专利名称：羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物材料制备及蚕丝蛋白的加工利用领域，特别涉及一种骨 组织工程用羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的制备方法。
背景技术：
骨损伤和骨缺损是临床上常见的疾病，常需植骨治疗，传统的治疗方法 是进行自体或异体骨移植进行骨修复。自体骨移植修复效果好，但存在供应 有限，需进行二次手术的缺点，同种异体骨移植存在免疫原性的缺点并且可 能传播传染病，都不是理想的骨修复材料。骨组织工程的基本思路是用少量 的组织细胞经体外培养扩增后修复骨缺损，同时可依据骨缺损情况任意塑形 达到完善的形态修复，为最终实现无损伤修复创伤和真正意义上的功能重建 开辟了一条新的途径。
丝素蛋白(Silk Fibroin简称SF)是一种天然结构性蛋白，由结晶区和 非结晶区两部分组成，由于其特殊的分子结构使其具有良好的生物学性质， 如生物相容性、生物降解性、抗凝血性能、力学性能、支持多种细胞的粘附、 增殖和分化等。近年来丝素蛋白在生物医用材料领域的研究和应用较多，如 细胞培养基质、药物缓释载体、固定化酶载体、隐形眼镜、人工血管和创面 膜等。
羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP或HA)是一种生物活性陶瓷，其化 学组成和结晶结构类似于人体骨骼中的磷灰石。HA分子中的Ca"可以与含有 羧基的氨基酸、蛋白质、有机酸等发生交换反应，具有良好的骨传导性能和 生物活性，能与骨组织形成牢固的骨性结合促进骨骼生长，并且相态比较稳 定，无毒性、发炎性，是公认的性能良好的骨修复替代材料。但单一组分的 羟基磷灰石脆性大、韧性较差、力学性能不足，降解缓慢且易从植入位点迁 移，这都限制了其作为人体材料种植体的使用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种羟基磷灰石/丝素蛋 白复合多孔支架材料的制备方法，包括以下步骤
(1) 将脱胶后的纤维状丝素在重量百分比浓度为50X的CaCl2溶液中， 重量比为1:25，温度98。C，时间5min，溶解后经过滤、透析后获得重量浓 度为5%丝素蛋白溶液；
(2) 将6(TC的饱和Ca(OH)2溶液置于6(TC水浴中，缓慢滴加10% wt的 H3P04溶液，滴加过程中快速搅拌，溶液的pH保持在8.7;搅拌3h后置于 25r静置48 h，将沉淀离心，将离心所得沉淀物于超声波清洗器中振荡处理 30 min，得到羟基磷灰石匀浆；
(3) 在不断搅拌并保持水温为25 。C条件下，根据配比需要，将丝素蛋 白溶液滴加于羟基磷灰石匀浆中，将混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处 理3 5 min后取出，向其中缓慢滴加终浓度为0.03%的戊二醛交联剂并搅拌 均匀后，快速移入24孔细胞培养平板，并立即放入-20 。C冰箱预冷冻12h;
(4) 将冷冻12 h后的载样细胞培养平板取出，在25t:条件下，回温处 理10 30min，然后重新放入-20 。C冰箱再冷冻24 h，然后再次取出放入-50 'C冷冻干燥机中干燥，最终制得各种不同比例的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多 孔支架材料。
所述步骤(2)饱和Ca(OH)2溶液和10% wt的H3P04溶液的配比为体积 比700: 11。
所述步骤(2)用氨水调节pH值，使pH保持在8.7。 所述步骤(2)的滴加过程中使用磁力搅拌器快速搅拌。 所述步骤(2)的沉淀离心的离心速率为4000r/min。 所述步骤(2)得到的羟基磷灰石匀浆的钙磷比为1.67。 所述步骤(4)的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的比例为1: 9 7: 3。
所述的脱胶后的纤维状丝素的脱胶方法，包括以下步骤 (1)将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成约lcn^的茧片，放入重量百分比浓度 为0.5% Na2C03沸水中进行脱胶处理，桑蚕茧层与Na2C03溶液的质量比为l : 30。(2)30min后，将己成纤维状的蚕茧捞出拧干，并用去离子水清洗多次， 重复上述操作2次，室温下自然晾干后得纤维状脱胶蚕丝，即脱胶后的纤维 状丝素。
本发明方法制得的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料应用于骨组织 工程支架材料。
本发明具有以下有益效果
(1) 将丝素蛋白与羟基磷灰石制成骨组织工程用复合支架材料， 一方面 丝素蛋白可以作为羟基磷灰粒子的粘结剂，抑制羟基磷灰石粒子在植入点的 脱离和迁移；另一方面可以提高材料的力学性能，将聚合物的韧性与无机粒 子的强度和硬度相中和。本发明采用共混法制备羟基磷灰石/丝素蛋白复合多 孔支架材料，能综合两者的性能，优势互补，获得性能优良的生物活性骨修 复材料。
(2) 本发明制备的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料制备工艺简 单，需时短，制备条件容易满足；不添加致孔剂，所用试剂少且廉价，成本 低；本发明所制备的支架材料孔隙率较高，孔隙分散均匀且孔与孔之间相互 贯通，适用于骨组织工程支架材料对孔隙及孔径结构的要求。
图l为本发明中合成的羟基磷灰石颗粒的透射电镜照片。 图2为本发明实施例的HA与SF的比例为1: 9时的复合多孔支架材料 的孔隙结构照片。
图3为本发明实施例的HA与SF的比例为3: 7时的复合多孔支架材料 的孔隙结构照片。
图4为本发明实施例的HA与SF的比例为1: 1时的复合多孔支架材料 的孔隙结构照片。
图5为本发明实施例的HA与SF的比例为O: IOO时的复合多孔支架材 料的孔隙结构照片。
具体实施例方式
下面结合实施例来说明本发明的技术方案-
61、 纤维状丝素的脱胶
(1) 将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成约10112的茧片，放入重量百分比浓度
为0.5% Na2C03沸水中进行脱胶处理，桑蚕茧层与Na2C03溶液的质量比为l : 30。
(2) 30min后，将己成纤维状的蚕茧捞出拧干，并用去离子水清洗多次， 重复上述操作2次，室温下自然晾干后得纤维状脱胶蚕丝，即脱胶后的纤维 状丝素。
2、 重量浓度为5%丝素蛋白溶液的制备
(1)将脱胶后的纤维状丝素在重量百分比浓度为50X的CaCl2溶液中， 重量比为1:25，温度98。C，时间5 min，溶解后经过滤、透析后获得重量浓 度为5%丝素蛋白溶液。
3、 羟基磷灰石匀浆的制备
(1) 将700ml的6(TC的饱和Ca(OH)2溶液置于60。C水浴中，缓慢滴加 10% wt的H3P04溶液llml，滴加过程中使用磁力搅拌器不断快速搅拌并保持 水温，数显pH计监测溶液的pH，待溶液的pH低于7.0时，向其中滴加氨水， 调整溶液的pH保持在8.7;
(2) 搅拌3h后置于25。C静置48h，倾去上层清液，收集下部沉淀并用 蒸馏水洗涤，将沉淀离心(4000 r/min)，向离心后所得沉淀物中加入少量去 离子水并搅拌均匀，于超声波清洗器中振荡处理30 min，得到转磷比为1.67 的羟基磷灰石匀浆(图1)。
实施例1:
(1) 精确称取一定质量羟基磷灰石匀浆，使用磁力搅拌器不断搅拌并保 持水温为25 °C,向其中缓慢逐滴加入丝素蛋白溶液。使HA与SF的比例为1: 9。
(2) 将羟基磷灰石与丝素蛋白的混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处 理3 5 min。
(3) 取出混合溶液，向其中缓慢滴加终浓度为0.03%的戊二醛交联剂(市 售)，磁力搅拌器缓慢搅拌均匀。(4) 将混合溶液快速移入24孔细胞培养平板，并立即放入-20。C冰箱中 预冷冻12 h。
(5) 将冷冻12 h后的载样细胞培养平板取出，在25X:条件下，进行回 温处理10min，然后重新放入-2(TC冰箱再冷冻24h。
(6) 将冷冻24 h后的载样细胞培养平板取出，放入-5(TC冷冻干燥机中 干燥，最终制得羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料HA10 (图2)，其平 均孔径为157.36um，密度为106.1 ±2.5mg/ml，孔隙率为75.5± 1.0 %。
实施例2:
(1) 精确称取一定质量羟基磷灰石匀浆，使用磁力搅拌器不断搅拌并保 持水温为25 °C，向其中缓慢逐滴加入丝素蛋白溶液。使HA与SF的比例为3: 7。
(2) 将羟基磷灰石与丝素蛋白的混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处 理3 5 min。
(3) 取出混合溶液，向其中缓慢滴加终浓度为0.03%的戊二醛交联剂， 磁力搅拌器缓慢搅拌均匀。
(4) 将混合溶液快速移入24孔细胞培养平板，并立即放入-2(TC冰箱中 预冷冻12 h。
(5) 将冷冻12 h后的载样细胞培养平板取出，在25"C条件下，进行回 温处理20min，然后重新放入-20 。C冰箱再冷冻24 h。
(6) 将冷冻24 h后的载样细胞培养平板取出，放入-5(TC冷冻干燥机中 干燥，最终制得羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架HA30 (图3)，其平均孔 径为126.26U m，密度为123.1±3.1mg/ml，孔隙率为82.1 ± 1.5 %。
实施例3:
(1) 精确称取一定质量羟基磷灰石匀浆，使用磁力搅拌器不断搅拌并保 持水温为25°C，向其中缓慢逐滴加入丝素蛋白溶液。使HA与SF的比例为1:
(2) 将羟基磷灰石与丝素蛋白的混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处 理3 5 min。(3) 取出混合溶液，向其中缓慢滴加终浓度为0.03%的戊二醛交联齐廿， 磁力搅拌器缓慢搅拌均匀。
(4) 将混合溶液快速移入24孔细胞培养平板，并立即放入-20。C冰箱中 预冷冻12 h。
(5) 将冷冻12 h后的载样细胞培养平板取出，在25'C条件下，进行回 温处理30min，然后重新放入-20 。C冰箱再冷冻24 h。
(6) 将冷冻24 h后的载样细胞培养平板取出，放入-5(TC冷冻干燥机中 干燥，最终制得羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架HA50 (图4)，其平均孔 径为94.67Pm，密度为175.9±5.2mg/ml，孔隙率为73.8± 1.4 %。
HA与SF的比例为O: 100，制备方法同实施例1至3，制备得如图5所
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能 从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保 护范围。
对照例:
权利要求
1、一种羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将脱胶后的纤维状丝素在重量百分比浓度为50％的CaCl2溶液中，重量比为1∶25，温度98℃，时间5min，溶解后经过滤、透析后获得重量浓度为5％丝素蛋白溶液；(2)将60℃的饱和Ca(OH)2溶液置于60℃水浴中，缓慢滴加10％wt的H3PO4溶液，滴加过程中快速搅拌，溶液的pH保持在8.7；搅拌3h后置于25℃静置48h，将沉淀离心，将离心所得沉淀物于超声波清洗器中振荡处理30min，得到羟基磷灰石匀浆；(3)在不断搅拌并保持水温为25℃条件下，根据配比需要，将丝素蛋白溶液滴加于羟基磷灰石匀浆中，将混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处理3～5min后取出，向其中缓慢滴加终浓度为0.03％的戊二醛交联剂并搅拌均匀后，快速移入24孔细胞培养平板，并立即放入-20℃冰箱预冷冻12h；(4)将冷冻12h后的载样细胞培养平板取出，在25℃条件下，回温处理10～30min，然后重新放入-20℃冰箱再冷冻24h，然后再次取出放入-50℃冷冻干燥机中干燥，最终制得各种不同比例的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料。
2、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)饱和 Ca(OH)2溶液和10% wt的H3P04溶液的配比为体积比700: 11。
3、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)用氨 水调节pH值，使pH保持在8.7。
4、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)的滴 加过程中使用磁力搅拌器快速搅拌。
5、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)的沉 淀离心的离心速率为4000r/min。
6、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(2)得到 的羟基磷灰石匀浆的钙磷比为1.67。
7、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的比例为1: 9 7: 3。
8、 权利要求1所述的脱胶后的纤维状丝素的脱胶方法，其特征在于包括 以下步骤(1) 将桑蚕茧去蛹后的茧层剪成约lcr^的茧片，放入重量百分比浓度 为0.5% Na2C03沸水中进行脱胶处理，桑蚕茧层与Na2C03溶液的质量比为1 : 30。(2) 30min后，将己成纤维状的蚕茧捞出拧干，并用去离子水清洗多次， 重复上述操作2次，室温下自然晾干后得纤维状脱胶蚕丝，即脱胶后的纤维 状丝素。
9、 权利要求1至6中任一权利要求的方法制得的羟基磷灰石/丝素蛋白 复合多孔支架材料应用于骨组织工程支架材料。
全文摘要
本发明公开了羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的制备方法，包括将丝素蛋白溶液滴加于羟基磷灰石匀浆中，将混合溶液放入超声波清洗器中，振荡处理，向其中滴加戊二醛交联剂并搅拌后，移入细胞培养平板，并放入-20℃冰箱预冷；冷冻12h后，在25℃条件下，回温处理再冷冻24h，然后再次干燥，制得各种不同比例的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料。本发明制备的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料制备工艺简单，需时短，制备条件容易满足；不添加致孔剂，所用试剂少且廉价，成本低；本发明所制备的支架材料孔隙率较高，孔隙分散均匀且孔与孔之间相互贯通，适用于骨组织工程支架材料对孔隙及孔径结构的要求。
文档编号A61L27/56GK101502672SQ20091009678
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月19日 优先权日2009年3月19日
发明者强 丰, 张海萍, 朱良均, 闵思佳 申请人:浙江大学