2,4-二甲氧基反式茋的新用途的制作方法

专利名称：2,4-二甲氧基反式茋的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及2，4_ 二甲氧基反式芪的新用途，特别是2，4_ 二甲氧基反式芪在降脂 及抗老年痴呆中的用途。
背景技术：
心脑血管疾病是威胁全人类健康与生命的头号杀手。在中国，每年大约有260 万人死于心脑血管疾病，且发病率仍不断上升。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)可 以引起冠心病、脑卒中、心肌梗死等病症。在动脉粥样硬化的发病机理中，高脂血症是一 个主要的独立危险因素。高脂血症是指血液中的总胆固醇(total cholesterol, TC), 低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholestero，LDL-C)及甘油三酯水平 (triglyceride,TG)高于正常范围及/或高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平低下1_2，脂质代谢紊乱尤其是低密度脂蛋白水平增高可引起血粘 稠度增高，血流缓慢，血液中过多的脂质沉积于血管壁，形成粥样斑块，导致动脉粥样硬化 的发生。脑部动脉硬化可引起脑血栓或脑溢血；心脏冠状动脉硬化可引起心慌、胸闷，严重 者可导致心肌梗塞。所以控制高脂血症的发生对于预防心脑血管疾病有着重要意义3_4。阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)是一种最常见的痴呆症，影响到全球 1500万人口生活质量。随着生命周期的延长，到2050年，大约25%的西半球人年龄超过65 周岁，而其中1/3的人口将会发展为老年痴呆5。在中国，人口老龄化问题也日益突出，所以 面临同样的挑战。老年痴呆发病期长，护理费用高，给家庭和社会带来沉重负担。目前临床 用于治疗AD的药物主要为胆碱酯酶抑制剂，此类药物虽然能改善症状，但不能改变AD的发 病进程，因此，开发抗AD药物迫在眉睫。此外，越来越多的证据证实，老年痴呆(AD)与高胆固醇血症有着密切的关系6_8， 流行病学研究也发现，血清中胆固醇的水平升高会增加神经退行性痴呆的发病风险9_1(1。例 如，载脂蛋白E的ε 4表型是AD的重要危险因子，载脂蛋白E ε 4表型与血清中胆固醇高低 密切相关“。另外，早老痴呆患者脑脊液中24s-羟基胆固醇水平明显比同年龄段的正常人 高12_13，24s-羟基胆固醇是一种只可能在脑组织中由胆固醇代谢生成的产物14，提示早老痴 呆患者脑中胆固醇可能比同年龄段的正常人高。2，4-二甲氧基反式芪最早合成于1956年15。现有技术中仅有少数文献报导过2， 4-二甲氧基反式芪类似物的一些活性，例如美国专利申请公开号US2007/0249647 Al公开 通式I的反式芪化合物参与抑制癌症和癌前病变、炎症、中风、局部缺血，且这些化合物都 有抗氧化活性。Heynekamp J. J.等人16报导反式芪(包括天然产物白藜芦醇及其衍生物) 具有抑制肿瘤坏死因子α (TNFa)对NF-κΒ的激活作用。Ali MA.等人17报导羟基芪类 具有杀线虫活性。经查现有技术文献，未见2，4-二甲氧基反式芪关于降脂和抗老年痴呆活性的报 导。

发明内容
本发明的目的是寻找并开发2，4_ 二甲氧基反式芪(以下简称S3)的医药新用途。本发明首次采用在高脂大鼠侧脑室注射A β建立AD模型，验证S3的抗AD作用，复 制了老年痴呆患者同时伴有高胆固醇血症的自然发病环境。本发明人经研究发现，2，4-二 甲氧基反式芪具有降脂和抗老年痴呆的良好前景。本发明第一方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在制备治疗高脂血症的药物中的用 途。本发明第二方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在制备治疗老年痴呆的药物中的用 途。本发明第三方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在制备治疗老年痴呆同时伴有高脂血 症的药物中的用途。本发明第四方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在制备预防由高脂血症导致的老年痴 呆的药物中的用途。进一步，本发明提供含有2，4_ 二甲氧基反式芪以及药学上可接受的载体的药物 组合物在制备治疗高脂血症的药物中的用途、治疗老年痴呆的药物中的用途、在制备治疗 老年痴呆同时伴有高脂血症的药物中的用途和在制备预防由高脂血症导致的老年痴呆的 药物中的用途。本发明药物组合物中的载体包括稀释剂、吸收剂、湿润剂、粘合剂、崩解剂、崩解抑 制齐 、吸收促进剂、润滑剂、分散剂、助溶剂、缓冲剂、表面活化剂。本发明所述的药物或药物组合物是以片剂、注射剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉 剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂的形式使用。本发明所述的药物或药物组合物经静脉、口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、 腹腔、直肠给予。2，4_ 二甲氧基反式芪可依据本发明的方法制备，也可根据现有技术所述的方法制 备。用于此目的时，如果需要，可将2，4-二甲氧基反式芪与一种或多种固体或液体药物赋 形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用药使用的适当的施用形式或剂量形式。2，4_ 二甲氧基反式芪或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可 为肠道或非肠道，如静脉、口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒 剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其它剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混 悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂等。2，4_ 二甲氧基反式芪可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂 及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体 的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露糖、蔗糖、氯化钠、葡萄 糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、 乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、 紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、 褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基
4纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收 促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂 酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。其它载体如聚丙稀酸树脂类、脂质体，水溶性载体如 PEG4000和PEG6000、PVP等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、 肠溶包衣片，或双层片和多层片。例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体 的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷 酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等； 崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分2，4-二甲氧基反式芪与上述的各种 载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将2，4_ 二甲氧基反 式芪制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中应用。例如，将2，4_ 二甲氧基反式芪制成液体制剂，如溶液剂、混悬剂、溶液剂、乳剂，这 种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合 剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二 醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。此外，还可以添 加常规的助溶剂、缓冲剂、PH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。此外，如果还需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味 剂或其它材料。为达到用药目的，增强治疗效果，2，4-二甲氧基反式芪制成的药物或药物组合物 可用任何公知的给药方法给药。2，4_ 二甲氧基反式芪、含有它的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所 要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给 药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发 明中化学成分的使用剂量可以根据2，4_ 二甲氧基反式芪组合物中最后的制剂中所含有的 化合物实际数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的治疗目的。 通常人用每天的剂量不超过lg。


图1 :S3对侧脑室注射Αβ25_35$导神经损伤模型小鼠海马细胞凋亡的影响(图中 箭头所示)。a 对照组；b 模型组；c :S3 (50) ；d :S3 (25)。图2 :S3对高脂+侧脑室注射Αβ25_35神经损伤大鼠跳台实验潜伏期的影响。均数 士标准差(η = 10) ;，<0.01化对照齐<0.05化高脂+侧脑室注射六325_35神经损伤 模型组。图3 :S3对高脂+侧脑室注射Αβ25_35神经损伤大鼠跳台实验错误次数的影响。均 数士标准差(η = 10) ；##Ρ < 0. Olvs对照；*P < 0. 05vs高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损 伤模型组。 图4 :S3对高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型大鼠海马细胞凋亡的影响(图 中褐色团块)。A 对照组；B 高脂组；C 高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型组；D :S350mg/kg；E :S3 25mg/kg；F :S3 12.5mg/kg。图5 :S3对高脂+侧脑室注射々025_35神经损伤模型大鼠海马SOD酶活性的影响。 均数士标准差(η = 6)卞<0.05^对照组，乍<0.05^高脂+侧脑室注射4 025_35神经 损伤模型组。图6 :S3对高脂+侧脑室注射Αβ 25_35神经损伤模型大鼠海马GSH-PX酶活性的影 响。均数士标准差(η = 6) ；##P<0.01vs对照组广P<0.01vs高脂+侧脑室注射Αβ25_35 神经损伤模型组。图7 :S3对高脂+侧脑室注射Αβ 25_35神经损伤模型大鼠海马丙二醛(MDA)含量 的影响。均数士标准差(η = 6) ；##Ρ < 0. Olvs对照组，**Ρ < 0. Olvs高脂+侧脑室注射 Αβ25_35神经损伤模型组。图8 :S3对高脂+侧脑室注射Aβ 25_35神经损伤模型大鼠海马乙酰胆碱转移酶 (ChaT)活性影响。均数士标准差(η = 6) ’##Ρ < 0. Olvs对照组，**Ρ < 0. Olvs高脂+侧 脑室注射A β 25_35神经损伤模型组。图9 :S3对高脂+侧脑室注射々025_35神经损伤模型大鼠海马乙酰胆碱酯酶(AchE) 活性影响。均数士标准差(η = 6) ；-P < 0. Olvs对照组,P < 0. 05vs高脂对照；*P < 0. 05vs 高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型组。图10 :S3对高脂+侧脑室注射々025_35神经损伤模型大鼠海马乙酰胆水平的影响。 均值均数士标准差(η = 6) ；##Ρ < 0. Olvs对照组·，Ρ < 0. 05vs高脂对照；*P < 0. 05vs高 脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型组。图11 :S3对细胞色素C(Cyto-C)释放的影响。分离线粒体和胞浆后，胞浆部分采 用WB检测细胞色素C的释放。均数士标准差(η = 3) ；##Ρ < 0.01, _Ρ < 0. Olvs对照； ■P < 0. Olvs高脂对照，**Ρ < 0. Olvs模型组。图12 :S3对高脂大鼠血清总胆固醇(TC)的影响。均数士标准差；##P < 0. Olvs 对照组；*P < 0. 05vs高脂模型组。图13 :S3对高脂模型大鼠血清中高密度脂蛋白(HDL-C)的影响。均值士标准差； flflP < 0. Olvs对照组广P < 0. Olvs模型组。图14 :S3对高脂模型大鼠血清低密度脂蛋白(LDL-C)的影响。均数士标准差；##P < 0. Olvs对照组；*P < 0. 05vs模型组。图15 :S3对A β 25_35诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响。将细胞与不同浓度的A β 25_35 共同孵育48小时，MTT方法检测细胞活力。< 0. Olvs对照组。图16 S3对A β 25_35损伤SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。细胞加入S3 IOmin后， 再加入 Αβ 25_35 共同孵育 48h。##P < 0. Olvs 对照组；*P < 0. 05vs Αβ 25_35 组。图17 :S3对Αβ25_35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响。细胞在50 μ mo 1/L Αβ25_35 作用下加入S3 48h后。图18 :S3对A β 25_35诱导SH-SY5Y细胞产生活性氧(ROS)的影响。细胞中加入S3， IOmin后，再加入A β 25_35共同孵育48h，经H2DCF-DA探针染色后，通过荧光比色法检测ROS 的产生。##P < 0. Olvs 对照组广P < 0. 01ν8Αβ25_35 组。图19 :S3对A β 25_35诱导SH-SY5Y细胞损伤细胞线粒体膜电位变化。细胞中加入 S3 IOmin后，加入A β 25_35共同孵育48h，JC-1探针染色。
具体实施例方式以下将结合实施例与附图用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发 明的范围和精神实质。实施例12，4-二甲氧基反式芪(以下简称S3)的制备化合物1 (苄化溴，0. Imol)与稍过量的亚磷酸三乙酯(0. 125mol)反应，油浴加热 到120°C，反应至无气体逸出，约需3小时，得化合物2 (浅黄色油状液体)。在IOOml圆底瓶中置上步反应制得的化合物2 (0. 02mol)，将反应瓶置于冰水浴 中，加入无水四氢呋喃，搅拌下加入NaH(0. 02mol)，反应2小时，加入化合物3 (0. 0126mol)， 搅拌2小时后，室温搅拌过夜。将反应液过滤，滤液浓缩至无四氢呋喃蒸出，固体以水甲醇为2 1的溶液做重 结晶，得白色针状结晶，为化合物4，即2，4- 二甲氧基芪(S3)，此步收率为80. 1 %。EI-MS240(M+,100)，197，182，165，153，121，91。1H-WR(CDCl3) 3. 82 (3H, s)，3. 86 (3H，s) ,6. 46 (1H, d, J = 2. 4Hz)，6. 51 (1H，dd, Jl = 2. 4Hz, J2 = 6. 0Hz)，7. 01 (1H, d, J = 16. 2Hz)，7. 21 (1H, t, J = 7. 8Hz)，7. 32 (1H, t, J = 7. 8Hz)，7. 39 (1H, d, J = 16. 2Hz)，7. 51 (3H, m)。实施例2S3对Αβ 25_35脑室注射诱导记忆缺陷小鼠的保护作用(一 )实验方法1.实验动物Balb/c小鼠，雌性，6周龄，购自中国医学科学院动物研究所。2.药物用量及分组分4组对照组、模型组、采用本发明实施例1得到的S3高剂 量组(50mg/kg/day)、S3低剂量组(25mg/kg/day)。每组动物15只。给药方式以0. 5wt% 羧甲基纤维素钠作为溶媒制作S3的药物混悬液，自手术当天开始灌胃给药，0. 2ml/只/天。 对照组和模型组以等量的溶媒灌胃。3. Αβ 25_35脑室注射动物饲养在中国医学科学院基础医学研究所清洁级动物房， 饲料和饮水均经过消毒。所有动物适应行喂养一周，采用戊巴比妥钠3%，0. lml/100g腹腔 注射麻醉小鼠。酒精擦拭小鼠头部皮肤，剪毛。碘酒擦拭消毒，酒精再擦去碘。镊子提起头 部皮肤，沿两耳中线中部剪开口后再向前剪开约1cm，在前卤后2mm中隔左边1.5mm，进针 2. 5mm的部位注射lmg/ml的A β 25_35 5 μ 1，接着缝合皮肤。用棉球蘸酒精，擦去皮肤伤口处
P(OC2Hs):
Λ /-CH2PO(OC2H5)1
7血渍。4.检测指标(1)小鼠空间记忆测定造模后，第5天开始做动物水迷宫实验(water-maze test)，将小鼠头朝池壁放入黑色圆形水池中(直径100cm，高50cm，水深25cm，)，水池中有 一平台(直径5cm)，平台位于水面下lcm。池水用墨水染成黑色，记录动物找到平台的时间， 第一次实验中，如果动物找到平台的时间超过120s，则引导动物到平台，让动物在平台停留 10s。(2)细胞凋亡测定采用免疫组化实验方法检测，试剂盒购置Roche molecular biochemicals，USA0(3)小鼠海马、皮质ChAT、AchE及SOD活性测定购置南京建成生物工程研究所的 乙酰胆碱转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，采用紫外分 光光度计测定。( 二)实验结果1. S3对A β 25_35脑室注射诱导记忆缺陷小鼠空间记忆的影响由表1可见，与对照组比较，模型组在造模后第7天和第8天，小鼠找到平台的时 间明显延长(Ρ<0.01)；与模型组比较，S3 (50)和S3(25)组小鼠在造模后第7天和第8天 找到平台的时间明显缩短，显示S3可以明显改善Αβ25_35脑室注射小鼠的空间学习记忆能 力。表1 S3对侧脑室注射A β 25_35诱导AD模型小鼠学习记忆能力的影响
5th天6th天7th天8th天对照104.6 土 2675.2±30.144.4±31.543.3 土 15.2模型107.6 土 23.672.9 土 33.381.4±37.7##83.4 土 34.4.7##S3 (50mg/kg)105.5 土 15.668.2±27.248.0 士 23.广46.9士21.4"S3 (25mg/kg)108.2 土 23.769.5 土 20.8556.1±25.8*53.4 土 22 广均值士标准差(η = 12)。数据显示小鼠找到水底平台需要的时间(潜伏期)。##Ρ < 0. Olvs 对照，*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs 模型组2. S3对A β 25_35脑室注射诱导神经凋亡的保护作用由图1可以看出，空白对照组无凋亡细胞出现，模型组，海马区有大量凋亡细胞出 现(箭头所指褐色团块)；S3 (50)组海马区无凋亡细胞出现；S3 (25)组海马区有凋亡细胞， 但明显少于模型组。提示S3对々025_35脑室注射诱导神经凋亡的保护作用。3. S3对脑室内注射Αβ 25_35诱导神经损伤模型小鼠海马、皮质SOD活性的影响与对照组比较(表2)，模型组海马和皮质的超氧化物歧化酶(SOD)活性分别下降 20.6% (P < 0.01) ^P 35.4% (P < 0.01), S3 (50)与模型组比较，海马和皮质的SOD活性 分别提高40. 2% (P <0.01)和45.0% (P < 0. 01)。提示S3能改善A β 25_35脑室注射诱导 的SOD活性的降低。表2 S3对海马和皮质SOD酶活性的影响
8SOD 活性(IU/g)组别海马皮质对照组116.7±15.8162.3±23.8模型组92.7士 11.6#105.0 士 20.0##S3 (50)130.0 士 18.4**152.3 士 19.1S3 (25)106.8±15.295.8±24.2均数士 标准差(η = 10) /P < 0. 05，##Ρ < 0. Olvs 对照组；*P < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs
模型组4. S3对脑室内注射Αβ 25_35小鼠海马、皮质ChAT活性的影响与对照组比较(表3)，模型组海马和皮质的乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性分别下降 20. 6% (P < 0. 01)和61. 2% (P < 0. 01) ；S3 (50)与模型组比较，海马和皮质的ChAT活性 分别提高39. 5% (Ρ<0. 05)和55. 3% (P < 0. 05)。提示S3能改善Αβ 25_35脑室注射诱导 的ChAT活性的降低。表3 S3对海马和皮质乙酰胆碱转移酶酶(ChAT)活性的影响
乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性(IU/mg)组别海马皮质对照组1.02 士 0.190.98 士 0,20模型组0.81±0.14#0.38 士 0.13##S3 (50)1.13±0.13"0.59±0.12*S3 (25)0.87 士 0.130.42 士 0.14均数士 标准差(η = 7) /P < 0. 05、##Ρ < 0. Olvs 对照组；*P < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs
模型组5. S3对脑室内注射Αβ 25_35小鼠海马、皮质AchE活性的影响与对照组比较(表4)，模型组海马和皮质的乙酰胆碱酯酶(AchE)活性分别提高 36. 2% (P < 0.01)和 45. 8% (P < 0.01) ；S3 (50), S3 (25)与模型组比较，海马和皮质的 AchE 活性分别下降 59. 0% (P < 0. 01) ,29. 2% (P < 0. 01)和 40. 0% (P < 0. 01) ,28. 6% (P < 0. 05)，提示S3能改善A β 25_35脑室注射诱导的AchE活性的升高。表4 S3对海马和皮质乙酰胆碱酯酶(AchE)酶活性的影响
AchE 活性(IU/g) 组别海马皮质
对照组0.138 士0.0240.048±0.014
模型组0.188±0.037##0.070士 0.017##
9S3 (50)0.077±0.016**0.042±0.009**
S3 (25)0.133士0.026**0.050±0.015*均数士 标准差(η = 7)，flflP < 0. Olvs 对照组；**Ρ < 0. Olvs 模型组实施例3S3对高脂+Αβ 25_35脑室注射诱导记忆缺陷大鼠的保护作用(一 )实验方法1.实验动物wistar大鼠，雌性，180g，购自中国医学科学院动物研究所，许可证 编号SCXK (京)2005-0013。2.药物用量及分组动物分6组，分别为正常对照组，高脂对照组，模型组，采用市 售的 S3 高剂量组(50mg/kg/day)，S3 中剂量组(25mg/kg/day)，S3 低剂量组(12. 5mg/kg/ day)。每组动物10只。3. Αβ 25_35脑室注射动物饲养在中国医学科学院基础医学研究所清洁级动物房， 饲料和饮水均经过消毒。所有动物适应行喂养普通饲料一周后，除正常对照组外，其他所有 组给予高脂饲料喂养两个月。随后脑室注射Aβ 25_35 戊巴比妥钠1%，0. 5ml/100g腹腔注射 麻醉大鼠。脑室定位仪固定大鼠，酒精擦拭大鼠头部皮肤，剪毛。碘酒擦拭消毒，酒精再擦 去碘。手术刀切开头部皮肤，在前卤后Imm中隔左边2mm的部位用牙科钻在颅骨钻一小孔， 用微量注射器进针3.8!11111注射11^/1111的六025_35 10μ1，接着缝合皮肤。用棉球蘸酒精，擦 去皮肤伤口处血渍。腹腔注射8万IU的青霉素。4.给药方式以0. 5%羧甲基纤维素钠作为溶媒制作S3的药物混悬液，自手术当 天开始灌胃给药，2ml/只/天。对照组和模型组以等量的溶媒灌胃。5.检测指标(1)S3对模型大鼠空间记忆的影响动物造模后，第3天开始做动物水迷宫实 验(water-maze test)，将大鼠头朝池壁放入黑色圆形水池中(直径120cm，高60cm，水深 30cm，)，水池中有一平台(直径8cm)，平台位于水面下2cm。池水用墨水染成黑色，记录动 物找到平台的时间，第一次实验中，如果动物找到平台的时间超过60S，则引导动物到平台， 让动物在平台停留10s。(2)跳台实验跳台装置为一 25CmX20CmX75Cm的被动回避反应箱，箱底铺直径 为Imm铜栅，通36V交流电，铜栅的一角固定一 8cmX 8cmX 5cm大小的塑料泡沫块作为动物 回避电击反应的安全区。先将大鼠放入箱中自由活动3min，熟悉环境，然后接通铜栅电源， 大鼠受到电击，其正常反应是跳回泡沫块以躲避伤害性刺激，多数动物可能再次或多次跳 至铜栅上，受到电击(双足同时接触铜栅)又跳回安全区，如此训练5min。24h后重复上述 试验，记录每只大鼠第一次跳下安全区的时间(潜伏期)和错误次数，作为记忆测试成绩。(3)细胞凋亡测定采用免疫组化实验方法检测，试剂盒购置Roche molecular biochemicals, USA。(4)大鼠海马ChAT、AchE、GSH-PX、MDA及SOD活性测定购置南京建成生物工程研究 所的乙酰胆碱转移酶(ChAT)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、GSH-PX 试剂盒、MDA试剂盒，采用紫外分光光度计测定。(5)大鼠海马Ach水平的测定大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒[ELISA Kit for Rat]。试剂购自ADL公司。
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(6)细胞色素C的释放采用West Blot方法检测。抗体购自R&D公司。(二)实验结果1. S3对高脂+侧脑室注射Aβ 25_35神经损伤模型大鼠空间记忆的影响与对照组 比较(表5)，高脂对照组在第7天找到平台的时间明显延长(P <0.01)；高脂+Αβ25_35 造模后第6天和第7天，找到平台的时间明显延长(P <0.01)；与高脂+Αβ 25_35组比较， S3 (50)和S3(25)组小鼠在造模后第6天和第7天找到平台的时间明显缩短。显示S3可以 明显改善Αβ 25_35脑室注射小鼠的空间学习记忆能力。表5 S3对高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型大鼠学习记忆的影响
5th天6th天7th天对照组38.22士23.5839.99±16.5410.61±6.32高脂对照组57.1 土 9.1744.72±17.0940.49土 19.78#高脂+Αβ25_3549.26±15.9856.61±6.9#52.09±6.9##S3 (50)39.2 土 20.1933.8 士 17.5"34.75士 19.07*S3 (25)52.78±11.9935.34±23.31*37.10±21.16S3 (12.5)40.2 土 25.6044.93土 21.5738.80±18.49
均数士标准差(η= 10).表中数据显示大鼠找到水底平台需要的时间(潜伏期) flP < 0. 05、flflP < 0. Olvs 对照组；*Ρ < 0. 05、**Ρ < 0. Olvs 高月旨 +A β 25_35
2. S3对高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型大鼠记忆的影响 从图2和图3可以看出，与空白对照组比较，模型组大鼠首次跳下平台需要的时间 (潜伏期)明显缩短(P < 0. 05)，错误次数明显增加(P < 0. 05)。高脂组与正常对照组比 较潜伏期与错误次数无差异。与模型组比较，S3 (50)组潜伏期明显延长，错误次数明显减 少，提示S3可改善大鼠记忆。3. S3对高脂+侧脑室注射Αβ 25_35神经损伤模型大鼠海马组织细胞凋亡的影响从图4可以看出，空白对照组海马区域无凋亡细胞出现，高脂组有海马区域零星 的凋亡细胞(褐色团块)；而高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型组海马区有大量凋亡 细胞出现(褐色团块)；S3 (25)和S3 (50)组海马区仍有凋亡细胞；S3 (50)组海马区则仅有 零星凋亡细胞，明显少于高脂+侧脑室注射Αβ 25_35神经损伤模型组。4. S3对模型大鼠皮质、海马SOD活性的影响从图5可以看出，高血脂对大鼠脑海马SOD活性并无影响，而高脂+脑室注射 Αβ 25_35则能明显降低海马SOD活性(与对照组比，P < 0. 05) ；S3(50/mg/kg)能明显升高 SOD 的活性(P < 0. 05，P < 0. 05)。5. S3对A β 25-35脑室注射诱大鼠海马GSH-PX活性的影响从图6可以看出，高脂大鼠海马GSH-PX活性与正常组比较无显著性差异；脑室注 射Αβ25_35后，大鼠海马GSH-PX活性与正常组比较明显降低(P <0.01)。S3(50/mg/kg)则 能明显升高GSH-PX的活性(P < 0. 01)。6. S3对A β 25_35脑室注射诱大鼠海马MDA水平的影响从图7可以看出，高脂大鼠海马中MDA含量比正常组稍有升高，但无统计学意义； 模型组大鼠海马MDA含量比正常组明显升高(P < 0. 05)。给予S3能剂量依赖性的降低海
11马中MDA含量，但只有在S3高剂量时才有显著性差异(P < 0. 01)。7. S3对A β 25_35脑室注射诱大鼠海马ChAT活性的影响由图8可以看出，高脂大鼠海马中ChAT活性比正常组升高，但无统计学意义。模 型组大鼠海马中ChAT活性与正常组比较明显降低；给予高剂量的S3能升高ChAT活性，与 模型组比价有显著性差异(P < 0. 01)。8. S3对高脂+侧脑室注射ΑΒ25-35神经损伤模型海马AchE活性的影响由图9可以看出，高脂组和高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型组大鼠海马 中AchE活性比正常组升高(P < 0. 05，P < 0. 01)。高剂量S3能明显降低AchE活性(P < 0. 05)。9. S3对高脂+侧脑室注射ΑΒ25-35神经损伤模型海马Ach水平的影响由图10可以看出，高脂对照组大鼠海马中Ach水平比对照组稍有降低，但无统计 学意义；模型组大鼠海马Ach水平比正常对照组和高脂对照组明显降低(均P < 0. 01)。给 予高剂量的S3和中剂量的S3后，海马中Ach水平较模型组明显升高(P < 0. 01，P < 0. 05)。10. S3对高脂+侧脑室注射A β 25_35神经损伤模型大鼠海马细胞色素C(Cyto-C)释 放的影响由图11可以看出，与对照组相比，高脂组与模型组脑组织胞浆中cyto-c水平升高 (均 P < 0. 01) ；S3 (50)和 S3 (25)能显著降低 cyto-c 的释放(均 P < 0. 01)。实施例4、S3对高脂模型大鼠血脂的影响(一)实验方法1.动物来源及饲料雌性Wistar大鼠(二级)购自中国医学科学院实验动物研究 所繁育场，动物合格证号SCXK (京)2005-001372只，体重180g。饲养于本所清洁动物房，动 物房编号SYXK (京)2005-0036。动物适应性喂养一周后开始实验，实验期间动物自由进食 和饮水，所有饲料和饮用水均进过消毒处理。大鼠高脂饲料配方如下10%猪油，1.5%的胆 固醇，0. 2%的胆酸盐，5%的蛋黄粉，0. 2%的甲基硫氧嘧啶，83. 的基础饲料。2.药物辛伐他汀片由默沙东公司生产。3.动物分组将动物随机分成6组①正常组；②高脂模型组；③辛伐他汀组；④本 发明实施例1得到的S3低剂量组；⑤S3中剂量组；⑥S3高剂量组。(二)实验结果1. S3对高脂大鼠TC的影响由图12可以看出，与对照组比较，高脂模型组大鼠TC水平提高508% (P <0.01)； 与模型组比较，辛伐他汀组TC水平降低30. 0% (P < 0. 05)，S3 (50)、S3 (25)组TC水平分 别降低30. 0%和27. 9%。2. S3对高脂模型大鼠HDL-C的影响由图13可以看出，与对照组比较，模型组HDL-C的水平升高79. 94% (P < 0. 01)。 与模型组比较，S3 (50)组升高26. 9% (P < 0. 01)。辛伐他汀与S3 (25)及S3 (12. 5)分别 与模型组比较无显著性差异。3. S3对高脂模型大鼠LDL-C的影响由图14可以看出，与对照组比较，模型组LDL-C的水平升高24. 2倍(P < 0. 01)。
12与模型组比较，辛伐他汀组和S3 (50)组LDL-C的水平降低20. 72% (P < 0. 05)和20. 47% (P < 0. 05)。S3 (25)组S3 (12. 5)与模型组比较LDL-C的水平无显著性差异。实施例5S3对A β 25_35诱导SH-SY5Y细胞的保护作用(一)实验方法1.药物来源S3由本发明实施例1得到。2.试剂 RPMI 1640粉末GIBCO公司产品；青霉素钠，80万U/瓶；硫酸链霉素， 100万U/瓶，华北制药集团有限责任公司产品；胎牛血清(FBS) ,Hyclone公司产品；MTT粉 末Amresco公司产品；Αβ 25_35，sigma公司产品；DCFH-DA探针，sigma公司产品。3.仪器细胞培养箱SANY0 MCO175, Japan 超净工作台苏州艾可林净化设备 有限公司；SpectraMax M5酶标仪。4. Αβ 25_35损伤SH-SY5Y细胞模型的建立SH-SY5Y细胞购自中国医学科学院药物 研究所，以低糖RPM1640培养基(含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100 U/ml)，于 37°C,5% CO2恒温培养箱中培养，采用含有EDTA的胰蛋白酶消化传代。SH-SY5Y细胞采用 含有EDTA的胰蛋白酶消化传代，以0. 5X IO5个/孔接种于96孔板。培养12h后，加入终 浓度为 12. 5ymol/L、25ymol/L、50ymol/L、100ymol/L 的 Αβ25_35，培养 48h 后，进行细胞 活力测定。A β 25_35处理结束后，弃去原培养液，用PBS洗两次，每孔加入100 μ 1 MTT液(采用 RPM1640培养基配制，MTT终浓度为0. 5mg/ml)，于37°C，5% CO2继续培养4小时。吸弃上 清，每孔加入100 μ 1的DMS0，充分振荡10分钟，观察每孔中甲贜颗粒均已溶解后于570nm 处测定OD值。5. S3对A β 25_35诱导细胞损伤的保护S3用DMSO溶解，然后用无血清RPM1640培 养基倍比稀释至所需浓度，-20°C保存，DMSO使用最高终浓度< 0. 1%。细胞共分为五个 组另I」，分别为正常组、々325_35组、雌二醇(10_7M)组，S3 (HD)组(10_6M)、S3 (MD)组(10_7M)， S3 (LD)组(I(T8M)和 S3 (I(T7M)+ICI (I(T6M)组。细胞采用含有EDTA的胰蛋白酶消化传代，以0. 5X IO5个/孔接种于96孔板。12h 后，加入 S3 (终浓度分另Ij lXl(T6mol/L、lXl(T7mol/L、lXl(r8mol/L)，雌二醇 ICT6M 及 ICI 10_6M，随后加入终浓度为50ymol/L的A β 25_35 (Α β 25_35的使用终浓度根据损伤模型结果来 确定)，培养24小时后进行细胞活力检测。不加A β 25_35的作为正常对照组，只加A β 25_35为 A β 25_35组。正常组和A β 25_35组加入与S3药液等体积的无血清RM1640培养基。弃去原培养液，用PBS洗两次，每孔加入100 μ 1 MTT液(采用无血清RM1640培 养基配制，MTT终浓度为0. 5mg/ml)，于37°C，5% CO2继续培养4小时，吸弃上清，每孔加入 100 μ 1的DMS0，充分振荡10分钟，观察每孔中甲贜颗粒均已溶解后于570nm处测定OD值。6.细胞凋亡(Hoechst 33342染色)A β 25_35作用48小时后，吸尽培养液，用无 酚红的培养基洗涤两次，加入50μ 1的Hoechst 33342染色液(10 μ g/ml)，37°C染色20分 钟。用无酚红的培养基洗涤两次，加入ΙΟΟμΙ无酚红培养基，在荧光显微镜下检测。激发 波长在350nm左右，发射波长在460nm左右。7. S3对Αβ 25_35诱导细胞ROS水平的影响吸出细胞上层培养液，加入100 μ 1的 DCFH-DA(5 μ Μ)探针，37°C孵育45min，吸出上清，用PBS(Ph = 7. 3)洗涤3次，加入100 μ 1
13PBS (Ph = 7. 3)上机检测，激发波长为480nm，发射波长为525nm。8. S3对细胞线粒体膜电位的影响细胞线粒体膜电位的测定吸取mitolight Apoptosis Detection Kit (LOT :PS01450307 Exp 2009/06)染色液 2 μ 1 加入到 0. 9ml 的 双蒸水中，加入0. Iml的IOX buffer，加入Iml的无酚红DMEM高糖培养基，超声助溶。吸出 细胞上清，加入配好的染色液，每孔0. 25ml。37°C孵育20min，吸出上清液，用无酚红的DMEM 培养基洗细胞两次，上荧光显微镜观察(激发光为蓝光和绿光)。(二)实验结果1. Αβ 25_35诱导细胞损伤模型的建立由图15可以看出，细胞活力与△日25_35成浓度依赖性的降低。下面实验中，Αβ25_35 浓度均取50(ymol/L)。2. S3对A β 25_35诱导细胞损伤的保护由图16可以看出，Αβ25_35的细胞活率比对照组降低27. (P < 0. 01)，S3在 10_6Μ浓度时，与模型组比较细胞活率提高30. 8% (P < 0. 05)。3. S3对Αβ 25_35诱导的细胞凋亡的影响由图17可以看出，Hoechst 33342染色实验结果表明，对照组细胞核多数为大小 较一致、染色均勻的圆形核，偶见固缩浓染核；Αβ25_35处理组细胞数减少，出现凋亡细胞核， 染色质发生固缩，细胞核致密浓染，形状不规则，为颗粒、小块状。给予S3后能显著减少细 胞凋亡。4. S3对A β 25_35诱导损伤细胞ROS的影响由图18可以看出，与对照组比较，模型组(Αβ25_35)的ROS水平显著提高(增 加了 124.2%，P <0.01)；与模型组比较，S3能剂量依赖的降低细胞ROS水平，分别降低 50. 98%,40. 22%,24. 95% (P < 0. 01)。5. S3对A β 25_35诱导损伤细胞线粒体的影响由图19可以看出，与正常组比较，模型组细胞突触变短，细胞变圆，细胞膜电位降 低(染色变绿)。S3 (50)，S3 (25)组与模型组比较，细胞膜电位明显升高(显示橙色细胞变 多)。实施例6S3对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响1.实验方法药品与试剂S3由本发明实施例1得到；MTT购自Sigma ；DMEM高糖培养基和血清 购自Hyclone ；其他试剂均为国产分析纯。MCF-7细胞购自本所细胞中心。实验方法MCF-7细胞以0.5X IO5密度接种于96孔板中，每孔180 μ L细胞液培 养24小时后，每孔分别加入各浓度的药物20μ L，使S3终浓度分别为10_4、10_5、10_6、10_7、 10_8mOl/L，雌二醇的终浓度为lO—W/L。48小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20ul, 37°C，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150ul 二甲基亚砜 DMSO (分析纯)，振荡lOmin，使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测 定各孔光吸收(OD)值，记录结果。2.实验结果由表6可见，S3能抑制MCF-7细胞的增殖作用，在10_4、10_5、10_6、liTmol/L浓度时
14与正常组比较有显著性差异，分别抑制细胞增殖达到46. 3 %，11 %，9. 4 %，9. 4 %。表6 S3对MCF-7细胞增殖作用
组别浓度(mol/L)OD值对照组0.529士 0.051雌二醇组10"0.534士0.04710"7+ICI0.526士 0.048ICIIO"60.458士0.076*10·40.284士 0.041*IO"50.471±0.093*IO"60.479±0.061*ΙΟ·70.479士 0.075S3IO"80.498士 0.061
10'7+ICI0.547士 0.036MCF-7与S3共同孵育48h。MTT方法检细胞增殖情况，*P < 0. 05vs对照组结论S3结构上类似于植物雌激素，本领域技术人员公知体内雌激素高容易诱发 乳腺癌，而本发明实验结果显示S3能抑制MCF-7细胞的增殖作用，克服了雌激素的副作用。实施例7小鼠单次给药急性毒性实验实验动物为昆明小鼠，雌雄各半。体重18_20g。S3由本发明实施例1得到。实验 分组分3组，每组5只小鼠，5g/kg组，10g/kg组，15g/kg组。动物灌胃量为0. 2ml/只。实验方法小鼠按5g/kg给药，5只，观察2天，如果无死亡；按10g/kg给药，5只； 观察2天，如无死亡；按15g/kg给药，5只，观察2天。实验结果(1)小鼠按5g/kg给药，观察14天，无死亡。(2)小鼠按10g/kg给药，观察14天，无死亡。结论S3安全性较高。参考文献1. “中国胆固醇教育计划(CCEP) ”暨卫生部“十年百项”冠心病血脂干预推广项 目年度工作总结会议简介.中国临床医生，2005 ;33 (2) 27.2.叶平.积极降脂，有效防治冠心病.老年医学与保健，2005; 11(1) 11 13.3. Prasad K，Kalra J. Oxygen free radicals and hypercholesterolemic atherosclerosis :effect of vitamin E.Am Heart J,1993 ；125(4) :958 973·4.Deepa PR， Varalakshmi P.Atheroprotective effect of exogenous heparin-derivative treatment on the aortic disturbances and lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic diet fed rats. Clin Chim Acta,2005 ；355 (1-2) 119 130.5. Luigi Puglielli，Rudolph E，Tanzi, et al. Alzheimer' s disease :the
15choesterol connection. Nature Neuroscience，2003，6(4)，345-3516.Koudinov AR, Berezov TT，Koudinova NV. The levels of soluble amyloid beta in different high density lipoprotein subfrations distinguish Alzheimer's and normal aging cerebrospinal fluid-implication for brain cholesterol pathology ？ Neurosci Lett，，2001，314，115—1187. Wolozin B.Afluid conection :cholesterol and A β . Proc Natl Acad Sci USA，2001，98，5371-53738.Paza F，D’ Introno A,Colacicco AM，et al. Lipid metabolism in cognitive decline and dementia，Brain Res Rev，2006，51，275-292.9.Jarvik GP, Austin MA, Fabsitz RR, et al.Genetic influences on age-related change in total cholesterol， low density lipoprotein—cholestero， and triglyceride levels :longitudinal apolipoprotein E genotype effects. Genet Epidemiol，1994，11，375-384.10.Tan ZS,Seshadri S，Beiser A,et al.Plasma total cholesterol level as a risk factor for Alzheimer's disease :the Frmingham study. Arch Intern Med,2003, 163，1053-1057.11. Gomez-Isla T，West HL, Rebedk GW, et al. Cinical and pathological correlates of apolipoprotein E 4 in Alzheimer's disease， Ann Neurol，1996，39， 62-70.12. Papassotiropoulos AiLutjohann DiBagli M et al. 24Shydroxycholesterol in cerebrospinal fluid is elevated in early stages of dementia. J Psychiatr Res， 2002，36 27-3213. Schonknecht P，Lutjohann D，Pantel J et al. Cerebrospinal fIuid24S-hydroxycholesterol is increased in patients with Alzheimer’ s disease compared to healthy controls. Neurosci Lett，2002，324 :83_814. Lutjohann D，Breuer 0，Ahlborg G，et al. Cholesterol homeostasis in human brain :evidence for an age-dependent fluxof 24S-hydroxycholesterol from the brain into the circulation. Proc Nat Acad Sci USA,1996,93 9799-980415. Molho D，Coillard J. (1956)New methods of preparation of some stilbene derivatives. Bulletin de la Societe Chimique de France, p78-p93.16. Heynekamp，J J，Weber W M，Hunsaker LA, et al. Substituted trans-stilbenes,including analogues of the natural product resveratrol, inhibit the human tumor necrosis factor alpha-induced activation of transcription factor nuclear factor kappaB. Journal of Medicinal Chemistry,2006，49 (24) 7182-7189.17.Ali MA, Kondo. , TsudaY. Studies on crude drugs effective on visceral larva migrans.XV.Synthesis and nematocidal activity of hydroxystilbenes. Chemical &Pharmaceutical Bulletin，1992，40 (5) 1130-6.
1权利要求
2，4 二甲氧基反式芪在制备治疗高脂血症的药物中的用途。
2.2，4-二甲氧基反式芪在制备治疗老年痴呆的药物中的用途。
3.2，4_ 二甲氧基反式芪在制备治疗老年痴呆同时伴有高脂血症的药物中的用途。
4.2，4_ 二甲氧基反式芪在制备预防由高脂血症导致的老年痴呆的药物中的用途。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其中2，4-二甲氧基反式芪进一步与药学上 可接受的载体组合。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述的载体包括稀释剂、吸收剂、湿润剂、粘合剂、 崩解剂、崩解抑制剂、吸收促进剂、润滑齐 、分散剂、助溶齐 、缓冲齐 、表面活化剂。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其中所述的药物是以片剂、注射剂、胶囊、 滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂的形式使用。
8.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其中所述的药物经静脉、口服、肌肉、皮下、 鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹腔、直肠给予。
全文摘要
本发明涉及2，4-二甲氧基反式芪的新用途，特别是2，4-二甲氧基反式芪在降脂及抗老年痴呆中的用途。
文档编号A61P3/06GK101919830SQ20091008598
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月10日 优先权日2009年6月10日
发明者孙兰, 斯建勇, 李展, 阮灿军, 陈迪华, 骆庆峰 申请人:中国医学科学院基础医学研究所;中国医学科学院药用植物研究所