专利名称：：葛根素的提取方法及葛根在制备保护肝脏药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于中药
技术领域：
，具体涉及一种葛根素的提取方法及葛根在制备保护肝脏药物中的用途。
背景技术：
：肝脏作为人体内最大的"化工厂"，肩负着分解进入人体一切物质的重任，特别是对人体有害物质的分解(包括酒精、化学药物、食物的农药残留等)，当人体有害物质长期大量摄入时，就会导致肝脏自身中毒，肝细胞受到损伤，临床上常见的脂肪肝、酒精肝及转氨酶、转肽酶增高的主要原因在肝细胞受损肝脏中毒所致。葛根又叫粉葛、葛藤，生长于地面上的为藤状植物，地下部分为根块状，葛根生于山坡草丛、路旁、疏林中较阴湿处，在我国分布广泛，盛产广西、广东、湖南等地。葛根全身是宝，在我国有悠久的应用历史，连葛藤、葛叶、葛花都有应用之法。经历代医药家不断总结和试验，得出葛根具有性凉、气平、味甘，具清热、降火、排毒诸功效。用现代医学方法进一步分析表明，葛根中富含多达13种异黄酮类物质，包括葛根素、葛雌素、葛根素木糖甙、大豆黄酮等，葛根素对高血压、高血脂、高血糖和心脑血管疾病有疗效。而现有提取葛根素的方法很多，但是其提取的纯度不高，并且由于葛根的产量大，人们对葛根的用途还有待进一步发掘。
发明内容因此人类对葛根的用途仍存在需求，.至今为止，还没有发现任何有关本发明药物的报道，本发明人经过反复研究，终于找到了葛根提取物葛根素的另一提取方法及其用途。'本发明的目的是提供一种葛根素的提取方法。本发明的另一目的是提供葛根在制备保护肝脏中的用途。本发明所述葛根提取物葛根素在保护肝脏功能方面有较好的疗效，可以从葛根中提取葛根素；其主要步骤如下①粉碎、提取将葛根粉碎后过io目筛，称取定量葛根粉，置于提取罐中，先用其质量4倍体积的蒸镏水或浓度为95%乙醇或甲醇作溶剂回流提取l1.5h，过滤，滤渣再用2倍体积的上述溶剂回流提取lh，再次过滤，收集、合并两次滤液，获得葛根素粗提液；②浓縮将醇提取液置于真空浓縮器中，控制真空度为-0.10.08MPa，浓縮温度为8590。C，回收甲醇或乙醇；③上柱取定量活化DIOI大孔吸附树脂装柱，按照其对葛根素的吸附容量计算出应吸附的提取液体积，将提取液泵入树脂柱中，控制流出液速度为1-1.5倍树脂柱体积/h，使葛根素吸附于DIOI吸附树脂上；④洗脱当上柱液流完后，先用蒸馏水洗涤，洗去糖类、蛋白质、鞣质水溶性杂质，直至洗脱液近无色时止，然后用70%的乙醇溶液进行洗脱，控制洗脱液流出速度为1-1.5倍树脂柱体积/h，用12倍树脂体积的洗脱液即可洗脱被树脂吸附的85%以上的葛根素；浓縮将洗脱液置于真空浓縮机中，控制真空度为-0.10.08MPa，浓縮温度为859(TC，回收乙醇直至浓縮液相对密度为1.2时止；⑥萃取、浓缩、干燥将浓縮液置于萃取器中，加入等体积正丁醇，反复萃取4次，收集正丁醇相，再次进行真空减压浓縮至干，浓缩条件同提取液，获得葛根素粗提取物。本发明是发明人经过长期大量摸索总结得来的，发现所述葛根提取物葛根素在保护肝脏功能方面有较好的疗效。经过动物实验证明，葛根具有很好的解毒护肝之功效。与现有技术相比，本发明具有提取的葛根素纯度高、使用方便的优点。具体实施例方式本发明所述葛根提取物葛根素在保护肝脏功能方面有较好的疗效，可以从葛根中提取葛根素；其主要步骤如下①粉碎、提取将葛根粉碎后过IO目筛，称取定量葛根粉，'置于提取罐中，先用其质量4倍体积的蒸馏水或浓度为95%乙醇或甲醇作溶剂回流提取l1.5h，过滤，滤渣再用2倍体积的上述溶剂回流提取lh，再次过滤，收集、合并两次滤液，获得葛根素粗提液；②浓縮将醇提取液置于真空浓縮器中，控制真空度为-0.10.08MPa，浓缩温度为859(TC，回收甲醇或乙醇；◎上柱取定量活化DIOI大孔吸附树脂装柱，按照其对葛根素的吸附容量计算出应吸附的提取液体积，将提取液泵入树脂柱中，控制流出液速度为1-1.5倍树脂柱体积/h，使葛根素吸附于DIOI吸附树脂上；洗脱当上柱液流完后，先用蒸馏水洗涤，洗去糖类、蛋白质、鞣质水溶性杂质，直至洗脱液近无色时止，然后用70%的乙醇溶液进行洗脱，控制洗脱液流出速度为1-1.5倍树脂柱体积/h，用12倍树脂体积的洗脱液即可洗脱被树脂吸附的85。％以上的葛根素；⑤浓縮将洗脱液置于真空浓縮机中，控制真空度为-O.10.08MPa，浓縮温度为8590°C，回收乙醇直至浓縮液相对密度为1.2时止；⑥萃取、浓縮、干燥将浓縮液置于萃取器中，加入等体积正丁醇，反复萃取4次，收集正丁醇相，再次进行真空减压浓縮至干，浓縮条件同提取液，获得葛根素粗提取物。葛根素粗操取物为浅褐色粉末。将获得的葛根素粗提取物再次用有机溶剂溶解，进行重结晶，.可获得高纯反广叩。观察葛根素(葛根素)对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤是否具有保护作用。方法首先建立大鼠肝硬化动物模型，在此模型基础上建立大鼠全肝缺血再灌注模型，比较用葛根素预处理对缺血再灌注后，肝组织光镜下的形态学改变；血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和氧化亚氮(NO)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，及肝组织中NO、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、MDA含量、SOD活性变化。结果葛根素预处理可使大鼠血清NO含量、肝组织NO含量及SOD活性明显增高；而血清ALT、AST、MDA含量及肝组织TNF-a、MDA含量明显降低；肝组织形态损伤也有所减轻。结论葛根素对肝硬化大鼠肝缺血再灌注损伤有显著的保护作用，其主要是减少NO的降低、扩张血管、改善微循环；清除氧自由基、减轻脂质过氧化。本试验通过葛根素预处理及缺血预处理对肝硬化大鼠肝脏I/R损伤保护作用的对比，探讨葛根素是否对肝硬化大鼠肝脏的I/R损伤具有保护作用，并进一步研究其作川机制。1材料与方法1.1动物Wastar大鼠200只，体重200220g，雌雄各半。1.2仪器与试剂奧林巴斯2700全自动生化分析仪、DY89-1全自动玻璃匀浆机、ArthosHTII酶标仪、SANYOMDF-330型-70。C低温冰箱、HH21-600型恒温水浴箱、722分光光度计。CC14，泸州市鑫达化工有限公司提供，批号2008713;食用酒，泸州市食品厂提供；葛根素注射液哈尔滨三联药业有限公司提供，批号09102B;SOD测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，黄嘌呤氧化酶法测定，批号20080716;MDA测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；TBA法测定，批号20080716;NO测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，亚硝酸盐法测定，批号20080719;TNF-a测定试剂盒，上海森雄科技实业有限公司，双抗休夹心ABC-ELISA法测定，批号20080719。1.3模型制备及试验方法1.3.1大鼠肝硬化模型制备经大鼠腹部皮下注射CCL大豆油溶液，前4次剂量为0.5m丄/100g体重60%CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，第4次后间隔7天注射第5次(可减少大鼠死亡率)，第5次起剂量改为0.3ml/100g体重40。/。CCl4大豆油溶液，每隔3天1次，共13次；除注射CCl4当日外，每日1次60%食用酒灌胃，乙醇剂量0.4g/100g体重；给予正常饮水；以高脂低蛋白饲料喂养。上述操作第6周末停止，继续观察至8周末大鼠肝硬化模型制备成功并趋于稳定。第2周起每周末行B超定位肝穿刺病理检査，8周末挑选肝硬化程度趋于同--水平大鼠128只，继续进行下面试验。1.3.2动物分组按随机数字表法，将128只大鼠随机分为4组，组再分为4个时间亚组，每亚组8只大鼠。4组分别为A组假手术组；B组单纯缺血再灌注组；C组缺血预处理组；D组葛根素预处理组。4个时间亚组分别为a亚组缺血前时间亚组；b亚组缺血再灌注后lh时间亚组；C亚组缺血再灌注2h吋间亚组；d亚组缺血再灌注6h时间亚组。1.3.3缺血再灌注模型的制备术前禁食12h，自由饮水。以戊巴比妥钠3mg/100g体重腹腔注射麻醉后开腹并充分显露肝门，游离门静脉及肝固有动脉，用无损伤动脉钳给予钳夹，30min后移去动脉钳复灌60min，形成全肝I/R模型。C组于缺血前反复3次缺血5min再灌注5min形成缺血预处理模型及术前D组12h、lh分别2次分别给予葛根素10mg/100g体重，其他各组给予等量生理盐水，再行缺血30min，再灌注60min，D组形成葛根素预处理模型。1.3.4标木采集B、C、D组动物在再灌注Oh(即缺血前)、再灌注lh、2h、6h后分别从各时间亚组大鼠心内取血5.0ml，不加抗凝剂静置2h，并标明分组及动物编号，用自动平衡离心机离心，取部分血清测定ALT、AST的含量，其余的置入-7(rC冰箱内待测定N0、SOD、MDA。取血后快速取右肝组织进行HE染色光镜观察；其他肝组织取0.5g制备10%组织匀浆，检测其中NO、SOD、MDA及TNF-a。A组亦在相对应的时间点取血及肝组织行上述检查。在实验完毕时处死动物。2结果2.1病理结果各组低倍镜下均可见肝小叶结构紊乱，肝小叶重建，可见纤维再分隔现象，肝内假小叶广泛形成，同时伴有明显的肝细胞结节状再生等肝硬化病理表现。A组除上述表现外未见其他异常。B组高倍镜下可见肝细胞核边聚、浓縮及溶解，胞浆疏松化，并可见嗜酸性浸润；肝窦明显狭窄，可见大量的红细胞淤积其内并有微血栓形成、中性粒细胞贴壁等。C组高倍镜下可见肝细胞核边聚、浓縮及溶解，胞浆疏松化，但较B组显著减轻；肝窦狭窄较轻，但仍有红细胞淤积及微血栓形成现象，炎性细胞浸润减少。D组高倍镜下仅偶见核边聚，胞浆疏松化；肝窦无明显狭窄，内无明显红细胞淤积，及其微血栓形成等，汇管区炎性细胞浸润不明显。2.2血清及肝脏组织匀浆检验结果2.2.1各组大鼠肝功酶学指标变化D组肝功酶学检验缺血前与其他各组无明显差异(&0.05)，再灌注后各时间点明显降低B组(代0.05)，与C组无显著差异(/7〉0.05)，C、D组再灌注6h时较B组ALT、AST显著降低(K0.05)，但与A组相比未完全恢复正常(代O.05)，见表l。表14组大鼠灌注后各时间点血清ALT、AST的变化(义±&u/L)组别Ohlh,ALTASTALTASTA组69.4±10.8355.9±32,572.6±8.3362.5±37.6B组64.1±8.5362.1±32.91660.6±35.22886.9±324.C组65.2±8.4352.5±37.2919.4±74.61228.l士UO.1D组67.6±9.1359.9±43.7783.1±85.31043.5±118.89<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与A组同时间点相比，▲/<().05;与同组灌注缺血前即Oh时相比，△/<().05;与B组同时间点相比，*/<0.052.2.2各组大鼠血清NO含量变化C、D组血清NO与再灌注lh、2h含量较缺血前有所降低，但较B组下降幅度小(K0.05)。再灌注6h时C、D组恢复正常与A组差异无显著性(/>0.05);而B组含量明显升高，且高于A组(代O.05)，见表2。表24组大鼠灌注后各时间点血清N0的变化(义±&umol/L)组别Ohlh2hA组9.27±0.439.32±0.299.25±0.53B组9.26±0.365.67±0.406.86±0.38c组9.24±0.367.83±0.568.95±0.52D组9.29±0.407.78±0.538.75±0.55注与A组同时间点相比，▲/<().05，与同组灌注缺血前即Oh时相比，△/<().05，与B组同时间点相比，*代0.05103讨论3.1葛根素对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注的保护作用葛根素进入体内后主要分布于血浆、肾、肝和心。本实验结果显示光镜下，与对照组相比葛根素预处理组，肝细胞水肿及肝窦狭窄明显减轻，内无红细胞淤积及微血栓形成等，汇管区炎性细胞浸润不明显。血液中ALT、AST及肝组织中TNF-a等反映肝损害的指标较对照组显著减少，表明葛根素对肝硬化大鼠肝脏有明确的保护作用。本实验证实，葛根素可通过调节NO含量、改善微循环、清除自由基等途径对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤产生较好的保护作用。实验中D组短期使用葛根素，缺血前转氨酶较其他组差异无显著性(/^0.05)，且全过程中无一只大鼠出现出血倾向，可证明短期应用葛根素不会增加肝脏功能的损害及凝血机制障碍的发生率，所以认为葛根素是对肝硬化肝脏缺血再灌注保护有研究前景的药物之一。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种葛根素的提取方法，其主要步骤如下①粉碎、提取将葛根粉碎后过10目筛，称取定量葛根粉，置于提取罐中，先用其质量4倍体积的蒸馏水或浓度为95％乙醇或甲醇作溶剂回流提取1～1.5h，过滤，滤渣再用2倍体积的上述溶剂回流提取1h，再次过滤，收集、合并两次滤液，获得葛根素粗提液；②浓缩将醇提取液置于真空浓缩器中，控制真空度为-0.1～0.08MPa，浓缩温度为85～90℃，回收甲醇或乙醇；③上柱取定量活化D101大孔吸附树脂装柱，按照其对葛根素的吸附容量计算出应吸附的提取液体积，将提取液泵入树脂柱中，控制流出液速度为1-1.5倍树脂柱体积/h，使葛根素吸附于D101吸附树脂上；④洗脱当上柱液流完后，先用蒸馏水洗涤，洗去糖类、蛋白质、鞣质水溶性杂质，直至洗脱液近无色时止，然后用70％的乙醇溶液进行洗脱，控制洗脱液流出速度为1-1.5倍树脂柱体积/h，用12倍树脂体积的洗脱液即可洗脱被树脂吸附的85％以上的葛根素；⑤浓缩将洗脱液置于真空浓缩机中，控制真空度为-0.1～0.08MPa，浓缩温度为85～90℃，回收乙醇直至浓缩液相对密度为1.2时止；⑥萃取、浓缩、干燥将浓缩液置于萃取器中，加入等体积正丁醇，反复萃取4次，收集正丁醇相，再次进行真空减压浓缩至干，浓缩条件同提取液，获得葛根素粗提取物。2、葛根在制备保护肝脏药物中的用途。全文摘要本发明公开了一种葛根素的提取方法及葛根在制备保护肝脏中的用途，从葛根中提取葛根素；其主要步骤如下①粉碎、提取；②浓缩；③上柱；④洗脱；⑤浓缩；⑥萃取、浓缩，获得葛根素粗提取物。经过动物实验证明，葛根素具有很好的解毒护肝之功效。与现有技术相比，本发明具有提取的葛根素纯度高、使用方便的优点。文档编号A61P1/16GK101550133SQ20091006495公开日2009年10月7日申请日期2009年5月13日优先权日2009年5月13日发明者叶道群申请人:南阳市海达生物技术有限公司