九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用的制作方法

专利名称：：九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用的制作方法九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用本发明涉及对糖尿病具有治疗作用的中药有效部位，属于中医中药领域。
背景技术：
：目前糖尿病发病率和病死率逐渐上升，已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后，危害人类健康的第三大病种，我国糖尿病的发病率与国外发达国家相比虽然并不算高，但我国人口众多，病人的绝对人数却居世界首位。因此，寻找安全有效的药物用于防治糖尿病成为医学研究的重要课题之一。目前用于治疗2型糖尿病的口服降糖药包括磺酰脲类、双胍类、胰岛素增敏剂、促胰岛素分泌药、醛糖还原酶抑制剂等。而这些口服降糖药存在低血糖症、胃肠道反应等副作用，同时随着治疗时间的延长，降糖效果呈降低趋势。九里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]为芸香科九里香属植物，主要产自我国云南、贵州、湖南、广东、广西、福建、台湾等地。到目前为止从九里香[Murrayapaniculata(L.)Jack]叶中共分得9个黄酮类化合物，分别是3，5，6，7，8，3'，4'，5'-八甲氧基黄酮(3,5，6，7，8，3',4',5'—octaraethoxyflavone)、3，5，6，7，3'，4'，5'—^匕甲氧基黄酮(3，5，6，7，3'，4'，5'-h印tamethoxyflavone)(江苏新医学院，中药大辞典，上册，上海人民出版社，1977:44-45);5，7，8，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮(5，7,8,3'，4',5'—hexamethoxyflavone)、3，5，7，8，3'，4'，5'—七甲氧基黄酮(3,5，7，8，3'，4',5'-h印tamethoxyflavone)(植物学报1984，26(2):184-186);5，7，3',4'，5'-五甲氧基黄酮(5,7，3'，4',5'-pentamethoxyflavone)(化学学报1984，42，1308-1311)以及5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮以及3'-羟基-5，7，4'-三甲氧基黄酮(中国专利《千里香叶总黄酮及其制备方法及应用》，申请号200710147357.2)。
发明内容本发明提供的是一种植物提取物的新的医药用途，即九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用。所述九里香叶总黄酮其特征在于其中至少含有5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。而且其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮的含量之和大于50%或者5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮和5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮的含量之和大于50%。本发明所述的药物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等口服剂型，也可以是注射剂等非口服剂型。另外本发明所述的九里香叶总黄酮可以与其他药物包括化学药、中药以及天然药物组成复方药物用于糖尿病的治疗。本发明是通过如下创新性研究完成的。(1)通过对九里香叶化学成分的提取分离，从九里香叶中分得了6种黄酮类化合物，并通过NMR等波谱数据的分析鉴定了其结构，它们分别是5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7,3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮以及3'-羟基-5，7，4'-三甲氧基黄酮(2)通过提取纯化工艺的研究，完成了九里香叶总黄酮的制备工艺，所得九里香叶总黄酮以5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮为主要成分(3)建立了5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮的HPLC含量测定方法，测定结果表明九里香叶总黄酮中上述黄酮类化合物的含量之和在50%至100%之间(4)通过动物实验发现了九里香叶总黄酮对糖尿病的治疗作用(5)对以九里香叶总黄酮为活性成分的药物制剂进行了研究，从而完成了本发明。具体如下。1、九里香叶化学成分的提取分离及结构鉴定(中国专利《千里香叶总黄酮及其制备方法及应用》，申请号200710147357.2)。2、九里香叶总黄酮的制备工艺(中国专利《千里香叶总黄酮及其制备方法及应用》，申请号200710147357.2)。3、九里香叶总黄酮中黄酮含量测定(1)仪器、试剂、对照品Agilent1100Series高效液相色谱仪Z0RBAXExtend—C184.6X250誦ODS，5wm色谱柱VWD可变波长自外检测器色谱甲醇、二次蒸馏水(2)色谱条件色谱柱用ZorbaxExtendODS柱，4.6X250,，5um;柱温为25。C;流动相为甲醇水=58:42;流速为1.2mL/min;检测波长为337nm;进样量为20y1。(3)对照品溶液的制备分别取5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮和7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1毫升分别含0.4、0.3、0.03、0.03、0.04毫克的溶液，摇匀，即得。(4)供试品溶液的制备取九里香叶总黄酮100mg，精密称定，加甲醇溶解，超声提取3次，每次加甲醇15ml，超声时间均为20min，合并提取液，蒸干溶剂，加甲醇溶解并定容至100ml，滤过，取续滤液作为供试品溶液。(4)测定方法分别精密吸对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，利用外标一点法进行含量计算。具体实施方式实施例1取九里香叶2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分别为10、8、6倍，回流时间分别为60、45、30分钟，滤过，合并提取液，减压浓縮至无乙醇味，加水稀释，过AB-8大孔吸附树脂吸附，50升千分之一氢氧化钠水溶液冲洗，水洗至中性，85%乙醇洗脱至薄层层析检测不到JA(5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮)为止，洗脱液减压回收乙醇，得九里香叶提取物。取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱，收集黄酮部分，回收溶剂，得九里香叶总黄酮38克。经HPLC检测，其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮含量为39.8%，5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮含量33.2%为，5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮含量为3.2%、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮含量为2.8%，7-羟基_5，3'，4'-三甲氧基黄酮含量为5.0%。实施例2取九里香叶2公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分别为IO、8、6倍，回流时间分别为60、45、30分钟，滤过，合并提取液，减压浓縮至无乙醇味，加水稀释，过D4020大孔吸附树脂吸附，80升千分之一氢氧化钠水溶液冲洗，水洗至中性，85°/。乙醇洗脱至薄层层析检测不到JA(5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮)为止，乙醇洗脱液过D941脱色树脂脱色，减压回收乙醇，得九里香叶提取物。取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱，收集黄酮部分，回收溶剂，得九里香叶总黄酮31克。取此九里香叶总黄酮再次进行硅胶柱层析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱，5收集黄酮部分，回收溶剂，得精制九里香叶总黄酮26克。经HPLC检测，其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮含量为50.6.0%，5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮含量41.2%为，5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮含量为1.2%、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮含量为1.8%，7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮含量为2.0%。实施例3取九里香叶l公斤，85%乙醇回流提取3次，乙醇量分别为IO、8、6倍，回流时间分别为60、45、30分钟，滤过，合并提取液，减压浓縮至无乙醇味，加水稀释，过AB-8大孔吸附树脂吸附，85%乙醇洗脱至薄层层析检测不到JA(5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮)为止，洗脱液减压回收乙醇，得九里香叶提取物。取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析，乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱，收集黄酮部分，回收溶剂，得九里香叶总黄酮37克。经HPLC检测，其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮含量为24.8%，5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮含量21.2%为，5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮含量为2.0%、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮含量为1.6%,7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮含量为3.0%。实施例4取九里香叶总黄酮10克，加淀粉适量，制粒，装入胶囊，制成1000粒，得九里香叶总黄酮胶囊。实施例5取九里香叶总黄酮10克，加预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠适量，制粒，压片，制成1000粒，得九里香叶总黄酮片。实施例6取九里香叶总黄酮10克，加吐温80适量，加10升加热溶解，高温灭菌，分装成100瓶，得九里香叶总黄酮口服液。实施例7取九里香叶总黄酮10克，加入1000ml丙二醇和1000ml注射用水，搅拌溶解，过滤，灭菌，罐装，每支2ml，得九里香叶总黄酮注射液。实验实施例第一部分九里香叶总黄酮对肾上腺素所致高血糖小鼠的影响1实验材料1.1实验动物健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重1620g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，质量合格证号SCXK-(吉)2003-0001。九里香叶总黄酮，自制，批号070905(实施例l所得样品，以下简称TFMP1)，071018(实施例2所得样品，以下简称TFMP2)，071028(实施例3所得样品，以下简称TFMP3)。1.2药品与试剂上海禾丰制药有限公司批号070303天津太平洋制药有限公司批号070416优克糖惠基生物科技股份有限公司盐酸肾上腺素注射液二甲双胍1.3主要仪器血糖仪优克糖血糖试纸2实验方法昆明种小鼠90只，雌雄各半，按体重随机分为9组空白对照组给予O.5%CMC-Na模型组给予0.5%CMC-Na二甲双胍组给予二甲双胍100mg/kgTFMP1小剂量组给予TFMPl50mg/kgTFMPl大剂量组给予TFMPllOOmg/kgTFMP2小剂量组给予TFMP250mg/kgTFMP2大剂量组给予TFMP2lOOmg/kgTFMP3小剂量组给予TFMP350mg/kgTFMP3大剂量组给予TFMP3lOOmg/kg各组动物按上面方案灌胃给药(容量为20ml/kg)，每日l次，共10日，实验动物于给药第9日禁食不禁水12h，第10日以优克糖血糖仪测定空腹血糖值(mmol/L)为药前值，然后给药。末次药后l小时，除对照组外其他各组动物分别皮下注射O.P/。肾上腺素0.25mg/kg，注射后于30、60、90min断尾取血，用血糖仪测定血糖值(鹏ol/L)。3统计学分析数据以均数士标准差(f±S)表示，统计分析采用组间比较t检验。4实验结果结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠注射肾上腺素后3090min血糖均明显升高，有显著性差异(代O.Ol)。与模型组比较，二甲双胍组和TFMP1、TFMP2大剂量组及TFMP3小、大剂量组注射肾上腺素后60min、90min血糖值均明显下降(代O.05或代O.01)，提示TFMP1、TFMP2及TFMP3均可明显对抗肾上腺素所致小鼠高血糖，结果见Tab.1。Tab丄EffectofTFMPonbloodglucoseinhyperglycemiamiceinducedbyadrenaline(JT士iS,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二部分TFMP的糖耐量实验1实验材料1.1实验动物健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重1620g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，质量合格证号SCXK-(吉)2003-0001。1.2药品与试剂10%葡萄糖注射液吉林科伦康乃尔制药有限公司批号S070224LI格列本脲天津太平洋制药有限公司批号0702051.3主要仪器血糖仪优克糖优克糖血糖试纸惠基生物科技股份有限公司2实验方法昆明种小鼠90只，雌雄各半，按体重随机分为9组空白对照组给予O.5%CMC-Na模型组给予0,5°/。CMC-Na格列本脲组TFMP1小剂量组TFMP1大剂量组TFMP2小剂量组TFMP2大剂量组TFMP3小剂量组TFMP3大剂量组给予格列本脲50mg/kg给予TFMP150mg/kg给予TFMPll(K)mg/kg给予TFMP250mg/kg给予TFMP2lOOmg/kg给予TFMP350mg/kg给予TFMP3lOOrag/kg各组动物按以上方案灌胃给药，每日1次，连续10日，实验动物于给药第9日禁食不禁水12h，第IO日以血糖仪测定空腹血糖值(mmolZL)为药前值，然后给药。末次药后l小时，除对照组外其他各组经腹腔注射葡萄糖2g/kg，测定0.5、1、2小时的血糖值，观察各组药物作用。3统计学分析数据以均数士标准差(f±S)表示，统计分析采用组间比较t检验。4实验结果结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠注射葡萄糖后30120min血糖均明显升髙，有显著性差异(代O.Ol)。与模型组比较，格列本脲组注射葡萄糖后60、120min血糖值明显下降(代O.05);TFMP1、TFMP2及TFMP3小、大剂量组注射葡萄糖后60min、120min血糖值均有下降趋势，但无统计学意义("0.05)。提示TFMP1、TFMP2及TFMP3对葡萄糖所致小鼠高血糖无显著性作用，结果见Tab.2。Tab.2.EffectofTFMPonbloodglucoseinhyperglycemiamiceinducedbyglucose(X±5"，n=10)FBG(画1/L)GroupOmin30min60min120minControlModelTFMP150mg/kg100mg/kgTFMP250mg/kg100mg/kgTFMP350mg/kg8.59±1.839.09±1.609.26±1.679.12±1.699.41±2.059.67±2.129.60±1.0218.47±7.28*:21.63±6.5316.93±5.7217.33±4.1415.62±3.709.93±1.0215,15±5.4(T14.45±3.8611.39±3.60丄3.09±4.3212.58±3.278.80±1.0013.41±3,36*'12.30±4.0011.52±3.7911.36±3.2710.59±2.659.38±1.9218.24±4.8712.18±2.4911.38±3.50100mg/kg9.56±2.0217.27±3.4411.55±3.2111.12±3.21Glibenclamide50mgZkg9.84±1.6518.97±4.67丄丄.22土2.06*10.32±3.20*#代0.05,w代0.01vsControl;*尸<0.05，林代O.01vsModel第三部分TFMP对大鼠实验性2型糖尿病的影响1实验材料1.1实验动物健康Wistar大鼠，雄性，体重230290g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，质量合格证号SCXK-(吉)2003-0001。1.2药品与试剂链脲佐菌素美国Sigma化学公司批号:20070512二甲双胍灭津太平洋制药有限公司批号:070416胆固醇上海新兴化工研究所批号:060228丙硫氧嘧啶上海复星朝晖药业有限公司批号:070602吐温-80天津市昆达工贸有限公司批号:0703171，2-丙二醇天津市博迪化工有限公司批号:20061003戊巴比妥钠中国上海批号:060612TC测试盒温州津玛生物科技有限公司批号:2007090384HDL测试盒温州津玛生物科技有限公司批号:2007080011LDL测试盒温州津玛生物科技有限公司批号:2007080160TG测试盒温州津玛生物科技有限公司批号:2007090383肝糖原测试盒南京建成生物研究所批号:20070924SOD测试盒南京建成生物研究所批号:20071122MDA测试盒南京建成生物研究所批号:20071121iL-1e放免测试盒解放军总医院科技放免所批号:20071130IL-6放免测试盒解放军总医院科技放免所批号:20071130TNF-a放免测试盒解放军总医院科技放免所批号:20071130INS放免测试盒解放军总医院科技放免所批号:20071130C肽放免测试盒解放军总医院科技放免所批号:200711301.3主要仪器血糖仪优克糖优克糖血糖试纸惠基生物科技股份有限公司LDZ5-2型普通离心机北京医用离心机厂DR-HW-1电热恒温水温賴北京西城区医疗器械厂7202B型可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司GAMMAmaticII型r计数器瑞士K0NTR0N公司QL-901Vortex混悬器海门市其林贝尔仪器制造2.实验方法2.1药物配制脂肪乳配方猪油25%，胆固醇1%，丙硫氧嘧啶1%，吐温-8025%，1,2-内二醇20%。脂肪乳制备取猪油25g放入200ml烧杯中，加热至iO(TC，加入25ml吐温_80，制成油相。另一烧杯中加入30ml蒸馏水和20ml1，2-丙二醇加热，制成水相。然后将水相加入油相，充分混匀，即制成脂肪乳剂。链脲佐菌素(STZ)，临用时以O.1mol/L，PH4.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制成1%的STZ溶液。将TFMP用0.5%CMC-Na配成0.7%、0.35%的溶液，二甲双胍在研钵内用0.5%CMC-Na配成O.7%的溶液。2.2动物造模将250只Wistar大鼠随机分为正常组和模型组，正常组大鼠给予蒸馏水10mi/kg，模型组大鼠在正常饮食基础上按10ml/kg灌胃(ig)给脂肪乳剂，iO日后，正常组和模型组随机取12只大鼠尾静脉取血检测血清TC、TG、FFA含量。然后，各组动物禁食不禁水12小时，正常组舌下iv0.lmol/L，WW.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，模型组舌下ivSTZ30mg/kg，药后4小时ig给模型组大鼠25。/。葡萄糖溶液避免低血糖反应，72h后从造模大鼠中选取空腹血糖值〉11.lmmol/L的大鼠为2型糖尿病模型大鼠。2.3分组及给药方法将2型糖尿病模型大鼠按血糖和体重随机分为ll组，每组15只，g口TFMP1大、中、小剂量组、TFMP2大、中、小剂量组、TFMP3大、中、小剂量组、二甲双胍组及模型对照组。具体给药方案为正常对照组给予0.5%CMC-Na模型对照组给予0.5%CMC-Na二甲双胍组TFMP1小剂量组TFMP1中剂量组TFMP1大剂量组TFMP2小剂量组TFMP2中剂量组TFMP2大剂量组TFMP3小剂量组TFMP3中剂量组TFMP3大剂量组给予二甲双胍70mg/kg给予TFMP17.5mg/kg给予TFMP35mg/kg给予TFMP70mg/kg给予TFMP17.5mg/kg给予TFMP35mg/kg给予TFMP70mg/kg给予TFMP17.5mg/kg给予TFMP35mg/kg给予TFMP70mg/kg各组动物按照上述方案ig给药，连续4周。2型糖尿病大鼠ig给脂肪乳10ml/kg，每3日给药1次。每周断尾取血，用血糖仪测定空腹血糖值一次，以实测值或变化百分率进行组间比较。各组存活动物于第四周最后1次给药前禁食不禁水12h，测定空腹血糖值，ig给药，药后lh腹腔注射3。/。戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，腹主动脉采血，分离血清，进行各种生化指标和放免指标的测定。采集各鼠同一部位肝脏，测定肝糖原含量。采集各鼠胰腺，10%甲醛固定。2.4观测指标及测定方法2.4.1—般状态观察监测实验过程中空白组及糖尿病各组大鼠的一般状态、体重、摄食及摄水等变化，并记录各组大鼠每日的摄食摄水量。2.4.2血糖和肝糖元的测定测血糖前夜，各组大鼠禁食不禁水12h，次日断尾取血，用血糖仪和优克糖试纸测定空腹血糖值，每周1次。给药第28日采集各鼠同一部位肝脏，按照肝糖元试剂盒说明书测定肝糖原含量。2.4.3糖尿病相关的氧化因子的测定腹主动脉采血约6ml，注入干净的试管内，4°C，2000rpm离心10min，分离血清，按相应的试剂盒说明书要求严格操作，一部分血清用于测定血清中TC、TG、HDL、LDL、SOD、MDA含量；另外一部分血清用放射免疫分析方法测定IL-10、IL-6、TNF-ct、INS、C肽含量，以HomaModel方法计算ISI和胰岛素抵抗指数(Homa-IR)。2.4.4胰岛细胞形态学观察采集各鼠胰腺，10%甲醛固定，作免疫组化，进行胰岛细胞的形态学观察。13.统计学分析数据以均数土标准差±S)表示，计量资料进行组间t检验。4.实验结果4.1高脂饮食对正常大鼠血脂的影响与正常组比较，模型组大鼠连续ig脂肪乳剂10日后出现血脂代谢紊乱TC、TG、FFA含量均显著增高(代O.Ol)，结果见Tab.3。Tah.3.Effectofhighlyfattedfoodonserumlipidinnormalrats(X士5",n=12)GroupTC(mmol/L)TG(mmol/L)FFA—ol/L)Control1.59±0.260.64±0.110.74±0.31Model1.79±0.29*0.80±0.16#1.22±0.34**'代O.05，**代0.01vscontrol4.2TFMP对T2DM大鼠FBG及肝糖原的影响在模型组大鼠出现血脂代谢紊乱的基础上舌下iv30mg/kgSTZ后，模型对照组大鼠第0、1、2、3、4周血糖值与正常对照组相比均显著升高(代O.Ol)，第4周肝糖原含量与正常对照组相比明显降低(代0.05)，表明大鼠T2DM模型建立成功。与模型对照组比较，TFMP1、TFMP2及TFMP335、70mg/kg剂量组及二甲双胍组于药后第3、4周FBG均明显降低(代0.05或代O.01)，第4周肝糖原含量明显升高(代0.05或代0.01)，提示TFMP1、TFMP2及TFMP3可显著改善T2DM大鼠的高血糖症状，提高肝糖原含量，见Tab.4及Tab.5。Tab.4.EffectofTFMPonbloodglucoseinT2DMratsd±S)Bloodglucosecontentaftertreated(mmol/UGroup-0W1W2W3W4WNormal6.34±0.475.09±0.425.94±0.505.91±0.495.05±0.30Model23.44±4.89"20,33±7.69s*23.57±7.37**22.16±4.8420.27±4.24*sTFMP117.5mg/kg23.46±4.4219.28±7.6319.94±4.9718.67±5.7919.46±5.7635mg/kg22.61±3.9817.50±5.0019.77±2.1616.45±4.50*15.17±2.54*70mg/kg24.18±4.0416.20±3.5317.60±3.2715.16±3.ll林14.92±5.15*TFMP217.5mg/kg23.56±5.1818.89±5.2418.26±5.2618.11±5.3418.57±5.8235mg/kg24.37±4.2716.27±6.7217.07±5.1816.15±4.87*15.87±3.16*70mg/kg23.49±3.6716.01±4.5816.25±6.2115.04±3.24林15.18±5.36*TFMP317.5mg/kg24.06±5.0217.85±4.2917.97土5.1817.56±5.9817.21±5.3735mg/kg23.58±4.2417.14±5.2716.88±5.3515.42±3.28氺*15.21±3.04氺70mg/kg22.96±3.7816.47±4.6717.26±5.2515.01±3.17氺*14.95±4.98*Metformin70mg/kg24.68±5.8515.22±6.3414.19±5,36**14,73±5.27林14.89±3.37**"代O.05，*#代0.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodelTab.5.EffectofTFMPonliverglycogencontentinT2DMrats(7±<S)GroupDose(mg/kg)liverglucogen(mg/gliver)Normal—10.01±2.36DiabetesModel一7.77±2.09ttT匿l17.59.31±2.47359.92±1.89*709.94±2.00*TFMP217.59.28±2.02359.87±1.77*709.99±1.96*TFMP317.59.06±1.68359.97±1.58*7010.02±2.32*Metformin7010.51±1.89***代0.05vsno服l;*代0.05，林代O.01vsmodel4.3TFMP对T2DM大鼠血脂及脂代谢的影响与正常组比较，模型对照组TG、TC、LDL-C含量均显著升高(代O.05或代O.01)，HDL-C含量明显下降(代O.01);与模型对照组比较，TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg剂量组的TC、TG及LDL-C含量均显著下降，而HDL-C含量明显上升(代O.05或代0.01);TFMP1、TFMP2及TFMP335mg/kg组的TC含量显著下降，HDL-C含量明显上升(代().05)，表明TFMP可改善T2DM大鼠的血脂代谢紊乱。结果见Tab.6。Tab.6.EffectofTFMPonserumlipidinT2DMrats(X±S)TCTGHDL-CLDL-CGroup(醒ol/L)(mmol/U(mmol/L)(隱ol/L)Normal1.74±0.390.70±0.250.98±0.260.66±0.33Model2.48±0,60#*1.16±0.44*0.68±0.19#*1.26±0.55#TFMPl17.5mg/kg2.23±0.341.02±0.370.82±0.321.12±0.4235mg/kg2.00±0.35*0.82±0.370.92±0.25*0.93±0.2970mg/kg1.90±0.22氺*0.75±0.21*0.94±0.28*0.83±0.29*TFMP217.5mg/kg2.30±0.571.13±0.480.85±0.381.12±0.4235mg/kg2.06±0.30*0.89±0.310.93±0.27*0.93±0.2970mg/kg1.98±0.48*0.77±0.25*0.96±0.30*0.83±0.29*TFMP317.5mg/kg2.18±0.621.09±0.290.79±0.411.15±0.4735mg/kg2.10±0.25*0.93±0.320.90±0.450.98±0.3170mg/kg1.87±0.27承*0.73±0.28*0.93±0.24*0.80±0.25*Metformin70mg/kg1.92±0.30*0.74±0.26*0.95±0.27*0.76±0.32*匕代O.05，"#代0.01vsnormal;*代0.05，林代O.01vsmodel4.4TFMP对T2DM大鼠胰岛素分泌功能及胰岛素抵抗的影响与正常组相比，模型对照组血清中胰岛素和C-肽含量及胰岛素分泌指数ISI显著下降(代O.Ol)，Homa-IR明显升高(代O.01);与模型对照组比较，二甲双胍组和TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg剂量组的胰岛素和C-肽含量及ISI显著升高(代O.05或代0.01)，Homa-IR明显降低(代O.05或代O.01)，TFMP1、TFMP2及TFMP335mg/kg剂量组的C-肽含量及ISI显著升高(代O.05)，Homa-IR明显降低(代O.05)，说明TFMP能改善T2DM胰岛e细胞功能，促进胰岛素分泌，增强组织对胰岛素的敏感性，改善IR。结果见Tab.7。Tab.7.EffectofTFMPonIns，C-p印tide，Homa-IRandISIinT2DMrats(7±5)GroupIns(yIU/ml)C-peptide(ng/ml)Hotna-IRISINormal29.30±9.590.49±0.156.35±0.48394.70±156.05Model7.87±2.83能0.32±0.089s*20.62±4.25"9.91±3.68ssTFMPl17.5mg/kg10.33±3.580.35±0.1519.92±5.8114.01±5.2535mg/kg9.78±3.860.43±0.16.77±2.16.22±8.20*70mg/kg12.65±4.79*0.46±0.16*15.48±5.19*27.34±18.56*TFMP217.5mg/kg10.47±3.660.37±0.3418.87±4.5314.04±4.6635mg/kg10.92±4.030.45±0.23*16.12±2.58*16.25±7.28*70mg/kg13.14±4.55*0.44±0.13*15.93±4.85*26.30±15.59**TFMP317.5mg/kg10.68土3.790.33±0.4219.15±5.5714.09±5.3335mg/kg10.55±3.430.46±0.25*16.52±3.16.76±6.46*70mg/kg12.98±4.26*0.48±0.24*15.07±4.52*25.30±16.56**Metformin70mg/kg12.95土3.22**0.49±0.IO林15.46±3.27林26.74±16.31**代O.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodel4.5TFMP对T2DM大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响与正常组相比，模型对照组SOD活性明显降低(代O.Ol)，MDA含量明显增加(代O.Ol);与模型对照组比较，TFMP1、TFMP2及TFMP335、70mg/kg剂量组及二甲双胍组的SOD活性明显提高(代O.05或代O.Ol)，TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg剂量组及二甲双胍组的MDA含量明显降低(代0.05)，结果见Tab.8。Tab.8EffectofTFMPonSODactivityandMDAcontentinT2DMrats(^±5)GroupDose(mg/kg)S0D(U/ml)MDA(腸l/ml)Nornal_338.57±50.8912.68±3.72DiabetesModel—245.96±74.8(T22.59±3.45賴TFMPl17.5300.27±50.7421.20±5.1935318.29±40.30*19.71±3.5370328.32±39.72*18,29±3.43*TFMP217.5297.68±61.3221.57±4.8835324.56±42.48*22.04±5.1870325.39±41.76*18.04±3.55承TFMP317.5312.36±52.3521.40±5.3335320.41±45.19.89±4.1370331.30±31.54林18.16±3.27*Metformin70323.95±29.73**18.27±4.81*賴代O.01vs證mal;*代0.05,林代O.01vsmodel4.6TFMP对T2DM大鼠血清IL-lp、IL-6、TNF-a的影响与正常组相比，模型对照组IL-1e、IL-6及TNF-a含量均明显升高(P〈0.05或P〈0.01);与模型对照组比较，二甲双胍组及TFMP1、TFMP2及TFMP335、70mg/kg剂量组的IL-1e含量均明显降低(P〈0.05或P〈0.01);TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg剂量组的IL-6含量明显下降(P<0.05);TFMP1、TFMP2及TFMP3三个剂量组的TNF-a含量有下降趋势，但无显著性差异(ZM).05)。结果见Tab.9。Tab.9.EffectofTFMPonIL-lp、IL-6andTNF-ainT2DMrats(亍±。GroupIL-10(ng/ml)IL-6(pg/mL)TNF-a(ng/ml)Normal0.086土O.046132.95±22.081.405±0.399DiabetesModel0.164±0.07M179.58±47.54s1.965±0.520sTFMPl17.5mg/kg0.141±0.051157.62±34.691.783±0.44935mg/kg0.105±0.050*152.33±31.321.774±0.35870mg/kg0.092±0.037**143.21±19.49*1.637土0.276TFMP217.5mg/kg0.146±0.042159.61±37.221.769±0.53135mg/kg0.110±0.043*158.41±43.671.712±0.13870mg/kg0.090±0.035**140.65±21.09*1.572±0.358TFMP317.5mg/kg0.150±0.056161.65±28.321.641±0.56835mg/kg0.108±0.042*155.37±36.471.625±0.45770mg/kg0.094±0.032**139.77±24.13*1.605±0.376Metformin70mg/kg0.101±0.054*153.43±35.251.879±0.396:代0.05，**代0.01vsnormal;*代0.05，**代0.01vsmodel4.7胰岛细胞形态学观察与正常对照组比较，模型组胰岛数目减少，胰岛结构失去完整性，胰岛细胞分散，分布不均匀，胰岛内P细胞数明显减少；与模型对照组比较，二甲双胍组及TFMP1、TFMP2、TFMP3组的胰岛数目增多，胰岛结构趋向完整，胰岛内0细胞数增多，对胰岛的损伤有较好的改善作用。结论1)TFMP对小鼠肾上腺素所致高血糖有明显的对抗作用，于药后60min开始起效持续到90min。2)TFMP对小鼠葡萄糖所致高血糖有一定的对抗作用，但无显著性差异。3)TFMP可以明显降低T2DM大鼠的血糖，并于给药后第3周开始血糖值降低最为显著；并且能升高T2DM大鼠肝糖元的含量。4)TFMP可以改善T2DM大鼠的脂代谢紊乱。5)TFMP可以升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰岛素含量，提高胰岛P细胞分泌指数，降低胰岛素抵抗指数，改善IR。6)TFMP可以降低T2匿大鼠的血清MDA含量，升高SOD活性。7)TFMP可以降低T2DM大鼠的血清IL-1P、IL-6、TNF-a含量，减轻炎性反应。证明九里香叶总黄酮对糖尿病及其并发症具有显著的预防与治疗作用。图l胰岛P细胞形态学免疫组化分析权利要求1、九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用。2、权利要求1所述的九里香叶总黄酮，其特征在于其中至少含有5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。3、权利要求1所述的九里香叶总黄酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮的含量之和大于50%。4、权利要求1所述的九里香叶总黄酮，其特征在于其中5，7，3'，4'-四甲氧基黄酮和5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮的含量之和大于50%。5、九里香叶总黄酮与化学药或中药或天然药物组成的治疗糖尿病的复方药物。全文摘要本发明公开了九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用。从中药九里香叶中提取分离的九里香叶总黄酮，主要含有5，7，3′，4′-四甲氧基黄酮、5，7，3′，4′，5′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′-五甲氧基黄酮、5，6，7，3′，4′，5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5，3′，4′-三甲氧基黄酮。动物实验结果表明，九里香叶总黄酮能够明显降低T2DM大鼠的血糖，改善T2DM大鼠的脂代谢紊乱，升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰岛素含量，提高胰岛β细胞分泌指数，降低胰岛素抵抗指数，改善IR，降低T2DM大鼠的血清MDA含量，升高SOD活性，降低T2DM大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。证明九里香叶总黄酮对糖尿病具有显著的治疗作用。文档编号A61K36/75GK101601760SQ200910117940公开日2009年12月16日申请日期2009年2月22日优先权日2008年4月8日发明者于晓风,曲绍春,李绪文,桂明玉,睢大员,金永日申请人:长春瑞德医药科技有限公司