中药贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测方法

专利名称：中药贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测方法
技术领域：
本发明属于毛细管电泳电化学发光检测技术领域，具体涉及毛细管电 泳电化学发光检测中药贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的方法。
技术背景由于中药中各种活性成分具有重要的药理作用，因此中药活性成分的 检测已经成为当前分析化学研究的热点领域。为了提高中药产业的国际竞 争力，中国的天然药物发展必须与先进的检测技术相接轨，中药的分析检 测必须科学化。贝母是用于止咳化痰的一种有名的中草药。贝母中的两种 主要活性成分贝母素甲和贝母素乙对止咳化痰具有重要的药理作用。人们 一直在研究探索贝母中活性成分检测的新方法，对贝母提取物中贝母素甲 和贝母素乙的有效分离、灵敏检测是化学分析领域的一个重要课题。由于贝母素甲和贝母素乙不具有生色基团，因此常需要对其进行衍生 才可实现分析检测，目前对中药贝母中贝母素甲和贝母素乙的检测大部分 集中在色谱-蒸发光联用法[l-3]，此外还包括高效液相色谱-质谱分析方法 [4]。对贝母素甲和贝母素乙进行衍生往往需要繁复的操作程序，冗长的分 析时间，且受蒸发光检测技术灵敏度的限制，很难满足中药贝母提取物中 低含量活性成分的检测需求。高效液相色谱-质谱法不仅具有较高的灵敏度 同时还能提供被分析物的结构信息，是中药提取物检测一个重要、常规的分析方法。但是色谱-质谱需要的仪器设备昂贵、操作复杂，这是该技术难 以推广使用的技术物质障碍。毛细管电泳是一种高效的分离分析手段，样品需求小，高效分离，仪 器价格低廉，适用于各种带电离子以及中性物质的分析，在分析化学、生 物分析化学等领域有着广泛的应用。吡啶钌电化学发光是一种灵敏的检测 技术，其原理是通过电化学方法在电极表面产生一些特殊的物质，这些物 质之间或与体系中其它组分之间通过电子传递形成激发态，激发态返回到 基态产生发光现象，产生的发光强度正比于被分析物浓度，从而被分析物 得到检测。吡啶钌电化学发光无需对待测样品进行衍生，无需其它额外的 光源，避免了背景光源的干扰，且吡啶钌电化学发光反应高效可逆，试剂 本身可循环使用，是一种灵敏经济的检测手段。毛细管电泳与吡啶钌电化 学发光技术相联用，使二者的优势相得益彰，毛细管电泳电化学发光检测 联用技术仪器造价低，操作简单，可实现待测样品的高效分离，灵敏检测。(参考文献[1] Z. Liu, Y. Jin, R Shen, J. Wang, Y. Shen, Talanta 71 (2007) 1873.[2] Y. Jin, P. Shen, J. Zhang, C. Zhuo, C. Xu, Y. Yu, Research & Information on Traditional Chinese Medicine 7 (2005) 13. [3] S.-L. Li, G. Lin, S.國W. Chan, P. Li, J. Chromatogr. A 909 (2001) 207. [4] J.-L Zhou, P. Li, H,J. Li, Y. Jiang, M,T. Ren, Y. Liu, J. Chromatogr. A1177 (2008) 126.)发明内容本发明的目的是提供一种灵敏、简单、快速的毛细管电泳 电化学发光检测贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的方法。 l.l待检品的制备 l丄l中药贝母l丄2贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准溶液的制备分别把贝母素甲标准品和贝母素乙标准品溶解甲醇中，制得贝母素甲 标准品储备液和贝母素乙标准品储备液，所述的储备液的浓度为分别为5.0 mmol/L，储备液在4。C冰箱中冷藏保存；分别用甲醇，将贝母素甲标准品储备液和贝母素乙标准品储备液稀释 成浓度为5.0X104 mol/L的贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准溶液； l丄3贝母提取物相关溶液的制备A. 贝母提取物溶液的制备将贝母研磨成粉末，过40目筛子，称取0.2g中药贝母粉末，用0.2mL 氨水碱化，然后在超声池中用3.0mL氯仿超声萃取30min，萃取操作重复 2次，合并萃取液，在室温下挥发掉氯仿，得到中药贝母提取物干物质；由 0.2g中药贝母粉末提取的干物质溶解在1.0 mL甲醇中，用0.45pm的滤膜 过滤，得到贝母提取物溶液；B. 贝母提取物稀释溶液的制备由步骤A得到的贝母提取物溶液用甲醇稀释，获得贝母提取物稀释溶 液，甲醇加入的体积是步骤A甲醇体积的20或120倍；C. 贝母提取物稀释加标溶液的制备向步骤A得到的贝母提取物溶液中分别加入由步骤1丄2获得的浓度为 5.0X10-Smol/L的贝母素甲标准溶液和浓度为5.0Xl(TSmol/L的贝母素乙标准溶液，用甲醇稀释获得贝母提取物稀释加标溶液，甲醇加入的体积是步 骤A甲醇体积的20或120倍； 1.2检测步骤和条件1.2.1仪器装置内径50/z附未涂层融硅毛细管；直径500/zw铂盘工作电极；士30kV 直流髙压电源，美国Spellman高压电子公司生产；电化学发光检测系统， 西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产；Cffl 832型电化学分析仪，上海辰 华仪器公司生产；1.2.2试剂 'NaH2P04， Na2HP04， NaOH，氨水，氯仿，甲醇，1-丁基-3-甲基咪唑 四氟硼酸盐(BMImBF4)，三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)32+)，贝母 素甲和贝母素乙的标准品，二次水；所用试剂均为分析纯；配制好的溶液 在使用之前均经0.45/zm滤膜过滤； 1.2.3溶液的制备 1.2.3.1背景电解质溶液的配制(1) 磷酸盐缓冲溶液的配制配制浓度为200.0 mmol/L的NaH2P04和浓度为200.0 mmol/L的 Na2HP04，将同浓度的二者混合再用二次水稀释配成浓度为100.0 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.48;(2) Ru(bpy)32+溶液的配制 用二次水配制20.0mmol/LRu(bpy)3"溶液；(3) 背景电解质溶液的配制将步骤(1)制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤(2)制备的Ru(bpy),溶 液混合，用二次水稀释配制背景电解质溶液；背景电解质溶液中磷酸盐浓 度为50.0 mmol/L， Ru(bpy)^+浓度为5.0 mmol/L;(4)含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液的配制先将步骤(1)制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤(2)制备的Ru(bpy)32+溶 液混合；把得到的混合溶液中的一部分加入由步骤l丄2获得的贝母素甲标 准溶液，把得到的混合溶液中的另一部分加入由步骤l丄2获得的贝母素乙 标准溶液，然后分别用二次水稀释，分别得到含贝母素甲的背景电解质溶 液和含贝母素乙的背景电解质溶液；含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝 母素乙的背景电解质溶液中磷酸盐浓度均为50.0 mmol/L， Ru(bpy)f浓度 均为5.0mmol/L，贝母素甲和贝母素乙的浓度均为1.0X l(T6mol/L; 1.2.3.2运行缓冲溶液的配制(a) 磷酸盐缓冲溶液的配制配制浓度为200.0 mmol/L的NaH2P04和浓度为200.0 mmol/L的 Na2HP04，将同浓度的二者混合，再用二次水稀释配成浓度为100.0 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为8.00; .(b) BMImBF4溶液的配制将BMImBF4用二次水稀释配成浓度为100.0 mmol/L的溶液；(c) 运行缓冲溶液的配制将步骤(a)得到的磷酸盐缓冲溶液与步骤(b)获得的BMmBF4溶液 混合，再用二次水稀释得到运行缓冲溶液；运行缓冲溶液中磷酸盐浓度为 8.0 mmol/L, BMImBF4浓度为40.0 mmol/L; 1.2.4检测步骤 1.2.4.1分离毛细管的处理为了保证贝母素甲和贝母素乙高效分离，灵敏检测及分析结果的重现 性，需对毛细管做以下处理新的毛细管柱使用0.1 mol/L氢氧化钠活化过夜，之前，毛细管柱用0.1 mol/L浓度的氢氧化钠冲洗5 min，再用二次水冲洗5min，然后用由步骤 1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡5 min;由于中药贝母提取物中含有大量共存物质对毛细管内壁产生吸附，因 此，在两次进样之间需要对毛细管进行如下活化处理毛细管柱用0.1 mol/L 浓度的氢氧化钠冲洗30 s，再用二次水冲洗30s，然后用由步骤1.2.3.2获 得的运行缓冲溶液平衡30 s。1.2.4.2贝母素甲标准品溶液和贝母素乙标准品溶液的循环伏安实验在步骤1.2.3.1 (3)获得的背景电解质溶液中循环扫描3-10周，扫描 电位区间是0 - 1.30 V，记录稳定时的循环伏安曲线；然后分别用由步骤 1.2.3.1 (4)获得的含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解 质溶液中循环扫描3-10周，扫描区间同样为0-1.30V，记录稳定时的循 环伏安曲线；将由含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液获 得的循环伏安曲线分别与背景电解质溶液得到的循环伏安曲线进行比较， 以确定贝母素甲和贝母素乙具有电化学活性及其电化学活性区间； 1.2.4.3中药贝母提取物的检测将步骤1丄3中的步骤B得到的贝母提取物稀释溶液和1丄3中的步骤 C得到的贝母提取物的稀释加标溶液分别按下述条件进行检测检测电位1.20 V;进样时间3 S;进样高压16kV;电泳分离高压16 kV;检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液；电泳采用步骤1.2.3.2获 得的运行缓冲溶液；三电极体系包括直径500/^铂盘工作电极、铂丝对极 以及Ag/AgCl参比电极；毛细管柱内径50/^2;电化学发光采用柱端检测 模式；光电倍增管偏置电压设定在800V;获得中药贝母检测的电泳图谱。 有关湖北贝母和新疆贝母的检测电泳图谱分别见图2和图3。 有益效果本发明所涉及的中药贝母中两种活性成分贝母素甲和贝母素乙的检测方法同其它检测方法比较有如下特点1) 灵敏度高，线性范围宽。本发明的方法对贝母素甲和贝母素乙的检测限分别为1.25xl(T1()mol/L和1.0><10—1()mol/L，比常用的蒸发光检测方法 检测限低4个数量级，比质谱检测技术检测限低2个数量级。贝母素甲和 贝母素乙的线性范围分别为是l.OxlO-8 - l.OxlO"6 mol/L和5.0X10-8 — 1.0x10—6 mol/L，跨越二个数量级。2) 分离功能强大。离子液体具有特殊的物理、化学性质，运行缓冲溶 液中离子液体BMImBF4的使用，使得结构相似的贝母素甲和贝母素乙的分 离选择性发生了重要改变，可以实现二者的高效分离。3) 样品用量少，检测时间短。纳升级的进样量即可满足毛细管电泳电 化学发光体系的分离检测需求。本发明的检测方法不需要对待测样品进行 柱前、柱后衍生，中药贝母提取物可直接用于毛细管电泳分离电化学发光 检测，整个电泳过程可控制在12min以内。4) 分析成本低，操作简单。毛细管、高压电源、恒电位仪是毛细管电 泳电化学发光检测的基本操作平台，辅助一些实验室常用的化学试剂即可 完成检测任务；吡啶钌电化学发光可逆、高效，极大的降低了试剂的消耗，减少检测成本。同质谱等一些非常灵敏的检测方法相比，本发明的方法更 加方便快捷，同时仪器成本相对较低。本发明首次将毛细管电泳电化学发光检测技术应用于中药贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测，首次采用离子液体BMImBF4对中药的活性成分进行分离。


图l是对湖北贝母提取物进行检测的电泳谱图。其中a是湖北贝母的贝母提 取物稀释溶液电化学发光电泳谱图，b是加入贝母素甲标准品和贝母素乙标准品 的贝母提取物稀释加标溶液电泳谱图。贝母素甲标准品和贝母素乙标准品加标 浓度均为2.5X10々mol/L。 1、 2峰分别为贝母素乙和贝母素甲的电泳峰。图2是对新疆贝母提取物进行检测的电泳谱图。其中a是新疆贝母的贝母提 取物稀释溶液电化学发光电泳谱图，b是加入贝母素甲标准品的贝母提取物稀释 加标溶液电泳谱图。贝母素甲标准品加标浓度为1.0X1(T6 mol/L。 l峰为贝母素 甲的电泳峰。
具体实施方式
以下实施例采用毛细管电泳电化学发光分析检测体系。检测电位1.20 V; 进样时间3S;进样高压16kV;电泳分离高压16kV;检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液；电泳采用步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液；三电极体 系包括直径50(Mm铂盘工作电极、铂丝对极以及Ag/AgCl参比电极；毛细管柱 内径50/^;电化学发光采用柱端检测模式；光电倍增管偏置电压设定在800V;实施例l中药湖北贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测 1.1待检品的制备l丄l中药贝母是中药湖北贝母l丄2贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准溶液的制备分别把贝母素甲标准品和贝母素乙标准品溶解甲醇中，制得贝母素甲 标准品储备液和贝母素乙标准品储备液，所述的储备液的浓度为分别为5.0 mmol/L，储备液在4。C冰箱中冷藏保存；分别用甲醇，将贝母素甲标准品储备液和贝母素乙标准品储备液稀释 成浓度为5.0X104mol/L的贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准溶液； l丄3贝母提取物溶液的制备A贝母提取物溶液的制备将贝母研磨成粉末，过40目筛子，准确称取0.2g中药贝母粉末，用 0.2mL氨水碱化，然后在超声池中用3.0mL氯仿超声萃取30min，萃取操 作重复2次，合并萃取液，在室温下挥发掉氯仿，得到中药贝母提取物干 物质；由0.2g中药贝母粉末提取的干物质溶解在1.0 mL甲醇中，用0.45pm 的滤膜过滤，得到贝母提取物溶液；B贝母提取物稀释溶液的制备由A得到的贝母提取物溶液用甲醇稀释，获得贝母提取物稀释溶液， 甲醇加入的体积是步骤A甲醇体积的120倍； C贝母提取物稀释加标溶液的制备向步骤A得到的贝母提取物溶液中分别加入由步骤1丄2获得的浓度为 5.0X l(r5mol/L的贝母素甲标准溶液和浓度为5.0X 10—5mol/L的贝母素乙标准溶液，用甲醇稀释获得贝母提取物稀释加标溶液，甲醇加入的体积是步 骤A甲醇体积的120倍；1.2检测步骤和条件 1.2.1仪器装置内径50/Z7W未涂层融硅毛细管；直径500//附铂盘工作电极；± 30 kV直流高压电源,美国Spellman高压电子公司生产；电化学发光检测系统， 西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产；Cffl 832型电化学分析仪，上海辰 华仪器公司生产； 1.2.2试齐JNaH2P04， Na2HP04， NaOH，氨水，氯仿，甲醇，1-丁基-3-甲基咪唑 四氟硼酸盐(BMmBF4)，三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)32+)，贝母 素甲和贝母素乙的标准品，二次水；所用试剂均为分析纯；配制好的溶液 在使用之前均经0.45/zw滤膜过滤； 1.2.3溶液的制备 1.2.3.1背景电解质溶液的配制(1) 磷酸盐缓冲溶液的配制配制浓度为200.0 mmol/L的NaH2P04和浓度为200.0 mmol/L的 Na2HP04，将同浓度的二者混合再用二次水稀释配成浓度为100.0 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.48;(2) Ru(bpy)32+溶液的配制 用二次水配制20.0mmol/LRu(bpy),溶液；(3) 背景电解质溶液的配制将步骤(1)制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤(2)制备的Ru(bpy)32+溶 液混合，用二次水稀释配制背景电解质溶液；背景电解质溶液中磷酸盐浓度为50.0 mmol/L， Ru(bpy)32+浓度为5.0 mmol/L;(4)含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液的配制先将步骤(1)制备的酸盐缓冲溶液与步骤(2)制备的Ru(bpy)32+溶 液混合，再分别加入由步骤l丄2获得的贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准 溶液，然后用二次水稀释，分别得到含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝 母素乙的背景电解质溶液；含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的 背景电解质溶液中磷酸盐浓度均为50.0 mmol/L， Ru(bpy) +浓度均为5.0 mmol/L，贝母素甲和贝母素乙的浓度均为1.0X10《mol/L; 1.2.3.2运行缓冲溶液的配制(1) 磷酸盐缓冲溶液的配制配制浓度为200.0 mmol/L的NaH2P04和浓度为200.0 mmol/L的 Na2HP04，将同浓度的二者混合，再用二次水稀释配成浓度为100.0 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为8.00;(2) BMImBF4溶液的配制将BMImBF4用二次水稀释配成浓度为100.0 mmol/L的溶液；(3) 运行缓冲溶液的配制将步骤(1)得到的运行缓冲溶液与步骤(2)获得的BMImBF4溶液混 合，再用二次水稀释得到运行缓冲溶液；运行缓冲溶液中磷酸盐浓度为8.0 mmol/L, BMImBF4浓度为40.0 mmol/L; 1.2.4检测步骤 1.2.4.1分离毛细管的处理为了保证贝母素甲和贝母素乙高效分离，灵敏检测及分析结果的重现 性，需对毛细管做以下处理新的毛细管柱使用0.1 mol/L氢氧化钠活化过夜，之前，毛细管柱用0.1 mol/L浓度的氢氧化钠冲洗5 min，再用二次水冲洗5 min，然后用由步骤 1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡5 min;由于中药贝母提取物中，有大量共 存物质对毛细管内壁产生吸附，因此，在两次进样之间需要对毛细管进行 如下活化处理毛细管柱用0.1mol/L浓度的氢氧化钠冲洗30s，再用二次 水冲洗30 s，然后用由步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡30 s。 1.2.4.2贝母素甲标准品溶液和贝母素乙标准品溶液的循环伏安实验在步骤1.2.3.1 (3)获得的背景电解质溶液中循环扫描3-10周，扫描 电位区间是0 - 1.30 V，记录稳定时的循环伏安曲线；然后分别用由步骤 1.2.3.1 (4)获得的含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解 质溶液中循环扫描3-10周，扫描区间同样为0-1.30 V，记录稳定时的循 环伏安曲线；将由含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液获 得的循环伏安曲线分别与背景电解质溶液得到的循环伏安曲线进行比较， 以确定贝母素甲和贝母素乙具有电化学活性及其电化学活性区间； 1.2.4.3中药贝母提取物的检测将步骤l丄3 B中得到的贝母提取物稀释溶液和l丄3 C中得到的贝母 提取物的稀释加标溶液分别按下述条件进行检测检测电位1.20 V;进样时间3 S;进样高压16kV;电泳分离高压16 kV;检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液；电泳采用步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液；三电极体系包括直径500^m铂盘工作电极、铂丝对极以及Ag/AgCl参比电极；毛细管柱内径50，；电化学发光采用柱端检测模式；光电倍增管偏置电压设定在800V;获得中药湖北贝母提取物的电泳谱图(见图1)。
实施例2中药新疆贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测中药新疆贝母提取物的检测，所采用的检测步骤除步骤1丄3外，均采用与实施例1相同的检测步骤和条件。l丄3贝母提取物溶液的制备A贝母提取物溶液的制备
将贝母研磨成粉末，过40目筛子，准确称取0.2g中药贝母粉末，用0.2mL氨水碱化，然后在超声池中用3.0mL氯仿超声萃取30min，萃取操作重复2次，合并萃取液，在室温下挥发掉氯仿，得到中药贝母提取物干物质；由0.2g中药贝母粉末提取的干物质溶解在l.OmL甲醇中，用0.45nm的滤膜过滤，得到贝母提取物溶液；
B贝母提取物稀释溶液的制备
由A得到的贝母提取物溶液用甲醇稀释，获得贝母提取物稀释溶液，甲醇加入的体积是步骤A甲醇体积的20倍；C贝母提取物稀释加标溶液的制备
向步骤A得到的贝母提取物溶液中加入由步骤l丄2获得的浓度为5.0X10-5mol/L的贝母素甲标准溶液，用甲醇稀释获得新疆贝母的贝母提取物稀释加标溶液，甲醇加入的体积是步骤A甲醇体积的20倍；获得中药新疆贝母提取物的电泳谱图(见图2)。
权利要求
1、中药贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测方法，其特征在于步骤和条件如下1.1待检品的制备1.1.1中药贝母1.1.2贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准溶液的制备分别把贝母素甲标准品和贝母素乙标准品溶解甲醇中，制得贝母素甲标准品储备液和贝母素乙标准品储备液，所述的储备液的浓度为分别为5.0mmol/L，储备液在4℃冰箱中冷藏保存；分别用甲醇，将贝母素甲标准品储备液和贝母素乙标准品储备液稀释成浓度为5.0×10-4mol/L的贝母素甲标准溶液和贝母素乙标准溶液；1.1.3贝母提取物相关溶液的制备A.贝母提取物溶液的制备将贝母研磨成粉末，过40目筛子，称取0.2g中药贝母粉末，用0.2mL氨水碱化，然后在超声池中用3.0mL氯仿超声萃取30min，萃取操作重复2次，合并萃取液，在室温下挥发掉氯仿，得到中药贝母提取物干物质；由0.2g中药贝母粉末提取的干物质溶解在1.0mL甲醇中，用0.45μm的滤膜过滤，得到贝母提取物溶液；B.贝母提取物稀释溶液的制备由步骤A得到的贝母提取物溶液用甲醇稀释，获得贝母提取物稀释溶液，甲醇加入的体积是步骤A甲醇体积的20或120倍；C.贝母提取物稀释加标溶液的制备向步骤A得到的贝母提取物溶液中分别加入由步骤1.1.2获得的浓度为5.0×10-5mol/L的贝母素甲标准溶液和浓度为5.0×10-5mol/L的贝母素乙标准溶液，用甲醇稀释获得贝母提取物稀释加标溶液，甲醇加入的体积是步骤A甲醇体积的20或120倍；1.2检测步骤和条件1.2.1仪器装置内径50μm未涂层融硅毛细管；直径500μm铂盘工作电极；±30kV直流高压电源，美国Spellman高压电子公司生产；电化学发光检测系统，西安瑞迈分析仪器有限责任公司生产；CHI 832型电化学分析仪，上海辰华仪器公司生产；1.2.2试剂NaH2PO4，Na2HPO4，NaOH，氨水，氯仿，甲醇，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(BMImBF4)，三联吡啶钌的六水合氯化物(Ru(bpy)32+)，贝母素甲和贝母素乙的标准品，二次水；所用试剂均为分析纯；配制好的溶液在使用之前均经0.45μm滤膜过滤；1.2.3溶液的制备1.2.3.1背景电解质溶液的配制(1)磷酸盐缓冲溶液的配制配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4，将同浓度的二者混合再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为7.48；(2)Ru(bpy)32+溶液的配制用二次水配制20.0mmol/L Ru(bpy)32+溶液；(3)背景电解质溶液的配制将步骤(1)制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤(2)制备的Ru(bpy)32+溶液混合，用二次水稀释配制背景电解质溶液；背景电解质溶液中磷酸盐浓度为50.0mmol/L，Ru(bpy)32+浓度为5.0mmol/L；(4)含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液的配制先将步骤(1)制备的磷酸盐缓冲溶液与步骤(2)制备的Ru(bpy)32+溶液混合；把得到的混合溶液中的一部分加入由步骤1.1.2获得的贝母素甲标准溶液，把得到的混合溶液中的另一部分加入由步骤1.1.2获得的贝母素乙标准溶液，然后分别用二次水稀释，分别得到含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液；含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液中磷酸盐浓度均为50.0mmol/L，Ru(bpy)32+浓度均为5.0mmol/L，贝母素甲和贝母素乙的浓度均为1.0×10-6mol/L；1.2.3.2运行缓冲溶液的配制(a)磷酸盐缓冲溶液的配制配制浓度为200.0mmol/L的NaH2PO4和浓度为200.0mmol/L的Na2HPO4，将同浓度的二者混合，再用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的磷酸盐缓冲溶液，调整磷酸盐缓冲溶液pH值为8.00；(b)BMImBF4溶液的配制将BMImBF4用二次水稀释配成浓度为100.0mmol/L的溶液；(c)运行缓冲溶液的配制将步骤(a)得到的磷酸盐缓冲溶液与步骤(b)获得的BMImBF4溶液混合，再用二次水稀释得到运行缓冲溶液；运行缓冲溶液中磷酸盐浓度为8.0mmol/L，BMImBF4浓度为40.0mmol/L；1.2.4检测步骤1.2.4.1分离毛细管的处理为了保证贝母素甲和贝母素乙高效分离，灵敏检测及分析结果的重现性，需对毛细管做以下处理新的毛细管柱使用0.1mol/L氢氧化钠活化过夜，之前，毛细管柱用0.1mol/L浓度的氢氧化钠冲洗5min，再用二次水冲洗5min，然后用由步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡5min；由于中药贝母提取物中含有大量共存物质对毛细管内壁产生吸附，因此，在两次进样之间需要对毛细管进行如下活化处理毛细管柱用0.1mol/L浓度的氢氧化钠冲洗30s，再用二次水冲洗30s，然后用由步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液平衡30s。1.2.4.2贝母素甲标准品溶液和贝母素乙标准品溶液的循环伏安实验在步骤1.2.3.1(3)获得的背景电解质溶液中循环扫描3-10周，扫描电位区间是0-1.30V，记录稳定时的循环伏安曲线；然后分别用由步骤1.2.3.1(4)获得的含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液中循环扫描3-10周，扫描区间同样为0-1.30V，记录稳定时的循环伏安曲线；将由含贝母素甲的背景电解质溶液和含贝母素乙的背景电解质溶液获得的循环伏安曲线分别与背景电解质溶液得到的循环伏安曲线进行比较，以确定贝母素甲和贝母素乙具有电化学活性及其电化学活性区间；1.2.4.3中药贝母提取物的检测将步骤1.1.3中的步骤B得到的贝母提取物稀释溶液和1.1.3中的步骤C得到的贝母提取物的稀释加标溶液分别按下述条件进行检测检测电位1.20V；进样时间3s；进样高压16kV；电泳分离高压16kV；检测池中添加步骤1.2.3.1制备的背景电解质溶液；电泳采用步骤1.2.3.2获得的运行缓冲溶液；三电极体系包括直径500μm铂盘工作电极、铂丝对极以及Ag/AgCl参比电极；毛细管柱内径50μm；电化学发光采用柱端检测模式；光电倍增管偏置电压设定在800V；获得中药贝母检测的电泳图谱。
全文摘要
本发明提供了中药贝母提取物中贝母素甲和贝母素乙的检测方法，采用毛细管电泳电化学发光的方法。对贝母素甲和贝母素乙的检测限分别为1.25×10^-10mol/L和1.0×10^-10mol/L，线性范围分别为是1.0×10^-8-1.0×10^-6mol/L和5.0×10^-8-1.0×10^-6mol/L；比常用的蒸发光检测方法检测限低4个数量级，比质谱检测技术检测限低2个数量级，线性范围跨越二个数量级；运行缓冲溶液中离子液体BMImBF₄实现贝母素甲和贝母素乙的高效分离；纳升级的进样量且不需要对待测样品进行柱前、柱后衍生，中药贝母提取液直接用于检测；整个电泳过程在12min以内。
文档编号A61P11/10GK101601805SQ20091006719
公开日2009年12月16日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者前 向, 吴仙花, 春 郑, 戈 马, 英 高 申请人:长春工程学院