专利名称：稳定蛋白质制剂的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及含有CTLA4Ig分子的稳定制剂，包括用于 各种给药途径(包括例如静脉内(IV)和皮下(SC))的低压冻干和液体 制剂。
背景技术：
在过去20年中，重组DNA技术使许多蛋白质疗法商业化。 蛋白质药物最常规的给药途径为静脉内(IV)给药，这是由于绝大多 数其它给药途径的生物利用度低、临床给药时需要更多的监控以及 更快速的药物研发。对于需要频繁和长期给药的产品而言，另一种 皮下(SC)给药途径更具有吸引力。当与预充式注射器和自动注射 器技术联合使用时，SC给药允许家庭给药并提高了给药的顺应性。
使用高于1 mg/kg或100 mg /剂量的高剂量治疗时需要研发 浓度超过100 mg/ml的制剂，这是由于小体积(<1.5 ml)才可以通过 SC途径给药。对于在更高浓度容易聚集的蛋白质而言，达到这样高 浓度的制剂是一种研发挑战。甚至对于可以大体积给药的IV给药途径而言，高剂量给药方案可能需要几十mg/ml的蛋白浓度，而这一 浓度会影响 一些蛋白质的稳定性。控制蛋白质溶解度的原理比小合成分子的更复杂，因此克服 蛋白质的溶解度问题需要不同的策略。在操作上，蛋白质的溶解度 可描述为在辅溶质存在下并因此溶液保持澄清(例如，没有蛋白质 沉淀、结晶或凝胶)时蛋白质的最大量。蛋白质的溶解度对离子强 度、盐形式、pH、温度和某些赋形剂的依赖性可由重力水(bulk water)表面张力的变化和蛋白质与水和离子的结合与自身结合的对比 进行机械学角竿释，见Arakawa等，T7zec^ 。/so/m&7z'Cv (蛋白 质溶解度原理),Methods of Enzymology, 114:49-77, 1985; Schein
解度作为蛋白质结构和溶剂组分的函数)，BioTechnology 8(4):308-317, 1990; Jenkins 7T^ee so/w"o"s o/f/ieso/砲鄉( 蛋 白质溶解度问题的三种解答)，Protein Science 7(2):376-382， 1998;及 其它。蛋白质与某些赋形剂或盐的结合可通过蛋白质构象的变化或 遮盖参与自身结合的某些氨基酸影响溶解度。蛋白质也会优先被某
些盐、氨基酸和糖水化(并稳定化形成更紧致的构象)，导致其溶 解度变化。聚集需要两分子之间的碰撞，是蛋白质溶液中的主要降解途 径。浓度与形成聚集的关系取决于聚集物的大小和结合机制。蛋白 质聚集可引起共价(例如二硫键连接)或非共价(可逆或不可逆) 结合。由非共价结合引起的不可逆聚集通常经由可改变蛋白质天然 构象的由温度、机械或化学过程暴露的疏水区域发生。蛋白质聚集 可影响蛋白质活性、药物代谢动力学和安全性，例如由于免疫原 性。最小化聚集作用的典型方法为限制蛋白质的移动性以降低碰 撞次数。用适当的赋形剂低压冻干可防止聚集提高蛋白质的稳定 性，其方式为P争低蛋白质的移动性和限制构象的柔性，其另外的益处为由于去除水分使水解反应降至最低。加入适当的赋形剂，包括 冻干保护剂，可防止在冻干和终产品的保存过程中发生聚集。有效 保护的关键参数为冻干保护剂与蛋白质的摩尔比值。通常要求
300: 1或更高的摩尔比值以提供适当的稳定性，尤其是对于室温保 存。然而这些比值也可引起不利的粘度增加。低压冻千可设计具有适当稳定性和张力的制剂。虽然SC给 药并不 一 定要求等渗性，但对于降低给药时的疼痛还是有需要的。 亲液物的等渗性较难达到，这是由于在重新溶解的过程中蛋白质和 赋形剂都净皮浓缩。如果终蛋白浓度的目标>100 mg/ml， 500:1的赋形 剂与蛋白质的摩尔比将得到高渗制剂。如果要得到等渗制剂，那么 各种可供选择的较低的赋形剂与蛋白质摩尔比将可能得到较不稳定 的制剂。确定可达到的最高蛋白质浓度仍然取决于经验，这是由于蛋 白质构象的易变性和其与自身、与表面和特定溶质相互作用的倾向 性。可从SC制剂中获益的受试者实例为其病症需要频繁或长期 给药的患者，例如患有免疫系统疾病、类风湿性关节炎和与移植物 移植相关的免疫紊乱的受试者。可购买的用于治疗类风湿性关节炎 的蛋白质产品包括HUMIRA⑧，ENBREL⑧和REMICADE 。
HUMIRA (Abbott)的包装为一次性、lml的预充式玻璃注射 器作为无菌的、不含防腐剂的溶液用于皮下给药。HUMIRA 溶液 澄清、无色，pH约为5.2。每一支注射器可释放0.8ml(40mg)的药 品。每0.8 ml 1^]\411^@含有40mg阿达木单抗、4.93 mg氯化钠、 0.69 mg 二水合磷酸二氢钠、1.22 mg 二水合磷酸氢二钠、0.24 mg 柠檬酸钠、1.04 mg —水合柠檬酸、9.6 mg甘露醇、0.8 mg聚山梨 酯80和注射用水USP。必要时加入氢氧化钠调节pH。
ENBREL (Amgen)的包装为一次性、lml的预充式注射器作 为无菌的、不含防腐剂的溶液用于皮下给药。ENBREI^溶液澄清、无色，pH为6.3士0.2。每一支ENBREL逸 一次性预充式注射器含有 0.98 ml的50 mg/ml依那西普溶液，其中含10 mg/ml蔗糖、5.8 mg/ml氯化钠、5.3 mg/mlL-精氨酸盐酸盐、2.6 mg/ml—水合磷酸二 氢钠和0.9 mg/ml无7K磷酸氢二钠。如果将管形瓶重新溶解并按照建 议给药，给药一支50 mg/ml的ENBREL⑧预充式注射器相当于2支 25mg的ENBREL⑧冻干管形瓶。ENBREL⑧多次使用管形瓶含有无 菌、白色、不含防腐剂的冻干粉末。用lml所提供的抑菌性注射用 水(BWFI), USP (含有0.9%苯曱醇)可都得到多次使用、澄清、无色 溶液，pH为7.4 ±0.3，含有25 mg依那西普、40 mg甘露醇、10 mg蔗糖和1.2 mg氨丁三醇。 REMICADE (Centocor)为用于静脉输注的无菌、白色、冻干 粉末。在用10ml无菌注射用水USP重新溶解后，所得pH接近 7.2。每一支一次性管形瓶含有100 mg英夫利昔单抗、500 mg蔗 糖、0.5 mg聚山梨酯80、 2.2 mg—水合磷酸二氢钠和6.1 mg 二水 合磷酸二氢钠。不添加防腐剂。可购买的用于治疗与移植物移植相关的免疫紊乱的蛋白质产 品包括SIMULECT⑧和ZENAPAX 。药品SIMULECT (Novartis)为无色冻干物，其包装为6ml无 色玻璃管形瓶，含量为10mg和20mg。每一支10-mg管形瓶含有10 mg巴利昔单抗、3.61 mg —水合磷酸二氪钠、0.50 mg磷酸氢二钠 (无水)、0.80 mg氯化钠、10 mg蔗糖、40 mg甘露醇和20 mg甘 油，用2.5 ml无菌注射用水USP重新溶解。每一支20-mg管形瓶 含有20mg巴利昔单抗、7.21mg磷酸二氢钾、0.99mg磷酸氢二钠 (无水)、1.61 mg氯化钠、20 mg蔗糖、80 mg甘露醇和40 mg甘 油，用2.5ml无菌注射用水USP重新溶解。不添加防腐剂。
ZENAPAX (Roche Laboratories), 25 mg/5 ml，为用于进一步 稀释和静脉内给药的澄清、无菌、无色浓缩物。每毫升ZENAPAX 含有5 mg达克珠单抗和3.6 mg —水合磷酸二氢钠、11 mg七水合磷酸氢二钠、4.6 mg氯化钠和0.2 mg聚山梨酯80并且可含有盐酸或 氢氧化钠以调节pH至6.9。不添加防腐剂。 CTLA4Ig分子可通过抑制CD28-B7相互作用干扰T细胞协同 刺激。因此，CTLA4Ig分子可用于治疗免疫系统疾病，例如类风湿 性关节炎和与移植物移植相关的免疫紊乱。我们需要一种含有CTLA4Ig分子用于治疗免疫系统紊乱的稳 定、有效、方便的制剂。
发明概迷本发明提供了治疗免疫系统紊乱的制剂，其方式为给予受试 者CTLA4Ig分子，其可与B7阳性细胞上的B7分子结合并因此抑 制内源性B7分子与CTLA4和/或CD28在T-细胞上的结合。
本发明的冻干制剂包含CTLA4Ig分子，其蛋白质与冻干保护 剂的重量比至少为1: 2。冻干保护剂优选糖，更优选双糖，最优选 蔗糖或麦芽糖。冻干制剂也可含有一种或多种选自緩沖剂、表面活 性剂、填充剂和防腐剂中的组分。在某些实施方案中，用于稳定冻干药品的蔗糖或麦芽糖的量 为蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比至少为1: 2,优选蛋白质与蔗糖 或麦芽糖的重量比至少为1: 2至1: 5,更优选蛋白与蔗糖或麦芽 糖的重量比约为1: 2。本发明的皮下(SC)制剂在含水载体中含有蛋白浓度至少为 100mg/ml的CTLA4Ig分子与稳定化水平的糖，优选至少为 125mg/ml的蛋白质浓度与稳定化水平的糖。该糖的优选重量比至少 为蛋白质与糖1: 1.1。稳定剂的使用量优选不大于可能引起SC注 射器给药时不利或不适当粘度的量。糖优选为二糖，最优选为蔗 糖。SC制剂也可含有一种或更多种选自緩冲剂、表面活性剂和防腐 剂的组分。
在某些实施方案中，用于稳定CTLA4Ig分子SC药品的蔗糖 用量为蛋白质与蔗糖的重量比至少为1: 1，优选蛋白质与蔗糖的重 量比为1: 3至1: 5,更优选蛋白质与蔗糖的重量比约1: 1.4。
本发明的液体制剂在含水载体中包含蛋白质浓度至少为 20mg/ml的CTLA4Ig分子与稳定化水平的糖，优选至少25mg/ml与 稳定化水平的糖。优选糖的重量比至少为蛋白质与糖1: 1。糖优选 双糖，最优选蔗糖。该液体制剂也可含有一种或更多种选自緩冲 剂、表面活性剂和防腐剂的组分。在某些实施方案中，用于稳定液体药品的蔗糖用量为蛋白质
与蔗糖的重量比至少为1: 1,优选蛋白质与蔗糖的重量比为1: 2
至l: 10,更优选蛋白质与蔗糖的重量比约1: 2。在本发明的另一个实施方案中提供了制造品，其包括药品并
优选提供其使用说明。本发明进一步提供了给予本发明CTLA4Ig分子制剂治疗免疫 系统疾病和耐受诱导作用的方法。
附图简介
图1显示了 CTLA4Ig分子表达盒一部分的核苷酸序列(SEQ ID N0:1)。也显示了由该核酸编码的氨基酸序列(SEQ ID N0.'2)。可 由该表达盒生产的CTLA4Ig分子包括具有以下残基的氨基酸序列 (i) SEQ ID NO:2的26-383 , (ii) SEQ ID NO:2的26-382 , (iii) SEQ ID NO:2的27-383或(iv) SEQ ID NO:2的26-382 ,或任选(v) SEQ ID NO:2的25-382或(vi) SEQ ID NO:2的25-383。该表达盒包含以下 区(a)抑瘤素M信号序列(SEQ ID NO: 1的核苷酸ll-88; SEQ ID NO:2的氨基酸1-26 ); (b)人CTLA4的胞外结构域(SEQ ID NO:l的核苷酸89-463; SEQ ID NO:2的氨基酸27-151); (c)人IgGl 恒定区的被修饰部分(SEQ ID NO: 1的核苷酸464-1159 ; SEQ ID NO:2的氨基酸152-383 ),包括被修饰的绞链区(SEQ ID NO:i的核苷 酸464-508 ; SEQ ID NO:2的氨基酸152-166 ),被修饰的人IgGlCH2结构域(SEQIDNO:l的核苷酸509-838 ; SEQ ID NO:2的氨基 酸167-276 )和人IgGl CH3结构域(SEQ ID NO:l的核苷酸839-1159 ; SEQ ID NO:2的氨基酸277-383 )。如本文中使用"稳定的"制剂或药品为在保存过程中其中的CTLA4Ig分子可 基本保持其物理和化学稳定性和完整性的制剂或药品。可在所选温 度下经过所选时间段后测定CTLA4Ig分子制剂的稳定性。例如，冻 干和保存后聚集形成的增加可作为冻干的CTLA4Ig分子制剂不稳定 性的指标。除了聚集形成之外，在保存期间原有澄清度、颜色和气 味的保持都可用作监控CTLA4Ig分子溶液稳定性的指标。HMW种 类为多聚体(例如，四聚体，七聚体等)，其分子量大于CTLA4Ig 分子二聚体。通常， 一种"稳定的"药品为于2-8 。C保存一年其中的 聚集增加(通过高分子量种类(。/。HMW)的增加测定)小于约5%并优 选3。/。的药品。所生产的药品优选含有小于约25%的HMW种类，优选小于约15% HMW种类，更优选小于约10% HMW种类，最 优选小于约5% HMW种类。可通过分子排阻色谱(SEC)分离CTLA4Ig分子的单体、二 聚体和HMW种类。SEC基于分子大小分离分子。当分子沿着柱子 长度迁移时通过差别分子排阻或进入实现分离。因此，随着柱子长 度的增加分离度增加。可使用串联了 TSK Gel G3000SWXL (300mm x 7.8mm)和TSK Gel G3000SWXL (40mm x 6.0mm)柱 (Tosoh Bioscience, Montgomery, PA)的2695 Alliance HPLC (Waters, Milford, MA)分离CTLA4Ig分子样品。可用含有0.2 M KH2P04和 0.9% NaCl, pH 6.8的流动相在流速为1.0 m/min时分离10 mg/ml (20|il等分试样)的样品。使用Water's 2487双波长检测器于280腿 处检测样品吸光值。使用这一系统，HMW种类的保留时间为7.5 min ± 1.0 min。对每一个峰的峰下面积积分。HMW种类峰面积除 以总峰面积可计算得到。/。HMW种类。"重新溶解"制剂为通过将冻干制剂溶解于含水载体制备的制 剂，这样CTLA4Ig分子被溶解至重新溶解的制剂中。该重新溶解的 制剂适用于对需要的病人进行静脉内给药(IV)。"等渗"制剂为与人血液具有基本相同的渗透压的制剂。等渗 制剂的渗透压通常为250至350 mOsmol/KgH20。术语"高渗"用于 描述渗透压高于人血液渗透压的制剂。例如可使用蒸汽压或冰冻型 渗透压剂测量等渗性。术语"緩冲剂"指当加入至含水溶液中可防止加入酸或碱或溶 剂稀释时溶液pH变化的一种或多种组分。除了磷酸盐緩冲液，也 可使用甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐緩冲液及类似緩冲液，其中 钠、钾或铵可作为平衡离子。"酸，，为可在含水溶液中产生氢离子的物质。"药学可接受酸" 包括无机和有机酸，其在制剂中使用的浓度和方式是无毒性的。
"碱"为可在含水溶液中产生羟基离子的物质。"药学可接受的 碱"包括无机和有机碱，其在制剂中使用的浓度和方式是无毒性的。"冻干保护剂"为当与相关蛋白质结合时可防止或降低该蛋白 质在冻干和之后的储存过程中化学和/或物理不稳定性的分子。
"防腐剂"为可降低细菌作用的试剂，可选择性加入本文的制 剂中。加入防腐剂可，例如，辅助多剂量制剂的生产。可用的防腐 剂实例包括十八烷基二甲基千基氯化铵、氯己双铵、苯扎氯铵(十八 烷基二曱基节基氯化铵的混合物，其中的烷基为长链化合物)和氯化 节乙铵。其它类型的防腐剂包括芳族醇，例如苯酚、丁基和苯甲基 醇，烷基尼泊金类，例如甲基或丙基尼泊金，儿茶酚，间苯二酚， 环己醇，3-戊醇和间甲酚。"表面活性剂"为含有疏水部分(例如烷基链)和亲水部分 (例如羧基和羰酸基团)的表面活性分子。可将表面活性剂加入本
梨酯(例如聚山梨酯20或80);泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188); 山梨坦酯及其衍生物；Triton;十二烷基^l酸钠；辛基糖苷钠；十二 烷基、十四烷基、亚油酰-或硬脂酰-磺基甜菜碱；十二烷基、十四烷 基、亚油酰或硬脂酰-肌氨酸；亚油酰-、十四烷基或十六烷基-甜菜 碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺 丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如月桂酰胺丙基); 肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；曱基 椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基牛磺酸二钠；和MONAQUAT 系 歹寸(Mona Industries, Inc.， Paterson, N丄)；聚乙二醇，聚丙醇以及乙 二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics,PF68等)。
"药物，，指用于药物终产品制剂的起始材料。通常CTLA4Ig药 物组合物含有浓度为20 mg/ml至60 mg/ml， pH 7至8的蛋白质并 JL%HMW < 5%。
ii
"已配制成的总体溶液"指注入容器之前的最终制剂，例如注
入管形瓶用于冻干前的已配制成的溶液或注入用于sc注射的注射 器之前的已配制成的溶液。"药品"指包装于容器中的最终制剂，其可在使用前被重新溶 解，例如冻干药品；使用前被稀释，例如液体药品；或被用作SC ，容液药品。术语"CTLA4-Ig"或"CTLA4-Ig分子"或"CTLA4Ig分子" 可交换使用，指至少包含具有CTLA4胞外结构域或其部分片段和免 疫球蛋白恒定区或其部分片段的多肽的蛋白质分子。该胞外结构域 和免疫蛋白恒定区可为野生型，或突变型或修饰型，和哺乳动物 型，包括人和小鼠。该多肽可进一步包括附加蛋白结构域。C.TLA4-Ig分子也可指该多肽的多聚体形式，例如二聚体、四聚体和七聚 体。CTLA4-Ig分子也可与CD80和/或CD86结合。
术语"B7-1"指CD80;术语"B7-2"指CD86;术语"B7" 指B7-l和B7-2 (CD80和CD86)两者。术语"B7-1-Ig""或"B7-llg，，指CD80-Ig;术语"B7-2-Ig"或"B7-2Ig，，指CD86-Ig。
在一个实施方案中，"CTLA4Ig，，指具有以下残基的氨基酸序 列的蛋白质分子(i) SEQ ID N0:2的26-383 , (ii) SEQ ID NO:2的26-382 ; (iii) SEQ ID NO:2的27-383 ,或(iv) SEQ ID NO:2的27-382 , 或任选(v) SEQ ID NO:2的25-382 ,或(vi) SEQ ID NO:2的25-383。 在单体形式中，这些蛋白质可在本文中指"SEQ ID NO:2单体,"或 "具有SEQ ID NO:2序列的"单体。这些SEQ ID NO:2单体可二聚 体化，这些二聚体组合可包括，例如(i)和(i); (i)和(ii); (i)和
(iii) ; (i)和(iv); (i)和(v); (i)和(vi); (ii)和(ii); (ii)和(iii); (ii)和
(iv) ; (ii)和(v); (ii)和(vi); (iii)和(iii); (iii)和(iv); (iii)和(v); (iii) 和(vi); (iv)和(iv); (iv)和(v); (iv)和(vi); (v)和(v); (v)和(vi); 和，(vi)和(vi)。这些不同的二聚体组合也可以相互组合形成四聚体
CTLA4Ig分子。这些单体、二聚体、四聚体和其它多聚体可在本文中指"SEQ ID NO:2蛋白质，，或"具有SEQ ID NO:2序列，，的蛋白 质。(编码如SEQIDNO:2中所示CTLA4Ig的DNA按照布达佩斯 条约的规定于1991年3月31日保藏于美国典型培养物保藏中心 (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 , ATCC登 录号ATCC 68629;表达如SEQ ID NO:2所示CTLA4Ig的中国仓鼠 卵巢(CHO)细胞系于1991年3月31日保藏，ATCC标识号为CRL-10762)。如本文所使用，"Abatacept"指SEQ ID NO:2蛋白。
在一个实施方案中，CTLA4-L104EA29Y-Ig (有时称作 "LEA29Y"或"L104EA29Y")为基因工程融合蛋白，与SEQ ID NO: 1 所示的CTAL4-Ig分子具有相似的结构。U04EA29Y-Ig具有4^务饰 的人CTLA4功能性胞外结合结构域和IgGl类人免疫球蛋白的Fc结 构域。对CTLA4结构域B7结合区域的两个氨基酸进行修饰以产生 L104EA29Y,将104位(L104E)的亮氨酸突变为谷氨酸(在SEQ ID NO:2的130位)并将29位(A29Y)的丙氨酸突变为酪氨酸(在SEQ ID NO:2的55位)。SEQ ID NOS: 3和4分别描述了含有信号肽的 L104EA29YIg的核苷酸和氨基酸序列；突变的CTLA4胞外结构 域，起于+27位的甲硫氨酸，止于+150位的天冬氨酸，或起于+26 位的丙氨酸，止于+150位的天冬氨酸；和Ig区。编码L104EA29Y-Ig的DNA按照布达佩斯条约的规定于2000年6月20日保存于美 国典型培养物保藏中心(ATCC)。 ATCC登录号为PTA-2104。美国专 利7094874 (颁发于2006年8月22日)和WO 01/923337 A2中进 一步描述了 L104EA29Y-Ig，均以其整体并于本文以作参考。
在哺乳细胞中表达L104EA29YIg可产生N-和C-端突变体， 因此所产生的蛋白质可具有以下残基的氨基酸序列(i) SEQ ID NO: 4的26-383 , (ii) SEQ ID NO:4的26-382 ; (iii) SEQ ID NO:4的27-383 或(iv) SEQ ID NO:4的27-382 ,或任选(v) SEQ ID NO:4的25-382, 或(vi) SEQ ID NO:4的25-383。如果为单体形式，这些蛋白质在本 文中可指"SEQ ID NO:4单体"或"具有SEQ ID NO:4序列"的单
13体。这些蛋白质可二聚体化，这些二聚体组合可包括，例如(i)和
(i) ; (i)和(ii); (i)和(i)和(iv); (i)和(v); (i)和(vi); (ii)和
(ii) ; (ii)和(iii); (ii)和(iv); (ii)和(v); (ii)和(vi); (iii)和(iii); (iii) 和(iv); (iii)和(v); (iii)和(vi); (iv)和(iv); (iv)和(v); (iv)和(vi); (v)和(v);(v)和(vi);和，(vi)和(vi)。这些不同的二聚体组合也可 以相互组合形成四聚体L104EA29YIg分子。这些单体、二聚体、四 聚体和其它多聚体在本文中可指"SEQ ID NO:4蛋白质"或"具有 SEQIDNO:4序列，，的蛋白质。如本文所使用，"Belatacept"指SEQ IDNO:4蛋白。
CTLA4-Ig单体和多聚体 CTLA4-Ig分子包括，例如CTLA4-Ig蛋白单体、二聚体、三 聚体、四聚体、五聚体、六聚体或其它多聚体形式。CTLA4-Ig分子 可包含至少具有一个CTLA4胞外结构域和一个免疫球蛋白恒定区的 蛋白质融合。CTLA4-Ig分子可具有野生型或突变型序列，例如 CTLA4的胞外域和免疫球蛋白恒定区序列。单独CTLA4-Ig单体或 二聚体、四聚体或其它多聚体形式均可被糖基化。
在一些实施方案中，本发明提供至少具有一定百分比的二聚 体或其它多聚体分子的CTLA4-Ig分子群。例如，本发明提供 CTLA4-Ig 二聚体大于90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 99,5%的CTLA4-Ig分子群。在一个实施方案中，本发明提供含有约 95%至约99.5。/。CTLA4-Ig二聚体和约0.5% to至约5%CTLA4-Ig四 聚体的CTLA4-Ig分子群。在另一个实施方案中，CTLA4-Ig分子群 含有约98%的CTLA4-Ig 二聚体、约1.5%的CTLA4-Ig四聚体和约 0.5%的CTLA4-Ig单体。在一个实施方案中，本发明提供了基本不含CTLA4-Ig单体 分子的CTLA4-Ig分子群。基本不含CTLA4-Ig单体分子可指具有少 于1%、 0.5%或0.1%单体的CTLA4-Ig分子群。
在一个实施方案中，本发明提供了基本不含大于二聚体，例如四聚体、六聚体等的CTLA4-Ig多聚体的CTLA4-Ig分子群。基本 不含大于二聚体的CTLA4-Ig多聚体可指含有少于6%、 5%、 4%、 3%、 2%、 1%、 Q.5。/。或0.1%大于二聚体的CTLA4-Ig多聚体的 CTLA4-Ig分子群。在一个实施方案中，CTLA4-Ig单体分子可具有，例如，以 下氨基酸序列(i) SEQ ID NO:2的26-383， (ii) SEQ ID NO:2的26-382 (iii) SEQ ID NO:2的27-383,或(iv) SEQ ID NO:2的27-382或 任选(v) SEQ ID NO:2的25-382或(vi) SEQ ID NO:2的25-383。当 在CHO细胞中表达含有SEQ ID NO: 1氨基S吏序列的表达盒时，所 表达的大多数单体形式具有甲硫氨酸(SEQ ID NO:2的残基27 )N-端 氨基酸残基，其与野生型人CTLA4的N-端氨基酸残基一致。但 是，由于SEQ ID NO:l也包括抑瘤素M信号序列(SEQ ID NO: 1的 11-88核苷酸)的编码序列，所以从SEQ ID NO:l表达的蛋白质包括 抑瘤素M信号序列。在蛋白质运出细胞质或分泌出细胞的过程中， 该信号序列从所表达的蛋白质上剪切下来。但是该剪切过程可产生 N-端突变体，例如氨基酸残基25至26之间的剪切(得到残基26的 N-端，如"丙氨酸变异体")，或氨基酸残基24至25之间(得到残 基2的N-端，如"天冬氨酸-丙氨酸变异体")，与氨基酸残基26至 27之间的剪切相反(得到残基27的N-端)。例如，天冬氨酸-丙氨 酸变异体可以约1%存在于CTLA4-Ig分子混合物中，丙氨酸变异体 可以8-10%存在于CTLA4-Ig分子混合物中。此外，由于不完全加 工，从SEQIDNO:l表达的蛋白质可具有C-端变异体。大多数C-端 为SEQ ID NO:2残基382的甘氨酸。在CTLA4-Ig分子混合物中可 存在例如约4-5%具有C-端赖氨酸(SEQ ID NO:2的残基383 )的单 体。 CTLA4-Ig单体分子可含有人CTLA4的胞外结构域。在一个 实施方案中，该胞外结构域可包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸27-151的SEQ ID NO:l的核苷酸89-463的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该胞外结构域可包含人CTLA4的突变序列。在另一个实施 方案中，该胞外结构域可包含SEQ ID NO:l核芬酸89-463的核香酸 变化，这样就改变了保守氨基酸。在另一个实施方案中，该胞外结 构域可包含至少75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98% 或99%与SEQ ID NO:l核香酸89-463相同的核苷酸序列。
CTLA4-Ig单体分子可含有人免疫球蛋白的恒定区。该恒定区 可为一个恒定区的一部分；该恒定区可具有野生型或突变型序列。 该恒定区可源自人IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAl、 IgA2、 IgD或IgE。该恒定区可源自免疫球蛋白的轻链或重链。当该恒定 区源自IgG、 IgD或IgA分子时，该恒定区含有一个或更多个以下 恒定区结构域CL、 CH1、铰链区、CH2或CH3。当该恒定区源自 IgM或IgE时，该恒定区含有一个或更多个以下恒定区结构域 CL、 CH1、 CH2、 CH3或Ca4。在一个实施方案中，该恒定区可包 含一个或更多个源自IgG、 IgD、 IgA、 IgM或IgE的结构域。
在一个实施方案中，CTLAHg单体分子含有一皮修饰的人 IgGl铰链区(SEQ ID NO: 1的核苷酸464-508; SEQ ID NO:2的氨 基酸152-166),其中SEQ ID NO:2的氨基酸残基156、 162和165 的丝氨酸来自于野生型序列中的半胱氨酸。在一个实施方案中，CTLA4-Ig单体分子含有被修饰的人 IgGl CH2区和野生型CH3区(具有SEQ ID NO: 1核苷酸509-838 和SEQ ID NO:2氨基酸167-276的被修饰人IgGl CH2结构域；含 有SEQ ID NO:l核苷酸839-1159和SEQ ID NO:2氨基酸277-383 的人IgGl CH3结构域)。在一个实施方案中，CTLA4-Ig分子群含有具有以下序列的 单体，如2006年8月22日颁发的美国专利7,094,874的图7、 8或 9 中任一个或多个中以及公布号为 US20030083246和 US20040022787的美国专利申请中所显示的序列，其均以其整体并 于本文作为参考。
在一个实施方案中，CTLA4-Ig四聚体分子含有两对CTLA4-Ig多肽或两个CTLA4-Ig多肽二聚体，其中各多肽具有以下氨基酸 序列之一(i) SEQ ID NO:2的26-383 ， (ii) SEQ ID NO:2的26-382 , (iii) SEQ ID NO:2的27-383 ,或(iv) SEQ ID NO:2的27-382 ,或任 选(v) SEQ ID NO:2的25-382或(vi) SEQ ID NO:2的25-383。多肽 对或二聚体的每一成员与另 一成员共价连接，并且两对多肽之间非
共价连接并由此形成四聚体。该四聚体分子可与CD80或CD86结 合。在另一个实施方案中，该四聚体分子可与CD80或CD86结 合，其亲和力至少比CTLA4-Ig 二聚体(其单体具有上述氨基酸序 列之一)与CD80或CD86的亲和力大2倍。在另一个实施方案 中，该四聚体可与CD80或CD86结合，其亲和力至少比野生型 CTLA4与CD80或CD86的亲和力大2倍。这一更大的亲和力有助 于在治疗免疫紊乱和其它下述疾病中的达到更高的药效。此外，更 高或经提高的亲和力可产生更高的药效强度。例如，含有CTLA4-Ig 四聚体的医药组合物将具有更高的亲和力并因此比相同量的含有 CTLA4-Ig单聚体的医药组合物具有更高的药效强度。在另一个实施 方案中，该四聚体分子对T细胞增殖的抑制比CTLA4-Ig 二聚体相 (其单聚体具有以上氨基酸序列之一)大2倍。在另一个实施方案 中，该四聚体分子对T细胞增殖的抑制比野生型CTLA4分子至少 大2倍。可使用本技术领域的标准测定法检测T细胞增殖，例如，最 常用的检测T细胞增殖的方法之一为通过抗原或TCR的激动性抗体 激活T细胞并检测，例如氚(titrated)-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入增殖T 细胞的情况，或增殖T细胞释放至培养基中的细胞因子的量。可由 此测定CTLA4-Ig分子对T细胞激活或增殖的抑制作用。
CTLA4-Ig分子的亲和性为该分子与单链，包括CD80、 CD86 或CD80Ig或CD86Ig融合蛋白的结合力。可使用例如基于表面等离振子技术的结合相互作用分析(BIA)测定CTLA4-Ig与配体的亲和 性。除了检测结合力，它还使结合动力学例如结合和解离速率常数 等得以实时测定。将一种由金属薄膜包被的玻片(与表面基质共价 结合)组成的传感器芯片用相互作用物之一即CTLA4-Ig或配体之 一包被。使含有其它相互作用物的溶液流过该表面。将一连续光束 照射表面的另一侧，测量其反射角。当CTLA4-Ig与配体结合时， 光束的共振角发生变化(因为其取决于传感器反应侧邻近介质的屈 光指数，其与介质中溶解物质的浓度直接相关)。接着由计算机辅
助分析。在一个实施方案中，可在BIAcore仪器(BIAcore AG, Uppsala, Sweden)上通过表面等离子共振(SPR)进行CTLA4-Ig结合试验。 CTLA4-Ig可通过伯胺基团共价偶联至BIAcore传感器芯片上的羧曱 基葡聚糖基质上，从而将CTLA4-Ig固定至芯片上。或者，可用抗 恒定区抗体将CTLA4-Ig通过Ig片段间接固定至传感器表面。然 后，将配体加入芯片以检测CTLA4-Ig与配体的结合。可根据van der Merwe, P.等,J. Exp. Med. (1997) 185 (3):393-404描述的方法进行 亲和力测定。可测定CTLA4-Ig分子的亲和力。亲和力可定义为两个分子 或细胞之间在多位点上的总结合力。亲和力(avidity)与亲和性 (affinity)不同，后者为一个分子上的某一位点与其配体的结合强度。 不受理论的约束，更高的CTLA4-Ig分子亲合力可增强CTLA4-Ig分 子对T-细胞增殖和激活的药效强度。可通过两类固相分析测定亲合 力，例如a)竟争抑制检测和b)洗脱检测。在两种情况下，配体均 与固相载体结合。在竟争性抑制检测中，将固定浓度的CTLA4-Ig 分子与不同浓度的配体加入溶液中，测定可抑制50%固相结合的配 体数量。所需配体越少，亲合力越强。在洗脱片企测中，将配体加入 溶液中。在达到平衡态之后，加入不同浓度的离液剂或变性剂(如 异硫氰酸盐、尿素或二乙胺)干扰CTLA4-Ig/配体相互作用。然后用EUSA测定CTLA4-Ig抗性洗脱液的量。亲合力越高，用于洗脱 某一数量CTLA4-Ig所需的离液剂越多。CTLA4-Ig分子异质混合物 的相对亲合力可以表示为亲和力指数(AI),等于洗脱50%结合 CTLA4-Ig分子所需的洗脱剂浓度。可通过测定不同浓度的洗脱剂洗 脱的CTLA4-Ig百分比进行精细分析。 生产本发明CTLA4-Ig分子的方法可在原核细胞中表达CTLA4-Ig分子。各种细菌株可通常代 表大多数的原核细胞。细菌可为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性。通常 优选革兰氏阴性菌例如大肠杆菌(五.co")。也可使用其它微生物抹。
将如上所述的编码CTLA4-Ig分子的序列插入用于表达外原 序列的原核细胞载体中，例如大肠杆菌。这些载体可包括通常使用 的原核控制序列，其在本文定义为包括用于起始转录的启动子，任 选含有操纵子，以及核糖体结合位点序列，包括这些常用的启动子 例如卩-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang，等， (1977) Nature 198:1056)、色氨酸(trp )启动子系统(Goeddel,等， (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057)以及人衍生Pi启动子和N-基因核糖 体结合位点(Shimatake，等，(1981) Nature 292:128)。
这样的表达载体也包括复制起点和可筛选标记，例如使其具 有抗生素抗性的p-内酰胺酶和新霉素磷酸转移酶基因，这样载体可 在细菌内复制并且可在抗生素(例如氨苄西林或卡那霉素)存在下 生长从而筛选携带质粒的细胞。可通过各种标准方法将表达质粒导入原核细胞，包括但不限 于CaCl2休克(Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110和 Sambrook等.(eds.),"分子克隆:实验室手册"("Molecular Cloning: A Laboratory Manual"),第二版，冷泉港出版社(1989))和电穿孔。
与本发明的实践一致，真核细胞也可为适当的宿主细胞。真 核细胞的实例包括任何动物细胞，原始的或固定化的，酵母(例如 酉良酒酵母 (Sacc/mromyces cerev^siae )、 粟酒裂歹直酵母(iSWn'msacc/jflramyces / om6e )和毕赤酵母(尸fc/n'a ，加& ))和 植物细胞。骨髓瘤、COS和CHO细胞为可作为宿主的动物细胞实 例。尤其是CHO细胞包括但不限于DG44 (Chasin,等.，1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909)、 CHO-K1 (ATCC No. CCL-61)、 CHO-K1 Tet陽On细胞系 (Clontech)、标为ECACC 85050302的CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO克隆13 (GEIMG, Genova， IT)、 CHO克隆B (GEIMG, Genova, IT)、标为ECACC 93061607的CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)和标为ECACC 9205229的RR-CHOK1 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)。示例性植物细胞包括烟草
(全植物、细胞培养物或愈伤组织)、玉米、大豆和水稻细胞。玉 米、大豆和水稻细胞也可接受。也可将上述编码CTLA4Ig分子的核酸序列插入用于表达外源 序列的真核宿主中。该载体的调控元件依具体的真核宿主而不同。
用于表达载体的常用真核控制序列包括与哺乳动物细胞相容 的启动子和控制序列，例如CMV启动子(CDM8载体)和鸟类肉瘤 病毒(ASV)(兀LN载体)。其它常用启动子包括猿猴病毒40 (SV40) (Fiers,等，(1973) Nature 273:113)的早期和晚期启动子，或其它病毒 启动子，例如衍生自多瘤、腺病毒2和牛乳头状瘤病毒的启动子。 也可使用诱导型启动子，例如hMTII (Karin,等，(1982) Nature 299:797掘)。在真核细胞中表达CTLA4Ig分子的载体也可携带被称作增强 子区的序列。这些对于优化基因表达是非常重要的并且存在于启动 子区的上游或下游。用于真核宿主细胞的表达载体实例包括但不限于哺乳动物宿 主细胞载体(例如，BPV-1、 pHyg、 pRSV、 pSV2、 pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2、 pRc/RSV、 pSFVl (Life Technologies); pVPakc载体、pCMV载体、pSG5载体(Stratagene))、逆转录病毒载体(例如，pFB载体(Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen)或其修饰形 式、腺病毒载体；腺伴随病毒载体、杆状病毒载体、酵母载体(例如, pESC载体(Stratagene))。可将编码CTLA4Ig分子的核S臾序列整合至真核宿主细胞的基 因组中并按照宿主基因组复制的方式复制。或者，携带CTLA4Ig分 子的载体可含有允许染色体外复制的复制起点。对于在酿酒酵母(&cc/wtram_ycey cerev&ae )中表达核酸序 列，可使用来自酵母质粒的复制起点2p环(Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307)。或者，可使用来自酵母基因组可启动自主复制的序列(见 例如，Stinchcomb等，(1979) Nature 282:39; Tschemper等.，(1980) Gene 10:157;和Clarke等，(1983) Meth. Enz. 101:300)。
酵母载体的转录控制序列包括用于合成糖酵解酶(Hess等., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland等，(1978) Biochemistry 17:4900)的启动子。本技术领域已知的其它启动子包括CDM8载体 (Toyama核Okayama, (1990) FEBS 268:217-221)中提供的CMV启动 子、3-磷酸甘油酸酯激酶的启动子(Hitzeman等.，(1980) J. Biol. Chem. 255:2073)和其它糖酵解酶的启动子。其它启动子为诱导型，因为它们受环境刺激和细胞生长培养 基的调节。这些诱导型启动子包括热休克蛋白、醇脱氬酶2、异细 胞色素C、酸性磷酸酯酶、与氮分解代谢相关的酶和负责麦芽糖和 半乳糖利用的酶的基因。调控序列可位于编码序列的3，端。这些序列可稳定信使 RNA。这些终止子存在于一些由酵母衍生和哺乳动物基因的编码序 列之后的3'非翻译区。示例性植物载体和植物细胞包括但不限于农杆菌Ti质粒、 花椰菜花叶病毒(CaMV)和番茄金花叶病毒(TGMV)。
哺乳细胞的转化方法包括但不限于磷酸钙存在下的转染、显 孩"主射、电穿孔或通过病毒载体转导。
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将外源DNA导入植物或酵母基因组的方法包括(1 )机械方 法，例如将DNA显樣"主射入单核细胞或原生质体，在DNA存在下 与玻璃珠一起涡旋细胞或将DNA包被的鵠或金微粒射入细胞或原生 质体；(2)用聚乙二醇处理或高电压电脉冲(电穿孔)使细胞膜可 透过大分子；或(3)使用可与细胞膜融合的脂质体(含有 cDNA)。美国专利申请美国公开号20050019859和美国专利申请美国
发明者C·E·达尔黑姆, M·M·达利, M·内鲁尔卡, R·B·甘地, S·波尔萨迪亚, V·H·纳林格雷卡 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司