专利名称：：Itgb4bp及其衍生物用于预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变的制作方法
技术领域：
：本发明涉及已知物质的新药用用途。具体地，本发明涉及(34整合素结合蛋白(Integrinbeta4bindingprotein,ITGB4BP)及其衍生物，表达ITGB4BP及其衍生物的基因重组表达载体，在预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变中的新应用。
背景技术：
：纤维化疾病是由于细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)如胶原等过度沉积而导致组织增生、变硬及瘢痕形成的的一类病变。持续的感染、自身免疫性疾病、过敏反应、化学损伤、辐射和组织损伤等慢性炎症长期刺激导致成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，造成大量结缔组织沉积形成纤维化，从而导致器官功能丧失直至死亡(1-3)。增生性瘢痕是纤维化疾病的一种，是由于深部真皮受到热力或者其它形式创伤后，纤维增生紊乱导致，常常引起患者美观和功能上的严重损害(4)。在进行增生性瘢痕成纤维细胞分化的机制研究中我们发现P311基因(GenBankID:hsu36189)与其有着密切的联系(5)，但其具体机制如何，文献却鲜有报道。P311(又名PTZ17，pentylenetetrazol17)的编码基因由Matthieu等于1993年首先在胚胎大鼠的脑组织中发现(6)。P311基因定位于5号染色体ORF13，其完整的基因全长约为2025bp，包含3个开放阅读框，但仅第一个阅读框编码含68个氨基酸的蛋白P311，分子量大小为8KD，该阅读框在人和小鼠之间高度保守。此外，在人、小鼠和鸡P311的N末端还存在一个高度保守的PEST结构域(富含Pro，Glu，Ser和Thr的区域)(7)。P311广泛表达于多种组织，其中在脑组织尤其是胚胎发育后期的大脑组织与成年期的小脑、海马和嗅球中高表达，同时也表达于肝、脾、肾、眼、心等器官与骨髓间充质、成纤维细胞、肌成纤维细胞等组织细胞(6)，而且Pan与Fujitani、Taylor等还分别证实该蛋白能表达于肌成纤维细胞、神经细胞的胞浆与胞核中。P311是机体的一种具有重要生物学作用的细胞因子，参与体内细胞分化、调节其它蛋白/基因转录、创伤修复、肿瘤发生等多种正常或异常的生物学活动(6-9)。我们利用酵母双杂交技术筛选了成人肝cDNA文库(美国BDClontech公司)中能与P311相互作用的蛋白的编码序列，经过生物信息学分析、回复性验证和激光共聚焦共定位检测后获得了一个目的基因，其编码的蛋白是(34整合素结合蛋白(Integrinbeta4bindingprotein，ITGB4BP，SEQIDNO1)(10)。研究提示该蛋白在细胞骨架形成及细胞凋亡中起着重要的作用，并可能在增生性瘢痕成纤维细胞分化过程中发挥了重要作用。以下就国内外该蛋白相关功能研究进行综述。1.ITGB4BP基本特征1.1ITGB4BP的编码基因FrancescaSanvito等于1998年通过荧光原位杂交技术发现ITGB4BP基因(SEQIDN02，NCBIgenebank登记号为NM-002212)定位于20号染色体的长臂20qll.2区，其mRNA全长1108bp，其开放读框含有735个核苷酸(ll)。ITGB4BP基因有7个外显子和6个内含子，该基因的5'端缺少TATA启动子结合区，CpG岛(12)。ITGB4BP基因在真核细胞中序列保守，在哺乳动物和酵母中有72%同源性，其中有85%序列相似(13)。ITGB4BP基因除了在人、小鼠、大鼠、非洲爪蟾等脊椎动物中发现外，在果蝇、乌贼、软疣等非脊椎动物上也发现该基因的存在，并且该基因的结构域在哺乳动物及非脊椎动物之间高度保守(14)。1.2ITGB4BP编码蛋白ITGB4BP蛋白(SEQIDNOl，Swiss-Prot:P56537.1，[GI:3122258])也称EIF6、p27BBP、CAB、EIF3等，由Biffo等于1997年发现，Biffo等运用酵母双杂交技术研究整合素卩4与半桥粒形成上的联系时，发现一个蛋白与(34有相互作用，故而命名为P4整合素结合蛋白(Integrinbeta4bindingprotein,ITGB4BP)。ITGB4BP蛋白含有245个氨基酸，分子量大小为27kd(15)。该蛋白在蛋白激酶C的作用下，通过磷酸化/去磷酸化介导信号的传导，但其具体机制尚不清楚(12、16)。现有的文献资料中对ITGB4BP的研究主要集中在ITGB4BP与细胞骨架形成、癌细胞分化、蛋白合成和迁移中。1.3ITGB4BP的表达和分布ITGB4BP蛋白分布广泛，可以表达在不同的组织，或者同一组织不同细胞，或者同一细胞不同周期。研究证实，在上皮细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、激活的T细胞、活化的肥大细胞及肌肉组织纤维中均有ITGB4BP蛋白的表达，也有研究证实只要表达(X6P4整合素的细胞均表达ITGB4BP(17)dITGB4BP蛋白表达在胞浆(中间丝附近)和胞核(主要位于核仁外周)(18)。在细胞增殖期，ITGB4BP的表达上调(19)。因此可以提示ITGB4BP蛋白与细胞骨架及细胞增殖有关。2.ITGB4BP的生物学功能2.1参与调控蛋白合成.-真核细胞在生长和分化过程中，基因组中的绝大多数基因不被转录，只有少数基因能表达，这些基因经过转录及转录后加工，变成成熟的mRNA，并在细胞质中的核糖体上翻译成多肽链，形成细胞所需的蛋白。mRNA的翻译存在多种水平的调控，其中对真核生物翻译起始阶段的调控是非常重要的一步。在真核生物翻译起始阶段，ITGB4BP从核糖体60s亚基解聚下来，促进40s亚基和60s亚基结合形成80s亚基，从而启动蛋白质的翻译(20-23)。有实验室敲除ITGB4BP基因后发现核糖体60s亚基丢失，从而证明其对核糖体60s的形成具有重要的作用(18)。并且对胞外信号的反应中ITGB4BP是作为最早的真核细胞翻译起始因子参与调节蛋白的翻译(24)。另一方面，ITGB4BP调控蛋白合成还与其对microRNA的调节相关。ITGB4BP与RISC(RNA诱导沉默复合体)结合，特异性地促进相应microRNA的作用，从转录水平上千扰mRNA形成，抑制其对应靶蛋白的表达，反之敲除ITB4BP后则会解除microRNA对靶蛋白的表达抑制作用而促进靶蛋白的表达(2526)。2.2参与调节细胞黏附及细胞骨架的形成整合素家族为黏附分子受体，参与介导细胞与细胞外基质、细胞与细胞间的相互作用。细胞间的黏附作用有接合作用、桥粒连接、半桥粒连接等，半桥粒连接的细胞外基质主要为层黏蛋白，(34整合素为层黏蛋白受体，故其与桥粒、半桥粒的形成有密切的联系。ITGB4BP为(34整合素结合蛋6白，与中间丝和C16P4整合素的胞内结构域的功能区结合，作为两者的桥梁介导半桥粒的形成，介导细胞的黏附功能(15)。此外，ITGB4BP还存在于核基质中，通过与核基质、中间丝等细胞骨架结构的连接，参与了细胞骨架的形成。有实验已证明ITGB4BP在中间丝和核基质上高表达(17)。并且ITGB4BP还可以调节Wnt信号通路中的P-联蛋白的表达，从而影响细胞骨架(27)。2.3与肿瘤发生和转移的关系肿瘤最明显的特点是细胞增殖异常，凋亡抑制，且容易转移。有实验证实ITGB4BP作为翻译调节因子参与了细胞的增殖。在对分化诱导前后的肝癌细胞核基质成分进行亚细胞蛋白组学分析发现，ITGB4BP在分化后的细胞中高表达，提示可能参与癌细胞分化(28)。ITGB4BP在正常粘膜细胞可以检测到，但是在癌细胞中过表达，如在结直肠癌中ITGB4BP的表达上调(19)，并且在淋巴结转移灶中尤为明显(29)，故而提示ITGB4BP的高表达可能参与了肿瘤的增殖和转移。从上面可以看出，ITGB4BP在核糖体合成、细胞骨架以及肿瘤的增殖分化和转移中具有重要的作用，但是目前对于ITGB4BP蛋白的相关文献较少，对于其在纤维化相关疾病中的作用和功能还未见报道，故对其在纤维化中的功能和作用还需进一步深入研究。
发明内容本发明人在进行增生性瘢痕成纤维细胞分化的机制研究中发现P311基因与其有着密切的联系。目前对于P311基因功能和机制的研究尚不清楚，本发明人利用酵母双杂交技术在成人肝cDNA文库(美国BDClontech公司)中筛选得到一个能与P311相互作用的蛋白的编码序列，经过进一步鉴定确定该编码序列编码的蛋白为I34整合素结合蛋白(Integrinbeta4bindingprotein,ITGB4BP，SEQIDNO1，Swiss-Prot:P56537.1，[GI:3122258])。在此基础上，本发明人进行了一系列研究，首次证明ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞分化过程中发挥重要作用，进而完成了本发明。特别地，本发明涉及(34整合素结合蛋白(ITGB4BP)及其衍生物，或表达ITGB4BP及其衍生物的基因重组表达载体，在预防和/或治疗增生性瘢痕或纤维化病变中的应用。具体地，本发明提供以下各方面的内容在本发明的第一方面中，本发明在成人肝cDNA文库中筛选得到了携带ITGB4BP基因的重组载体pACT2-ITGB4BP，在此基础上，利用常规基因克隆技术，克隆了携带ITGB4BP编码基因和绿色荧光蛋白基因EGFP的重组穿梭质粒pShutlle-CMV-ITGB4BP-EGFP，然后利用基因同源重组，将ITGB4BP-EGFP重组到腺病毒载体pAdEasy-l中，获得重组腺病毒表达载体pAdEasy-ITGB4BP-EGFP，并包装成腺病毒颗粒，用于ITGB4BP蛋白功能和ITGB4BP基因功能的鉴定。并且，进一步克隆了关于ITGB4BP基因的慢病毒干扰载体pFIV-Hl/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi，进行RNA干扰实验，用于ITGB4BP蛋白功能和ITGB4BP基因功能的鉴定。在本发明的第二方面中，本发明分离了正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞，建立了瘢痕细胞模型。并且，鉴定ITGB4BP在上述两种细胞中的表达水平，发现ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达(参见图1)，表明ITGB4BP的低表达加重了增生性瘢痕的纤维化。在本发明的第三方面中，本发明通过RNAi技术抑制ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达后检测纤维化相关的指标TGF-(31(转化生长因子(31)、MMP9(基质金属蛋白酶9)和I型胶原的表达量。结果表明，在mRNA水平上抑制ITGB4BP表达后，纤维化相关的指标TGF-J31、MMP9和I型胶原的表达量升高(参见图2)，明显加重了纤维化。在本发明的第四方面中，本发明通过在正常皮肤成纤维细胞中增加ITGB4BP的表达后检测纤维化相关的指标TGF-pi、MMP9和I型胶原的表达量。结果表明，在mRNA水平上增加ITGB4BP表达后，纤维化相关的指标TGF-(31、MMP9和I型胶原的表达量显著降低(参见图3)，抑制纤维化。在本发明的第五方面中，本发明通过在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达ITGB4BP后检测肌成纤维细胞表面标志物a-SMA和纤维化相关的指标TGF-(31和I型胶原的表达量，并利用成纤维细胞的三维培养系统(FPCL)检测对肌成纤维细胞收缩的抑制作用。结果表明，与阴性对照相比，在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达ITGB4BP后，a-SMA表达量减少(参见图4)，抑制了增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化；纤维化相关的指标TGF-(31、MMP9和I型胶原的表达均被明显抑制(参见图5和6)，并且肌成纤维细胞的收缩性下降(参见图7)。因此，本发明首次证明ITGB4BP在体外细胞培养系统中能抑制纤维细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞产生胶原蛋白(包括I型、III型等，本文显示了关于I型胶原蛋白的数据，未显示关于III型胶原蛋白的数据)；首次证明ITGB4BP能抑制肌成纤维细胞的收縮；发现ITGB4BP能下调TGF-j31、MMP9的表达。因此，本发明得出这样的结论在纤维化疾病中，ITGB4BP的低表达可能是一个调控成纤维细胞表型转化和功能改变的重要始动因素，ITGB4BP可能是一个具有强烈作用的纤维化形成相关的负调信号。因此ITGB4BP的高表达则是具有明显的抗纤维化作用。因此，ITGB4BP及其基因表达载体可以用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变。另一方面中，由于ITGB4BP基因在真核细胞中的序列高度保守，其以ITGB4BP的结合部位和功能部位发挥生物学作用的天然或基因工程蛋白质衍生物保留了保守功能结构域，具有类似的功能，也可以用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变。特别地，具有ITGB4BP的结合部位和功能部分，并且在高表达后能够抑制TGF-|31、MMP9或I型胶原等纤维化相关的指标的表达，或抑制成纤维细胞表面标志物a-SMA的表达的ITGB4BP衍生物都包括在本发明的范围内。因此，在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供一种用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变的药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包括治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体，和药用赋形剂或载体等。在本发明的另一个优选实施方案中，所述药物组合物或试剂盒还包括目前已知用于的瘢痕或纤维化病变的抑制剂。因此，本发明还提供一种预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体、或上述药物组合物或试9剂盒，优选地，所述受试者是人或动物。本领域的技术人员应该理解，所述药物组合物或试剂盒可以局部给药到瘢痕处或纤维化处，也可以通过口服、静脉内注射、肌内注射等常规施用方式施用。本领域中技术人员通过常规试验能够分别确定ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体、以及药物组合物的剂量水平。应该理解，关于任何具体受试者的具体剂量水平依赖于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物联合和经历治疗的具体疾病的严重性等。在施用所述药物组合物的情形中，ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体可以与其它瘢痕或纤维化病变抑制剂同时、或间隔一定时间进行施用。本发明还提供ITGB4BP蛋白或其衍生物、表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体在制备用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变的药物或试剂盒中的应用。在本发明中，所述增生性瘢痕包括但不限于烧伤、烫伤、切割伤、化学损伤，冷冻伤等皮肤外伤。所述纤维化病变包括各种组织器官的病理性纤维化，例如，但不限于，皮肤组织纤维化、肺纤维化、肝脏纤维化、或肾脏纤维化等；还包括由各种纤维化引起的病理性收縮，例如，但不限于，体表及体内脏器、组织的病理性收縮等。最后，本发明还提供一种获取ITGB4BP或其衍生物的方法，可以通过将编码ITGB4BP或其衍生物的核苷酸通过基因重组技术克隆到适当的原核表达载体、真核表达载体如酵母表达载体、或病毒表达载体中，构建合适的重组表达载体，转化或转染到相应宿主体内进行重组表达，最后进行蛋白质纯化步骤获得ITGB4BP或其衍生物。在本发明的一个优选实施方案中，所述方法将编码ITGB4BP的核苷酸克隆到病毒表达载体中，如腺病毒pAdEasy-l载体中，进行重组表达。本领域技术人员应该注意，本发明所述的ITGB4BP或编码其的基因主要来源于人。从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中-图1:ITGB4BP在正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。图2:在增生性瘢痕成纤维细胞中抑制ITGB4BP表达后，培养上清内TGF-pi、MMP9和I型胶原的表达水平升高。2A:筛选ITGB4BP基因干扰用的有效慢病毒，1#，2#和3#分别表示慢病毒-FIV-Hl/U6-copGFP-ITGB4BPRNAil#/2#/3#;2B:在增生性瘢痕成纤维细胞中抑制ITGB4BP表达后，培养上清内TGF-|31、MMP9和I型胶原的表达的检测，*:尸二0.0001，**:尸=0.005，***:P=0.03。图3:正常皮肤成纤维细胞中ITGB4BP高表达后细胞培养上清内TGF-卩1、MMP9和I型胶原的表达检测，*:尸=0.038，**:户=0,0005，火大女尸=0.007。图4:增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP表达升高后细胞内a-SMA的表达检测。4A:mRNA水平检测；4B:蛋白水平检测；4C:蛋白水平分析，1为EGFP，2为ITGB4BP-EGFP。图5:增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP表达升高后细胞内TGF-(31的表达检测。5A:mRNA水平检测；5B:蛋白水平检测；5C:蛋白水平分析，1为EGFP，2为ITGB4BP-EGFP。图6:在mRNA水平上，增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP表达升高后细胞内I型胶原的表达检测。图7:增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP高表达后肌成纤维细胞收縮功能检测。7A，三维凝胶模型，左图为ITGB4BP-EGFP，右图为EGFP;7B，收縮指数分析，P=0.008，1为ITGB4BP-EGFP，2为EGFP。图8:质粒图谱。8A，pEGFP-N2;8B，pl8MD-18;8C，pShuttle-CMV;8D，pAdEasy-l;8E，pFIV-Hl/U6-c叩GFP。具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。本发明所用的实验仪器和材料及其来源显示在下表1中。表l.本发明所用的实验仪器和材料以及它们的来源MyCyclearTY5533型PCR仪美国Bio-Rad公司MiniProtein3cell小型垂直电泳仪美国Bio-Rad公司手提紫外灯美国Upland公司凝胶成像分析系统GelDoc2000美国Bio-Rad公司SDS-PAGE电泳系统美国Bio-Rad公司MiniTrans-Blot电转系统美国Bio-Rad公司CP225D型电子天平德国Sartorius公司HHW21Cu600电热恒温水温箱上海医疗器械七厂LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器上海华线医用仪器公司LDR0.08-0.7G型电热真空灭菌器山东新华医疗器械公司DGF20003型电热鼓风干燥箱重庆试验设备厂HQ45型恒温摇床中科院武汉科仪厂高速台式离心机-TGL-18C-C上海安亭科仪厂SZK-202型净化工作台蚌埠绝缘材料厂HHB11.420-S型恒温培养箱上海跃进医疗器械厂DU-640型紫外分光光度计美国Beckman公司CR21F型低温高速离心机日本HITACHI公司-80°<:低温冰箱(1^111118)美国HARRIS公司Milli-QBiocel纯水仪美国Millipore公司各型移液器美国Eppendorf公司DH-IIDNA旋转混合仪宁波新芝生物科技股份有限公司F-3010型荧光分光光度仪日本Hitachi公司7500实时PCR仪美国ABI公司680型酶标仪美国Bio-Rad公司pEGFP陽N2美国BDclontech公司(6081-1)pITGB4BP-EGFP本实验室构建的质粒，构建方法参见实施例1pAdEasy-l质粒、pShuttle-CMV质粒美国Qbiogene公司大肠杆菌DH5a、BJ5183美国Qbiogene公司胰蛋白胨美国Sigma公司琼脂糖瑞士罗氏(Roche)公司溴酚兰上海Sangon公司Goldview核酸染料北京赛百胜公司本发明所需内切酶，yTaq等工具酶大连TaKaRa公司脂质体Lipofectamine2000大连TaKaRa公司氨苄青霉素、卡那霉素上海华美公司测序与引物合成上海博亚公司小鼠抗人ITGB4BP多克隆抗体台湾Abnova公司小鼠抗人a-SMA单克隆抗体武汉博士德公司小鼠抗人P-肌动蛋白单克隆抗体武汉博士德公司小鼠抗人TGF-pi单克隆抗体美国Peprotech公司过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG武汉博士德公司RIPA裂解液美国SantaCmz公司化学发光液美国SantaCruz公司RIPA上海申能公司SDS上海西宝公司Tris.HCl上海西宝公司丙烯酰胺上海西宝公司N'N'-甲叉双丙烯酰胺上海西宝公司PVDF膜美国Millipore公司脱脂奶粉内蒙古伊利公司六孔板和24孔板美国Corning公司胰蛋白酶美国Hyclone公司小牛血清成都哈里公司DMEM美国Hyclone公司75cm2培养瓶上海市万红玻璃仪器厂EP管美国Axygen公司引物合成上海Invitrogen公司实时PCRMasterMix(SYBRGreen)日本Toyobo公司反转录试剂盒AMV3.0大连TaKaRa公司Tripure瑞士罗氏(Roche)公司DNA连接试剂盒美国MBI公司质粒抽提、DNA纯化回收试剂盒美国Omega公司人MMP-9ELISA检测试剂盒美国RB公司13人I型胶原蛋白ELISA检测试剂盒美国RB公司人TGF-p1ELISA检测试剂盒美国RB公司实施例1.穿梭载体的构建1.1目的基因序列的获取本实验使用pEGFP-N2和pITGB4BP-EGFP质粒进行，其中pEGFP-N2购于clontech公司(货号6081-1)，pITGB4BP-EGFP为本实验室构建的质粒。pITGB4BP-EGFP的构建方法为根据重组载体pACT2-ITGB4BP(肝cDNA文库，美国BDClontech公司)的序列设计引物上游引物pITGB4BP-EGFP-五oRI(插入五coRI酶切位点)5'-CAGAATTCATGGCGGTCCGAGCTTCGTT-3';下游引物pITGB4BP-EGFP-S"wffl(插入SamHI酶切位点)5'-CAGGATCCCGGTGAGGCTGTCAATGAGGGAAT-3'。以pACT2-ITGB4BP为模板进行PCR反应，试剂为TaKaRa公司产品。反应体系如下pACT2陽ITGB4BPlpl(约为l昭)10xPCR缓冲液5pldNTP(2.5mmol/L)4^1MgCl2(25mmol/L)3pl上游引物0.5^1下游引物0.5^1一酶(5UV)0，ddH2035.5nl终体积5(^1反应条件94。C变性4分钟后94。C30秒，55。C30秒，72。C60秒，共30个循环，然后72。C延伸10分钟，获得约750bp大小的目的片段ITGB4BP。首先根据pMD18-T载体连接试剂盒(TaKaRa公司)操作步骤，将PCR产物连接至pMD18-T载体中，得到pMD18-T-ITGB4BP重组体。然后利用五coRI和^mffl双酶切ITGB4BP的PCR产物和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N2，反应条件如下pEGFP-N2(或pMD18-T-ITGB4BP)40^1(约为2吗)10xH缓冲液5^1肠HI2.5nl终体积5(^1反应条件37。C反应2h。然后，使用0.6%琼脂糖凝胶进行电泳，对目的条带进行切胶与胶回收。胶回收采用DNA纯化回收试剂盒(购自美国Omega公司)，按供应商提供的说明书进行纯化回收。最终得到￡CORI和B讓HI双酶切的ITGB4BP片段和pEGFP-N2线性质粒片段。然后利用T4DNA连接酶(大连Takara公司)分别连接胶回收产物，反应条件如下回收后的pEGFP-N23.5^1(约为0.5吗)回收后的ITGB4BP12^1(约为l昭)10xT4DNA连接缓冲液2^1T4DNA连接酶2.5pl终体积20^1反应条件16。C过夜。构建后的重组载体命名为pITGB4BP-EGFP。转化连接产物至感受态大肠杆菌DH5(x后，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，挑取单菌落进行扩增，提取质粒并用五coRPhB"mffl双酶切连接产物，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。至此pITGB4BP-EGFP载体构建完成。然后利用BglII和NotI(均购自大连Takara公司)双酶切pEGFP-N2和pITGB4BP-EGFP从中获得目的片段EGFP(长度约796bp)和ITGB4BP-EGFP(长度约1512bp)，构建至经同样双酶切处理的pShuttle-CMV(美国Abiogene公司，长度约7.5kb)中。pEGFP-N2、pITGB4BP-EGFP和pShuttle-CMV各自的酶切体系如下pEGFP陽N2(或pITG膽P-EGFP或28^(约为2)pShuttle-CMV)p10xH缓冲液4^10.1%BSA争Notl、BglII各2pl终体积4(^1反应条件37。C反应2h，0.6%琼脂糖凝胶进行电泳，对目的条带进行切胶与胶回收。胶回收釆用DNA纯化回收试剂盒(购自美国Omega公司)，方法按供应商提供的说明书进行。最终得到BglII和NotI双酶切的EGFP、ITGB4BP-EGFP片段和pShuttle-CMV线性质粒片段。1.2穿梭载体的连接将上一步回收后得到的目的片段EGFP和ITGB4BP-EGFP分别利用T4DNA连接酶连接至同样经酶切、回收后的质粒pShuttle-CMV中，从而获得含目的片段的穿梭质粒载体。二者各自的连接反应体系分别如下:回收后的pShuttle-CMV3.5^1(约为0.5吗)回收后的EGFP或ITGB4BP-EGFP12pl(约为1)10xT4DNA连接缓冲液2^1T4DNA连接酶2.5pl终体积20pl反应条件16。C过夜。连接产物的转化与扩增按照本领域公知的常规大肠杆菌转化方法，将连接产物转化利用氯化钙方法制备的感受态大肠杆菌DH5(X细胞，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行质粒扩增、鉴定和提取重组质粒。1.3穿梭载体构建后的鉴定对上一步获得的连接产物用XhoI(购自大连Takara公司)进行酶切鉴定，将构建成功后的重组穿梭质粒载体分别命名为pShuttle-CMV-ITGB4BP-EGFP和pShuttle-CMV-EGFP。鉴定的酶切反应体系如下pShuttle-CMV-ITGB4BP-EGFP或pShuttle-CMV-EGFP5|ul(约为0.2昭)10xH缓冲液lplddH203.5^1XhoI0.5^1终体积10^1反应条件37"C反应2h，0.6。％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定构建是否成功。实施例2.腺病毒的同源重组对实施例1中构建成功的穿梭载体利用Pmel酶切后进行回收，同时将其分别转化至氯化钙法制备的含pAdEasy-l质粒(购自美国Qbiogene公司)的感受态大肠杆菌BJ5183中，完成腺病毒的同源重组。具体操作内容如下2.1穿梭质粒的线性化将成功构建的穿梭质粒pShuttle-CMV-ITGB4BP-EGFP和pShuttle-CMV-EGFP用PmeI(购自英国NEB公司)进行酶切、回收。二者各自的酶切体系分别如下pShuttle-CMV-ITGB4BP-EGFP或pShuttle-CMV-EGFP18(约为0.5吗)NEB缓冲液45pl16lOOxBSA0.5nlddH2025.5piPmeI1^终体积50pi反应条件37t:反应2h后，0.6%琼脂糖凝胶电泳，切胶及胶回收(方法同实施例1中1.1)。2.2腺病毒的同源重组利用本领域公知的常规大肠杆菌转化方法，将线性化后的穿梭质粒分别转化至含腺病毒pAdEasy-1载体的氯化钙制备的大肠杆菌BJ5183中。在卡那霉素抗性的固体培养基中筛选阳性菌落。从长出的大、中、小三种菌落中挑取中小菌落，经扩增后提取质粒，利用PacI(购自英国NEB公司)对其进行酶切鉴定，将重组成功的腺病毒载体分别命名为pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和pAdEasy-EGFP。鉴定的酶切体系分别如下pAdEasy-ITGB4BP陽EGFP或pAdEasy-EGFP4|al(约为0.1昭)NEB缓冲液12^1lOOxBSA0.2^1ddH2013.5^1PacI0，终体积20^1反应条件37。C反应lh后，0.6Q^琼脂糖凝胶电泳，Goldview核酸染料染色分别显现23kb和3.0kb或23kb和4.5kb的条带，表明腺病毒载体重组成功。实施例3.腺病毒的包装与扩增3.1腺病毒载体转染HEK293细胞包装腺病毒3丄1腺病毒载体的线性化用PacI酶切重组腺病毒载体pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和pAdEasy-EGFP并回收。酶切体系如下pAdEasy層ITGB4BP-EGFP或pAdEasy-EGFP48^1(约为l.O吗)NEB缓冲液18pl訓xBSAO単ddH2021.7^1PacI1.5|_d终体积8(^1反应条件37。C反应lh后，0.6%琼脂糖凝胶电泳，Goldview核酸染料染色分别显现23kb和3.0kb或23kb和4.5kb的条带，对上述23kb的两条条带(分别主要包含重组目的基因pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和pAdEasy-EGFP)进行胶回收(方法同实施例1中1.1)。3丄2腺病毒的包装将3xl()S细胞HEK293细胞(购于中科院细胞库)接种至六孔板(美国Coming公司)中，待细胞达到80Q/^融合时开始转染。转染方法如下取8吗在3丄1中线性化的腺病毒质粒分别与250^il无抗DMEM(即，不含抗生素的DMEM)(购自美国Hyclone公司)混合，室温，5min;取20^1脂质体与480|Lil无抗DMEM轻柔混合，室温，5min，分为2等份；将上两步混合液进行混合，室温静置20min;PBS清洗六孔板中的293细胞两遍后，加入质粒脂质体混合物；C02孵箱中37t:培养4hr后更换新鲜无抗DMEM(含10%小牛血清)，每孔2ml。继续培养24h后开始观察细胞内荧光表达情况。3.2腺病毒的收集与扩增-HEK293细胞转染后第六天，荧光比较强，且细胞已完全呈悬浮状态，用无菌吸头将细胞吹打下来，收集于EP管(购自美国Axygen公司)中，于-80。C和37。C中反复冻融3次，12,000rpm，4。C离心15min后获得的上清即为原代病毒液，分别命名为Ad-ITGB4BP-EGFP和Ad-EGFP。随后将病毒液继续感染293细胞，利用同样的方法收集其第3-4代病毒液备用。实施例4.慢病毒干扰载体的构建与包装本实施例中所需ITGB4BP基因的慢病毒干扰载体pFIV-Hl/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi购自重庆金麦生物技术有限公司公司(地址重庆市沙坪坝区天星桥金地汇3-11)，作为阴性对照的干扰序列也购自该公司。将上述二者经转染293FT细胞包装后获得的慢病毒分别命名为慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi1#/2#/3#和阴性对照。RNA干扰筛选时选用的候选片段分别为ITGB4BPRNAi1#-1:AAAGGGGCTGGTGCATCCCAAGAITGB4BPRNAil#-2:AAAATCTTGGGATGCACCAGCCCITGB4BPRNAi2#-1:AAAGGGCTCAGAGAACTTCTACAITGB4BPRNAi2#-2:AAAATGTAGAAGTTCTCTGAGCCITGB4BPRNAi3#-l:AAAGCAGCCTCCCAGACACAGTGITGB4BPRNAi3#-2:AAAACACTGTGTCTGGGAGGCTG阴性对照RNAi-l:AAAGTCGACTCAGTCGGGTGGCA阴性对照RNAi-2:AAAACTGCTATCGAGCCTGGCGA慢病毒载体的构建按SBI公司pFIV—Hl/U6-copGFPsiRNA试剂盒(Cat:#SI111A-1)操作说明书进行。4.1慢病毒干扰载体pFIV-Hl/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi的构建将上述候选片段按照下述比例进行退火连接。反应体系如下上游片段2.5pl(约为2.5昭)下游片段2.5nl(约为2.5昭)2X退火缓冲液25.0plddH2020.0^1终体积50.0^1反应条件95"C反应5分钟后冷却至室温。然后将连接成功的片段和pFIV-Hl/U6-copGFP连接。反应体系如下候选片段1^1(约为0.01昭)pFIV-Hl/U6-copGFP2.5^1(约为0.5吗)10xT4DNA连接缓冲液1^1T4DNA连接酶ddH204.5u1终体积10wl反应条件如下16"C过夜。连接产物的转化与扩增按照本领域公知的常规大肠杆菌转化方法，将连接产物转化利用氯化钙方法制备的感受态大肠杆菌DH5(x细胞，利用氨节青霉素抗性筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行质粒扩增、鉴定和提取重组质粒。4.2慢病毒干扰载体pFIV-Hl/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi的包装将4xl()S细胞293FT细胞(购于中科院细胞库)接种至75cm4咅养瓶(上海市万红玻璃仪器厂)中，待细胞达到70%融合时开始转染。转染方法如下取2.5|ag包膜蛋白质粒pVSV-G，7.5ng包装质粒pFIV34N和2昭上述构建成功的表达质粒在ddH20(总体积1095W)混匀，再加入155jil2MCaCl2。然后再缓慢加入1250pl2XPBS混匀。PBS清洗293FT细胞两遍后，加入上述混合物；C02孵箱中37t:培养7hr后更换新鲜无抗DMEM(10X小牛血清)，每瓶10ml。继续培养48h后细胞出现绿色荧光。收集细胞上清，3000rpm，4。C离心5min后，取上清用0.45um的PVDF膜抽滤后即为我们所需要的慢病毒液。实施例5.原代皮肤成纤维细胞的分离与培养包皮正常成纤维细胞来自重庆西南医院泌尿外科(经患者书面同意)，增生性瘢痕成纤维细胞来自重庆西南医院烧伤科，釆自烧伤后一年内的患者(经患者书面同意)。原代皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞的分离与培养方法如下将组织块放入无菌培养皿内，PBS冲洗三遍，用无菌剪刀除去表皮和皮下组织，剪碎真皮组织；将剪碎后的组织放入25ml锥形培养瓶内，加入0.5%胰蛋白酶(购自美国Hydone公司)10ml，室温，轻微振荡2h;加入10ml含10%小牛血清(购自成都哈里公司)的DMEM(购自美国Hyclone公司)终止消化，将悬液通过无菌滤网过滤后弃去组织碎片；离心，800rpml0min，弃上清，加入10ml含10。/。小牛血清的DMEM洗二遍，再次离心；弃上清后，重悬细胞于10ml含10%小牛血清的DMEM中，移至75cr^培养瓶(购自上海市万红玻璃仪器厂)中，37°C，5。/。C02培养箱内进行培养，24h后更换培养基，同时除去未贴壁细胞。待细胞完全长满后，即可进行传代培养。实验时选用第6-10代成纤维细胞。5.1正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞RNA的提取具体步骤为取第8代成纤维细胞(六孔板培养)，弃去培养基；每孔加入20(HilTripure(购自瑞士罗氏(Roche)公司，目录号为11667157001)，冰盒上放置5miii后刮下所有细胞并收集；按l:5(三氯甲烷Tripure，v/v)的体积比例加入40)^1三氯甲烷，剧烈振荡15sec，冰盒上放置10min;然后每孔加入200|alTripure，冰盒上放置5min;4°C，12000g，离心15min;转移上层水相，加入等体积的异丙醇，混匀，冰盒上放置10min;4°C，12000g，离心10min;弃上清，加入75%乙醇(1^DEPC水稀释)500pl洗涤沉淀；4°C，7500g，离心5min;室温下待酒精挥发完后，加入10^1的1%。DEPC水溶解沉淀即为RNA;对RNA进行浓度测定，-80°C冻存。5.2提取RNA后的反转录反应利用上一步提取的RNA为模板进行反转录反应。反转录反应体系如20下5.1中提取的RNAAMV反转录酶RNA酶抑制剂dNTP混合液10xRT缓冲液OligodT-连接物引物MgCl2RNAddH20终体积反应条件50°C30min，99°C5min5.3实时荧光定量PCR检领U(Real-timePCR)实时PCR反应体系如下RT反应物SYBRGreen实时PCRMasterMix正向引物(10nM)反向引物(10nM)ddH20终体积此处所用的引物序列为ITGB4BP:正向引物5'-CCCAACAATACCACCGACCAGGA-3'反向弓1物5'-GCCCTCCCTGATTGCTGAAGACA-3，GAPDH:正向引物5'画GGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'反向引物5'画TCGCTCCTGGAAGATGGTGATG-3'反应条件95"C变性2min;95"C变性15秒，55。C退火35秒，72。C延伸31秒，共40个循环。在72t:进行信号采集并利用7500系统软件进行分析，结果显示在图1中。实施例6.ITGB4BP基因干扰用有效慢病毒的筛选因为所构建的慢病毒干扰载体并不是全都具有干扰作用，必须经过筛选，选出干扰最有效的组进行实验。筛选使用24孔板(美国Coming公司)进行实验，每孔瘢痕成纤维细胞数约为5xl()S个，每孔加入在实施例4中得到的慢病毒200(il，四天后对细约l叱lpl0、12pl2pl1^1l吗补全至20nl20nl，5°C5min，4。C保存;2^1，0.，0牟7，20^1胞利用实时荧光定量PCR技术检测感染慢病毒-FIV-Hl/U6-copGFP-ITGB4BPRNAil#/2#/3#以及阴性对照感染组内ITGB4BP的mRNA表达情况。所用的引物序列为(同实施例5):ITGB4BP:正向引物5'-CCCAACAATACCACCGACCAGGA-3'反向弓I物5'-GCCCTCCCTGATTGCTGAAGACA-3'GAPDH:正向引物5'-GGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'反向引物5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATG-3'具体步骤为观察瘢痕成纤维细胞感染慢病毒后荧光表达约50%，细胞形态呈长梭形，阴性对照组未见荧光，弃去培养基；使用Tripure，按实施例5中5.1的方法提取成纤维细胞的RNA，以提取的RNA作为模板进行反转录反应，反转录的引物、反应体系和反应条件均与实施例5中5.2的反转录反应相同。然后，利用所得到的反转录产物作为模板，按照实施例5中5.3的方法进行实时PCR检测，所用的引物与实施例5中5.3所用的引物相同，反应体系和反应条件也相同。在72。C进行信号采集并利用7500系统软件进行分析，结果显示在图2A中，最后筛选得到的干扰有效的慢病毒为慢病毒-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi2#，用于后续实验。实施例7.ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达后纤维化相关指标的表达检测根据先前的研究表明，细胞将在细胞培养上清中分泌纤维化相关蛋白如TGF-pi、I型胶原和MMP-9，通过检测这些蛋白的分泌表达，可以了解它们的表达变化。利用这些纤维化相关蛋白的表达水平的变化，可以推测瘢痕的形成情况。采用ELISA法检测增生性瘢痕成纤维细胞中的ITGB4BP在mRNA水平上受到抑制后培养基上清中细胞外基质蛋白TGF-(31、I型胶原以及MMP-9的表达。简言之，在实施例6中已经证明慢病毒^1￥^1/116<(^0-1108481^八12#能有效的抑制瘢痕成纤维细胞中的22ITGB4BPmRNA的表达。将瘢痕成纤维细胞传代于24孔板(美国Coming公司)进行实验，每孔瘢痕成纤维细胞数约为5xl(^个，每孔加入按照实施例4方法包装得到的慢病毒-FIV-Hl/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi2弁200^1，加入含10。/。小牛血清的DMEM800ul，37°C，5%(302培养箱内进行培养，四天后收集培养的瘢痕成纤维细胞上清，利用ELISA检测上清中TGF-(31、I型胶原以及MMP-9的含量。ELISA检测TGF-(31的实验步骤(参照美国RB公司的人TGF-(31ELISA检测试剂盒附上的说明书)加入100pl倍比稀释(即，连续稀释，将2000ng/ml的高浓度标准品连续稀释成1000ng/ml，500ng/ml，250ng/ml，125ng/ml，62.5ng/ml，31,25ng/ml，15.6ng/ml，Ong/ml)的标准品于相应的反应板中，一式两份；依次加入100)il样品(即实验分组瘢痕成纤维细胞+ITGBRBPRNAi，和瘢痕成纤维细胞十阴性对照)，共4个孔；轻轻混匀30秒，用保鲜膜封住板孔，37。C温育60min;洗板，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350^1洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次；每孔加入10(^1lx生物素(试剂盒所带)。轻轻混匀30秒，封住板孔，37。C温育60min;洗板，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入35(^1洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次；每孔加入100pllxHRP(试剂盒所带)。轻轻混匀30秒，封住板孔，37'C温育30min;洗板，鬼尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350^d洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次；每孔加入lO(HilTMB显色液，轻轻混匀10秒，37。C暗处温育25分钟(15±10分钟)；每孔加入10(^1终止液(试剂盒所带)。轻轻混匀30秒；30分钟内利用680型酶标仪在450nm处读出OD值。根据标准品确定TGF-(31的浓度。这里需要注意，美国RB公司的人TGF-pi检测试剂盒、人I型胶原检测试剂盒和人MMP-9检测试剂盒可以用来检测同一样本中的不同指标，具体而言，在本实验中，将一份样本分成3等份a、b和c，a用于TGF-(31检测试剂盒检测TGF-(31，b用于I型胶原检测试剂盒检测I型胶原，禾口c用于MMP-9检测试剂盒检测MMP-9。三种检测所用的试剂均为试剂盒所带，检测的步骤与上述利用人TGF-(31检测试剂盒检测TGF-pi的步骤相同。实施例8.正常成纤维细胞中ITGB4BP高表达后纤维化相关指标的表达测定使用24孔板进行实验，每孔正常皮肤成纤维细胞数约为5><103个，每孔加入在实施例3中获得的腺病毒Ad-EGFP禾卩Ad-ITGB4BP-EGFP各200^1，加入含10。/。小牛血清的DMEM800ul，37°C，5%(302培养箱内进行培养，五天后利用ELISA检测上清中TGF-pl、I型胶原以及MMP-9的含量(方法同实施例7，分别使用美国RB公司的人TGF-j31检测试剂盒、人I型胶原检测试剂盒和人MMP-9检测试剂盒进行)。实施例9.增生性瘢痕成纤维细胞中ITGB4BP高表达后纤维化相关指标的表达测定9.1mRNA水平检测a-SMA、TGF-卩1和I型胶原的表达使用六孔板进行实验，每孔增生性瘢痕成纤维细胞数约为8><104个，每孔加入在实施例3中获得的腺病毒Ad-EGFP和Ad-ITGB4BP-EGFP各600^1,加入含10。/。小牛血清的DMEM2400y1，37°C，5%(302培养箱内进行培养，五天后利用实时荧光定量PCR检测细胞中a-SMA、TGF-pi和I型胶原的表达(RNA提取、逆转录反应和实时荧光定量PCR的实验方法同实施例5)。所用的引物序列为TGF-(31:正向引物5'-TGGAAACCCACAACGAAATCTATGA-3'反向引物5'-TGGAAACCCACAACGAAATCTATGA-3'I型胶原正向引物:5'-tcccaccaatcacctgcgtaca-3'反向弓I物5'-cgccggtggtttcttggtcg-3'a-SMA:正向弓l物5'-cggctttgctggggacgat-3'反向引物5'-caggggcaacacgaagctcat-3'9.2蛋白水平检测TGF-pi、和a-SMA的表达使用六孔板进行实验，每孔细胞数约为8><104个，每孔加入在实施例3中获得的腺病毒Ad-EGFP和Ad-ITGB4BP-EGFP各600^1，加入含10%24小牛血清的DMEM2400u1，37°C，5%(302培养箱内进行培养，五天后利用蛋白质印迹法检测细胞中TGF-(31和a-SMA的表达。9.2.1增生性瘢痕成纤维细胞蛋白的提取(RIPA法)具体步骤为冰上处理细胞，预冷的PBS洗涤细胞后，每孔加20(Hi1RIPA细胞裂解(含1XPMSF)液，用细胞刮匙于冰上反复刮取细胞，移入一干净的1.5mlEP管，冰上放置30min;冰浴超声裂解，4°C14000rpmx30min，将离心后的上清移入新的1.5mlEP管中；BCA法测定蛋白浓度(参考美国Pierce公司BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书)。用ddH20调整样品的浓度至适当的浓度，加入5xSDS-PAGE上样缓冲液；蛋白煮沸5min;上样20pl/孔；SDS-PAGE电泳，电泳结束了取下凝胶放入电转缓冲液中浸泡20min，同时浸泡6张滤纸，1张PVDF膜，安装"三明治"结构，从负极到正极三层滤纸-凝胶-PVDF膜-三层滤纸，恒流0.8Ma/cm2，电转1.5小时。取出PVDF在含5%脱脂奶粉的TBST(HTween20)封闭液中室温封闭2小时；加入一抗(小鼠抗人(3-肌动蛋白单克隆抗体l:400，小鼠抗人TGF-(31单克隆抗体4pg/ml，小鼠抗人a-SMA单克隆抗体1:100)4。C过夜孵育；洗膜1。/。。TBSTxlOminx3次；加入二抗(过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，1:2000)室温孵育l小时；洗膜l%。TBSTxl0minx3次；显影，加入美国SantaCruz公司的化学发光液A液B液(均为试剂盒自带的)各500pl后闭光显影。SDS-PAGE电泳胶体系分离胶(12%)，80V电泳总体积5ml积层胶(5%)，150V电泳总体积2ml30%丙烯酰胺2ml30%丙烯酰胺0.33ml1.5mol/LTris-HCL1.3ml1.5mol/LTris-HCL1.3ml10%SDS0.05ml10%SDS0.02ml10%过硫酸铵0.05ml10%过硫酸铵0.02mlTEMED0.002mlTEMED0.002mlddH201.6mlddH201.4ml9.3利用FPCL模型观察ITGB4BP对成纤维细胞生物学行为的影响FPCL模型的制作取已感染腺病毒Ad-EGFP和Ad-ITGB4BP-EGFP5天后的增生性瘢痕成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后用无血清的DMEM重悬细胞，制备细胞悬液，并调整细胞密度为lxi(^个细胞/ml。按细胞悬液5xdmem:鼠尾胶原=1:2:7的体积比例混合上述各种成分，具体为先在冰上混合鼠尾胶原与5xDMEM，调节pH7.2，再加入细胞悬液；孵箱放置30min形成凝胶状后每孔加入3ml无血清DMEM培养。即获得成纤维细胞的三维培养系统(fibroblast-populatedcollagenlattice,FPCL)。每组各3个FPCL。第8天观察、记录FPCL的直径变化，计算收縮指数。FPCL收縮指数计算公式如下CI=[1-(D/D0)2]xl00%其中，CI:收縮指数；D:胶原蛋白凝胶块的直径；Do:凝胶块初始直径(22mm)。另外，应该注意，在本发明所有实施例中，如果需要进行统计学分析，则将数据采用SPSS13.0软件进行独立样本Z检验，/^0.05被认为具有统计学意义。结果与讨论1.ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达实施例5的检测结果显示在图1中。图1显示了ITGB4BP能够在正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞中表达，其代表mRNA表达水平的原始相对定量(rawrelativequantitation,以下简称原始RQ)值分别为1和0.704，说明ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达。这表明，ITGB4BP的低表达可能与增生性瘢痕中过度纤维化有关，即ITGB4BP的低表达加重了增生性瘢痕的纤维化。2.在增生性瘢痕成纤维细胞中，抑制ITGB4BP表达，能够加重瘢痕的纤维性图2A对应实施例6的结果，表明慢病毒-F^V-Hl/U6-copGFP-ITGB4BPRNAi2#在mRNA水平对ITGB4BP的干扰效果最好。具体而言，mRNA水平上阴性对照组为l.OO原始RQ，1#慢病毒载体对ITGB4BP表达量为2.068原始RQ，对ITGB4BP不具有干扰效果；2弁载体对ITGB4BP表达量为0.025原始RQ，抑制率达到99%，即最有干扰效果；3#载体对ITGB4BP表达量为0.253原始RQ，抑制率约为75%。图2B对应实施例7的结果，表明，在增生性瘢痕成纤维细胞中，在mRNA水平上抑制ITGB4BP表达后，TGF-卩1、MMP9和I型胶原在增生性瘢痕26成纤维细胞中表达升高，纤维化加重。与阴性对照相比，TGF-pi表达量升高约5倍，MMP9升高约4.5倍，I型胶原升高约6倍，表明在mRNA水平上，ITGB4BP抑制后能明显升高纤维化相关指标如TGF-pi、MMP9和I型胶原的表达，明显加重纤维化。3.在正常皮肤成纤维细胞中，增加ITGB4BP表达，能够抑制纤维性实施例8的结果显示在图3中。结果表明，在正常皮肤成纤维细胞中，ITGB4BPmRNA表达升高后，TGF-pi、MMP9和I型胶原在正常皮肤成纤维细胞中表达降低。具体而言，TGF-(31降低约2倍，MMP9降低约4.5倍，I型胶原降低约6倍，即ITGB4BP高表达后能明显抑制纤维化相关指标如TGF-(31、MMP9和I型胶原的表达，抑制纤维化。图2和图3对应的具体数据如下表2.1TGF-(31标准品浓度与对应的OD45o检测值标准品(ng/'ml)100050025012562.531.2515.6250第1组0.5400.4780.2990.2070.1490.1080.0930.076OD450第2组0.5770.5020.3280.2250.1460.1170扁0.092根据TGF-pl标准品浓度(x)和其相应的OD45Q值(y)进行回归分析(表2.1)，选用二次曲线模型拟合得相关系数(R)值为1.000，方差分析中F值=3464.810，显著性概率SignifF=0.000<0.05，说明这两个变量之间存在高度显著的二次函数关系，拟合的二次曲线方程式为y=0.079+0.001x—0.00000066x2'并据此得TGF-卩1浓度与0045()值的标准曲线。表2.2成纤维细胞在不同刺激条件下生成TGF-I31的OD45o检测值(人TGF-piELISA检测试剂盒检测)实验分组增生性瘢痕成纤维细胞正常皮肤成纤维细胞阴性对照ITGB4BPRNAiEGFPITGB4BP-EGFP第1组0.1140.3590.4470.247第2组OD450第3组0.1510.1500.4510.4490.4720.5190.3770.253第4组0.1540.3340.4960.374表3.1MMP-9的标准品浓度与对应的OD45o检测值标准品(ng/ml)100050025012562.531.2515.6250第1组0.7200.5990.5310.4580.3070.2080.1470細OD450第2组0.7260.6030.5570.4520.3270.1900.1490.094根据MMMP-9得到的标准品浓度(x)和对应的OD45Q值(y)进行回归分析(表3)，选用三次曲线模型拟合得到的相关系数(R)值为0.996，方差分析中F值=154.414，显著性概率SignifF=0.000<0.05，说明这两个变量之间存在高度显著的三次函数关系，其三次曲线回归方程式为y=0.106+0.003x—0.0000067x2+0.00000000399x3,据此得MMP-9浓度与OD柳值的标准曲线。表3.2成纤维细胞在不同刺激条件下生成MMP-9的OD45Q检测值(人MMP-9ELISA检测试剂盒检测)增生性瘢痕成纤维细胞正常皮肤成纤维细胞实验分组-阴性对照ITGB4BPRNAiEGFPITGB4BP-EGFP<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表4.1I型胶原标准品浓度与对应的OD450<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>根据I型胶原标准品浓度(x)和对应的OD45o值(y)进行回归分析(表4.1)，选用三次曲线模型拟合得到的相关系数(R)值为0.999，方差分析中F值=577.326，显著性概率SignifF=0.000<0.05，拟合的三次曲线回归方程式为y=0.086+0.002x—0.0000028x2+0.00000000139x3，并据此得I型胶原浓度与0045()值的标准曲线。表4.2成纤维细胞在不同刺激条件下生成I型胶原的OD45o检测值(人I型胶原蛋白ELISA检测试剂盒检测)增生性瘢痕成纤维细胞正常皮肤成纤维细胞实验分组-阴性对照ITGB4BPRNAiEGFPITGB4BP-EGFP第1组0.14403270.6320.416第2组0.1230,3230.5040.381OD450第3组0.1460.3210.7980.421第4组0.1450.3200.6530.4294.在增生性瘢痕成纤维细胞中，ITGB4BP的高表达具有明显的抗纤维化作用实施例9的实验结果显示在图4-7中。图4的结果表明，在增生性瘢痕成纤维细胞中，ITGB4BP表达升高后抑制了肌成纤维细胞表面标志物oc-SMA的表达，gP，抑制了成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化。ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达后，a-SMA的mRNA水平上表达量为0.329原始RQ，低于对照组的1.00原始RQ，即a-SMA的抑制率为67%(图4A)。图4B的蛋白质印迹实验结果也清楚地表明ITGB4BP的高表达在蛋白水平上抑制a-SMA的表达，进一步量化显示ITGB4BP高表达组的a-SMA蛋白水平相对表达量为0.016，低于对照组0.023，其抑制率为30%(图4C)。图5的结果表明，在增生性瘢痕成纤维细胞(或模型)中，ITGB4BP表达升高后抑制了TGF-(31在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达后，TGF-(31的mRNA水平上表达量为0.3979原始RQ，低于对照组的1.00原始RQ，即TGF-(31的抑制率为60%。图5B的蛋白质印迹实验结果也清楚地表明ITGB4BP的高表达在蛋白水平上抑制TGF-(31的表达，进一步量化显示ITGB4BP高表达组的TGF-卩1蛋白水平相对表达量为0.008，低于对照组0.069，其抑制率为88%(图5C)。图6的结果表明，在增生性瘢痕成纤维细胞(或模型)中，ITGB4BP表达升高后抑制了I型胶原在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达后，I型胶原的mRNA水平上表达量为290.480.始RQ，低于对照组的1.00原始RQ，即对I型胶原的抑制率为52%。图7的结果表明，在增生性瘢痕成纤维细胞(或模型)中，ITGB4BP抑制肌成纤维细胞的收缩。ITGB4BP在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达后，三维凝胶的收缩指数为0.23，对照组为0.90，即凝胶的收缩能力下降约74%。从上述结果可以看出，在纤维化疾病中，ITGB4BP的低表达可能是一个调控成纤维细胞表型转化和功能改变的重要始动因素，ITGB4BP可能是一个具有强烈作用的纤维化形成相关的负调信号。因此ITGB4BP的高表达则是具有明显的抗纤维化作用。因此，ITGB4BP及其治疗性基因表达载体可以用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，可以在其中进行各种形式和细节的变化，而不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围。参考文献1.WynnTA，etal.Commonanduniquemechanismsregulatefibrosisinvariousfibroproliferativediseases.JClinInvest2007;117(3):524—529.2.TomasekJJ,GabbianiG，HinzB,etal.Myofibroblastsandmechano-regulationofconnectivetissueremodelling.NatRevMolCellBiol2002;3(5):349-363.3.FriedmanSL，etal.Mechanismsofdisease:mechanismsofhepaticfibrosisandtherapeuticimplications.NatClinPractGastroenterolHepatol2004;1(2):98—105.4.WangJ,JiaoH，StewartTL,etal.ImprovementinpostbumhypertrophicscaraftertreatmentwithIFN-alpha2bisassociatedwithdecreasedfibrocytes.JInterferonCytokineRes，2007,27(11):921-930.5.WuJ,MaB,YiS,etal.GeneexpressionofearlyhypertrophicscartissuescreenedbymeansofcDNAmicroarrays.JTrauma，2004,57(6):1276-1286.6.StudlerJM,GlowinskiJ，Levi-StraussM.AnabundantmRNAoftheembryonicbrainpersistsatahighlevelincerebellum,hippocampusandolfactorybulbduringadulthood.EurJNeurosci.1993;5(6):614-23.7.PanD，ZheX，JakkarajuS，TaylorGAetal，P311inducesaTGF-betal-independent,nonfibrogenicmyofibroblastphenotype.JClinInvest,2002;110(9):1349-58.8.TaylorGA，HudsonE，ResauJHetal.RegulationofP311expressionbyMet-hepatocytegrowthfactor/scatterfactorandtheubiquitin/proteasomesystem.JBiolChem.2000;275(6):4215-9.9.FujitaniM,YamagishiS,CheYH，etal.P311acceleratesnerveregenerationoftheaxotomizedfacialnerve.JNeurochem.2004;91(3):737-44.10.袁顺宗，吴军，易绍萱等.以酵母双杂交系统从成人肝cDNA文库中筛选与研究P311相互作用蛋白的基因序列.第三军医大学学报，2005，27(14):1428-1431.11.SanvitoF，ArrigoG，ZuffardiO,AgnelliM,MarchisioPC，BiffoS.Localizationofp27beta4bindingproteingene(ITGB4BP)tohumanchromosomeregion20ql1.2.Genomics1998;52(1):111.12.DonadiniA，GiodiniA,SanvitoF,MarchisioPC,BiffoS.ThehumanITGB4BPgeneisconstitutivelyexpressedinvitro，buthighlymodulatedinvivo.Gene2001;266(1-2):35.13.BasuU，SiK，DengH，MaitraU.Phosphorylationofmammalianeukaryotictranslationinitiationfactor6anditsSaccharomycescerevisiaehomologueTif6p:evidencethatphosphorylationofTif6pregulatesitsnucleocytoplasmicdistributionandisrequiredforyeastcellgrowth.MolCellBiol2003;23(17):6187.14.SiK，ChaudhuriJ，ChevesichJ,MaitraU.MolecularcloningandfunctionalexpressionofahumancDNAencodingtranslationinitiationfactor6.ProcNatlAcadSciUSA1997;94(26):14285.15.BiffoS,SanvitoF,CostaS,etal.Isolationofanovelbeta4integrin陽bindingprotein(p27(BBP))highlyexpressedinepithelialcells.JBiolChem1997;272(48):30314.16.CarotenutoR,DeMarcoN,BiffoS，etal.Phosphorylationofp27(BBP)/eIF6anditsassociationwiththecytoskeletonaredevelopmentallyregulatedinXenopusoogenesis.CellMolLifeSci2005;62(14):1641.17.SanvitoF,PiattiS,VillaA,etal.Thebeta4integrininteractorp27(BBP/eIF6)isanessentialnuclearmatrixproteininvolvedin60Sribosomalsubunitassembly.JCellBiol1999;144(5):823.18.BalboA，BozzaroS.CloningofDictyostdiumelF6(p27BBP)andmappingitsnucle(ol)arlocalizationsubdomains.EurJCellBiol2006;85(9-10):1069.19.SanvitoF,VivoliF，GambiniS,etal.Expressionofahighlyconservedprotein,p27BBP,duringtheprogressionofhumancolorectalcancer.CancerRes2000;60(3):510.20.SiK，MaitraU.TheSaccharomycescerevisiaehomologueofmammaliantranslationinitiationfactor6doesnotfbnctionasatranslationinitiationfactor.MolCellBiol1999;19(2):1416.21.WoodLC，Ashby顧，G腿feldC,FeingoldKR.Cloningofmurinetranslationinitiationfactor6andfunctionalanalysisofthehomologoussequenceYPR016cinSaccharomycescerevisiae.JBiolChem1999;274(17):11653.22.BasuU,SiK，WarnerJR,MaitraU.TheSaccharomycescerevisiaeTIF6geneencodingtranslationinitiationfactor6isrequiredfor60Sribosomalsubunitbiogenesis.MolCellBiol2001;21(5):1453.23.CeciM，GaviraghiC，GorriniC,etal.ReleaseofelF6(p27BBP)fromthe60Ssubunitallows80Sribosomeassembly.Nature2003;426(6966):579.24.GandinV,MiluzioA,BarbieriAM,etal.Eukaryoticinitiationfactor6israte-limitingintranslation,growthandtransformation.Nature2008;455(7213):684,25.ChendrimadaTP,FinnKJ，JiX，etal.MicroRNAsilencingthroughRISCrecruitmentofeIF6.Nature2007;447(7146):823.26.FlavinRJ,SmythPC,FinnSP，etal.AlteredeIF6andDicerexpressionisassociatedwithclinicopathologicalfeaturesinovarianserouscarcinomapatients.ModPathol2008;21(6):676.27.JiY,ShahS,SoanesK,etal.Eukaryoticinitiationfactor6selectivelyregulatesWntsignalingandbeta-cateninproteinsynthesis.Oncogene2008;27(6):755.28.TangJ，NiuJW,XuDH,LiZX,LiQF，ChenJA.Alterationofnuclearmatrix-intermediatefilamentsystemanddifferentialexpressionofnuclearmatrixproteinsduringhumanhepatocarcinomacelldifferentiation,^VorldJGastroenterol2007;13(20):2791.29.RossoP,CortesinaG,SanvitoF，etal.Overexpressionofp27BBPinheadandneckcarcinomasandtheirlymphnodemetastases.HeadNeck2004;26(5):概序列表<110>重庆西南医院〈120〉ITGB4BP及其衍生物用于预防和/或治疗增生性瘢痕及纤维化病变<130>IB091679<160>2<170>PatentInversion3.1〈210〉1<211〉245<212>PRT〈213>人<400>1MetAlaValArgAlaSerPheGluAsnAsnCysGlulieGlyCysPhe151015AlaLysLeuThrAsnThrTyrCysLeuValAlalieGlyGlySerGlu202530AsnPheTyrSerValPheGluGlyGluLeuSerAspThrlieProVal354045ValHisAlaSerlieAlaGlyCysArglielieGlyArgMetCysVal505560GlyAsnArgHisGlyLeuLeuValProAsnAsnThrThrAspGinGlu65707580LeuGinHislieArgAsnSerLeuProAspThrValGinlieArgArg859095ValGluGluArgLeuSerAlaLeuGlyAsnValThrThrCysAsnAsp100105110TyrValAlaLeuValHisProAspLeuAspArgGluThrGluGlulie115120125LeuAlaAspValLeuLysValGluValPheArgGinThrValAlaAsp130135140GinValLeuValGlySerTyrCysValPheSerAsnGinGlyGlyLeu145150155160ValHisProLysThrSerlieGluAspGinAspGluLeuSerSerLeu165170175LeuGinValProLeuValAlaGlyThrValAsnArgGlySerGluVal180185190lieAlaAlaGlyMetValValAsnAspTrpCysAlaPheCysGlyLeu195200205AspThrThrSerThrGluLeuSerValValGluSerValPheLysLeu210215220AsnGluAlaGinProSerThrlieAlaThrSerMetArgAspSerLeu225230235240lieAspSerLeuThr245<210><211><212><213>2738DNA人<400>235atggcggtccgagcttcgttcgagaacaacaacacctactgtctggtagcgatcggaggcgagctctccgataccatccccgtggtgcaccgcatgtgtgtgggg犯caggcacggtctcctgcaacacattcgcaacagcctcccagacctctcagccttgggcaatgtcaccacctgcttggacagggagacag犯ga组tctggcaacagtggccgaccaggtgctagtaggaagcgtgcatcccaagacttcaattg犯gaccagcttgtggcggggactgtg犯ccg鄉cagtgsctggtgtgccttctgtggcctggscacagtcttc犯gctgaatgaagcccagcctagcattgacagcctcacctgatgtgagatcggctgctttgccaagctcacc60tcagagaacttctacagtgtgttcgagggc120gcgtctatcgccggctgccgcatcatcggg180ctggtacccaacaataccaccgaccaggag240acagtgcagattaggcgggtgggLggagcgg300aatgactacgtggccttggtccacccagac360gatgtgctcaaggtggaagtcttcagacag420tactgtgtcttcagcaatcagggagggctg480gatgagctgtcctctcttcttcaagtcccc540gaggtgattgctgctgggatggtggtg组6003cc兆C3C3g3gctgtc3gtggtgg3g兆t660accattgccaccagcatgcgggattccctc720738权利要求1.β4整合素结合蛋白(ITGB4BP)及其衍生物、或表达ITGB4BP及其衍生物的重组基因表达载体用于预防和/或治疗增生性瘢痕或纤维化病变的应用。2.权利要求1的应用，其中所述ITGB4BP衍生物是保留ITGB4BP的结合部位和功能部位的蛋白衍生物，包括保留抑制TGF-pi、MMP9或I型胶原等纤维化相关指标的表达、或抑制成纤维细胞表面标志物a-SMA的表达的能力的蛋白质衍生物。3.权利要求1或2的应用，其中所述增生性瘢痕包括烧伤、烫伤、化学损伤、冷冻伤、切割伤等皮肤损伤。4.权利要求1或2的应用，其中所述纤维化病变包括各种组织器官的病理性纤维化，包括皮肤组织纤维化、肺纤维化、肝脏纤维化、肾脏纤维化等。5.权利要求4的应用，其中所述纤维化病变包括各种由纤维化引起的病理性收縮，包括体表及体内脏器、组织的病理性收縮等。6.权利要求1的应用，其中在正常皮肤成纤维细胞中高表达所述ITGB4BP后，纤维化相关的指标TGF-f31、MMP9和I型胶原的表达量显著降低，抑制纤维化。7.权利要求6的应用，其中在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达所述ITGB4BP后，肌成纤维细胞表面标志物a-SMA表达量减少，抑制增生性瘢痕成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，并且抑制肌成纤维细胞的收縮性。8.用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变的药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包括治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体，和药用赋形剂或载体等。9.权利要求8的药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒还包括治疗有效量的其它瘢痕或纤维化病变抑制剂。10.ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体在制备用于预防和/或治疗增生性瘢痕疾病或纤维化病变的药物组合物或试剂盒中的应用。全文摘要本发明涉及β4整合素结合蛋白(ITGB4BP)及其衍生物，或表达ITGB4BP及其衍生物的基因重组表达载体，在预防和/或治疗增生性瘢痕或纤维化病变中的新应用，其中ITGB4BP的氨基酸序列为SEQIDNO1，并且所述ITGB4BP衍生物是保留ITGB4BP(SEQIDNO1)的结合部位和功能部位的蛋白衍生物。所述应用通过向受试者施用治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体、或本发明的药物组合物或试剂盒而实现。其中所述药物组合物或试剂盒包括治疗有效量的ITGB4BP或其衍生物、或表达ITGB4BP或其衍生物的重组基因表达载体，和药用赋形剂或载体等。优选地，所述受试者是人或动物。文档编号A61K38/17GK101596308SQ200910084029公开日2009年12月9日申请日期2009年5月13日优先权日2009年5月13日发明者军吴,旭彭,罗高兴,谭江琳,贺伟峰申请人:重庆西南医院