专利名称：：穿山龙治疗急性痛风性关节炎的有效部位及其提取方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药的有效部位，尤其涉及一种穿山龙治疗急性痛风性关节炎的有效部位，本发明有效部位的提取方法，属于中药治疗痛风性关节炎领域。
背景技术：
：研究表明，无论发达国家还是发展中国家，痛风的患病率皆呈迅速上升趋势。痛风的首发症状是急性痛风性关节炎，如防治不当，不仅给患者带来极大痛苦，且易导致关节畸形、肾结石、肾损伤等严重后果，故急性痛风性关节炎已成为危害人类健康的一种严重疾病，至今尚无法根治。所以迫切需求寻找预防和治疗急性痛风性关节炎的有效中药，以控制疾病的发生、发展。穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣("ioscoreani卯o;n'ca他iiflo)的才艮茎。主产于东北黑龙江省山区。味苦、微寒，无毒，具有祛风湿、活血通络、清肺化痰作用。痛风发病的根本原因是由于血中尿酸升高而导致的关节周围的局部炎症反应，如果既能降低尿酸，又能减緩局部的炎症反应，那么才是其治疗痛风性关节炎的真正意义所在。现有的穿山龙提取物或有效部位仅对于风湿、类风湿性关节炎具有较好的抗炎镇痛疗效，而尚不具备降低患者血中尿酸的功效，提供一种既能P条低患者血中的尿酸，又能减緩患者局部关节周围的炎症反应的穿山龙有效部位提取物将具有重要的意义。
发明内容本发明的目的是提供一种既能降低患者血中的尿酸，又能减緩患者局部关节周围的炎症反应的穿山龙有效部位提取物。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种治疗急性痛风性关节炎的穿山龙有效部位提取物，包括以下步骤制备得到将穿山龙粉碎后用水煎煮提取，收集水煎液，过滤，即得；或者将穿山龙粉碎后用10-95%乙醇提取，收集醇提液，回收乙醇，即得。其中，将穿山龙用水煎煮提取时，优选的用穿山龙药材水4-IO倍重量的水煎煮l-4小时；为了达到更好的提取效果，可以将穿山龙的水煎液浓缩后上大孔吸附树脂柱吸附，用蒸馏水或10-95%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，即得；更优选的，用30%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，即得；所述的大孔吸附树脂柱优选为AB-8型大孔吸附树脂柱或D101型大孔吸附树脂柱；优选的，将穿山龙用10-95%乙醇才是取时，用70%乙醇提取所得到的有效部位具有更好的治疗急性痛风性关节炎的药理活性。本发明治疗痛风性关节炎的穿山龙有效部位富含活性成分，具有降低尿酸、抗炎、镇痛的药理作用。本发明有效部位不但能緩解急性期关节红肿热痛的炎症反应，而且能够针对病机降低血中尿酸水平，对于痛风标本兼治，因此可以用来制备疗效好，安全可靠的防治急性痛风性关节炎的药物。本发明有效部位的提取工艺简单，不需高温高压和特殊设备，安全，易于操作且成本低。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1将穿山龙干燥根及根茎切片1000g,粉碎，浸泡30分钟，加水6倍重量，煎煮1小时，得到水煎液；水煎液浓缩至lg/ml上AB-8型大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗脱至无色，收集洗脱液，得到组分I;再用30%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，得到组分II;回收乙醇，再用50%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇，得到组分III;再用70%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇，得到组分IV。实施例2将穿山龙干燥根及根茎切片1000g,粉碎，浸泡30分钟，加水8倍重量，煎煮1小时，煎煮2次，合并煎液，得到水煎液；将水煎液浓缩至2g/ml上D101型大孔吸附树脂柱，用6倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用8倍30%乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到组分II,再用50%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇，得到组分III;再用70%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇，得到组分IV。实施例3将穿山龙干燥根及根茎切片lOOOg，粉碎，力口70°/乙醇3倍重量，回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龙有效部位提取物(组分V)。对比实施例1将穿山龙干燥根及根茎切片1000g,粉碎，加30%乙醇3倍重量，回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龙提取物(组分VI)。对比实施例2将穿山龙干燥根及根茎切片1000g,粉碎，加50%乙醇3倍重量，回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龙提取物(组分VII)。对比实施例3将穿山龙干燥根及根茎切片1000g,粉碎，力口60%乙醇3倍重量，回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龙提取物(组分VIH)。对比实施例4将穿山龙干燥根及根茎切片1000g,粉碎，加95%乙醇4倍重量回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龙提取物(组分IX)。实验例1穿山龙提取物的药效学试验61:穿山龙水煎液(实施例1或2所制备)；供试药物2:实施例1或2所制备的组分IV;供试药物3:对比实施例3所制备的穿山龙提取物(组分VII1);供试药物4:对比实施例4所制备的穿山龙提取物(组分IX);二、实l全方法①模型制备雄性Wistar大鼠和昆明种小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验方法釆用次黄噤呤和微晶尿酸钠造模，腹腔注射次黄噤呤500mg/kg,20min后右侧踝关节腔注射微晶尿酸钠溶液0.4ml。四个組分浓缩液连续灌胃3天，检测大鼠血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变及小鼠醋酸扭体实验，以检测抗炎、镇痛、血尿酸相关指标，统计学分析实验数据。②血尿酸及关节滑膜组织形态学检测各组大鼠于造模后lh，目艮底取血1.5mL,以检测血尿酸。24h后处死，取踝关节内组织急行10%曱醛溶液固定，24h后再锯取厚度约0.5厘米关节周围组织。再以10%福尔马林固定2天。将组织置于脱钓剂(甲酸-福尔马林液)中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。流水冲洗24小时(除酸)。进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。HE染色石蜡切片厚度为5Mm,裱于干净载玻片上，60。C烤片机烤片2h—二曱苯脱蜡5minx4次—乙醇100%1次—100%2次—95%—90%—85。/。各5min—流水冲洗5min4苏木素染胞核5min—流水冲洗5min—伊红染胞浆5min—乙醇逐级脱水—二甲苯透明—树脂胶封片—显微镜观察。结果判定大鼠步态分级评分标准据文献改良0级:正常行走，计0分；l级:轻微跛行，受试下肢略有弯曲，计2分；2级:跛行，受试下肢刚触及地面，计4分；3级重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走，计6分。镜下关节滑膜组织形态学检查，评分标准根据文献改良，(l)血管充血正常0分；轻度l分；中度2分；重度3分；(2)炎细胞浸润正常0分；轻度l分；中度2分；重度3分；(3)滑膜肿胀正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分；(4)组织坏死正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分。大鼠血尿酸水平的纟全测采用全自动生化分析仪进行检测。③醋酸致小鼠扭体反应小鼠腹腔注射(ip)药物20min后，再ipO.7°/。醋酸致痛，记录注射醋酸后小鼠出现扭体的时间和20min内的扭体次数。计算镇痛百分率。鏞餾签息謝对翻组ffl体度俊动物数-鏺葯邇扭体度应动物数？3HH，》对撤缀概钵狡应敏物敏X鹏％三、实l^结果表l大鼠步态、血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变和醋酸致小鼠扭体反应组别大鼠步态(分)血尿酸(ymol/L)服染色(分)镇痛百分率(%)空白组0150.24±38.710模型组5.60±1.56273.04±77.1611.5±3.5供试药物13.8±1.18'197.39±51.06'7.2±2.0'85±22'供试药物35.4±1.39238.69±47.0110.5±2.842±12供试药物24.7±1.33"236.87±45.338.5±2.6*'67±18"供试药物45.4±1.66229.4±46.2910.1±3.153±15注与模型组比较*P<0.01,〃P<0.05。其中在供试药物3与供试药物4组间无显著性差异(P>0.05)。结果表明，供试药物1和供试药物2均能显著改善急性痛风性关节炎大鼠步态、血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变和醋酸致小鼠扭体反应，说明对急性痛风性关节炎大鼠有治疗作用。其中供试药物1的作用最为显著。实验例2穿山龙提取物的药效学试验一、实验药物实施例l所制备的组分I,组分II,组分m和组分IV;二、实-睑方法①模型制备雄性Wistar大鼠和昆明种小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验方法采用次黄噤呤和微晶尿酸钠造模，腹腔注射次黄噤呤1000mg/kg，15min后右侧踝关节腔注射微晶尿酸钠溶液0.2ml。四个组分浓缩液连续灌胃5天，检测大鼠血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变及小鼠醋酸扭体实验，以检测抗炎、镇痛、血尿酸相关指标，统计学分析实验数据。②血尿酸及关节滑膜组织形态学检测各组大鼠于造模后1.5h，目艮底取血1.5mL,以检测血尿酸。24h后处死，取踝关节内组织急行10%曱醛溶液固定，36h后再锯取厚度约0.4厘米关节周围组织。再以10%福尔马林固定3天。将组织置于脱钩剂(VonEbner氏液)中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。流水沖洗18小时(除酸)。进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。HE染色石蜡切片厚度为5Mm，裱于干净载玻片上，60。C烤片才/L烤片1.5h—二曱笨脱错10minx4次—乙醇100%1次—100%2次—95%—90%—85%各10min—流水冲洗lOmin—苏木素染胞核lOmin—流水冲洗10min—伊红染胞浆lOmin—乙醇逐级脱水—二曱苯透明—树脂胶封片—显微镜观察。结果判定大鼠步态分级评分标准据文献改良0级:正常行走，计0分；1级轻微跛行，受试下肢略有弯曲，计2分；2级跛行，受试下肢刚触及地面，计4分；3级重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走，计6分。镜下关节滑膜组织形态学检查，评分标准根据文献改良，(l)血管充血正常0分；轻度l分；中度2分；重度3分；U)炎细胞浸润正常0分；轻度l分；中度2分；重度3分；(3)滑膜肿胀正常0分；轻度l分；中度2分；重度3分；(4)组织坏死正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分。大鼠血尿酸水平的检测采用全自动生化分析仪进行检测。③醋酸致小鼠扭体反应小鼠腹腔注射(ip)药物15min后，再ip0.5%醋酸致痛，记录注射醋酸后小鼠出现扭体的时间和15min内的扭体次数。计算镇痛百分率。謹:〗j—麵固g綱-國隱舰瞧a豕蕭暨#率》对履纖缀律fi慮动物敷x三、实验结果表2大鼠步态、血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变和醋酸致小鼠扭体反应<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与模型组比较*P<0.05。药效学实验结果表明，组分n能显著改善急性痛风性关节炎大鼠步态、血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变和醋酸致小鼠扭体反应，其余各组之间无显著性差异，因此确定组分n为穿山龙治疗急性痛风性关节炎的有效部位。实验例3一、供试药物供试药物1:穿山龙水煎液(实施例1或2所制备)；供试药物2:实施例1或2所制备的组分IV;供试药物3:对比实施例3所制备的穿山龙提取物(组分V1I1);供试药物4:对比实施例4所制备的穿山龙提取物(组分IX);二、实验方法①模型制备雄性Wistar大鼠和昆明种小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验方法采用氧溱酸钾和微晶尿酸钠造模，腹腔注射氧。秦酸钾500mg/kg,30min后右侧踝关节腔注射微晶尿酸钠溶液0.4。四个组分浓缩液连续灌胃9天，检测大鼠血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变及小鼠醋酸扭体实验，以检测抗炎、镇痛、血尿酸相关指标，统计学分析实验数据。②血尿酸及关节滑膜组织形态学检测各组大鼠于造模后2h,目艮底取血l.5mL，以检测血尿酸。24h后处死，取踝关节内组织急行10y。曱醛溶液固定，48h后再锯取厚度约0.3厘米关节周围组织。再以10%福尔马林固定1天。将组织置于脱4丐剂(Clayden氏液)中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。流水冲洗12小时(除酸)。进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。HE染色石蜡切片厚度为5Mm,^表于干净载玻片上，60。C烤片机烤片2.5h—二甲苯脱蜡15minx4次—乙醇100%1次—100%2次—95%—90%—85%各15min—流水冲洗15min—苏木素染胞核15min—流水冲洗15min—伊红染胞浆15min—乙醇逐级脱水—二曱苯透明—树脂胶封片4显^敖镜观察。结果判定大鼠步态分级评分标准据文献改良0级:正常行走，计0分；l级轻微跛行，受试下肢略有弯曲，计2分；2级:跛行，受试下肢刚触及地面，计4分；3级:重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走，计6分。镜下关节滑膜组织形态学检查，评分标准根据文献改良，(1)血管充血正常O分；轻度l分；中度2分；重度3分；(2)炎细胞浸润正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分；(3)滑膜肿胀正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分；(4)组织坏死正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分。大鼠血尿酸水平的检测釆用全自动生化分析仪进行检测。③醋酸致小鼠扭体反应小鼠腹腔注射(ip)药物25min后，再ip0.9°/。醋酸致痛，记录注射醋酸后小鼠出现扭体的时间和25min内的扭体次数。计算镇痛百分率。编癧龍童对厫组扭体度应动物数-毚药组扭体虔应动物数，通S分舉-对麒组缀钵反魔动物蕺X柳％表3大鼠步态、血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变和醋酸致小鼠扭体反应组别大鼠步态(分)血尿酸((Jmol/L)HE染色(分)镇痛百分率(％)空白组0132.80±40.110模型组5.30±1.45282.19±55.2611.4±3.7供试药物14.0±1.2T201.45±52.08'6.8±1.8'83±23'供试药物35.0±1.29244.59±70.1410.2±2.641±11供试药物24.5±1.26''242.75±65.218.1±2.4…66±21''供试药物45.2±1.55231,61±65.1110.4±2.751±14注:与模型组比较'P〈0.01，'*P<0.05。其中在供试药物3与供试药物4组间无显著性差异(P〉0.05)。结果表明，供试药物1和供试药物2均能改善急性痛风性关节炎大鼠步态、血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变和醋酸致小鼠扭体反应，说明对急性痛风性关节炎大鼠有治疗作用。其中供试药物1的作用最为显著。实验例4穿山龙提取物的药效学试验一、实验药物实施例l所制备的组分I,组分II,组分III和组分IV;二、实"验方法12①模型制备雄性Wistar大鼠和昆明种小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验方法采用氧溱酸钾和微晶尿酸钠造模，腹腔注射氧溱酸钾300mg/kg，25min后右侧踝关节腔注射微晶尿酸钠溶液0.3ml。四个组分浓缩液连续灌胃7天，检测大鼠血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变及小鼠醋酸扭体实验，以检测抗炎、镇痛、血尿酸相关指标，统计学分析实验数据。②血尿酸及关节滑膜组织形态学检测各组大鼠于造才莫后0.5h,目艮底取血l.5mL,以检测血尿酸。24h后处死，取踝关节内组织急行10%曱醛溶液固定，12后再锯取厚度约0.3厘米关节周围组织。再以10%福尔马林固定4天。将组织置于脱4丐剂(福尔马林-硝酸液)中，每日更换新鲜液、直至组织软化为止。流水冲洗20小时(除酸)。进行常规脱水，透明，浸蜡，切片。HE染色石蜡切片厚度为5卿，-浪于干净载玻片上，50。C烤片机烤片3h—二曱苯脱蜡10minx4次—乙醇100%1次—100%2次—95%—90%—85%各10min—流水冲洗10min—苏木素染胞核10min-流水冲洗lOmin—伊红染胞浆lOmin—乙醇逐级脱水—二曱苯透明—树脂胶封片—显孩i镜观察。结果判定大鼠步态分级评分标准据文献改良O级:正常行走，计O分；l级:轻微跛行，受试下肢略有弯曲，计2分；2级:跛行，受试下肢刚触及地面，计4分；3级:重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走，计6分。镜下关节滑膜组织形态学检查，评分标准根据文献改良，(1)血管充血正常O分；轻度l分；中度2分；重度3分；(2)炎细胞浸润正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分；(3)滑膜肿胀正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分；(4)组织坏死正常0分；轻度1分；中度2分；重度3分。大鼠血尿酸水平的检测采用全自动生化分析仪进行检测。③醋酸致小鼠扭体反应小鼠腹腔注射(ip)药物30min后，再ipl。/。醋酸致痛，记录注射醋酸后小鼠出现扭体的时间和30min内的扭体次数。计算镇痛百分率。慣顯s分率画对履组扭体反应动物載xt纖三、实验结果表4大鼠步态、血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变和醋酸致小鼠扭体反应<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注:与模型组比较*P<0.05。药效学实验结果表明，组分n能显著改善急性痛风性关节炎大鼠步态、血尿酸水平、关节滑膜组织形态学改变和醋酸致小鼠扭体反应，其余组分之间无显著性差异，因此确定组分n为穿山龙治疗急性痛风性关节炎的有效部位。权利要求1、一种治疗急性痛风性关节炎的穿山龙有效部位提取物，包括以下步骤制备得到将穿山龙粉碎后用水煎煮提取，收集水煎液，过滤，即得；或者将穿山龙粉碎后用10-95％乙醇提取，收集醇提液，回收乙醇，即得。2、按照权利要求1所述的穿山龙有效部位提取物，其特征在于将穿山龙药材用4-10倍重量的水煎煮1-4小时。3、按照权利要求l所述的穿山龙有效部位提取物，其特征在于将穿山龙的水煎液浓缩后上大孔吸附树脂柱吸附，用蒸馏水或10-95%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，即得。4、按照权利要求3所述的穿山龙有效部位提取物，其特征在于将穿山龙的水煎液浓缩后上大孔吸附树脂柱吸附，用30%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液。5、按照权利要求3或4所述的穿山龙有效部位提取物，其特征在于所述的大孔吸附树脂柱选自AB-8型大孔吸附树脂柱或D101型大孔吸附树脂柱。6、按照权利要求l所述的穿山龙有效部位提取物，其特征在于将穿山龙粉碎后用70%乙醇提取，收集醇提液，回收乙醇，即得。7、权利要求l-4任何一项所述的穿山龙有效部位提取物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的用途。全文摘要本发明公开了一种治疗急性痛风性关节炎的穿山龙有效部位提取物及其制备方法。本发明穿山龙有效部位提取物包括以下步骤制备得到将穿山龙粉碎后用水煎煮提取，收集水煎液，过滤，即得；或者将穿山龙粉碎后用10-95％乙醇提取，收集醇提液，回收乙醇，即得。本发明治疗痛风性关节炎的穿山龙有效部位富含活性成分，具有降低尿酸、抗炎、镇痛的药理作用。本发明有效部位不但能缓解急性期关节红肿热痛的炎症反应，而且能够针对病机降低血中尿酸水平，对于痛风标本兼治，可以用来制备疗效好，安全可靠的防治急性痛风性关节炎的药物。本发明有效部位的提取工艺简单，不需高温高压和特殊设备，安全，易于操作且成本低。文档编号A61P19/02GK101537103SQ20091013557公开日2009年9月23日申请日期2009年4月27日优先权日2009年4月27日发明者于书仪,刘树民,丽姚申请人:刘树民