专利名称：用细胞工程培养的泛生墙藓原丝体制备的抗病毒制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用细胞工程培养的泛生墙藓原丝体制备的抗病毒制剂，属于生物技 术领域。
背景技术：
在植物界，苔藓植物是由一类水生生活转为陆生生活过渡型的植物类群，是地球上 陆生植物中最古老的种群之一。目前地球上包括南极在内除5000米以上高山及海洋外， 在不同的生态系统中均有苔藓植物的足迹。苔藓植物隶属于高等植物中的孢子植物，全 世界约有23000种，种数仅次于被子植物，是植物界中的一个重要门类。
由于苔藓植物分布广，生境多样化以及对恶劣环境的特殊适应机制，多数的苔藓植 物能产生特别丰富的次生代谢物质，如单萜和倍半萜类化合物等。苔藓植物被认为是生 物活性物质的源泉。在民间，苔藓植物被广泛用于治疗创伤、烧伤、感染、肺结核、神 经衰弱、惊厥、烫伤和肺炎等症。
另外，几乎所有的苔藓植物都不被各种动物所采食，也不被细菌、真菌或病毒所感 染，所有这些都表明苔藓中存在着一些活性物质作为自身保护剂，来抵御外界的有害刺 激，例如，德国农场主曾用田边采集到的苔藓用水匀浆后喷洒在巻心菜上防止虫害；娄 红祥等发现苔藓的某些成分可以有效抵抗HIV病毒等。由于苔藓植物含有多种类型化合 物，而且许多化合物表现出良好的生物活性，因此苔藓植物有可能成为前景广阔的农用、 药用植物资源，造福人类。然而，苔藓植物形体小，混杂丛生，种间不易区别和分离， 单独一种苔藓的人工培养繁殖还没有成熟体系，某些种类釆集足够量的样品又比较困 难，导致了苔藓植物相关产品的研究开发面临原料困境。植物的组织培养技术恰恰可以 解决这一难题，利用快速繁殖技术，能在相对较短的时间内，获得大量单一种类的纯净 的材料，即可用于研究，又可为利用苔藓制备各种活性制剂提供大量原材料。
参考文献 Stefan A. Rensing, Daniel Lang, Andreas D. Zimmer， et al..The Physcomitrella Genome Reveals Evolutionary Insights into the Conquest of Land by Plants[J]. Science, 2008, 319(5859): 64-69.
4[2] D. Cove, M. Bezan川a, P. Harries, et al. Mosses as model systems for the study of metabolism and
development[J]. A簡Rev Plant Biol, 2006,57:497-520.吴鹏程，苔藓植物生物学[M].北京科学出版社，1998.吴鹏程，贾渝.中国苔藓植物的地理分区及分布类型[J].植物资源与环境学报,2006(01):1-8. [5]胡人亮，苔藓植物学[M].北京高等教育出版社，1987. Becker H. Zinsmeister H.D., Eicher T. BryoPhytes， a souree of biologically active,naturally occurring material [J]. AngewChemintEdit, 1991,30:130-147. Y. Asakawa, Recent advances in phytochemistry of bryophytes-acetogenins, terpenoids and bis (bibenzyl ) from selected Japanese, Taiwanese, New Zealand, Argentinean and European liverworts [M]. New York: Phytochemistry, 2001. Asakawa Y, Chemosystematics of the Hepaticae[J], Phytochemistry, 2004,65(6):623-669,王小宁，娄红祥.苔藓植物生物活性成分研究进展[J].中草药,2005(02):303-307.吴玉环，程国栋，高谦.苔藓植物的生态功能及在植被恢复与重建中的作用[J]. 20，
2003,3:215-220.王世冬，白学良，雍世鹏.沙坡头地区苔藓植物区系初步研究[J].中国沙漠植物， 2001,21(3):244-249. Erikson M, Miksche G.E. On the occurrence of lignin or polyphenols in some mosses and live腦rts.[J]. Phytochemis伊y, 1974,13:2295-2299.白学良，王瑶，徐杰，et al.沙坡头地区固定沙丘结皮层藓类植物的繁殖和生长特性研究[J].中 国沙漠，2003,23(2):171-176.
发明内容
, 本发明的目的在于将通过细胞工程的方法获得大量发育程度一致的泛生墙藓原丝 体，并将其用作原料，用乙醇或甲醇提取粗提物制备抗病毒制剂。
本发明是这样实现的
一、泛生墙藓原丝体的获得和大量繁殖 1、泛生墙藓成熟孢子的无菌萌发获得初生原丝体'
泛生墙藓成熟孢子的无菌初生原丝体的获得经由成熟孢子的灭菌、固体培养基上的 萌发得到，具体步骤如下
1.成熟孢子的灭菌
5挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下l一2cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗 净孢蒴表面，然后用体积浓度75%的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0.5-l分钟；而后 用含1. Og/L的氯化汞和1. 0%餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为3-5分钟；
再用灭菌水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用 无菌镊子固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤 出孢子到盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，
在4(TC的水浴中刺激40-50秒；
2.固体培养基上的萌发
在无菌条件下，取密度为104-106/ml的孢子，接种到改良的MS培养基(添加了 2,4-二氯苯氧基乙酸(2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid，简称2， 4-D) 2-5mg/L，硅酸钠 2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS培养基)中。培养温度为25°C±3°C，光照度为40001x。 10-20天之后就能获得由孢子萌发的初生原丝体。
二、原丝体的大量繁殖及收集 L原丝体的大量繁殖及收集 '
原丝体的大量繁殖及收集由摇瓶培养后离心纯化的工序得到。具体如下 (1)原丝体的大量繁殖
用镊子轻轻夹取体积为10-1000mi^萌发的原丝体，接种到添加了 2， 4-D 2-5mg/L, 硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液体培养基的体积为50-1000ml三角瓶中，每 个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3-1/2， 120rpm摇床培养7-10天，环境温度 控制在25土3'C，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养7-15后 获得大量原丝体。如需要更大量的原丝体，则在无菌条件下，将培养得到的原丝体连同 培养液倒入玻璃发酵罐中，加入3 — 10倍体积的新鲜培养液，底部通入无菌空气(200L/ 小时)，使得培养液中的原丝体不断翻腾，以发酵罐底部无永久沉积的原丝体为标准， 培养7—15天后，停止进气，待原丝体沉入罐底后，用蠕动泵在无菌条件下缓慢将处于 罐体上部的培养液抽出2/3，再加入新鲜无菌培养液至原初体积的5倍，继续重复扩大 培养，如此可反复至罐体最大容积为止，即能获得更大量的原丝体。
(2)原丝体的收集
6根据需要，可将三角瓶中培养的原丝体用来传代扩大培养，也可将培养瓶中的全部 混悬液倒入离心管中，在800rpm/min (转/分)离心2分钟，弃去上清液，回收得到原 丝体；发酵罐中的大量原丝体用4一8层纱布过滤收集获得。
三、抗病毒制剂的制备
抗病毒制剂经乙醇或甲醇提取工序得到。具体如下
1. 收集的原丝体用0. 5倍体积的90%乙醇或甲醇研磨，再加入10-100倍体积的75% 乙醇或甲醇，在5(TC温度下密闭提取4-8小时，再在35-50。C温度下用旋转蒸发仪去除 乙醇或甲醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即获得具有抗病毒活性的浓 縮胶状粗提物；
2. 收集的原丝体也可以8(TC烘干后保存，待需要使用时，将烘干的原丝体在50。C 温度下，先用1-2倍体积的75%乙醇或甲醇浸泡1-2小时，然后研磨，其余步骤同鲜活 原丝体。
本发明具有制备方法简便、环保、抗病毒效果佳等优点。
具体实施例方式
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。 实施例1:
抗病毒制剂经乙醇或甲醇提取工序得到。具体如下 1、泛生墙藓成熟孢子的无菌萌发获得初生原丝体
泛生墙藓成熟孢子的无菌初生原丝体的获得经由成熟孢子的灭菌、固体培养基上的 萌发得到，具体歩骤如下
(1)成熟孢子的灭菌 挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下lcm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净 孢蒴表面，然后用75%的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0. 5分钟；而后用浓度为2. Og/L
的氯化汞和含有1. 0%餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为2分钟；再用灭菌 水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊子
固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子到
7盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在4(TC的 水浴中刺激40秒；
(2)固体培养基上的萌发
在无菌条件下，取密度为104/1111的孢子，接种到改良的MS培养基(添加了2,4-二 氯苯氧基乙酸(2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid，简称2， 4-D) 2mg/L，硅酸钠2.0g/L， 蔗糖2.0%、 pH5.8的MS培养基)中。培养温度为25°C，光照度为40001x， 20天之后
获得由孢子萌发的初生原丝体。 2、原丝体的大量繁殖及收集
(1)原丝体的大量繁殖
用镊子轻轻夹取体积为100mn^萌发的原丝体，接种到添加了 2， 4-D 2mg/L，硅酸钠 2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液体培养基体积为500ml的三角瓶中，每个三角瓶中 加入的培养液为三角瓶容积的1/3, 120rpm摇床培养12天，环境温度控制在24-27。C， 光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶扩大培养，7后获得大量原丝 体，将培养瓶中的全部混悬液倒入离心管中，在800rpm/min (转/分)离心2分钟，弃 去上清液，回收得到原丝体；
3、抗病毒制剂的制备
收集的原丝体用0. 5倍体积的90%乙醇研磨，再加入10倍体积的75%乙醇，在50°C 温度下密闭提取5小时，再在35t:温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min 回收溶剂体积不会变化时，即获得胶状粗提物。
在常规烟草花叶病毒试验中，上述胶状物用蒸馏水稀释2000倍后，加入0.05%助溶 渗透剂二甲亚砜，对烟草花叶病毒的抑制率可达77. 2%;
实施例2:
1、泛生墙藓成熟孢子的无菌萌发获得初生原丝体
泛生墙藓成熟孢子的无菌初生原丝体的获得经由成熟孢子的灭菌、固体培养基上的 萌发得到，具体步骤如下
(1)成熟孢子的灭菌
挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下1.5cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净孢蒴表面，然后用75%的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面1分钟；而后用浓度为1. 0g/L 的氯化汞和含有1.0%餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为2分钟；再用灭菌 水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊子 固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子到 盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在4(TC的 水浴中刺激45秒；
(2)固体培养基上的萌发 在无菌条件下，取密度为10Vml的孢子，接种到改良的MS培养基(添加了2，4-二 氯苯氧基乙酸(2， 4-Dichlorophenoxyaceticacid，简称2， 4-D) 3mg/L，硅酸钠2.0g/L， 蔗糖2.0%、 pH5.8的MS培养基)中。培养温度为25'C，光照度为40001x， 20天之后 获得由孢子萌发的初生原丝体。 2.原丝体的大量繁殖及收集中
用镊子轻轻夹取体积为100mm3萌发的原丝体，接种到添加了 2， 4-D 2mg/L,硅酸 钠2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液体培养基体积为500ml的三角瓶中，每个三角瓶 中加入的培养液为三角瓶容积的1/3， 120rpm摇床培养12天，环境温度控制在24-27 。C，光源为漫射光，然后，在无菌条件下，将500ml三角培养瓶中的原丝体及其培养液 全部倒入玻璃发酵罐，加入1000ml新鲜培养液，底部通入无菌空气200L/小时，使得培 养液中的原丝体不断翻腾，培养15天后，停止进气，待原丝体沉入罐底后，用蠕动泵 在无菌条件下缓慢将处于罐体上部的培养液抽出2/3，再加入新鲜无菌培养液5000ml， 继续重复扩大培养，15天后重复上述步骤，加入新鲜无菌培养液至罐体最大有效容积 10L为止，培养8天后将罐内物体全部倒出，用6层纱布过滤清洗后得到大量的原丝体；
3、抗病毒制剂的制备
收集的原丝体用0. 5倍体积的90%甲醇研磨，再加入50倍体积的75%甲醇，在50°C 温度下密闭提取5小时，再在45'C温度下用旋转蒸发仪去除甲醇及水，至最后20min 回收溶剂体积不会变化时，即获得胶状粗提物。
在活体植株烟草花叶病毒试验中，将上述胶状物用蒸馏水稀释1200倍后，加入O. 1 %的十二垸基璜酸钠，0.05%二甲亚砜后均匀喷洒在烟叶表面，其烟草花叶病的相对防 效可达44. 8%。
9实施例3:
1、泛生墙藓成熟孢子的无菌萌发获得初生原丝体
泛生墙藓成熟孢子的无菌初生原丝体的获得经由成熟孢子的灭菌、固体培养基上的 萌发得到，具体步骤如下
(1) 成熟孢子的灭菌
挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下2cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净 孢蒴表面，然后用75%的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面45秒；而后用浓度为1.0g/L 的氯化汞和含有1.0%餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为10分钟；再用灭 菌水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊 子固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子 到盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在4(TC 的水浴中刺激50秒；
(2) 固体培养基上的萌发
在无菌条件下，取密度为10"ml的孢子，接种到改良的MS培养基(添加了2，4-二 氯苯氧基乙酸(2， 4-Dichlorophenoxyacetic acid，简称2， 4-D) 5mg/L，硅酸钠2.0g/L， 蔗糖2.0%、 pH5.8的MS培养基)中。培养温度为25。C，光照度为40001x， 20天之后 获得由孢子萌发的初生原丝体。 2.原丝体的大量繁殖及收集中
用镊子轻轻夹取体积为1000mr^萌发的原丝体，接种到添加了 2， 4-D 5mg/L,硅酸 钠2.0g/L，蔗糖2.0%、 pH5.8的MS液体培养基的体积为1000ml三角瓶中，每个三角 瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3， 120rpm摇床培养7天，环境温度控制在24。C， 光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养，11天后获得大量原丝体。
3、抗病毒制剂的制备中5个1000ml培养瓶中回收干燥后的原丝体先用1倍体 积的75%乙醇浸泡2小时，然后研磨，再加入100倍体积的75%乙醇，在45'C温度下密 闭提取5小时，再在5(TC温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂 体积不会变化时，即获得胶状粗提物。
小区田间试验中，将上述胶状物用蒸馏水稀释1000倍后，加入0.1%的十二烷基璜 酸钠和0.05%的二甲亚砜，均匀喷洒在烟叶表面，其相对防效达到49.5%。
10
权利要求
1、一种用细胞工程培养的泛生墙藓原丝体制备的抗病毒制剂，其特征在于该抗病毒制剂经以下工序得到a.成熟孢子的灭菌挑选泛生墙藓成熟饱满的孢蒴，从孢蒴以下1-2cm，蒴柄中间部分剪断，用清水洗净孢蒴表面，然后用75％的酒精浸泡孢蒴，预消毒组织表面0.5-1分钟；而后用含1.0g/L的氯化汞和1.0％餐洗剂的溶液对孢蒴表面进行消毒，处理时间为3-5分钟；再用灭菌水反复浸泡清洗孢蒴4次，洗净材料孢蒴表面的氯化汞和洗涤剂残留；然后用无菌镊子固定蒴柄，以无菌眼科剪刀横向切断孢蒴顶部，暴露出内部的孢子，用镊子挤出孢子到盛有无菌水的离心管中，使孢子分散悬浮起来；将盛有孢子的离心管密封好，在40℃的水浴中刺激40-50秒；b.固体培养基上的萌发在无菌条件下，取密度为104-106/ml的孢子，接种到添加了2，4-二氯苯氧基乙酸2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS培养基中，培养温度为25℃±3℃，光照度为4000lx，10-20天之后获得由孢子萌发的初生原丝体；c.原丝体的大量繁殖及收集用镊子轻轻夹取体积为10-1000mm3萌发的原丝体，接种到添加了2，4-D 2-5mg/L，硅酸钠2.0g/L，蔗糖2.0％、pH5.8的MS液体培养基的体积为50-1000ml三角瓶中，每个三角瓶中加入的培养液为三角瓶容积的1/3-1/2，120rpm摇床培养7-10天，环境温度控制在25±3℃，光源为漫射光；随后用相同的培养基和控制条件进行转瓶培养7-15天后获得大量原丝体；如需要更大量的原丝体，则在无菌条件下，将培养得到的原丝体连同培养液倒入玻璃发酵罐中，加入3-10倍体积的新鲜培养液，底部按200L/小时通入无菌空气，使得培养液中的原丝体不断翻腾，以发酵罐底部无永久沉积的原丝体为标准，培养7-15天后停止进气，待原丝体沉入罐底后，用蠕动泵在无菌条件下缓慢将处于罐体上部的培养液抽出2/3，再加入新鲜无菌培养液至原初体积的5倍，继续重复扩大培养，如此可反复至罐体最大容积为止，即能获得更大量的原丝体；将培养瓶中的全部混悬液倒入离心管中，在800rpm/min(转/分)离心2分钟，弃去上清液，回收得到原丝体；发酵罐中的大量原丝体可以用4-8层纱布过滤收集获得 id="icf0001" file="A2009100941490002C1.tif" wi="1" he="3" top= "248" left = "136" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>d.抗病毒制剂的制备收集的原丝体用0.5倍体积的90％乙醇或甲醇研磨，再加入10-100倍体积的75％乙醇或甲醇，在50℃温度下密闭提取4-8小时，再在35-50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇或甲醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即获得抗病毒的浓缩胶状粗提物；收集的原丝体也可用80℃烘干后保存，待需要使用时，将烘干的原丝体在50℃温度下，先用1-2倍体积的75％乙醇或甲醇浸泡1-2小时，然后研磨，再加入10-100倍体积的75％乙醇或甲醇，其余步骤同鲜活原丝体。
全文摘要
本发明涉及一种用细胞工程培养的泛生墙藓原丝体制备的抗病毒制剂，属生物技术领域。本发明的抗病毒制剂经以下工序得到由细胞工程方法繁殖得到的泛生墙藓原丝体用0.5倍体积的90％乙醇或甲醇研磨，再加入10-100倍体积的75％乙醇或甲醇，在50℃温度下密闭提取4-8小时，再在35-50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即可获得浓缩胶状粗提物；收集的原丝体也可80℃烘干后保存，待需要使用时，将烘干的原丝体在50℃温度下，先用1-2倍体积的75％乙醇或甲醇浸泡1-2小时，然后研磨，再加入10-100倍体积的75％乙醇或甲醇，其余步骤同鲜活原丝体。本发明具有制备方法简便、环保、抗病毒效果佳等的优点。
文档编号A61K36/10GK101491551SQ200910094149
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者鸽 张, 李育中, 汪家乐, 霏 沈, 静 范, 陈正贵, 陈穗云, 黎兴江 申请人:云南大学