专利名称：：一种杠板归有效成分总黄硐的提取方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种杠板归有效成分总黄硐的提取方法，本发明还涉及杠板归有效成分总黄硐制备治疗抗疱疹病毒药物中的应用。
背景技术：
：杠板归系蓼科植物杠板归PolygonumperfoliatumL.的全草，始载于《万病回春》谓"四五月生至九月见霜即无，叶尖青如犁头样，藤有小刺，子圆如珠，生青熟黑"。多生于阴湿草地，路边，河岸的草丛或灌丛中，在我国南北各地均有分布。杠板归为民间较广泛使用的草药，具有清热解毒，祛湿除痹，杀虫止疡等功效，但对其抗病毒的活性成分还未见相关研究。
发明内容本发明的要解决的技术问题是要提供一种从杠板归中提取其有效成分总黄硐的方法，本发明要解决的另一个技术问题是杠板归有效成分总黄硐在制备治疗抗疱疹病毒药物中的应用。本发明的目的是这样实现的一种杠板归有效成分总黄硐的提取方法，取杠板归并按固液比为1:25分别加入浓度为75%的250ml，在8CTC的恒温水浴锅中回流提取3小时，得到杠板归有效成分总黄酮。杠板归有效成分总黄硐在制备治疗抗疱疹病毒药物中的应用。本发明提供的杠板归有效成分总黄硐的提取方法中是采用可见光分光光度法在波长为500rim处测定杠板归总黄酮的含量，通过单因素和正交试验确定了最佳提取工艺的条件。随着提取温度的提高，黄酮的提取率呈上升趋势。但考虑到提取温度过高会对提取液中的黄酮类化合物的活性造成破坏，温度过低则不利于有效物质的溶出，影响生产效率，因此将提取温度确定为8(TC。随着乙醇浓度的提高，黄酮的提取率呈上升趋势，但大于75%后随着浓度的进一步升高，黄酮提取率反而有所下降，通过单因素和正交试验确定了最佳提取工艺的条件为以75%的乙醇溶液为溶剂，固液比为l:25，在80。C下回流3h，提取率最高，总黄酮提取率为7.589%。本发明对杠板归有效成分总黄硐在制备治疗抗疱疹病毒药物中的应用进行了研究，认为杠板归主要通过抑制病毒增殖途径发挥抗HSV-1作用，杠板归总提物在抑制病毒增殖(TI=27.58)和直接杀伤(TI=13.36)上作用明显，正丁醇部位(总黄酮)在抑制病毒增殖(TI=8.8)上作用明显，有直接杀伤病毒的作用。溶质对病毒无作用。得到杠板归主要通过抑制病毒增殖和直接杀伤病毒的途径发挥抗HSV-1作用，其主要活性成分库杠板归总黄酮的结论。图1是溶剂10。/。DMS0对细胞的毒性作用，溶剂的半数毒性浓度为0.226ug/ml。图2是G2药物对细胞的毒性作用，正丁醇部位(G2)的半数毒性浓度为0.00297rag/ml。图3是G3药物对细胞的毒性作用，乙酸乙酯部位(G3)半数毒性浓度为0.00104mg/ml。图4是G4药物对细胞的毒性作用，总提部位(G4)半数毒性浓度为0.00187mg/ml。具体实施例方式一、提取制备工艺的研究1.1仪器shb-m循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂(RE52-05);UV-2100紫外分光光度仪(上海尤尼柯公司)。1.2试药杠板归药材于采自湖北宜昌市郊区，经鉴定为PolygonumperfoliatumL.的干燥全草。药材原植物采集后洗净，自然风干，切碎后备用。芦丁标准品(HPLC纯度98%);医用乙醇(纯度〉95%);其他试剂均为国产分析纯。2方法与结果2.1标准曲线的绘制准确称取芦丁标准品4.7mg，置25mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并稀释到刻度，配制成浓度为0.188mg/mL的芦丁标准液。精密量取配制好的芦丁标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别装入25mL容量瓶中，不足6ml的用60%乙醇补足，加5%亚硝酸钠lmL，放置6min后加入10%硝酸铝溶液lmL，放置6min，再加入4%氢氧化钠溶液10mL，加蒸熘水至刻度，摇匀，放置15min，在500nm波长处进行比色测定，以吸光度(A)为纵坐标、芦丁标准品浓度(C)为横坐标作线性回归，得方程为A=13.333C-0.004(r=0.9997)。2.2样品含量测定将杠板归(10g)粉碎，按实验条件进行提取，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，加适量水稀释，用石油醚(609(TC)萃取，弃去石油醚层，抽滤，即得样品液。精密量取样品浓縮液0.lmL，置于25mL容量瓶中加60%乙醇溶解补足至6.Oml，按标准曲线的制备方法测定吸光度，通过标准曲线，得其含量。2.3单因素提取工艺研究2.3.1乙醇浓度对提取效果的影响由于乙醇对天然药材细胞具有穿透能力，对许多成分溶解性能好，能抑制酶的催化作用，及它的无毒特性，本研究采用乙醇为提取溶剂。精确称取5份杠板归各10g，分别加入浓度为40%、60%、75%、90。/。的乙醇200ml，料液比为1:20，在80。C的恒温水浴锅中回流提取2次(2h/次)，过滤冷却，分别取2.5ml提取液，置25ml容量瓶中，按照总黄酮的测定方法进行黄酮类化合物的测定。重复3次。试验结果表明，75%乙醇为最佳乙醇浓度，详见表l。表l乙醇浓度对提取率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>15、1:20、1:25、1:30分别加入浓度为75%的乙醇100、150、200、250、300ml，在80。C的恒温水浴锅中回流提取2次(2h/次)，过滤冷却，分别取2.5ml提取液，置25ml容量瓶中，按照总黄酮的测定方法进行黄酮类化合物的测定。重复3次。试验结果表明，随着固液比的升高，提取率也随之增大，固液比为1:20时黄酮提取率增加缓慢。详见表2。表2料液比对提取率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.3.3提取时间对提取效果的影响精确称取5份杠板归各10g，分别加入浓度为75y。的乙醇200ml，固液比为l:20，在80。C的恒温水浴锅中分别提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，过滤冷却，分别取2.5ml提取液，置25ml容量瓶中，按照总黄酮的测定方法进行黄酮类化合物的测定。重复3次。试验结果表明，随着提取时间的延长，黄酮类物质的提取率不断上升。详见表3。表3提取时间对提取率的影响水平提取时间(h)总黄酮Jl(mg)11.0551.7221.5580.6332.0632.7842.5645.232.3.4温度对提取效果的影响精确称取5份杠板归各10g，分别加入浓度为75%的乙醇200ml，固液比为1:20，分别在40、50、60、70、80。C的恒温水浴锅中回流提取2次(2h/次)，过滤冷却，分别取2.5ml提取液，置25ml容量瓶中，按照总黄酮的测定方法进行黄酮类化合物的测定。重复3次。试验结果表明，提取温度以8(TC较好。详见表4。表4提取温度对提取率的影响水平提取温度(°c)总黄酮量(mg)140583.75250597.44360603.58470632.462.4正交试验为了确定在提取过程中各因素的影响大小，实验对影响因素较大的乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(D)三因素进行正交试验和方差分析。详见表5，表6，表7。表5实验因素水平表水平乙醇浓度(A)提取时间(B)空白(C)料液比(D)1機1.51:15260%2.01:20375%2.51:25表6L"34)正交实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表6可以看出，在影响提取率的4个因素(乙醇浓度、料液比、空白、提取时间)中，乙醇浓度的影响最大，其影响总黄酮提取率的大小次序先后为乙醇浓度〉提取时间〉料液比，取乙醇为提取剂的杠板归总黄酮的优化工艺参数为乙醇浓度75%、固液比为1:25，在8CTC下回流3h.在这个最佳条件下试验，总黄酮提取率为7.589%。由表7的方差分析结果表明，乙醇浓度(因子A)对杠板归总黄酮的提取率的影响达到极显著水平，乙醇浓度在75%时，提取效果最好，增大或减小乙醇浓度，提取率都减小；提取时间(因子B)对提取的影响达次显著水平，增加提取时间，有利于杠板归总黄酮的溶出，但提取时间过长，不仅破坏有效物质结构，且降低工作效率，增加了成本。料液比(因子D)对提取的影响不大。2.5验证实验分别称取同批的杠板归粗粉10克5份，按上述优化后的制备工艺对杠板归进行提取，结果见表8，可见优化后的提取工艺总黄酮含量提取率均较稳定。表8优化工艺总黄酮含量实验号_总黄酮量(mg)_RSD1788.692796.033803.460.2%4801.325799,42本发明对杠板归有效活性成分总黄酮的提取工艺进行研究，采用可见光分光光度法在波长为500nm处测定杠板归总黄酮的含量，通过单因素和正交试验确定了最佳提取工艺的条件。在实验中，随着提取温度的提高，黄酮的提取率呈上升趋势。但考虑到提取温度过高会对提取液中的黄酮类化合物的活性造成破坏，温度过低则不利于有效物质的溶出，影响生产效率，因此将提取温度确定为8(TC。随着乙醇浓度的提高，黄酮的提取率呈上升趋势，但大于75%后随着浓度的进一步升高，黄酮提取率反而有所下降，乙醇浓度为60%80%时提取率高于其他浓度时的提取率。通过单因素和正交试验确定了最佳提取工艺的条件为以75%的乙醇溶液为溶剂，固液比为l:25，在80。C下回流3h，提取率最高。确定了影响因素的依次为乙醇浓度、提取时间、固液比。二、杠板归有效成分总黄硐在制备治疗抗疱疹病毒药物中的应用本发明采用体外试验，研究了归板归的主要提取成分的抗病毒活性.方法如下1)药物对H印-2细胞的毒性作用药物细胞毒性测定将H印-2细胞悬液稀释成8Xl07mL，接种96孔细胞培养板中，每孔200uL，置37。C、5%C02、100%相对湿度的培养箱中培养24h后，分别在各孔中加入各供试品液，相同条件下继续培养33h。观察细胞病变(CPE)情况，并以MTT法检测细胞存活率。每一药物浓度重复4L另设正常细胞对照。细胞存活率(％)=(实验孔^/对照孔^)X100%.从图1可以看是溶剂10%DMSO对细胞的毒性作用，溶剂的半数毒性浓度为0.226ug/mlo图2中，正丁醇部位(G2)的半数毒性浓度为0.00297mg/ml。图3中，乙酸乙酯部位(G3)半数毒性浓度为0.00104mg/ml。图4中，总提部位(G4)半数毒性浓度为0,00187mg/ml。2)药效学实验药物对HSV-1的直接灭活作用将不同质量浓度供试品液与100TCID5。/0.1mL的HSV-1等体积混合，37'C作用90min后，以此病毒药物混合液感染H印-2细胞。37°C、5%0)2吸附90min，洗涤，加细胞维持液置37°C、5%002培养。每日观察CPE,72h后以MTT法检测病毒抑制率。采用治疗指数(treatmentindex,TI)作为评价指标来衡量药物对病毒的抑制效力。每一药物浓度重复4L，同时设置正常细胞对照、药物对照及病毒对照，结果见表9。统计学处理用excell软件线性回归法计算药物半数毒性浓度TCs。和半数有效浓度IC5。，得到药物治疗指数(TreatmentIndex,TI=TC5。/IC50).表9药物对HSV-1的直接杀伤作用(将药物与病毒等体积混合后感染细胞)药物IC50TI溶质0.2271G20.0009513.123G30.0006691.555G40.0001413.36溶质为IOWMSO药物对HSV-1生物合成的抑制作用:以100TCID5。/0.1/mLHSV-1感染细胞，吸附90min后洗涤，加入不同浓度供试液，培养与检査同上，结果见表10。表IO、药物对HSV-1增殖的抑制作用(将病毒感染细胞后加药物)药物IC50TI溶质——G20.0003378.8G30.0019770.526G40.000064827.58药物对HSV-1侵入细胞的阻断作用:用药物预先处理细胞90min，洗涤后以100TCIDM/0.lmL的HSV-1攻击，37°C、5%(1)2吸附90min后洗涤，培养与检查方法同上，结果见表ll。表11药物抗HSV-1吸附的作用(用药物预先处理细胞再加病毒攻击)药物ic50TI溶质0.2251G20.004770.623G30.000961.083G40.00230.818采用治疗指数(treatmentindex,TI)作为评价指标来衡量药物对病毒的抑制效力。根据TI〈1为有毒无效，11=2为有效有毒，TI〉2为有效低毒结合高效低毒TI〉6，有效3<TI<6;低效TI<3，TI值越高，药物的治疗安全效果就越好来看，G4药物在抑制病毒增殖和直接杀伤上作用明显，G2在抑制病毒增殖上有作用。溶质对病毒无作用。初步推断杠板归主要通过抑制病毒增殖途径发挥抗HSV-1作用.杠板归总提物在抑制病毒增殖(TI=27.58)和直接杀伤(TI=13.36)上作用明显，正丁醇部位(总黄酮)在抑制病毒增殖(TP8.8)上作用明显,有直接杀伤病毒的作用。溶质对病毒无作用。初步推断杠板归主要通过抑制病毒增殖和直接杀伤病毒的途径发挥抗HSV-1作用，其主要活性成分库杠板归总黄酮。权利要求1、一种杠板归有效成分总黄硐的提取方法，其特征在于取杠板归并按固液比为1∶25分别加入浓度为75％的250ml，在80℃的恒温水浴锅中回流提取3小时，得到杠板归有效成分总黄酮。2、杠板归有效成分总黄硐在制备治疗抗疱疹病毒药物中的应用。全文摘要一种杠板归有效成分总黄硐的提取方法，取杠板归并按固液比为1∶25分别加入浓度为75％的250ml，在80℃的恒温水浴锅中回流提取3小时，得到杠板归有效成分总黄酮。本发明将杠板归有效成分总黄硐应用于制备治疗抗疱疹病毒药物中，认为杠板归主要通过抑制病毒增殖途径发挥抗HSV-1作用，杠板归总提物在抑制病毒增殖(TI＝27.58)和直接杀伤(TI＝13.36)上作用明显，正丁醇部位(总黄酮)在抑制病毒增殖(TI＝8.8)上作用明显，有直接杀伤病毒的作用。溶质对病毒无作用。杠板归主要通过抑制病毒增殖和直接杀伤病毒的途径发挥抗HSV-1作用，其主要活性成分库杠板归总黄酮。文档编号A61P31/22GK101596238SQ20091006278公开日2009年12月9日申请日期2009年6月16日优先权日2009年6月16日发明者何毓敏,周志勇,张长城,丁袁,黄鹤飞申请人:三峡大学