专利名称：普洱茶及其制剂在预防、治疗鼠疫中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及普洱茶及其制剂在治疗鼠疫中的应用，属于物质的医药用途技术领域。
背景技术：
鼠疫(Plague)是由鼠疫耶尔森菌(YersiniaPestis)引起的人畜共患的烈性传染病。 由于其发病急、传播快、传染性强、病死率高，被世界卫生组织规定为国境检疫传染病， 是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病。2001年发生于美国的炭疽芽孢 邮件事件引起了全世界对生物武器威胁的关注。若鼠疫耶尔森菌被用于恐怖武器和大规 模破坏性战争的装备中，必将成为国际恐怖分子首选的生物武器，因此已成为威胁世界 和平的因素之一。从80年代以来，鼠疫在世界范围内的流行呈上升趋势，2000-2001年， 有ll个国家报告人间鼠疫。在我国，鼠疫的流行范围不断扩大，并向城市及人口密集区 逼近。因此针对鼠疫耶尔森菌的有效抑制剂的研发，已成为国际性研究热点。目前，国 内外对鼠疫的治疗多采用链霉素辅以多种广谱抗生素。但是由于抗生素的滥用，已经产 生了多种耐药性的鼠疫耶尔森菌，使大多数病人难以得到及时有效的治疗，最终导致死 亡。
蛋白质的可逆酪氨酸磷酸化作用是细胞信号转导的最重要基础，也是最关键歩骤之 一。生物体内的蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs)与蛋白质酪 氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinases, PTKs)协同作用，共同控制着蛋白质酪氨酸的磷 酸化过程，调节细胞的生长发育，并在细胞信号转导过程中发挥着重要的作用，同时还 与许多生理和病理现象密切相关，是细胞之间通信、细胞生长和增殖、细胞周期调控过 程中的关键。鼠疫耶尔森菌外膜蛋白(Yersinia outer membrane proteins, Yops)是鼠疫 耶尔森菌致病的重要因素，主要包括ll个蛋白质，其中，鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H (Yersinia outer membrane protein H， YopH)是唯——个具有蛋白质酪氨酸磷酸酶 (protein tyrosine phosphatase, PTP)活性的，它可使真核细胞的某些蛋白去磷酸化，除 破坏细胞骨架，具有抗吞噬作用外，还能抑制PI-3通路，从而抑制T淋巴细胞增殖， 是耶尔森菌逃避宿主先天免疫应答的重要因素。因此，以鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H (YopH)为靶标筛选出的专一有效的抑制剂，将为鼠疫的预防及治疗提供新的方法和
3说 思路。
参考文献
1、 Sun, J.-P., Wu, L., Fedorov, A. A.， Almo, S. C. and Zhang, Z.-Y. "Crystal Structure of the r^/"si'm'a Protein-Ty rosine Phosphatase YopH Complexed with a Specific Small Molecule Inhibitor", / g/o/. Otg柳.，278,33392-33399函3).
2、 Liang, F., Huang, Z.， Lee, S.-Y., Liang, J.， Ivanov, M. I., Alonso, A.， Bliska, J. B., Lawrence, D. S., Mustelin, T., and Zhang， Z.-Y. "Aurintricarboxylic Acid Blocks in vitro and in vivo Activity of YopH， an Essential Virulent Factor of Yersinia pestis， the Agent of Plague", / C7^抓，278, 41734-41741 (2003).
3、 Lee, K, Gao， Y.， Yao, Z,J.， Phan， J.， Wu， L.， Liang, J., Waugh, D.， Zhang, Z,Y. and Burke, T. R. Jr. "Tripeptide Inhibitors of I^m'"/fl Protein-Tyrosine Phosphatase", g/owg. Afgrf. Otg肌丄g汰，13,2577-2581 (2003).
研究表明，国内尽管已经完成对鼠疫耶尔森菌外膜蛋白Yops的克隆表达，但是缺少 鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H (YopH)的针对性研究，对YopH抑制剂的筛选仍停留在空白 水平。国外虽然已经从各种化合物中筛选出YopH的有效抑制剂，但都因取材困难、成 本高、副作用大，而难以推广，只停留在机理方面的研究，尚未开发出治疗鼠疫的有效 药物。
我国对天然植物的使用已有数千年的悠久历史，天然植物具有取材方便、成本低廉、 副作用小等特点，有资料显示，天然植物联合抗生素对鼠疫有显著疗效，因此采用鼠疫 耶尔森菌外膜蛋白H——YopH为靶标，从传统天然植物中筛选出能够有效抑制鼠疫耶尔 森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的抑制剂，是最为可靠且具有前景 的方法，从而为预防国际恐怖组织的生物武器攻击提供有效保障，具有巨大的经济效益 和社会作用。
普洱茶是云南历史名茶，也是我国的传统饮品。传统普洱茶是用云南大叶种晒青毛 茶直接蒸压而成，在唐代已成为主要商品，明代有"士庶所用皆普茶"，少数民族有"不 可一R无茶"的说法；清，宋士雄《随息局饮食谱》云"茶微苦微甘而凉，清心神醒 睡，除烦，凉肝胆，涤热消痰，肃肺胃，明目解渴。普洱产者，味重力竣，善吐风痰， 消肉食，凡暑秽痧气腹痛，霍乱痢疾等症初起，饮之辄愈"。此外，历来就有"茶改百
4毒"，"茶为百病之药"之说。
普洱茶根据其在生产过程中是否采用发酵工艺而被分为"生茶"和"熟茶"两大类。生 茶是指在加工、生产过程中没有经过发酵处理的普洱茶，其加工生产过程主要为鲜叶、 摊凉、杀青、揉捻、晒干。普洱熟茶是指生产时采用人工渥堆发酵后的普洱茶，它的加 工生产过程主要为鲜叶、杀青、揉捻、晒干、渥堆发酵、摊凉、筛分、拼配、紧压成 型、干燥、检验、包装仓储。普洱茶常会因原料、生产工艺及发酵程度的不同，而使其 成分、口感、色泽和保健功效也各不相同。
近年来对普洱茶化学成分的药效学研究和作用机制的报道也越来越多，都证明了普
洱茶具有显著的保健及抗病毒作用，效果确切、安全可靠，是天然植物药用的材料。
发明内容
本发明的目的就是应用普洱茶制备预防、治疗鼠疫的制剂，制成的制剂能够高效 抑制鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白质酪氨酸磷酸酶活性，最终可预防和治 疗鼠疫。
本发明的发明人采用基因工程技术克隆的具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的鼠疫耶 尔森菌外膜蛋白H——YopH的催化结构域(AYopH)，并把它作为一个治疗鼠疫的特 异靶标，并用以酶活性变化为指标的高通量药物筛选技术在体外对多种普洱茶进行研 究，从而筛选出能够高效抑制鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H——Y叩H的蛋白质酪氨酸磷酸 酶活性的普洱茶抑制剂。最终开发出预防、治疗鼠疫的普洱茶制剂。
所述普洱茶是普洱原茶，或者是用普洱原茶制成的普洱茶饼、茶砖或坨茶，或者 是用普洱原茶的提取物制得的冲剂、粉剂、浸膏、丸剂、口服液或胶囊。
所述制剂是用普洱茶直接制备成的单方制剂，或者是用普洱茶与其他药物原料直 接制备成的复方制剂，其制备方法均是现有技术的常规方法。
所述制剂是用普洱茶的提取物制备成的单方制剂，或者是用普洱茶提取物与其他 药物提取物制备成的复方制剂，其中，提取物是水提物，或者是醇提物。
所述水提物是用现有技术中的常规提取方法获得的，即用水煎后，经浓縮得到的 浓縮液，或者将浓縮液再经醇沉、喷雾干燥后得到的粉剂。
所述醇提物是用现有技术中的常规提取方法获得的，即用乙醇或者其他有机溶剂 提取后，经浓缩得到的浓縮液或浸膏，或者再将浓縮液或浸膏进一歩干燥得到的粉剂。
具体是将普洱茶经下列方法制得
5普洱茶水=1 : 10 100 (W/V)，在IO(TC下煮沸30秒 3分钟，或用沸水浸泡3
分钟 30分钟，再用120目筛过滤去除残渣，收集水提液；重复此步骤2 4次，合并
每次的提取液；将总提取液分别用200目筛和0.45pM滤器过滤，经高温喷雾干燥得到
普洱茶粉剂。
或者将普洱茶经下列方法制得-
普洱茶粉水=1 : io 30 (w/v)，得到茶粉水溶液，加入等体积氯仿萃取三次，
收集保留水相，再用等体积乙酸乙酯萃取三次，收集水相，最后用等体积正丁醇进行萃 取，保留水相。将水相中的水蒸发去除，得茶褐素粉剂。
所述制剂是临床上能够使用的各种不同的药物剂型，如片剂、粉剂、丸剂、胶囊、 粒剂、液体药剂等形式的口服制剂，或者是注射剂、栓剂、膏剂、酊剂等形式的制剂。
所述制剂也可以是人们通常使用的各种食品，如固体饮料、液体饮料，或与其它 食品原料混合加工的米制品、面制品、糕点、小食品等。
所述制剂还可以是人们通常使用的各种保健食品，如保健粉、保健片、保健胶囊、 保健口服液、保健冲剂等。
所述普洱茶的有效剂是通过与适当的药用掺混物，如赋形剂、粘合剂、渗透剂、
润滑剂等混合配制成的，其中，普洱茶有效成分的质量含量比不低于20%。
剂量随患者的病情、给药途径、患者的年龄和体重而改变。在口服给药情况下，
剂量通常为成年人50 90mg/kg/天，优选70 80mg/kg/天。
本发明具有下列优点和效果普洱茶及其制剂在体外能抑制鼠疫耶尔森菌外膜蛋白 H——YopH的蛋白质酪氨酸磷酸酶活性。因为生物体内的蛋白质酪氨酸磷酸酶与蛋白 质酪氨酸激酶协同作用后，将共同控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程，调节细胞的生长 发育，在细胞信号转导过程中发挥重要的作用，而鼠疫耶尔森菌外膜蛋白是鼠疫耶尔森 菌致病的重要因素，其中的鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H是唯一一个具有蛋白质酪氨酸磷酸 酶活性的，它可使真核细胞的某些蛋白去磷酸化，除破坏细胞骨架，具有抗吞噬作用外， 还能抑制PI-3通路，从而抑制T淋巴细胞增殖，是耶尔森菌逃避宿主先天免疫应答的 重要因素。因此，抑制鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H——Y叩H的蛋白质酪氨酸磷酸酶活性， 就能防治鼠疫耶尔森菌致病。因此，以鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H——YopH为靶标筛选出 的普洱茶有效抑制剂，将为鼠疫的预防及治疗提供新的方法和思路。
具体实施方式
本发明实施例所用的普洱茶是采用云南普洱天福经贸有限责任公司生产的普洱 茶，该普洱茶是用专利号为ZL200610010625.1，名称为"一种用生物酶发酵普洱茶的方 法"的发明专利制得的普洱茶，如"紫妍宫廷普洱茶"、"乳香宫廷普洱茶"和"沉浮 人生普洱茶"，还有就是用上述普洱茶制备的茶粉等制剂。
其中，样品1、 2、 3号分别是将上述"乳香宫廷普洱茶"和"沉浮人生普洱茶" 及"紫妍宫廷普洱茶"用蒸馏水配制成25mg/ml的贮液，之后按2倍梯度进行稀释后得 到的。
样品4号是将上述"沉浮人生普洱茶"经下列方法制得的
普洱茶水=1 : 50 (W/V)，在10(TC下煮沸2分钟，再用120目筛过滤去除残渣， 收集水提液；重复此歩骤2 4次，合并每次的提取液；将总提取液分别用200目筛和 0.45pM滤器过滤，经高温喷雾干燥得到普洱茶粉剂。
样品5号是将上述"沉浮人生普洱茶"经下列方法制得的-
普洱茶粉水=1 : 15 (w/v)，得到茶粉水溶液，加入等体积氯仿萃取三次，收集
保留水相，再用等体积乙酸乙酯萃取三次，收集水相，最后用等体积正丁醇进行萃取，
保留水相；将水相中的水蒸发去除，得茶褐素粉剂。
普洱茶对鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的抑制 作用的测定
YopH是一种PTP，可以使磷酸化的蛋白质去磷酸化。对硝基苯磷酸二钠盐(pNPP) 是目前最通用的PTPs活力测定的底物，它可以被PTP去磷酸化，变成对硝基苯酚，颜 色呈黄色，通过检测405nm处光吸收值的变化来间接检测酶活性的变化情况。
测定体系如下25mM吗啉代丙烷磺酸(MOPS) pH 7.0， lmg/ml牛血清白蛋白 (BSA)， lmM 二硫苏糖醇(DTT)， O.lmM乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)， 5nMAYopH， △YopH为吉林大学生命科学学院克隆表达的YopH的催化结构域，在405nm处测定 30min内整个反应体系光吸收的变化值。
物质对Y叩H的抑制能力的考察是通过测定半数抑制浓度(IC5Q)来衡量。ICso即当 酶的总活力被抑制一半时，反应体系中所需的抑制剂的终浓度。将抑制组分按梯度进行 稀释，将稀释后的不同浓度的抑制剂加入到上述所说的反应体系中，于37'C中准确反应 30min后，测定波长405nm处的吸光值，将各个梯度的吸收值与未加抑制组分的吸光值 相除，得出的数值为抑制百分数，当抑制率达到50%时，所对应的抑制剂的终浓度就是IC50 (mg/ml)。
将上述样品的普洱茶及其制剂用蒸馏水配制成25mg/ml的贮液，按2倍梯度进行稀释，之后将每个浓度梯度的样品加入到Y(5pH活性测定的反应体系中，分别测定每个稀释浓度对Y叩H的抑制能力，以普洱茶的浓度(mg/ml)作为ICso的单位，得出各种普洱茶的IC5o值(mg/ml)(见表l)， K^值(mg/ml)越低，表明其对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的抑制能力越强。
表1为云南普洱天福经贸责任有限公司生产的普洱茶及其制剂对Y叩H抑制的IC50值。
表l_
样品名称 原液抑制率(25mg/ml) IC50
1号 98.6°/。 0. 183
2号 96.8% 0.292
3号 92. 1% 0.4365
4号 99.6% 0.0335
5号 100% 0.038
权利要求
1、普洱茶在制备预防和/或治疗鼠疫药物中的应用。
2、 普洱茶在制备预防和/或治疗鼠疫食品中的应用。
3、 普洱茶制剂在制备预防和/或治疗鼠疫药物中的应用。
4、 普洱茶制剂在制备预防和/或治疗鼠疫的食品中的应用。
全文摘要
本发明提供普洱茶及其制剂在预防、治疗鼠疫中的应用。具体是普洱茶及其制剂在体外能抑制鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白质酪氨酸磷酸酶活性。鼠疫耶尔森菌中的外膜蛋白H是唯一一个具有蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的，它可使真核细胞的某些蛋白去磷酸化，除破坏细胞骨架，具有抗吞噬作用外，还能抑制PI-3通路，从而抑制T淋巴细胞增殖，是耶尔森菌逃避宿主先天免疫应答的重要因素。因此，抑制鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H——YopH的蛋白质酪氨酸磷酸酶活性，就能防治鼠疫耶尔森菌致病。因此，以鼠疫耶尔森菌外膜蛋白H——YopH为靶标筛选出的普洱茶有效抑制剂，将为鼠疫的预防及治疗提供新的方法和思路。
文档编号A61K36/185GK101485788SQ20091009413
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者付学奇, 军 王, 王乐观, 军 盛 申请人:王乐观;付学奇;盛 军;王 军