立均匀稳定的胰腺癌种植瘤模型，接种后1周随机分为4组奥沙 利铂HSA纳米粒、空白HSA纳米粒、奥沙利铂原料药、生理盐水，每组各8只。接种后1周起， 通过左下腹腹腔注射给药，每周注射药物1次，连续4次。A组和B组含奥沙利铂药量相等，
7C组给予等量的空白纳米粒，D组给予相同体积的生理盐水。接种后第5周末处死动物，解 剖腹腔进行观察。结果如表2所示，奥沙利铂HSA纳米粒对肿瘤、腹水、淋巴转移和肝脏转 移均有一定的抑制作用，并且对体重的影响较原料药小。 表2奥沙利铂HSA纳米粒对大肠癌细胞株裸鼠腹腔种植瘤的抑制试验
组别(n=8)<formula>formula see original document page 8</formula> 3)奥沙利铂HSA纳米粒治疗结直肠癌新型淋巴导向化疗方案设计
在经实验室试验、动物试验之后，本发明已拟定了对奥沙利铂HSA纳米粒治疗结 直肠癌新型淋巴导向化疗方案设计，开腹结直肠癌根治术的患者于手术结束后，将1克奥 沙利铂HSA纳米粒其载药量为10%左右溶于100毫升几丁糖防粘连液，涂抹于手术区域 和肿瘤区域；并于腹壁留置化疗导管，然后关腹。术后3周开始淋巴导向化疗，方案采用 FOLFOX 4 :奥沙利钼85mg/m2， h0_h2， dl ;LV甲酰四氢叶酸f丐200mg/m2， h0_h2， dl，2 ;5_FU 400mg/i^推注，然后5-FU 600mg/m2，h2-h22， dl， 2 ;每两周重复一次，共6-8次。其中奥沙利 铂改为奥沙利铂HSA纳米粒，其含奥沙利铂量同，给药途径由静脉改为经腹腔导管推注或 滴注，溶剂也可采用乳剂；除奥沙利铂HSA纳米粒以外，其它药物也可仍由静脉途径给予； 可与静脉化疗间隔进行；可同时腹腔注入防粘连和保护腹膜的药物或者溶液。
本发明在不改变奥沙利铂的分子结构的情况下，制备一种全新的奥沙利铂剂 型——包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒，来保护药物缓释，减慢分解代谢，并增加药物的 体积和重量。纳米粒是粒径介于10-lOOOnm的微颗粒系统，作为靶向或缓释给药制剂的载 体是其在临床上的重要应用之一。本发明所制备的载药纳米粒主要由药物和骨架材料组 成。人血白蛋白(human serum albumin, HSA)是人血浆中的水性蛋白之一，同时也是临床 应用的重要药物。以HSA为骨架材料制备的纳米粒不存在溶血性和免疫原性的问题，生物 相容性好、安全无毒、可生物降解，可保护药物缓释、增加靶向性、减少药物副作用，对于提 高疗效有显著的作用。
权利要求
一种包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒，由奥沙利铂原料药和人血白蛋白HSA组成；在制备过程中用到注射用水、无水乙醇、戊二醛和氢氧化钠；其中奥沙利铂原料药与白蛋白的质量比为10-25％，白蛋白水溶液的浓度为1-2.5％(g/ml)，沉淀剂无水乙醇与白蛋白水溶液的体积比为2∶1-3∶1；交联剂戊二醛与白蛋白的氨基摩尔比为75-200％，氢氧化钠适量；其制备经过下列步骤制备步骤一，直接载药与去溶剂常温下，以质量比为5-25％称取奥沙利铂、人血白蛋白HSA，用注射用水配制成1-2.5％白蛋白水溶液，以适量氢氧化钠调节其pH至8.8～9.2，在300-2000转/min搅拌下采用滴加法加入与前述白蛋白水溶液体积比为1∶2～1∶3的无水乙醇，得到蓝色乳光胶体溶液，继续搅拌；步骤二，吸附载药与交联常温下，另取与前述等量奥沙利铂，以纯水配制成10mg/mL溶液，并以适量氢氧化钠调节pH至8.3～8.7，在300-2000转/min搅拌下加入到步骤一所得蓝色乳光胶体溶液中，搅拌30min后加入戊二醛，所述戊二醛与白蛋白氨基摩尔比为75～100％，搅拌一定时间；步骤三，旋转蒸发利用旋转蒸发仪，将步骤二得到的纳米粒胶体溶液于40℃旋转蒸发器除去乙醇；步骤四，离心沉淀利用高速离心机，将步骤三得到的除去乙醇的纳米粒混悬液置于14000转/min速度下，离心20min；步骤五，冷冻干燥沉淀的纳米粒注入20mL的注射用水混悬后在低温条件下冷冻干燥，获得包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒冻干粉，完成制备。
2. 根据权利要求1所述的包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于 所述适量氢氧化钠为保持制备溶液PH值在给定范围内。
3. 根据权利要求1所述的包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于 所述步骤一滴加法为以lmL/min速率加入无水乙醇。
4. 据权利要求1所述的包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于所 述交联剂戊二醛与白蛋白的氨基摩尔比较优比例为100 % 。
5. 根据权利要求1所述的包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于 所述步骤五在低温条件下其低温为_7(TC。
全文摘要
本发明涉及一种包载奥沙利铂的人血白蛋白纳米粒及其制备方法。由奥沙利铂原料药和人血白蛋白HSA组成；在制备过程中用到注射用水、无水乙醇、戊二醛和氢氧化钠；其中奥沙利铂原料药与白蛋白的质量比为10-25％，白蛋白水溶液的浓度为1-2.5％(g/ml)，沉淀剂无水乙醇与白蛋白水溶液的体积比为2∶1-3∶1；交联剂戊二醛与白蛋白的氨基摩尔比为75-200％，氢氧化钠适量。其制备包含下列步骤直接载药与去溶剂、吸附载药与交联、旋转蒸发、离心沉淀、冷冻干燥五大步骤。本发明具有如下优点1)保留奥沙利铂的抗肿瘤效力，改变其代谢快的局限性，并提高药物缓释性。2)以人血白蛋白为骨架材料，人体相容性好，安全无毒，可生物降解，可增加淋巴循环药物浓度。
文档编号A61K9/19GK101708337SQ20091005662
公开日2010年5月19日 申请日期2009年8月18日 优先权日2009年8月18日
发明者崔龙, 张纪伟, 李金明, 翁子毅, 陈卫 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院