专利名称：小叶莲提取物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小叶莲提取物，以及该提取物及其中的有效成分在制备治疗乳腺癌药物 中的应用。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7~10%， 严重地威胁着女性的健康和生命。我国近年来乳腺癌发病率正以每年3%的速度递增，成为城 市中死亡率增长最快的癌症，发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。中药预防和治疗乳腺癌具有 独特的疗效，被越来越多地用于乳腺癌围手术期、术后抗复发转移、晚期乳腺癌的治疗、对 放化疗增效减毒、逆转肿瘤细胞多药耐药、延长患者生存期和提高生活质量等方面。
小叶莲(Fructus Podophylli)为常用藏药，中国药典2005年版收载其来源为小檗科植物 桃儿七Potfop/^Z/wm/^jca"^ww Royle的干燥成熟果实。具有活血调经功能，常用于治疗多种 妇科疾病。但是目前关于小叶莲的研究却少见报道。
化学研究表明，小叶莲的主要成分为鬼臼毒素类木脂素和黄酮类成分。其中，前者具有 较强的抗肿瘤和抗病毒等活性。
尚明英(尚明英，徐珞珊，蔡少青等.鬼臼类中药及其木脂素类成分的药效学研究.中草 药.2002;31(08):722 724.)通过体内实验发现小叶莲乙醇提取物对小鼠移植性肝癌(HepA) 和艾氏腹水癌(EAC)具有抑制作用，并证明根和根茎提取物以及小叶莲提取物的活性均明 显高于单体化合物(鬼臼毒素和去氧鬼臼毒素)。宗玉英(宗玉英.110种藏药抗肿瘤体外筛 选实验研究.药学实践杂志.2000;18(05):290 291.)利用110种藏药乙醇提取物对体外培养的 5种人体肿瘤细胞乳腺癌(BC1)、肺癌(Lul)、直肠癌(Co12)、 口腔上皮癌(KB)、前 列腺癌(LNCaP)及一种大鼠神经胶质肿瘤细胞(ASK)进行筛选实验，结果显示小叶莲乙 醇提取物对人口腔上皮癌、前列腺癌及大鼠神经胶质细胞具有抑制作用。
以小叶莲为主药的中成药主要包括十一味能消丸、二十五味鬼臼丸和红花如意丸等，"十 一味能消丸"是中国药典2005版收载中成药(藏族验方)，功能化瘀行血，通经催产。用于经 闭，月经不调，难产，胎盘不下，产后瘀血腹痛。"二十五味鬼臼丸"是传统的藏医古验方， 是藏医治疗各种妇科疾病的首选药物和经典良方，用于经期疼痛、月经不调、子宫肌瘤、卵 巢囊肿、子宫内膜炎、盆腔炎、附件炎、阴道炎等，并可补血养颜。
综上所述，传统藏药小叶莲能够治疗多种妇科病，具有抗肿瘤作用，且毒性较小，具有很好的研究前景。
发明内容
本发明的目的在于提出一种小叶莲提取物，以及该提取物及其中的有效成分在制备治疗 乳腺癌药物中的应用。
本发明提出的小叶莲提取物的制备方法如下将小叶莲干燥粉碎，以80% 95%乙醇回 流提取2 4次，每次0.5 2小时，回收乙醇，浓縮至60 8(TC时相对密度为1.05 1.30的浸 膏，即为小叶莲提取物。
从小叶莲中分离有效成分的步骤如下将小叶莲提取物浸膏均匀分散至水中，分别用石
油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，回收溶剂得到不同极性的萃取物；乙酸乙酯萃取部分 经反复硅胶柱色谱(石油醚-丙酮或氯仿-甲醇洗脱)分别得到含有鬼臼毒素类木脂素和含有 黄酮类成分的流分。含有鬼臼毒素类木脂素的流分经过C-18半制备液相(甲醇-水)进一步 纯化，得到鬼臼毒素(podophyllotoxin)、去氧鬼臼毒素(desoxypodophyllotoxin)禾卩4'-去甲 去氧鬼臼毒素(4'-demethyldesoxypodophyllotoxin);含有黄酮类成分的流分以乙酸乙酯为溶 剂反复重结晶或通过Sephadex LH-20纯化、氯仿-甲醇洗脱，得到8-异戊烯基山柰酚 (8-prenylkaempfero1)和一个新化合物8，2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚(8,2'-diprenylquercetin 3-methyl ether )<=
鬼臼毒素为无色针晶，该化合物的光谱数据与文献(廖矛川，王有为，肖培根等.西藏八 角莲的化学成分研究.武汉植物学研究.2002;20(1):71 74.)报道一致，故确定其为鬼臼毒素。
去氧鬼臼毒素为白色粉末，该化合物的光谱数据与文献(廖矛川，王有为，肖培根等.西 藏八角莲的化学成分研究.武汉植物学研究.2002;20(1):71 74.)报道一致，故确定其为去氧 鬼臼毒素。
4'-去甲去氧鬼臼毒素为白色粉末，该化合物的光谱数据与文献(尚明英，李萍，李军等. 藏药小叶莲的化学成分研究.中草药.2000;31(08):569 571.)报道一致，故确定其为4'-去甲去
氧鬼臼毒素。
8-异戊烯基山柰酚为黄色针晶，该化合物的光谱数据与文献(ShenCC, Chang YS，HoLK. Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids. 1993;34(3):843 845.)报道一致， 故确定其为8-异戊烯基山柰酚。
8,2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚为黄色粉末，盐酸镁粉反应呈阳性。HR-ESI-MS: m/z 453.19118 [M+H]+，给出分子式C26H2807。 ^-NMR、 13C-NMR、 HSQC和HMBC数据见表1。 该化合物为一新化合物，命名 为8,2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚。表l8，2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚的核磁数据Position'H-画R (50函Hz， methan0l-i/4)"C-NMR (125MHz， methanol-^)HSQC (13C-NMR,ppm)HMBC (!3C-NMR,卯m)
2-161.8
3-140.3
4-180.4
5-160.7
66.26(1H，s)99.399.3106.2,107.9，160.7,163.1
-163.1
8-107.9
9-156.2
10-106.2
r-123,2
2,-129.4
3,-144.7
4,-148.3
5,6.75(1H, d, 8.5)113.2113.2123.2,144.7,148.3
6,6.78(1H，d, 8.5)122.5122.5129.4,148.3,161.8
r'3.32(2H,d, 7.0)22.422.4107.9,123.3,132.3,156.2,163.1
2"5.08(1H，m)123.3123.3107.9
3"-132.3
4"1.30(3H，s)17.717.7124.1,132.1
5"L57(3H,d, 1.0)25.925.9123.3,132.3
r"3.42(2H,d， 7.0)26.626.6123.2，124.1，129.4,132.1，144.7
2'〃5.01(1H,m)124.1124.1129.4
^ ,〃-132.1
4〃，1.48(3H,s)17.717.7123.3,132.3
1.42(3H,d， 1.5)25.725.7124.1,132.1
-OCH33.56(3H,s)60,960.9140.3
6本发明所述的化合物结构式如下
化合物
鬼臼毒素
去氧鬼臼毒素
Ri
-OH
-H
4'-去甲去氧鬼臼毒素-H
R2 -Me -Me -H
8-异戊烯基山柰酚
OH O
8,2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚
小叶莲提取物对小鼠移植性乳腺癌的抑制作用实验表明，小叶莲提取物对小鼠移植性乳 腺癌有明显的抑制作用。
小叶莲提取物和各化合物对人乳腺癌细胞的抑制作用实验表明，小叶莲提取物和各化合 物均具有抑制乳腺癌细胞的作用，而鬼臼毒素类木脂素和异戊烯基黄酮类成分配伍使用具有
协同作用，能够显著提高其抑制乳腺癌细胞的效果。
因此，本发明提出含有所述鬼臼毒素类木脂素中的1-3个以及异戊烯基黄酮中的1-2个 的药物组合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。优选该药物组合物中鬼臼毒素类木脂素和异
戊烯基黄酮的总重量比为1: 1 1: 6。例如其选择可以是去氧鬼臼毒素和8-异戊烯基山柰酚，其重量比为l:l;或4'-去甲去氧鬼臼毒素和8-异戊烯基山柰酚，其重量比为1:4;或鬼臼 毒素、去氧鬼臼毒素、4'-去甲去氧鬼臼毒素、8-异戊烯基山柰酚和8，2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚，其重量比为2:4:1:4:32。
具体实施例方式
下面通过具体实施例，对本发明做出进一步说明。
实施例1
干燥小叶莲药材，粉碎后约18kg，以8倍量95%乙醇回流提取2次，提取时间分别为2 小时和1小时，回收乙醇，浓縮至7(TC时相对密度为1.10的浸膏约5.2kg，即为小叶莲提取 物。
实施例2
干燥小叶莲药材，粉碎后以6倍量80%乙醇回流提取4次，提取时间为0.5，回收乙醇， 浓縮至60'C时相对密度为1.05的浸膏，即为小叶莲提取物。
实施例3
将实施例1中所得提取物取约4.8kg，加IOL蒸馏水充分搅拌至完全悬浮后，依次用石油 醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇等体积萃取5次。萃取液减压回收溶剂，得各萃取部位。取乙 酸乙酯部分274g，经硅胶柱(100-200目)色谱进行分离，氯仿-甲醇(10: 0~0: 10)梯度 洗脱，根据TLC检测结果，在氯仿甲醇为25: 1 15: 1极性部位含有鬼臼毒素类木脂素
成分。该部位浓縮至干后继续进行硅胶柱色谱分离，以体积比为10: 1 1: 5的石油醚丙
酮梯度洗脱，通过TLC检测在2: l极性部位含有去氧鬼臼毒素和4'-去甲去氧鬼臼毒素，在 1: l极性部位含有鬼臼毒素。分别经过C-18半制备液相分离纯化，得到鬼臼毒素15mg，去 氧鬼臼毒素32mg， 4'-去甲去氧鬼臼毒素13mg。在氯仿甲醇为40: 1 30: 1极性部位含有 8,2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚和8-异戊烯基山柰酚，通过Sephadex LH-20纯化、氯仿-甲醇(6: 4)洗脱，得到8，2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚60mg，经过乙酸乙酯反复重结晶得到8-异戊烯 基山柰酚100mg。
实施例4
在正常喂养6天后，将共21只移植人乳腺癌细胞MCF-7的裸小鼠随机分为3组阴性
8对照组(生理盐水)、给药组(实施例1小叶莲提取物水溶液)和阳性对照组(环磷酰胺水溶 液)，每组7只。接种后第二天给药，持续21天。其中生理盐水组灌胃给药，500mg/kg，每 天给药一次。小叶莲组灌胃给药，500mg/kg，每天给药一次。环磷酰胺组腹腔注射，20mg/kg， 隔天给药一次。
结果发现，如表2所示，小叶莲组和环磷酰胺组与阴性对照组的平均瘤重相比，均具有 显著性差异，提示肿瘤生长受抑。其瘤重抑制率分别为48%和46%。小叶莲组比环磷酰胺组 的抑瘤率稍高，提示小叶莲提取物对小鼠移植性乳腺癌具有较强的抑瘤作用。 表2小叶莲提取物对MCF-7移植性乳腺癌裸鼠的瘤重抑制率
体重(g)
组别 n_瘤重(g) 抑瘤率
给药前 给药后 增重
NS组 7 18.36±0.48 21.29±0.86 2.93±1.13~~0.61±0.18 ^
小叶莲组7 18.07±1.13 21.57±1.34 3.50±0.76 0.32±0.14** 48%
CTX组7 18.57±1.37 20.93±1.54 2.36±1.68 0.33±0.08** 46%
与模型组比较，**P<0.01 实施例5
采用酸性磷酸酶法检测实施例1小叶莲提取物和实施例3各萃取部分对人乳腺癌细胞的 抑制作用。
人乳腺癌MDA-231细胞株和人乳腺癌MCF-7细胞株均用含体积分数为10%新生牛血清、 100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养基培养，37°C， 95%湿度，5%<:02孵箱条 件；常规2.5g/L胰蛋白酶消化传代。
取对数生长期细胞消化后，制成细胞悬液按1.5xl0"孔的密度接种于96孔培养板，培养 24h细胞完全贴壁之后，实验组分别加入不同浓度的小叶莲提取物；空白对照组加入DMEM 培养液；不同浓度的顺铂溶液为阳性对照组。实验中，每个浓度设6个平行孔，作用24h、 48h、 72h后，弃去96孔板中的培养基，各孔用PBS 100pL洗2遍，弃PBS，加入10mmol/L 的硝基苯磷酸盐溶液lOOpL (0.1mol/L醋酸缓冲液配制，含0.1。/。TritonX-100)，置于37。C孵 育2h后，每孔加入lmol/L氢氧化钠10pL终止反应。用酶联免疫检测仪在405nm处检测光 吸收度(J值)记录结果，重复实验3次。
结果表明，如表3所示，含有鬼臼毒素类木脂素和黄酮类成分的小叶莲提取物以及乙酸 乙酯部分具有很强的抑制作用。表3小叶莲提取物及各部分对两种细胞株的ICso
提取物作用时间(h)MDA-231 IC50(pg/mL)MCF-7 IC50(ng/mL)
2424.3-
小叶莲提取物4814.084.3
720.1592.65
2417.8-
石油醚部分480.8450.470
72-2.08
242.548.69
乙酸乙酯部分482.216.53
720.2001.26
2432.3-
正丁醇部分48-56.2
72-16.6
249.1814.9
顺铂486.387.80
722.913.50
实施例6
采用酸性磷酸酶法检测各化合物对人乳腺癌细胞的抑制作用。 实验方法同实施例5。
结果表明，如表4所示，鬼臼毒素类木脂素和黄酮类成分均具有很强的抑制作用。 另外，还测定了鬼臼毒素类木脂素和异戊烯基黄酮类成分混合物的IC5()，结果表明，将
鬼臼毒素类木脂素中的一种或多种和异戊烯基黄酮中的一种或多种以混合具有协同作用，能
够显著提高其抑制乳腺癌细胞的效果。表4小叶莲各化合物对MDA-231细胞株的ICSo
化合物(重量比)作用时间 MDA-231 (h) IQo(拜ol/L)
鬼臼毒素24 -48 6.46 72 -
去氧鬼臼毒素24 0.889 48 5.27 72 -
4'-去甲去氧鬼臼毒素24 2.01 48 0.718 72 2.22
8-异戊烯基山柰酚24 106 48 28.8 72 20.0
8,2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚24 18.0 48 25.4 72 13.7
去氧鬼臼毒素8-异戊烯基山柰酚 =1:124 3.50 48 7.23 72 3.81
4'-去甲去氧鬼臼毒素8-异戊烯基山柰酚 =1:424 4.20 48 3.52 72 3.89
鬼臼毒素去氧鬼臼毒素4'-去甲去氧鬼臼毒素 8-异戊烯基山柰酚8,2'-二异戊烯基槲皮素3-甲醚 =2:4:1:4:3224 0.660 48 -72 3.01
顺钼24 30.6 48 21.3 72 9.7
1权利要求
1.小叶莲提取物在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于所述的小叶莲提取物中含有3种鬼臼毒素类木脂素鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素和4′-去甲去氧鬼臼毒素以及2种异戊烯基黄酮8-异戊烯基山柰酚和8，2′-二异戊烯基槲皮素3-甲醚。其结构式如下
2. —种治疗乳腺癌的药物组合物，其特征在于含有权利要求l所述的鬼臼毒素类木脂素中的 l-3个以及异戊烯基黄酮中的l-2个化合物，鬼臼毒素类木脂素和异戊烯基黄酮的总重量比为1: 1 1: 6。
3. —种如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的鬼臼毒素类木脂素和异戊烯基黄 酮分别为去氧鬼臼毒素和8-异戊烯基山柰酚，其重量比为1:1。
4. 一种如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的鬼臼毒素类木脂素和异戊烯基黄 酮分别为4'-去甲去氧鬼臼毒素和8-异戊烯基山柰酚，其重量比为1:4。
5. —种如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述的鬼臼毒素类木脂素为鬼臼毒素、 去氧鬼臼毒素和4'-去甲去氧鬼臼毒素，所述的异戊烯基黄酮为8-异戊烯基山柰酚和8,2'-二异 戊烯基槲皮素3-甲醚，上述五种化合物的重量比为2:4:1:4:32。
6. —种药物组合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于该药物组合物含有权利要求 1所述的鬼臼毒素类木脂素中的1-3个以及异戊烯基黄酮中的1-2个化合物。
7. —种如权利要求3、 4或5所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种小叶莲提取物，以及该提取物及其中的有效成分在制备治疗乳腺癌药物中的应用。所述的小叶莲提取物中含有鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素、4′-去甲去氧鬼臼毒素、8-异戊烯基山柰酚和一个新化合物8，2′-二异戊烯基槲皮素3-甲醚。小叶莲提取物和各化合物对人乳腺癌细胞的抑制作用实验表明，小叶莲提取物和各化合物均具有抑制乳腺癌细胞的作用，而鬼臼毒素类木脂素和异戊烯基黄酮类成分配伍使用具有协同作用，能够显著提高其抑制乳腺癌细胞的效果。
文档编号A61K36/185GK101647842SQ200910092769
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月24日 优先权日2009年9月24日
发明者越 孔, 尚明英, 肖军军, 葛跃伟, 蔡少青, 马祥君 申请人:北京大学