专利名称：聚羟基烷酸靶向载体、载药纳米粒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚羟基垸酸靶向载体、载药纳米粒，具体是一种通式为FA-PEG-P(HBHO) 的聚羟基烷酸靶向载体和以FA-PEG-P(HBHO)为载体的靶向载药纳米粒，以及在制备抗肿瘤 药物中的应用。
背景技术：
由于癌症等疾病治疗的需要和纳米科技及医用高分子材料技术的发展，耙向给药系统 (Targeted drug delivery system, TDDS)已成为国内外医药领域的重要研究方向。理想的耙向 给药系统应具备定位蓄积、控释、无毒和可生物降解4个要素。
近年来，配体-受体靶向给药系统已成为TDDS的研究重点，其中叶酸-叶酸受体耙向给 药系统受到人们的特别关注。叶酸受体(Folate receptor, FR)是一种通过聚糖磷脂酰肌醇锚着 于膜上的糖蛋白，对叶酸(Folic acid, FA )具有高度亲和力，在大部分恶性肿瘤细胞(如卵巢 癌，脑癌，子宫内膜癌，肾癌，头颈部肿瘤，肺癌，乳腺癌，结肠直肠癌等)表面均有过度 表达，而在正常组织中的表达高度保守。基于这种表达差异，可实现叶酸介导的主动耙向输 送。
制备靶向给药系统的关键是寻找合适的载体材料。理想的载体材料需无毒、无免疫反应、 可生物降解。目前，用于叶酸受体介导的靶向给药系统的载体材料多选用脂质体、壳聚糖、 白蛋白等。但这些载体材料在使用过程中均存在一定的缺陷，如脂质体不稳定、泄漏快及储 存期易变质；壳聚糖具有一定的水溶性，在体内运行时难以保证将药物运送到靶向部位；白 蛋白既具水溶性，又可被体内蛋白酶降解，因此不是理想的载药材料。 一种新型天然高分子 聚酯载药材料一多聚羟基烷酸(Polyhydroxyalkanoates， PHAs)正在受到高度重视。PHAs具 有良好的热塑性、压电性、光学活性等物理学特性和优良的生物可降解性、生物相容性、生 物可再生性、表面可修饰性、降解产物无毒性等生物学与环境学特性，已成为当前生态环境 材料和生物医用材料的重要候选材料之一。在PHAs材料中，己有聚羟基丁酸(PHB)、羟基 丁酸与羟基戊酸共聚体(PHBHV)等作为药物缓释载体材料的研究报道，但并未应用到耙向 载体系统。我们开发的3-羟基丁酸和3-羟基辛酸共聚体[P(HBHO)]是一种新型PHAs，已获 得国家发明专利。P(HBHO)不仅具有PHAs的通性，而且与同类的PHB、 PHBHV相比，由 于长链单体辛酸的掺入，有着更为优良的柔韧性，更适合作为靶向载体材料。到目前为止， 尚未见到以P(HBHO)与叶酸偶联形成的复合物制备载抗肿瘤药物纳米粒的相关文献或专利 报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚羟基烷酸靶向载体、载药纳米粒及其制备方法，以及在制备 抗肿瘤药物中的应用。
3本发明提供的一种聚羟基烷酸靶向载体，其通式为FA-PEG-P(HBHO)，其中FA是叶 酸类化合物，PEG是聚乙二醇，P(HBHO)是3-羟基丁酸和3-羟基辛酸共聚体。 所述的叶酸类化合物是叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸或亚叶酸。
所述的3-羟基丁酸与3-羟基辛酸共聚体，其分子量范围为100，000-250,000Da。是一种
聚羟基垸酸，有着更为优良的理化性能与加工性能，且生产成本较低。 上述聚羟基垸酸靶向载体的制备方法，包括如下步骤
(1) FA-PEG-NH2的制备
将叶酸类化合物溶于二甲基亚砜中，加入聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2)、吡咬、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌，室温下反应i0-15小时，纯化、冷冻干燥，得淡黄色粉末。 其中，叶酸类化合物、NH2-PEG-NH2、吡啶和DCC的摩尔比为1:1~10:1~5:1~5。
(2) FA-PEG-P(HBHO)的制备
将步骤(1)制备的FA-PEG-NH2溶于二氯甲烷中，加入P(HBHO)、 DCC，室温下反应 12-15小时后，纯化，冷冻干燥得黄色粉末。其中，FA-PEG-NH2、 P(HBHO)和DCC的摩尔 比为1:1 10:1 10。
所述的聚羟基垸酸靶向载体可以在制备抗肿瘤药物中应用。
本发明提供的一种聚羟基烷酸靶向载药纳米粒，是以F-PEG-P(HBHO)为载体，采用超声 乳化法包载抗肿瘤药物制备而成。
所述的抗肿瘤药物为阿霉素、表阿霉素、紫杉醇或喜树碱。 上述聚羟基烷酸靶向载药纳米粒的制备方法，包括如下步骤
(1) 将载体FA-PEG-P(HBHO)溶于含Span-80与Tween-80的有机相中，与含有抗肿瘤 药物的超纯水按体积比2 4:1混合，超声探头超声，形成乳液；
所述的F-PEG-P(HBHO)、 Span-80、 Tween-80在有机相中的浓度分别为5~7%、 1 2%、 3~5%;所述的有机相为二氯甲烷或三氯甲烷所述的抗肿瘤药物在超纯水中的质量浓度为 1%。
(2) 按质量浓度1 4。/。将PVA溶于超纯水中，按体积比10~20:1与上述乳液混合，超声 探头超声，充分搅拌，使有机相完全挥发，高速离心，除去游离药物与Span-80、 Tween-80 及PVA,沉淀物冷冻干燥，得载药纳米粒。
所述的超声探头功率为100-200W，超声时间为3-5min。 所述的搅拌转速为300 600rpm。 所述的高速离心转速为10000 15000rpm。'
所述的聚羟基垸酸靶向载药纳米粒可以在制备抗肿瘤药物中应用。
本发明采用P(HBHO)与叶酸类化合物偶联形成FA-PEG-P(HBHO)载体，该载体对抗肿 瘤药物有较好的包封率，在运行过程中较稳定、不易泄漏，能较好的将药物运送到靶向部位， 是一种较好的具有肿瘤靶向的载体材料。采用超声乳化法以该载体包载抗肿瘤药物制得的靶 向载药纳米粒，粒径分布范围较窄， 一般在300 500nm，形貌规则，具有优良的生物可降解性、生物相容性，结构较稳定，毒副作用小等特点，经体外细胞实验证实，对肿瘤细胞具有 较好的抑制作用。
图1为叶酸靶向载阿霉素纳米粒扫描电镜图。
图2为叶酸靶向载阿霉素纳米粒粒径分布图。
图3为各药物组对体外培养HeLa细胞增殖的影响。
图4为体外培养HeLa细胞对叶酸靶向纳米粒与P(HBHO)纳米粒摄取的荧光显微照片与
相差显微照片。
具体实施例方式
实施例1: FA-PEG-P(HBHO)的制备 (1) FA-PEG-NH2的制备及检测
称取52.8mg叶酸溶于40mL二甲基亚砜(含吡啶20pL)中，加入DCC 24.8mg，避光搅 拌lh后，加入NH2-PEG-NH2 400mg，反应搅拌12h，待反应结束后，向反应液中加入40mL 超纯水，离心，除去不溶性副产物，上清用pH9.0NaHCO3缓冲液、超纯水依次进行透析，除 去未反应叶酸及NH2-PEG-NH2, CPCER柱进一步纯化，冷冻干燥，即得FA-PEG-NH2 225.2mg。
对合成的FA-PEG-NH2进行叶酸类化合物含量与a-氨基含量的检测。叶酸含量的检测是 将FA-PEG-NH2溶于pH7.4PBS中，采用紫外分光光度法在280.5nm处测最大吸光度，并根 据标准曲线(y=0.0633x+0.0088， R2=0.9997)，计算测得产物中的叶酸含量为4.5mg/g。 a-氨 基含量的检测采用茚三酮比色法(570nm)，根据标准曲线(y=0.1656x-0.0545， R2=0.9999)， 测得产物中的a-氨基含量为3.8mg/g。
对合成的FA-PEG-NH2进行红外光谱分析，结果显示在IR(KBr): 3500-2500 cm"之间叶 酸羧基O-H伸縮振动吸收峰的消失，C=0吸收也从1693cm"移至1650cm"(酰胺键的C=0 伸縮振动吸收)，同时3600-3100 cm"之间产生酰胺键的N-H伸縮振动吸收，1114cm"处出现 NH2-PEG-NH2的C-O-C伸縮振动吸收，充分表明FA与NH2-PEG-NH2发生了酰化反应。
(2)FA-PEG-P(HBHO)的制备
将114mgFA-PEG-NH2溶于20mL三氯甲辉中，向其中加入P(HBHO) 3.75g、DCC 6.3mg， 室温下反应12h，浓縮，醇沉，冷冻干燥得FA-PEG-P(HBHO) 2.04g。
对合成的FA-PEG-P(HBHO)进行红外光谱分析，结果显示在IR(KBr): 3438cm"左右的吸 收峰强度增加(酰胺键的N-H伸縮振动吸收)，1633cm—1处为酰胺键的C=0伸縮振动吸收峰， 1101cm"左右的吸收峰为NH2-PEG-NH2的C-O-C的伸縮振动吸收峰，1724cnT1处为P(HBHO) 的-COO的特征吸收峰，以上表明FA-PEG-P(HBHO)形成。
实施例2:载紫杉醇纳米粒的制备
称取0.105g FA-PEG-P(HBHO)溶于L5mL 二氯甲垸中，并加入0.018g Span-80与0.07g Tween-80;将0.005g紫杉醇溶于0.5mL超纯水中，将上述两种溶液混合，超声探头(200W) 超声3分钟，形成乳液；将0.8g PVA溶于20ml超纯水中，与乳液混合，超声探头(200W)超 声3分钟后，机械搅拌7h，使二氯甲烷完全挥发，15000rpm高速离心除去游离药物与表面活性剂(Span-80、 Tween-80及PVA)，沉淀物冷冻干燥，得载紫杉醇纳米粒。
载紫杉醇纳米粒呈球形，粒径分布较均匀，采用紫外分光光度法测得载紫杉醇纳米粒的
载药量与包封率分别可达9.9%， 45%。 实施例3:载阿霉素纳米粒的制备
称取0.0975g FA-PEG-P(HBHO)溶于1.5mL三氯甲烷中，并加入0.015g Span-80与0.075g Tween-80;将0.005g阿霉素溶于0.5mL超纯水中，将上述两种溶液混合，超声探头(200W) 超声5分钟，形成乳液；将0.6g PVA溶于20mL超纯水中，与乳液混合，超声探头(200W) 超声5分钟后，机械搅拌6h，使三氯甲烷完全挥发，15000rpm高速离心除去游离药物与表面 活性剂(Span-80、 Tween-80及PVA)，沉淀物冷冻干燥，得载阿霉素纳米粒。
载阿霉素纳米粒呈球形，大小均一 (见图l)。图1为叶酸靶向载阿霉素纳米粒扫描电镜 图。粒径分布较均匀，平均粒径为300 500nm (见图2)。图2为叶酸靶向载阿霉素纳米粒粒 径分布图。采用紫外分光光度法测得叶酸靶向载阿霉素纳米粒的载药量与包封率分别可达 10.1%, 49%。
实施例4:叶酸靶向载阿霉素纳米粒对体外培养HeLa细胞增殖的影响 将对数生长期的HeLa细胞(10。/。FBS/RMPI1640培养基，5%C02， 37°C )按每孔5X 104 个/100pL接种于96孔板，5%C02， 37。C培养24h后，换10。/。FBS/无叶酸RMPI1640培养基
配制的各药物组(A:叶酸靶向载阿霉素纳米粒+lmM游离叶酸组；B:叶酸耙向载阿霉素纳 米粒组；C:游离阿霉素组；D: P(HBHO)载阿霉素纳米粒组；)培养2h，再换新鲜培养基培
养48h后，进行MTT检测，结果见图3。
图3为各药物组对体外培养HeLa细胞增殖的影响。A、 B、 C、 D各药物组在所选浓度 范围内，细胞毒性随药物浓度增大而增大；约在100pg/mL左右，细胞毒性可达60%左右。 叶酸靶向纳米粒组细胞毒性显著高于P(HBHO)载阿霉素纳米粒组，而添加了游离叶酸会影响 HeLa细胞对叶酸耙向纳米粒的摄取。
实施例5:体外培养HeLa细胞对纳米粒摄取的定性观察
将HeLa细胞用含10%FBS/RMPI1640培养基(5%C02， 37°C)贴壁培养在预置了盖玻片 的6孔板上，培养24h后，换液，PBS洗涤，换10。/。FBS/无叶酸RPMI1640培养基培养24h 后，加入相同浓度的叶酸靶向纳米粒与P(HBH0)纳米粒培养4h后，冷PBS洗涤，10%甲醛 固定细胞10min，吹干，荧光显微镜与相差显微镜下观察(见图4)。
图4为体外培养HeLa细胞对叶酸靶向纳米粒与P(HBHO)纳米粒摄取的荧光显微照片与 相差显微照片(A与B分别为HeLa细胞对叶酸靶向纳米粒摄取的荧光显微照片与相差显微 照片，C与D分别为HeLa细胞对P(HBHO)纳米粒摄取的荧光显微照片与相差显微照片)。 叶酸靶向纳米粒(荧光标记)在实验时间内进入HeLa细胞内，荧光显微镜下可观察到HeLa 细胞的形态，而P(HBHO)纳米粒(荧光标记)朱观察到HeLa细胞的形态。说明连接叶酸耙 向纳米粒具有较好的靶向性。
权利要求
1、一种聚羟基烷酸靶向载体，其通式为FA-PEG-P(HBHO)，其中FA是叶酸类化合物，PEG是聚乙二醇，P(HBHO)是3-羟基丁酸和3-羟基辛酸共聚体。
2、 如权利要求1所述的聚羟基垸酸靶向载体，所述的叶酸类化合物是叶酸、二氢叶酸、 四氢叶酸或亚叶酸。
3、 如权利要求1所述的聚羟基垸酸靶向载体的制备方法，包括如下步骤(1) FA-PEG-NH2的制备将叶酸类化合物溶于二甲基亚砜中，加入聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2)、吡啶、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌，室温下反应10-15小时，纯化、冷冻干燥，得淡黄色粉末； 所述的叶酸类化合物、NH2-PEG-NH2、吡啶和DCC的摩尔比为1:1 10:1 5:1 5;(2) FA-PEG-P(HBHO)的制备将步骤(l)制备的FA-PEG-NH2溶于三氯甲烷中，加入P(HBHO)、 DCC，室温下反应12-15 小时后，纯化，冷冻干燥，得黄色粉末；所述的FA-PEG-NH2、 P(HBHO)和DCC的摩尔比为 1:1 10:1 10。
4、 一种聚羟基垸酸靶向载药纳米粒，是以FA-PEG-P(HBHO)为载体，采用超声乳化法包 载抗肿瘤药物制备而成。
5、 如权利要求4所述的聚羟基垸酸靶向载细纳米粒，所述的抗肿瘤药物为阿霉素、表阿 霉素、紫杉醇或喜树碱。
6、 如权利要求4所述的聚羟基烷酸靶向载药纳米粒的制备方法，包括如下步骤(1) 将载体FA-PEG-P(HBHO)溶于含Span-80与Tween-80的有机相中，与含有抗肿瘤药物 的超纯水按体积比2~4:1混合，超声探头超声，形成乳液；所述的F-PEG-P(HBHO)、 Span-80、 Tween-80在有机相中的浓度分别为5~7%、 1~2%、 3~5%;所述的有机相为二氯甲垸或三氯 甲烷；所述的抗肿瘤药物在超纯水中的质量浓度为1%;(2) 按质量浓度1 4。/。将PVA溶于超纯水中，按体积比10~20:1与上述乳液混合，超声探 头超声，充分搅拌，使有机相完全挥发，高速离心，除去游离药物与Span-80、 Tween-80及 PVA，沉淀物冷冻干燥，得载药纳米粒。
7、 如权利要求6所述的聚羟基垸酸靶向载药纳米粒的制备方法，所述的超声探头功率为 跳200W，超声时间为3-5min。
8、 如权利要求1所述的聚羟基垸酸靶向载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
9、 如权利要求4所述的聚羟基烷酸靶向载药纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种通式为FA-PEG-P(HBHO)的聚羟基烷酸靶向载体和以FA-PEG-P(HBHO)为载体，采用超声乳化法包载抗肿瘤药物制备而成的靶向载药纳米粒。该载药纳米粒，粒径分布范围较窄，一般在300～500nm，形貌规则；具有优良的生物可降解性、生物相容性，结构较稳定，毒副作用小；经体外细胞实验证实，对肿瘤细胞具有较好的抑制作用。
文档编号A61K31/4745GK101513530SQ20091007397
公开日2009年8月26日 申请日期2009年3月18日 优先权日2009年3月18日
发明者吕利华, 婵 张, 张晓艳, 董岳峰, 赵良启, 璋 陈 申请人:山西大学