龙眼肉多糖组分在制药中的应用的制作方法

专利名称：：龙眼肉多糖组分在制药中的应用的制作方法龙眼肉多糖组分在制药中的应用
背景技术：
：据国内外文献报道，龙眼肉主要含有多糖、葡萄糖、栎精、栎素、丹宁、五环三萜类、脑苷脂、龙眼三萜A和龙眼三萜B、38种挥发性成分及维生素B,、B2、P、C等成分。龙眼肉具有安神补血、抗焦虑、降脂护心，益智补肾，调经、壮阳益气、抗衰老等作用。但是从所查阅的国内外文献来看，人们对龙眼的利用仅限于果肉的食用和作为中药配伍成分，对龙眼的研究不够深入，对龙眼肉中的一些极性大分子如多糖的研究基本没有，许多有效的活性成分也未能分离鉴定，还有一些新的活性没有被发现。
发明内容本发明的目的是提供龙眼肉多糖组分在制药中的应用，获得龙眼肉多糖组分LYRP2的体外抗肿瘤及免疫活性的结果。本发明通过以下技术方案达到上述目的龙眼肉多糖组分LYRP2在制备抑制人肿瘤细胞HO8910生长的药物中的应用，龙眼肉多糖组分LYRP2的有效浓度为40320mg/L。龙眼肉多糖组分LYRP2在制备抑制人肿瘤细胞SKV03生长的药物中的应用，龙眼肉多糖组分LYRP2的有效浓度为540mg/L。龙眼肉多糖组分LYRP2在制备促进脾淋巴细胞增殖的药物中的应用，龙眼肉多糖组分LYRP2的有效浓度在16400mg/L。所述龙眼肉多糖组分LYRP2是以P-D-(1—3)-葡萄糖键型为主链，在6-0位有P-D-(1—3)-葡萄糖-P-D-l)-葡萄糖以及P-D-(1—4)-葡萄糖-P-D-l)葡萄糖支链的多糖，1-葡萄糖连接主链末端。本发明的有益效果在于1、获得龙眼肉多糖组分LYRP2以及LYRP2结构，为龙眼的综合利用提供科学依据。2、获得龙眼肉多糖组分LYRP2体外抗肿瘤活性及免疫活性的结果，为龙眼在医药领域的应用提供科学依据。图1是龙眼肉多糖组分LYRP2完全酸水解后高效液相色谱图。图2是标准糖高效液相色谱图。图3是龙眼肉多糖组分LYRP2红外谱图。图4是龙眼肉多糖组分LYRP2甲基化后红外谱图。图5是S印hacrylS-300分子量测定标准曲线。图6是龙眼肉多糖组分LYRP2甲基化后水解气相色谱图。图7是1，5-二乙酰氧基-2,3，4，6-四甲氧基-D-葡萄糖醇质谱图。图8是1，3，5-三乙酰氧基-2，4,6-三甲氧基-D-葡萄糖醇质谱图。图9是l，4，5-三乙酰氧基-2，3，6-三甲氧基-D-葡萄糖醇质谱图。图10是1，3，4,5-四乙酰氧基-2,6-二甲氧基-D-葡萄糖醇质谱图。图11是1，3，5，6-四乙酰氧基-2，4-二甲氧基-D-葡萄糖醇质谱图。图12是龙眼^I多糖组分LYRP2-1和LYRP2-2对人肿瘤细胞H0891072小时细胞毒性表述示意图。图13是龙眼肉多糖组分LYRP2-1和LYRP2-2对人肿瘤细胞SKV0348小时的细胞毒性表述示意图。图14是龙眼肉多糖组分LYRP2-1和LYRP2-2对体外正常BALB/c小鼠的脾淋巴细胞增殖作用表述示意图。具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步描述。实施例l龙眼肉多糖组分LYRP2的制备方法步骤如下1.原料预处理购买龙眼干果剥壳去核后，称重，加入四倍量体积的95v/v%乙醇浸泡48小时后，取出果肉阴干，称重，4'C冷藏。2.热水提取取2.0kg经预处理果肉，加入蒸馏水，匀桨成细果肉粒，加入四倍量体积的蒸馏水，控制温度在9(TC提取4小时，提取结束后用四层纱布过滤，滤渣再重复提取3次，合并滤液，于65"C下薄膜浓縮。3.醇沉待提取液浓縮至粘稠状后，冷却，缓慢倒入4倍体积的95v/vW乙醇中，玻棒搅拌，使沉淀充分散开，密封静置。醇沉物为龙眼肉粗多糖LYR。4.蛋白酶水解法除蛋白称取龙眼肉粗多糖LYR用蒸馏水充分溶解配制成5.00g/mL溶液，往溶液中加入1.00g/mL的木瓜蛋白酶并充分溶解，然后置于5CTC恒温水浴锅中保温反应3h。反应后于IOO'C灭活5min,4000r/min离心15min，沉淀去掉，合并上清液，即得到除蛋白后的龙眼肉粗多糖LYR溶液。重复上述方法一次后，将除蛋白后的龙眼肉粗多糖LYR用旋转蒸发仪浓缩，温度控制在60'C，至没有水分蒸出即可，用95v/vy。乙醇醇沉，在200nm-400nm范围下进行紫外扫描，在260nm-280nm内无吸收峰，即得到棕褐色的除蛋白后龙眼肉粗多糖LYR。5.除色素将已除蛋白的龙眼肉粗多糖LYR配成5.OOg/mL的水溶液，滴加质量百分比浓度为30%的HzO2，其用量为龙眼肉粗多糖LYR溶液体积的15.00y。，用0.1Omol/L的NaOH溶液调节龙眼肉粗多糖LYR溶液的pH值为8.0，于45'C水浴中反应，每隔30min检测一次pH值，确保反应过程中反应液的pH值维持在8.0。4小时后终止反应，冷至室温，用0.10mol/L盐酸调回中性，加入氯化钠，使其浓度在总反应溶液体积中达到5.00g/mL，然后缓慢加入无水乙醇，使其含量在总反应溶液体积中达到3540v/v%，在冰箱中4。C放置过夜，次日离心收集沉淀物，沉淀物经无水乙醇、丙酮反复洗涤后，45'C减压干燥，得白色或淡黄色龙眼肉粗多糖LYR。6、DEAE-纤维素柱层析纯化称取龙眼肉粗多糖LYR2.00g，加入蒸馏水使其充分溶解配成终浓度为5.00g/mL的龙眼肉粗多糖LYR溶液，溶液呈淡黄色，上DEAE-纤维素柱进行初步分离纯化。分别用蒸馏水、0.125mol/L的NaCl、0.30mol/L的NaOH溶液洗脱，控制流速4ml/min，25min收集约100ml，用改良的苯酚一硫酸法跟踪检测，作出洗脱图。根据洗脱图结果，合并相同峰位的收集液。5(TC减压浓縮三个洗脱流分，其中0.125mol/LNaCl溶液洗脱流分再用蒸馏水透析48小时，干燥后分别得水、0.125mol/LNaCl、0.30mol/LNa0H溶液洗脱的三个流分，命名为龙眼肉多糖LYRA、LYRB、LYRC。7、S印hacrylS-300HR凝胶过滤层析纯化加入蒸馏水将龙眼肉多糖LYRB配制成5.00g/mL浓度的溶液，超声助溶1小时，经0.45um微孔滤膜过滤后，上样，按流速为1滴/4s，13min/tube洗脱条件洗脱，并用苯酚-硫酸跟踪检测。合并正态峰的收集液。将收集液于5CTC减压浓縮，醇沉，醇沉物于45'C减压真空干燥，得到分级纯化的白色或微黄色的龙眼肉多糖LYRP2。龙眼肉多糖组分分析方法步骤如下1、多糖的全水解取所述龙眼肉多糖LYRP210mg，加入2mol/L三氟醋酸6ml，在110。C下水解6小时，水解液于<40'。减压蒸干，加入甲醇蒸干，再向样品加入3ml蒸馏水使其溶解，得到水解物。2、水解样的薄层层析TLC分析将所述水解物与标准品葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖以及木糖溶液配成浓度为1.00mg/ml待测液，同时进行三种展开系统薄层层析①按体积比为正丁醇:苯:吡啶乙酸=10:4:4:1;②按体积比为氯仿:吡啶乙醇乙酸=10:3:10:1;③按体积比为乙酸乙酯正丁醇吡啶乙酸=6:5:1.5:4;以苯胺-二苯胺-磷酸的丙酮溶液作显色剂。从表l龙眼肉多糖LYRP2的组分分析结果看出，龙眼肉多糖LYRP2水解液的Rf值与葡萄糖的Rf值相同，说明龙眼肉多糖LYRP2水解液为葡萄糖。表l龙眼肉多糖组分LYRP2的分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、高效液相色谱分析样品处理称取干燥至恒重的龙眼肉多糖组分LYRP25.0mg，加1.5ml蒸馏水溶解，分别称取干燥至恒重的标准品果糖、葡萄糖、蔗糖各5.0mg，分别用lml蒸馏水溶解。色谱条件为柱子TIANHEP/N:TH3025S/N:22N25132KromasilNH25|il00)250mmx4.6mm，Waters2695SeparationsModule(Alliance)检测器蒸发光散射Waters2420ELSDetector流动相按体积比为乙腈水=80:20，流速1.2ml/min，上样量标准品和样品分别上样3^L。从图1中龙眼肉多糖组分LYRP2完全酸水解后高效液相分析图的洗脱峰与图2的葡萄糖洗脱峰对比看出，两者洗脱峰保留时间一致，说明龙眼肉多糖LYRP2组分为葡萄糖。4、红外光谱分析在干燥灯下，取干燥至恒重的龙眼肉多糖组分LYRP2样品少许，与适量己干燥的KBr压片，在4000-400cm"下扫描，扣除背景后得到龙眼肉多糖组分LYRP2的红外扫描图谱。龙眼肉多糖组分LYRP2红外光谱分析结果如图3所示，龙眼肉多糖组分LYRP2在3388crrT1处出现一个宽峰，是龙眼肉多糖组分LYRP2的O-H的伸縮振动，表明龙眼肉多嬙组分LYRP2存在分子内的氢键；2927cm"为C-H不对称伸縮振动峰，此处吸收峰明显，提示其分子结构中甲基和亚甲基含量较大，体现为分子链较长，相对分子量较高；1612cm'1是C=0非对称伸縮振动峰；1413cm"糖类C-H弯曲振动峰；1078cm"附近处的强吸收峰证明组成龙眼肉多糖组分LYRP2的单糖以吡喃糖苷的形式存在。1200-1000cm"有一个特殊的吸收区域，这是环的振动与C-OH的伸縮振动以及吡喃环的C-O-C、C-0伸縮振动叠加的结果；897cm"(3-构型吡喃糖吸收峰。以上均为多糖的典型结构，说明龙眼肉多糖组分LYRP2是P-型端基吡喃环多糖。5、高碘酸氧化和Smith降解高碘酸氧化(1)准确称取龙眼肉多糖组分LYRP250mg，用水溶解，然后加入30mmol/LKI04溶液25.00ml，定容至50.00ml，于室温下放置在暗处反应，间隔时间为0、6、12、24、36、48、60、72、96、112h分别取样lml，用蒸馏水稀释250倍，用紫外-可见分光光度计，以蒸馏水作空白对照，在223nm波长处测光密度值，直到光密度值恒定为止，加乙二醇终止反应，高碘酸氧化完成，根据高碘酸钾浓度与吸光度标准曲线，计算出高碘酸在反应中的消耗量。(2)甲酸生成量的测定平行取3份上述完成高碘酸氧化(1)操作的龙眼肉多糖组分LYRP2氧化液2ml，加1滴溴甲酚红作指示剂，用经邻苯二甲酸氢钾标定的0.0102mol/LNaOH滴定，根据滴定消耗NaOH的量计算反应中甲酸的生成量。Smith降解(1)将上述完成高碘酸氧化(l)操作的龙眼肉多糖组分LYRP2氧化液分别经自来水及蒸馏水透析48小时和24小时。40'C下减压浓縮至50mL，加入40mgKBH4，室温下暗处搅拌还原24h。反应结束后用0.2mol/L乙酸中和至pH为67，再分别经自来水及蒸馏水透析48小时和24小时处理。(2)取被还原的龙眼肉多糖组分LYRP2的1/3体积氧化液减压干燥后，用2mol/L的三氟乙酸于105。C水解8h。取2/3体积被还原的龙眼肉多糖组分LYRP2的氧化液，加入等体积的0.02mol三氟乙酸，室温水解48小时，将水解液于<40°。下减压蒸干，加入甲醇继续蒸干，得Smith降解后的龙眼肉多糖组分LYRP2样品。(3)糖醇衍生化干燥后的(2)样品先加无水吡啶2ml，在9(TC反应0.5小时，再加入2ml乙酸酐于9(TC下反应2h，反应后清除乙酸酐，然后干燥，将衍生化产物进行气相色谱分析。龙眼肉多糖组分LYRP2高碘酸氧化及Smith降解分析结果如表2所示。龙眼肉多糖组分LYRP2经高碘酸氧化96小时后，吸光度值达到恒定，测得消耗4.47mmo1高碘酸，大于甲酸生成量2.064mmo1的两倍，表明龙眼肉多糖组分LYRP2中含有1—6位键合的糖基、非还原末端糖基和只消耗高碘酸不生成甲酸的氧化键型1—2、1—2,6、1—4、1—4,6及不氧化键型1—3、1—2，3、1—2,4、1—3，4、1—3,6、1—2,3,4中的连接。表2龙眼g多糖组分LYRP2高碘酸氧化及Smith降解<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(1)龙眼肉多糖组分LYRP2完全水解后检出葡萄糖，说明它存在不被高碘酸氧化的键型，即存在1—3、1—2，3、1—2,4、1—3,4、1—3,6、1—2,3，4当中的连接方式。(2)透析袋外检出葡萄糖，说明含有不被高碘酸氧化的葡萄糖键型。(3)Smith降解后检出甘油，说明有产生甘油的键型，即存在1—、1—6、1—2、1—2,6当中的连接方式。(4)透析袋内醇沉析出有沉淀，说明主链含有不被高碘酸氧化的1—3、1—2,3、1—2,4、1—3,4、1—3,6、1—2，3，4当中的连接方式。6、龙眼肉多糖组分LYRP2酸水解16小时后的样品及分子量测定(1)、龙眼肉多糖组分LYRP2酸水解16小时称取纯化并干燥后的龙眼肉多糖组分LYRP2样品50mg，加入2ml0.05M三氟乙酸溶液，于90'C条件下水解16小时，降至室温后，4000r/min离心分离10min，得到沉淀物A，将其干燥。上清液用无水乙醇蒸除三氟乙酸至pH为67，然后将蒸除三氟乙酸上清液置于透析袋中以蒸馏水透析24小时，将袋外透析液浓縮，醇沉，得到沉淀物B，将其真空干燥。袋内液浓縮至5ml左右，加5倍体积无水乙醇，醇沉过夜，4000r/min离心分离10min，得到沉淀物C，将其干燥。浓縮上清液，得到浓縮物D，将其真空干燥。(2)、糖腈乙酸酯衍生物的制备分别称取10mg葡萄糖，鼠李糖，甘露糖，半乳糖标准品及步骤1得到的龙眼肉多糖组分LYRP2沉淀物A、B、C和浓縮物D，分别加入10mg盐酸羟胺、0.5ml吡啶，放入9(TC水浴中加热反应30min并振荡，取出后冷至室温，加入0.5ml醋酸酐，在9(TC下继续水浴反应30min进行乙酰化。(3)气相色谱工作条件样品处理将糖腈衍生化后的龙眼肉多糖组分LYRP2反应产物A1、Bl、C1、D1及标准品，减压浓縮至干，加入0.5ml氯仿使残留物溶解后，于10000r/min离心分离10min，得的上清液用于气相色谱分析。Agilent48卯D;进样口温度280。C，检测器温度280°C。柱温程序15(TC保持lmin，以1(TC/min升温至182。C保持2min，再以l'C/min升温至188。C后，以5°C/min升温至240。C保持10min。酸水解16小时产物的气相色谱分析结果如表3所示。表3酸水解沉淀物的^〔相色谱分析结果葡萄糖半乳糖鼠李糖甘露糖透析前沉淀物A+■攀袋外沉淀物B+___袋内醇沉淀物C+画_袋内醇析上清液浓縮物D+---注表中"+"表示检出，"-"表示未检出。由表3结果表明(1)水解完成后离心沉淀物A为葡萄糖，结合完全水解的结果，龙眼肉多糖组分LYRP2完全水解后的产物仅为葡萄糖，说明龙眼肉多糖组分LYRP2以葡萄糖这一单糖构成主链。(2)袋外沉淀物B检出葡萄糖，说明形成龙眼肉多糖组分LYRP2的末端残基为葡萄糖。(3)袋内醇析沉淀物C检出葡萄糖，说明葡萄糖构成靠近龙眼肉多糖组分LYRP2主链核心区的结构。(4)袋内醇析上清液浓縮物D检出葡萄糖，说明葡萄糖形成龙眼肉多糖组分LYRP2支链、主链边缘。7、丙烯葡聚糖凝胶色谱法测定LYRP2酸水解16小时后各产物的分子量S印hacrylS-300层析柱。1.6cmx100cm，LYRP2酸水解16小时后，透析前沉淀物A、袋外沉淀物B、袋内醇析沉淀物C和袋内醇析上清液浓縮物D各5mg分别溶于lml蒸馏水，上样，蒸馏水恒定流速lml/2min平衡一天，洗脱，平衡流速lml/min,每分钟收集一管，洗脱液以硫酸-苯酚法监测，分别取5mg标准葡聚糖dextranT-10,T-40，T-70，T-500及龙眼肉多糖组分LYRP2水解后各样品上样，lmL/min收集，测出洗脱体积Ve，然后再将蓝葡聚糖上同一条柱，求出柱的空体积Vo，根据V尸Ve-Vo与logMw之间存在的线性关系，绘制标准曲线，最后，将待测龙眼肉多糖组分LYRP2按上述不变的条件上柱，求得待测龙眼肉多糖组分LYRP2的Ve，通过标准曲线上的Ve-Vo，査得待测龙眼肉多糖组分LYRP2的分子量对数，求出龙眼肉多糖组分LYRP2分子量M。由表4数据以分子量Mr的对数lgMr为纵坐标，洗脱体积Vr为横坐标绘制标准曲线y=-0.0062x+5.8471r2=0.9952，绘制的标准曲线如图4所示。表4标准糖的洗脱体积数据记录<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>测得透析前沉淀物A、袋外沉淀物B、袋内醇析沉淀物C、袋内醇析上清液浓縮物D的合并体积分别为216ml、366ml、322ml、343ml，死体积为52ml，洗脱体积分别为164ml、314ml、270ml、291ml。根据标准曲线得酸水解16小时后龙眼肉多糖组分LYRP2沉淀物A、B、C和浓縮物D分子量分别为6.8xl(A0.8x104，1.5xl04，I."IO4。其结构分别为主链、支链末端残基，主链核心区结构，支链、主链边缘。8、龙眼肉多糖组分LYRP2甲基化分析龙眼肉多糖组分LYRP2的甲基化反应(1)糖样溶解称取5mg彻底干燥龙眼肉多糖组分LYRP2，溶于6ml二甲亚砜DMSO中，充氮气封管后，室温超声助至全部溶解。(2)碱化龙眼肉多糖组分LYRP2取干燥研磨成粉末氢氧化钠200mg，快速加入到超声溶解的龙眼肉多糖LYRP2-DMS0溶液中，充氮气后加盖密封。(3)龙眼肉多糖组分LYRP2甲基化将(2)混合物在超声波作用下助溶10min，室温磁力搅拌反应lh使其生成糖羟基-醇钠，加入2ml碘甲垸，室温避光反应l小时，得甲基化后的龙眼肉多糖组分LYRP2，加入2ml水终止反应。所得反应物用蒸馏水透析48h后，减压浓縮，真空干燥。(4)萃取甲基化后的龙眼肉多糖组分LYRP2将上述反应液，加入等体积CHCl3，充分振荡30min以萃取甲基化后的龙眼肉多糖组分LYRP2。再用蒸馏水反复洗涤CHCl3层，然后加入无水Na2S04干燥24小时，过滤，蒸除CHCl3至lml左右。(5)红外光谱检测将(4)中获取的产物进行红外光谱检测，如图5所示，LR.图谱在3400cm"处无吸收峰，即无羟基吸收峰，则证明龙眼肉多糖组分LYRP2甲基化完全。甲基化糖的水解、还原及衍生(1)水解完全甲基化的龙眼肉多糖组分LYRP2真空干燥后，加体积比为85%的甲酸lml，充氮气封管，10(TC水解4h，蒸除甲酸，至pH为6至7，真空干燥，再加入2mol/L三氟乙酸2ml，10(TC水解6小时，然后用无水乙醇赶除三氟乙酸至中性，再用蒸馏水赶除乙醇。(2)还原在完全甲基化的龙眼肉多糖组分LYRP2的水解物中加入KBH460mg，室温磁力搅拌还原24h，滴加醋酸至溶液pH<7，减压浓縮至干，再加入甲醇3ml和一滴醋酸，减压浓縮至干，真空干燥。(3)乙酰化将(2)干燥后的样品先加无水吡啶2ml，9(TC反应0.5小时，再加入2ml乙酸酐90'C反应2h，反应后反复加无水乙醇减压浓縮以清除乙酸酐，然后真空干燥。(4)样品分析完全甲基化后的龙眼肉多糖组分LYRP2衍生化产物干燥后，用氯仿溶解，进行GC-MS分析。GC条件色谱柱HP-5MS毛细管柱30mx0.25mmx0.25^im，载气99.999%高纯氦气，柱流量1.0ml/min选用Constflow模式，进样模式脉冲不分流，压力206.7kPa，保持0.5min，进样口温度270'C恒温;柱温程序初温10(TC4min，以15°C/min升至180°C2min，再以5。C/min升至210。C2min,再以4'C/min升至终温250。C5min。MS条件采集方式Scan,溶剂延时3.0min，El源电子能量70eV，质量范围30400amu，气质接口温度280°C，离子源温度230°C,四级杆温度150。C，EMV值1188，调谐方式Autotune龙眼肉多糖组分LYRP2甲基化分析结果见表5和表6。龙眼肉多糖组分LYRP2甲基化的糖醇乙酸酯衍生物的GC.-M.S色谱中的气相色谱图见图6至11。各峰的M.S.图谱见下。根据上述方法解析龙眼肉多糖组分LYRP2的M.S.图谱，通过参考文献及参考美国佐治亚大学糖复合物研究中心(CCRC)的糖质谱数据库分析结果见表5和表6。表5甲基化的龙眼肉多糖组分LYRP2分析结果1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表6甲基化的龙眼肉多糖组分LYRP2分析结果2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>龙眼肉多糖组分LYRP2中1—3，6键型为主要键型，其次为1—3,4、1—、1—3。根据GC.-M.S.分析结果，存在l,5-二乙酰氧基-2,3，4,6-四甲氧基-D-葡萄糖醇为非还原型末端，示侧链主要由l位连接的葡萄糖，存在l，3，5，6-四乙酰氧基-2,4-二甲氧基-D-葡萄糖醇和l，3，4，5-四乙酰氧基-2，6-二甲氧基-D-葡萄糖醇，可确定主链上的分支点为l,3,6-D-葡萄糖和l,3，4-D-葡萄糖。存在l,3，5-三乙酰氧基-2，4，6-三甲氧基-D-葡萄糖醇、1，4，5-三乙酰氧基-2，3，6-三甲氧基-D-葡萄糖醇，确定1,3-D-葡萄糖、1，4-D-葡萄糖构成侧链。各键型的摩尔比表明，龙眼肉多糖组分LYRP2的结构单元，以卩-D-(1—3)-葡萄糖键型为主链，在6-0位有卩。-(1—3)-葡萄糖-卩-D-l)-葡萄糖以及卩-D-(1—4)-葡萄糖-卩-D-l)-葡萄糖支链的多糖，1-葡萄糖连接主链末端。实施例2本实施例是噻唑蓝MTT比色法对龙眼肉多糖组分LYRP2进行体外的抗肿瘤活性检测方法1实验材料人肿瘤细胞SKV03、HO8910;LYRP2-1为分级纯化后的龙眼肉多糖组分LYRP2未除蛋白样品；LYRP2-2为分级纯化后的龙眼肉多糖组分LYRP2除蛋白后样品。2溶液的配制1.RPMI-1640完全培养液取RPMI-1640粉末10.2g，加新鲜三蒸水800mL，加入NaHC032g，HEPES4.766g，充分搅拌至全部溶解，用5.6m/v。/。NaHC03调pH至7,2左右，定容至1000mL，0.22pm孔径的微孔滤膜过滤除菌，分装，4'C冰箱保存。取少量培养液在37°C、在体积比为5。/。C02及饱和湿度条件下培养48h，倒置显微镜下观察有否染菌。使用前加入己灭活的胎牛血清FCS、青霉素、链霉素使之终浓度分别为10m/v%、100U/mL和100U/mL。2.LYRP2-l和LYRP2-2母液精确称量1^￥112-1和LYRP2-2样品各0.0640g样品，用RPMI-1640完全培养基溶解、定容至100mL，配制成640mg/mL待测样品母液，并用0.22Mm孔径的微孔滤膜过滤除菌，待用。3.磷酸盐缓冲液PBS取磷酸盐缓冲液粉25g，溶于800mL新鲜三蒸水中，搅拌溶解，用5.6m/v0/0NaHC03调节pH至7.4，定容至1000mL，分装，于15磅，121°C，20min高压灭菌后，4'C保存备用。4.0.25m/vO/。胰蛋白酶消化液精确称取胰蛋白酶250mg溶于100mLPBS中。充分溶解后0.22pm孔径的微孔滤膜过滤除菌，分装成小瓶，-20°0保存备用。5.5mg/mL的MTT溶液精确称取MTT粉50mg，溶于IOmLPBS缓冲液中。充分溶解后0.22^m孔径的微孔滤膜过滤除菌，分装成小瓶，4'C避光保存备用。6.细胞冻存液RPMI-1640培养液70mL;胎牛血清20mL;二甲亚砜10mL。3实验方法MTT法检测LYRP2-1和LYRP2-2对人肿瘤细胞SKV03、HO8910细胞生长的影响1.实验分组(1)LYRP2-1和LYRP2-2对人肿瘤细胞SKV03影响的分组实验组终浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的LYRP2-1和LYRP2-2;阳性对照组终浓度为5mg/mL的环磷酰胺；空白对照组不加任何药物，只有细胞的RPMI-1640完全培养液；无细胞对照组不加任何药物，不含细胞的RPMI-1640完全培养液(2)LYRP2-1和LYRP2-2对人肿瘤细胞H08910影响的分组实验组终浓度分别为40mg/L、80mg/L、160mg/L、320mg/L的LYRP2-1和LYRP2-2;阳性对照组终浓度为5mg/mL的环磷酰胺；空白对照组不加任何药物，只有细胞的RPMI-I640完全培养液；无细胞对照组不加任何药物，不含细胞的RPMI-1640完全培养液。2.方法(1)人肿瘤细胞SKV03、HO8910均为贴壁生长细胞，将其接种于培养瓶中，加入RPMI-1640完全培养液，置于37'C恒温、体积比为5%的(302及饱和湿度的培养箱中培养。选用对数生长期的贴壁人肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10m/vX胎牛血清的RPMI-1640培养基配成5000个/mL的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种200pL，37°C，体积比为5X的C02培养24h。(2)吸弃上清液，SKV03实验组加入各含LYRP2-l和LYRP2-2不同浓度梯度的培养基各200pL，HO8910实验组加入各含LYRP2-l和LYRP2-2不同浓度梯度的培养基各200^L，各实验组的空白对照组和无细胞对照组加入等体积的RPMI-1640完全培养液，阳性对照组加入10mg/L的环磷酰胺使测定体系的环磷酰胺终浓度为5mg/L，每组设6个复孔。在37'C，体积比为5%的<:02的条件下，SKV03培养48h，HO8910培养72h。(3)弃去上清液，每孔加入IO^L新鲜配制的含5mg/mLMTT的无血清培养基，37'C继续培养4h。小心弃上清，并加入200pL二甲亚砜，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以检测波长为570nm测定光密度值。以下实验结果均为扣除无细胞对照组的OD值的光密度值。3.结果评定按下式计算药物对人肿瘤细胞生长的抑制率-生长抵制率(％)=空白对照组OD值-实验组OD值-无细胞对照组OD值xlO线空白对照组OD值-无细胞对照组OD值以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度IC50。合成化合物或植物提取纯品的ICso〈10mg/L或植物粗提物的1(:5()<20mg/L时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。4.统计学处理应用SPSS13.0软件进行处理，计量资料均采用；is表示，经方差齐性检验后进行单因素方差分析，方差齐性时，采用LSD方法进行组间多重比较；方差不齐时，采用Dunnett'sT3方法进行组间多重比较，以PO.05为差异有统计学意义。4.实验结果1.LYRP2-1和LYRP2-2对人肿瘤细胞SKV03细胞生长的影响表7LYRP2-1对肿瘤细胞SKV0348小时的细胞毒性的分析数据(I±s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注对只含细胞空白对照组*P<0.05，**P<0.01;从表7的实验数据说明LYRP2-1在540mg/L的浓度范围内对人肿瘤细胞SKVO3生长抑制率均在4070M;随着给药浓度的降低，LYRP2-1对SKV03的生长抑制率有下降趋势，经计算LYRP2-l的IC5。为5.6mg/L。各剂量组与只含细胞的空白对照组相比，LYRP2-1的各剂量组对SKV03都具有细胞毒性，结果都具有显著性差异，具有统计学意义。表8LYRP2-2对肿瘤细胞SKV0348小时的细胞毒性的分析数据(；士s,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注对只含细胞空白对照组*P<0.05,**P<0.01;从表8的实验数据说明LYRP2-2在540mg/L的浓度范围内对人肿瘤细胞SKVO3生长抑制率均在3040。/。；随着给药浓度的降低，LYRP2-2对SKV03的生长抑制率有下降趋势，在40mg/L的剂量下，其生长抑制率最高，为39.9%。各剂量组与只含细胞的空白对照组相比，LYRP2-2的各剂量组对SKV03都具有细胞毒性，结果都具有显著性差异，具有统计学意义。如图12所示，对于人肿瘤细胞SKV03，在浓度为5mg/L时，LYRP2-1和LYRP2-2的抑制率分别为49.7%和36.9%;在浓度为10mg/L时，LYRP2-1和LYRP2-2的抑制率分别为52.9%和37.9%;在浓度为20mg/L时，LYRP2-1和LYRP2-2的抑制率分别为65.8M和38.2。/c);在浓度为40mg/L时，LYRP2-1和LYRP2-2的抑制率分别为68.1%和39.9%;相同浓度的未除蛋白LYRP2-1较己除蛋白LYRP2-2对于人肿瘤细胞SKV03具有更高抑制率。2.LYRP2-l和LYRP2-2对人肿瘤细胞HO8910细胞生长的影响从表9的实验数据说明在40320mg/L的浓度范围内对人肿瘤细胞HO8910生长抑制率均在4052%;随着给药浓度的降低，对HO8910的生长抑制率有下降趋势，在320mg/L的剂量下，其生长抑制率最高，为52.1%。经计算LYRP2-1的IC5o为114mg/L。各剂量组与只含细胞的空白对照组相比，LYRP2-1各剂量组对HO8910都具有细胞毒性，结果都具有显著性差异，具有统计学意义。表9LYRP2-1对肿瘤细胞HO891072小时细胞毒性的分析数据(Iis，n-6)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>对>^潘應SA对厲资:*P<0.05，**P<0.01;表10LYRP2-2对肿瘤细胞HO891072小时细胞毒性的分析数据(7士s,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注对只含细胞空白对照组."P0.05，**P<0.01;从表10的实验数据说明LYRP2-2在40320mg/L的浓度范围内对人肿瘤细胞HO8910生长抑制率均在4050。/。；随着给药浓度的降低，对HO8910的生长抑制率有下降趋势，在320mg/L的剂量下，其生长抑制率最高，为50.3。/。。LYRP2-2的ICso为325mg/L。各剂量组与只含细胞的空白对照组相比，LYRP2-2各剂量组对HO8910都具有细胞毒性，结果都具有显著性差异，具有统计学意义。如图13所示，对于肿瘤细胞H08910，在浓度为40mg/L时，LYRP2-1和LYRP2-2的抑制率分别为46.5。/。和41.8%;在浓度为80mg/L时，LYRP2-1和LYRP2-2的抑制率分别为49.7。/。和45.9。/。；在浓度为160mg/L时，LYRP2-1和LYRP2-2的抑制率分别为51.6。/。和46.2。/。；在浓度为320mg/L时，LYRP2-1和LYRP2-2的抑制率分别为52.1。/。和50.3。/。；相同浓度的未除蛋白LYRP2-1较已除蛋白LYRP2-2对于肿瘤细胞HO8910具有更高抑制率。实施例3本实施例是噻唑蓝MTT比色法对龙眼肉多糖组分LYRP2进行体外的对正常小鼠脾淋巴细胞增殖的影响l动物SPF级BALB/c雄性小鼠，体重1822g，体重20士2g，周龄68周。2实验材料LYRP2-1为分级纯化后的龙眼肉多糖组分LYRP2未除蛋白样品；LYRP2-2为分级纯化后的龙眼肉多糖组分LYRP2除蛋白后样品。3实验方法l.实验分组实验组终浓度分别为16mg/L、80mg/L、400mg/L的LYRP2-l和LYRP2-2;阳性对照组终浓度为5mg/mL的刀豆蛋白；空白对照组不加任何药物，只有细胞的RPMI-1640完全培养液；无细胞对照组不加任何药物，不含细胞的RPMI-1640完全培养液2.小鼠脾淋巴细胞的制备颈椎脱臼处死BALB/c小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏置解剖盘中，注意观察脾的大小和颜色，颜色呈红黑色者剃除。将小鼠脾脏置于冰浴的RPMI-1640培养液的蒸发皿中，用镊子将其捣碎，并用200目筛过滤细胞悬液以除去组织块，移至离心管内500r/min离心5min洗涤l次。脾细胞悬液经1800r/min离心5min后用预冷却的RPMI-1640培养液重悬细胞，缓慢加至装有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min离心20min，小心吸取乳白色中间环，1800r/min离心5min，弃上清夜，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞，台盼兰染色计数，活细胞数量大于95%，在37'C，体积比为5。/。的C02饱和湿度中孵育2h，转移细胞悬液于另一培养瓶中，悬浮的即为小鼠脾淋巴细胞。3丄YRP2-l和LYRP2-2体外对正常小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响测定用RPMI-1640完全培养液配成小鼠脾淋巴细胞浓度2xl0MVmL。在96孔培养板中，每孔加入100pL脾淋巴细胞悬液，终浓度为lxl()S个/mL，再分别加入不同浓度药物LYRP2-1和LYRP2-2各100|iL，使其终浓度分别为400mg/L、80mg/L、16mg/L，同时设阳性对照孔加IOO^LConA，终浓度为5mg/L、空白对照和无细胞对照组，以排除假阳性。每个浓度均设3个复孔，每孔总体积200pL。在37T:，体积比为5%的C02饱和湿度中孵育72h。然后每孔加入5mg/mLMTT10(iL,继续培养4h，孔板离心机3000r/min离心10min，小心吸弃上清液，再加入二甲亚砜200pL/L，于微量振荡器上缓慢振荡10min，使蓝紫色甲瓒结晶完全溶解，酶标仪上于570nm处测吸光度值。以下实验结果均为扣除无细胞对照组的OD值的光密度值。3.结果评定按下式计算药物对淋巴细胞增殖作用的影响刺激指数(SI)(100%)=实验组OD值-无细胞对照组OD值-xlOO%空白对照组OD值-无细胞对照组OD值4.统计学处理应用SPSS13.0软件进行处理，计量资料均采用；士s表示，经方差齐性检验后进行单因素方差分析，方差齐性时，采用LSD方法进行组间多重比较；方差不齐时，采用Dunnett'sT3方法进行组间多重比较，以PO.05为差异有统计学意义。4.体外对正常小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注对只含细胞空白对照组"P0.05，**P<0.01;从表ll的实验数据说明浓度在16400mg/L范围内LYRP2-1随着浓度的降低刺激指数降低；在400mg/L的剂量下，其刺激指数最高，为124%。各剂量组与只含细胞的空白对照组相比，各剂量组在体外对正常小鼠脾淋巴细胞都有增殖作用，均具有显著性差异，具有统计学意义。表12LYRP2-2体外对正常BALB/c小鼠的脾淋巴细胞增殖作用的分析数据(I±s，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注对i拿箱i^^7^^带资:AP0.05,**P<0.01;从表12实验数据说明浓度在16400mg/L范围内，随着LYRP2-2浓度的降低，刺激指数具有下降趋势；在400mg/L的剂量下，其刺激指数最高，为140%。各剂量组与只含细胞的空白对照组相比，LYRP2-2各剂量组对体外正常小鼠脾淋巴细胞都有增殖作用，均具有显著性差异，具有统计学意义。如图14所示，对体外正常小鼠脾淋巴细胞，在浓度为16mg/L，LYRP2-1和LYRP2-2的刺激指数分别为113。/。和131。/。；在浓度为80mg/L，LYRP2-1和LYRP2-2的刺激指数分别为114e/。和135。/。；在浓度为400mg/L，LYRP2-1和LYRP2-2的刺激指数分别为124%和140%;相同浓度的己除蛋白的LYRP2-2较未除蛋白的LYRP2-1对体外正常小鼠脾淋巴细胞具有更高的刺激指数。权利要求1、龙眼肉多糖组分在制药中的应用，其特征在于，龙眼肉多糖组分LYRP2在制备抑制人肿瘤细胞HO8910生长的药物中的应用，龙眼肉多糖组分LYRP2的有效浓度为320～40mg/L。2、龙眼肉多糖组分在制药中的应用，其特征在于，龙眼肉多糖组分LYRP2在制备抑制人肿瘤细胞SKV03生长的药物中的应用，龙眼肉多糖组分LYRP2的有效浓度为540mg/L。3、龙眼肉多糖组分在制药中的应用，其特征在于，龙眼肉多糖组分LYRP2在制备促进脾淋巴细胞增殖的药物中的应用，龙眼肉多糖组分LYRP2的有效浓度为16400mg/L。4、根据权利要求1至3所述龙眼肉多糖组分在制药中的应用，其特征在于，所述龙眼肉多糖组分1^10>2是以3-0-(1—3)-葡萄糖键型为主链，在6-0位有卜D-(1—3)-葡萄糖-e-D-l)-葡萄糖以及e國D-(1—4)-葡萄糖-P-D-l)曙葡萄糖支链的多糖，1-葡萄糖连接主链末端。全文摘要本发明涉及龙眼肉多糖组分LYRP2在制药领域中的新用途。该产品具有抑制人肿瘤细胞HO8910和SKVO3生长的作用，对体外正常小鼠脾淋巴细胞有增殖作用。文档编号A61P37/00GK101579352SQ200910114100公开日2009年11月18日申请日期2009年5月27日优先权日2009年5月27日发明者吴华慧,李福森,李雪华,庆肖,琦贾,黄燕军,黄雪芳申请人:广西医科大学