一种稳定的含有蒿属花粉变应原的药物组合物及其制备方法

专利名称：一种稳定的含有蒿属花粉变应原的药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种稳定的含有蒿属花粉变应原的液体 药物组合物及其制备方法与应用。
背景技术：
过敏性疾病是当今世界上最常见、最顽固的疾患之一，是一种严重威胁人类健康 的疾病。过敏性疾病的发病率大约占人口的20%，从新生儿到中老年人各年龄段都有可能 发生，没有明显的性别倾向，但有明显的遗传性倾向。引起过敏的主要变应原有尘螨、花粉、屋尘、霉菌、羽毛等，其中花粉是一类重要的 过敏原。花粉是高等植物的雄性生殖细胞，在风或虫的作用下，在空气中传播，有些人在呼 吸过程中吸人花粉后，便会产生过敏反应。花粉的飘散具有明显的季节性。春天的风媒花 粉多来源于树木；晚春和初夏的风媒花粉多来源于牧草；夏末和秋初的风媒花粉多来源于杂早。目前已知可以引起人类过敏的花粉主要有蒿属花粉(Artemisia)、豚草属花粉 (Ambrosia)、蓖麻属花粉(Ricinus)、潷草属花粉(Hummlus)、藜属花粉(Chenlpldum)、苋属 花粉(Amaranthus)、木麻黄属花粉(Casuarina)、桦木属花粉(Betula)、松属花粉(Pinus)、 云杉属花粉(Picea)、柳杉属花粉(Cryptomeria)、悬铃木属花粉(Platanus)等。这些植物 的花粉因其病原性强，致敏率高，数量大，散播范围广；且植物自身分布的范围广，数量亦丰 富，对花粉污染的影响大，因而这些植物成为较重要的花粉污染源植物。由于花粉污染源植 物的分布受气候、土壤、生物和地形等因素的影响，因而不同地区，其主要的花粉污染源植 物亦不相同。在美国和加拿大，花粉污染源以豚草最为重要；在英国、捷克、丹麦、法国、意大 利、西班牙和瑞士，以禾本科植物为主；在南非、巴勒斯坦、澳大利亚和新西兰，除以禾本科 植物为主外，树木类植物也较为重要；而在日本，引起花粉症的主要是柳杉和雪松木。在我 国，因多数地区(如北京、新疆、山西、山东、武汉、沈阳、广州、宁夏等地)的主要花粉均为蒿 属植物花粉，因此我国的花粉污染源植物以蒿属植物最为严重。关于过敏性疾病的治疗国内外都还不能完全解决，目前主要的预防和治疗措施包 括避免接触变应原、对症药物治疗和特异性免疫治疗。特异性免疫治疗是一种对因治疗的 方法，它将不能避免的并经皮肤点刺试验或其他方法证实或怀疑的主要变应原性物质，制 成系列浓度的变应原制剂，以逐渐递增剂量及浓度的方法进行给药(一般为皮下注射或者 舌下含服)，促使体内产生相应的抗体。这类抗体属于IgG4型，当这些特异性抗体在体液 中提高之后，如再度接受外来特异性过敏原时，此类抗体首先与之结合，与体内原有的slgE 抗体竞争。血清中的slgE在连续脱敏治疗以后逐渐下降，到过敏反应阈值以下时，即能防 止过敏反应的发生，因而达到脱敏的目的。由于蒿属花粉变应原物质本身的组成与结构复杂，易受物理或化学因素的影响而 失去活性、降低效价，有时即使在低温环境中也无法保证其变应原活性的长期稳定，这使该类药物的“货架寿命”都较短，不利于长期保存。

发明内容
本发明所要解决的技术问题即克服上述缺陷，提供一种能长期稳定的蒿属花粉变 应原的液体药物组合物。为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种稳定的液体药物组合物，其特征在 于，它包含治疗有效量或诊断有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓 冲液、以及药学上可接受的载体。在一个较佳的实施方案中，所述液体药物组合物是由治疗 有效量或诊断有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲液、以及药学 上可接受的载体组成的。在另一个较佳的实施方案中，所述蒿属花粉变应原为用以下方法制得的蒿属花粉 变应原浸提液以蒿属花粉为原料，经过花粉脱脂、干燥、浸提、浓缩而获得。在一个优选的实施方案中，所述液体药物组合物的剂型选自口服剂、注射剂、气雾 剂、鼻腔剂、皮肤点刺剂、或舌下含服剂等液体剂型。在另一个优选的实施方案中，所述蒿属花粉变应原选自北艾花粉变应原、黄花蒿 花粉变应原、大籽蒿花粉变应原或其组合。在还有一个优选的实施方案中，所述PH 5. 0 7. 0的缓冲液选自磷酸氢二钠-柠 檬酸缓冲液、柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液、或乙酸_乙酸钠 缓冲液。在一个更优选的实施方案中，所述PH 5.0 7.0的缓冲液选自pH 5.0磷酸氢二 钠_柠檬酸缓冲液、PH 6. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 6. 4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲 液、pH 5. 0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH 6. 0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH 6. 4磷酸氢二 钠_磷酸二氢钠缓冲液、PH 7. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH 5. 0乙酸-乙酸钠缓 冲液、或PH 5. 4乙酸-乙酸钠缓冲液。本发明另一方面提供了一种制备所述稳定的液体药物组合物的方法，其包括如下 步骤将治疗有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲液、以及药学上 可接受的载体混合。在一个优选的实施方案中，所述的方法包括如下步骤a)以蒿属花粉为原料，将花粉脱脂、浸提、浓缩，制得蒿属花粉变应原浸提液；b)将步骤a)所得的蒿属花粉变应原浸提液用缓冲有效量的pH 5.0 7.0的缓冲 液稀释成体积比1 1至1 100000000范围内的制剂；再加入药学上可接受的载体，过滤 除菌。在一个更优选的实施方案中，在所述步骤a)中，所述浸提过程中使用pH值为 7. 5 8. 9的缓冲液浸提；所述浓缩过程中使用缓冲有效量的pH 5. 0 7. 0的缓冲液替换 浸提缓冲液。本发明第三方面还涉及所述稳定的液体药物组合物在制备治疗或诊断由蒿属花 粉引起的过敏性疾病药物中的应用。在一个较佳的实施方案中，所述过敏性疾病选自由蒿属花粉引起的花粉症。在另 一个较佳的实施方案中，所述过敏性疾病选自由蒿属花粉引起的过敏性哮喘、变应性鼻炎、 过敏性结膜炎、或特应性皮炎等I型变态反应性疾病。
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从长期稳定性试验可以得知，本发明的蒿属花粉变应原液体药物组合物具有很好 的稳定性，在2 8°C条件下可以存放36个月。
具体实施方案具体而言，本发明首先提供了一种稳定的液体药物组合物，其特征在于，它包含治 疗有效量或诊断有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲液、以及药 学上可接受的载体。此处的术语“包含……”指的是该药物中还可以含有任何其它组分，这 些组分可以以任何含量存在，只要以该含量存在的该组分是人体可接受的，并对于本发明 药物组合物中活性成分的生物活性没有实质性的影响即可。在一个优选的实施方案中，所述液体药物组合物是基本上由治疗有效量或诊断有 效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲液、以及药学上可接受的载体 组成的。在一个更优选的实施方案中，所述液体药物组合物是由治疗有效量或诊断有效量 的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲液、以及药学上可接受的载体组成 的。本发明所述蒿属(Artemisia)花粉变应原优选北艾(Artemisia vulgaris Linn.)花粉变应原、黄花蒿(Artemisia annua Linn.)花粉变应原、大籽蒿(Artemisia sieversiana Ehrhart ex ffilld.)花粉变应原、艾(Artemisia argyi Levi, et Van.)花 粉变应原或其组合。本发明所述蒿属花粉变应原可以呈液体形式或固体形式；可以是从商 业途径购买，也可以使用任何现有技术中不使变应原降解或失活的方式从天然蒿属花粉中 提取的方法获得(即蒿属花粉变应原浸提液的形式)；可以是单一成分的蒿属花粉变应原 (例如北艾花粉Art ν 1重组变应原)，也可以是来源相同(单一来源)的蒿属花粉的变应 原混合物(例如黄花蒿花粉变应原混合物)，在不影响蒿属花粉变应原自身活性和效价的 前提下，也可以是多种蒿属花粉变应原来源的、以任何方式混合的蒿属花粉变应原组合物 (例如黄花蒿花粉变应原与北艾花粉变应原的组合物)。在一个较佳的实施方案中，所述蒿属花粉变应原为用以下方法制得的蒿属花粉变 应原浸提液以蒿属花粉(宜使用干燥的蒿属花粉)为原料，经过花粉脱脂、干燥、浸提、浓 缩而获得。术语“治疗有效量”是指本发明的液体药物组合物应用于特异性免疫治疗(脱敏 治疗)时的浓度(剂量)。特异性免疫治疗是一种对因治疗的方法，它将不能避免的并经皮 肤点刺试验或其他方法证实或怀疑的主要变应原性物质，制成系列浓度的变应原制剂，以 逐渐递增剂量及浓度的方法进行给药(一般为皮下注射或者舌下含服)，通过反复使病人 接触特异性变应原，防止过敏反应的发生，因而达到脱敏的目的。一般而言，“治疗有效量” 的蒿属花粉变应原(浸提液)总蛋白浓度优选为0.0148/1111 101^/1111，更优选为0.1口8/ ml lmg/ml。根据给药途径的不同，一般舌下含服的浓度(剂量)是皮下注射的10倍 800 倍。术语“诊断有效量”是指本发明的液体药物组合物应用于皮肤点刺诊断时的浓度 (剂量)。一般而言，“诊断有效量”的蒿属花粉变应原(浸提液)总蛋白浓度优选为ι μ g/ ml 10mg/ml,更优选为 100 μ g/ml lmg/ml。本发明的液体药物组合物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况等因素确定对病人有益的剂量进行施用。所述液体药物组合 物的剂型选自口服剂、(皮下)注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、或皮肤点刺剂等液体 剂型；优选(皮下)注射剂、舌下含服剂、或皮肤点刺剂。其中，(皮下)注射剂、舌下含服 剂一般是作为特异性免疫治疗时常用的剂型，而皮肤点刺剂是作为体内变应原检测时常用 的剂型。本发明所述“缓冲液”是本领域技术人员所熟知的，并可以安全用于药学制剂中， 包括但不限于甘氨酸_盐酸缓冲液，邻苯二甲酸_盐酸缓冲液，磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲 液，柠檬酸_氢氧化钠_盐酸缓冲液，柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液，乙酸_乙酸钠缓冲液，磷酸 氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液，磷酸氢二钠_磷酸二氢钾缓冲液，磷酸二氢钾_氢氧化钠缓冲 液，巴比妥钠_盐酸缓冲液，Tris-盐酸缓冲液，硼酸-硼砂缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲 液，硼砂_氢氧化钠缓冲液，碳酸钠_碳酸氢钠缓冲液，PBS缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二 氢钠-氯化钠缓冲液)等。本领域技术人员可以通过市售获得以上缓冲液，也可根据需要 配制一定PH值的缓冲液。除非另有所述，本发明中所述的“pH值”都是在25°C条件下所测 的PH值。在本发明的液体药物组合物中，优选使用的是pH 5.0 7.0的缓冲液。在一个 更优选的实施方案中，所述PH 5. 0 7. 0的缓冲液选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬 酸_柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液、或乙酸_乙酸钠缓冲液。在一个还 要优选的实施方案中，所述PH 5.0 7.0的缓冲液选自pH 5. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲 液、pH 6. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 6. 4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 5. 0柠檬 酸_柠檬酸钠缓冲液、PH 6. 0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH 6. 4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠 缓冲液、PH 7. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH 5. 0乙酸-乙酸钠缓冲液、或pH 5. 4 乙酸-乙酸钠缓冲液。术语“缓冲有效量”是指所述缓冲液的浓度足以使所述液体药物组合物的PH值维 持在一个特定PH值(优选pH 5. 0 7.0) 士 0.5 (更佳士 0.3，还要佳士 0.2，最佳士 0. 1)个 pH 单位内。例如但不限于，pH6. 0士0. 2(即 ρΗ5· 8 6. 2)，pH5. 0士0. 3(即 ρΗ4· 7 5. 3) 等。具体所述缓冲液的浓度与缓冲液的种类、PH值、整个药物组合物的具体组成等因素有 关，其可由本领域技术人员根据有限次的常规实验来方便地确定。一般，所述酸性缓冲液的 浓度为5mM 500mM (优选IOmM 400mM，更优选30mM 300mM，还要优选50mM 200mM)。术语“药学上可接受的载体”应当与本发明药物中的变应原相容，即能与其共混而 不会在通常情况下大幅度降低药物的生物活性(变应原活性)。可作为药学上可接受的载 体包括但不限于糖类，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖；淀粉，如玉米淀粉、土豆淀粉；纤维 素或其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；明胶；滑石； 固体润滑剂，如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉 米油、可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇；氨基己酸，海藻酸； 乳化剂，如吐温；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；抗氧化剂；药用防腐剂等，或其 组合。本发明优选的药学上可接受的载体是多元醇(较佳为甘油)与药用防腐剂(较佳为 苯酚、或山梨酸盐)的组合。多元醇的作用是赋予变应原药物适宜的渗透张力。多元醇包括但不限于，丙二 醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇等。在整个液体药物组合物中，多元醇的浓度优选
620% 80% (ν/ν)，更优选30% 70% (ν/ν)，还要优选40% 60% (ν/ν)，最优选45% 55% (ν/ν) ο药用防腐剂是本领域技术人员所熟知的，它的作用是防止或抑制病原微生物的生 长。药用防腐剂包括，但不限于，苯酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸或其盐类、对羟基苯甲酸酯类 (尼泊金酯类)、苯甲醇、苯乙醇等，或其组合。药用防腐剂的用量一般与防腐剂的种类，药 物的种类、剂型、PH值等多种因素有关。在整个液体药物组合物中，优选药用防腐剂的浓度 为 0. 01% 3. 0% (w/v)。因此，在一个优选的实施方案中，本发明药物组合物包含治疗有效量或诊断有效 量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5.0 7.0的缓冲液、0.01% 3.0% (w/v)药用 防腐剂、以及20% 80% (ν/ν)多元醇。在一个更优选的实施方案中，所述药物组合物是 基本上由治疗有效量或诊断有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲 液、0.01% 3.0% (w/v)药用防腐剂、以及20% 80% (ν/ν)多元醇组成的。在一个还要 优选的实施方案中，所述药物组合物是由治疗有效量或诊断有效量的蒿属花粉变应原、缓 冲有效量的PH 5.0 7.0的缓冲液、0.01% 3.0% (w/v)药用防腐剂、以及20% 80% (ν/ν)多元醇组成的。在上述方案中，所述药用防腐剂优选0.2% 0.3% (w/v)苯酚、或0. 1 % 0. 2% (w/v)山梨酸钾；所述多元醇优选45% 55% (ν/ν)甘油。在本发明的具体实施方案中，长期稳定性试验主要是对蒿属花粉变应原的总变应 原活性及主要变应原含量等指标作了考察。假设蒿属花粉变应原制剂最初的总变应原活性 为100 %，在一定条件下经过一段时间，使用同样的检测手段，其总变应原活性改变为最初 活性的70%以上(优选80%以上，更优选90%以上)；并且主要变应原含量在一定条件下 经过一段时间，其含量改变也为最初含量的70%以上(优选80 %以上，更优选90 %以上) 时；就认定该蒿属花粉变应原的生物活性是“稳定”的，其用于变应原特异性免疫治疗或变 应原皮肤点刺诊断也是可靠的。本发明另一方面提供了一种制备所述稳定的液体药物组合物的方法，其包括如下 步骤将治疗有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5.0 7.0的缓冲液、以及药学上 可接受的载体混合。在一个优选的实施方案中，所述的方法包括如下步骤a)以蒿属花粉为原料，将花粉脱脂、浸提、浓缩，制得蒿属花粉变应原浸提液；b)将步骤a)所得的蒿属花粉变应原浸提液用缓冲有效量的pH 5. 0 7. 0的缓冲 液稀释成体积比1 1至1 100000000范围内的多个浓度的制剂；再加入药学上可接受 的载体，过滤除菌。其中，所述蒿属花粉变应原优选北艾(Artemisia vulgaris Linn.)花粉变应原、 黄花蒿(Artemisia annua Linn.)花粉变应原、大轩蒿(Artemisia sieversiana Ehrhart ex ffilld.)花粉变应原、艾(Artemisia argyi Levi, et Van.)花粉变应原或其组合。在上述方案中，所述花粉脱脂时所使用的脱脂剂是常规的，脱脂剂包括但不限于， 乙醚、丙酮等有机溶剂。在制备蒿属花粉变应原浸提液时，发明人尝试了多种浸提液，并且比较了它们的 浸提效率。所使用的浸提液包括生理盐水、pH5. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6. 0的磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液、PH7. 5的磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液、pH8. 0的磷酸氢 二钠-磷酸二氢钠缓冲液、ρΗ8· 2的coca，s液、ρΗ8· 9的Tris-盐酸缓冲液等。实验结果 证实，使用PH 7. 5 8. 9的缓冲液的浸提效率较高，这可能与花粉类材料是偏酸性的有关。 在一个较佳的实施方案中，使用PH 8. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液浸提蒿属花粉变 应原。与传统的coca’ s液相比，pH8. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的浸提效率虽 然没有显著提高，但能使整个浸提液的PH值保持稳定，该浸提液长时间存放亦不会产生沉 淀，克服了 coca’ s液的某些缺陷。在另一个优选的方案中，在所述步骤a)中，所述浓缩过程中使用缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲液替换浸提缓冲液。需要指出的是，上述浓缩变应原浸出液并同时替换缓冲液的方法是本领域技术人 员所熟知的，包括但不限于，超滤、透析等方法。所选用膜的截流孔径可以根据需要确定，要 求在尽可能保留变应原活性的前提下除去无活性的小分子色素等杂质，优选截流分子量为 3 10kD。在本发明的一个实施方案中，使用截流分子量3kD的超滤膜进行超滤的方法浓 缩变应原浸出液并同时替换缓冲液。在所述步骤a)的替换浸提缓冲液时所使用的pH 5. 0 7. 0的缓冲液，与在所述 步骤b)的稀释过程中所使用的pH 5.0 7.0的缓冲液可以相同，也可以不同，只要两者可 以互融，并且混合后的缓冲体系具有稳定的缓冲能力，使整个药物的PH值维持在一个特定 PH值(优选pH 5. 0 7.0) 士0.5 (更佳士0.3，还要佳士0.2，最佳士0. 1)个pH单位内即 可。一般优选使用相同的缓冲有效量的PH 5.0 7.0的缓冲液，例如，在所述步骤a)的替 换浸提缓冲液时使用缓冲有效量的PH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在所述步骤b)的 稀释过程中使用缓冲有效量的PH 6. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。在一个较佳的实施方案中，所述pH 5. 0 7. 0的缓冲液选自磷酸氢二钠-柠檬酸 缓冲液、柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液、或乙酸_乙酸钠缓冲 液。在一个更佳的实施方案中，所述PH 5.0 7.0的缓冲液选自pH 5.0磷酸氢二钠-柠 檬酸缓冲液、PH 6. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 6. 4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 5. 0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH 6. 0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH 6. 4磷酸氢二钠-磷 酸二氢钠缓冲液、PH 7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液、或 PH 5. 4乙酸-乙酸钠缓冲液。因此，在一个更加优选的实施方案中，制备本发明所述稳定的液体药物组合物的 方法包括如下步骤步骤一蒿属花粉变应原浸提液的制备。(1)脱脂可连续用有机溶剂(例如丙酮)浸泡干燥的蒿属花粉(每次按质量体积 比1 2 1 10加入丙酮)，脱脂2 6次，每次0.1 24小时(优选1 12小时)， 至脱脂后的丙酮为无色后，将脱脂后的固体物自然干燥至无丙酮味后称重。实验室操作应 在通风橱内完成，中试采用真空浓缩提取罐。(2)浸提使经脱脂干燥后的蒿属花粉与pH 7.5 8.9的缓冲液(优选pH 8. 0的 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)二者以1 10 1 50 W/V (即每1克脱脂干燥后的 蒿属花粉用2 50毫升pH 7. 5 8. 9的缓冲液浸提)(较佳的为1 20 1 40 W/V, 更佳的为1 30 W/V)的比例提取，充分接触浸提0.1 72小时(优选进行1 60小时，更优选12 48小时)，离心或/并过滤，收集粗提液。其中，所述浸提操作宜在低温(优选 2 8°C)下进行；为了防止或抑制病原微生物的生长，宜对浸提缓冲液事先进行灭菌处理。(3)浓缩将上述得到的粗提液使用截流分子量为3 IOkD的超滤膜进行超滤， 反复加入pH 5. 0 7. 0的缓冲液替换原来的浸提缓冲液(优选超滤2 5次)，除去小分 子色素等杂质，最终使粗提液体积浓缩2 10倍，得到蒿属花粉变应原浸提液。步骤二 液体药物组合物的配制。(1)稀释将步骤一制得的蒿属花粉变应原浸提液用缓冲有效量的pH 5. 0 7. 0 的缓冲液稀释成体积比1 1至1 100000000范围内的制剂，加入药学上可接受的载体 (优选加入多元醇与药用防腐剂，使多元醇的终浓度为20% 80% (ν/ν)、药用防腐剂的终 浓度为 0.01% 3.0% (w/v)) ο(2)除菌使用孔径不大于1 μ m(优选0. 22 μ m)的无菌微孔滤膜进行过滤除菌， 分装、灌封，制得所述液体药物组合物成品。值得注意的是，本发明在描述制备所述液体药物组合物方法时，使用了“包括如下 步骤……”的句式。也就是说，本领域技术人员还可以根据需要，在制备所述液体药物组 合物时，增加其它的技术步骤，例如但不限于，使用现有的常规技术将所述蒿属花粉变应原 浸提液进行冻干，在配制制剂(药物)时再使用适宜的缓冲液(优选pH 5. 0 7. 0的缓冲 液)溶解；或者在浸提后先对粗提液调节PH值，再进行超滤浓缩；还可以对于所述蒿属花 粉变应原浸提液进行质量检测(如测定蛋白含量等)，方便后续的稀释步骤。当然，增加的 技术步骤必须确保基本上不会影响所述液体药物组合物的生物活性(变应原活性)。本发明第三方面还涉及所述稳定的液体药物组合物在制备治疗或诊断由蒿属花 粉引起的过敏性疾病药物中的应用。在一个较佳的实施方案中，所述过敏性疾病选自由蒿属花粉引起的花粉症。在另 一个较佳的实施方案中，所述过敏性疾病选自由蒿属花粉引起的过敏性哮喘、变应性鼻炎、 过敏性结膜炎、或特应性皮炎等I型变态反应性疾病。在另一个较佳的实施方案中，所述蒿属花粉选自北艾(Artemisia vulgaris Linn.)花粉、黄花蒿(Artemisia annua Linn.)花粉、大轩蒿(Artemisia sieversiana Ehrhart ex ffilld.)花粉、艾(Artemisia argyi Levi, et Van.)花粉或其组合。当本发明液体药物组合物应用于诊断由蒿属花粉引起的过敏性疾病时(即变应 原皮肤点刺诊断试验)，除了本发明液体药物组合物外，一般还应包括阴性对照液、阳性对 照液、以及点刺针。阴性对照液一般为对人体无过敏性反应的液体(例如甘油与盐溶液的 混合物等)，阳性对照液一般为1. 0 5. Omg/ml的磷酸组胺/盐酸组胺溶液(例如1. 7mg/ ml磷酸组胺溶液)。此外，本发明液体药物组合物也可以应用于斑贴试验中。其原理为将可疑致敏物 质(变应原)敷贴于患者皮肤上，通过皮肤或粘膜进入机体后由抗原呈递细胞将抗原呈递 给T淋巴细胞，使特异性T淋巴细胞活化，诱发炎症反应。下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只 是为了起到说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。实施例1黄花蒿花粉变应原舌下含服剂的制备(1)脱脂准确称取干燥的黄花蒿花粉，按质量体积比1 4加入丙酮，连续搅拌
9脱脂2小时，再静置30分钟，去掉上层丙酮，重复上述脱脂过程4次；将脱脂后的固体铺平， 于通风厨中干燥，至呈干粉状，且没有丙酮气味。(2)浸提将步骤(1)得到的脱脂花粉与50mM pH8. 0的磷酸氢二钠_磷酸二氢钠 缓冲液二者以1 30 (W/V)比例，4°C连续搅拌浸提48小时；4°C，IOOOOr. p.m.离心30分 钟，收集上清液；先后使用普通滤纸、0. 45 μ m微孔滤膜依次过滤，除去小颗粒物质，得到粗 提液。(3)浓缩将步骤(2)得到的粗提液用截留孔径为3kD的超滤膜进行超滤，反复加 入50mM pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液替换浸提缓冲液(超滤3次)，除去小分子色 素等杂质，最终使粗提液体积浓缩6倍，得到黄花蒿花粉变应原浸提液。(4)蛋白浓度测定对步骤(3)得到的黄花蒿花粉变应原浸提液进行总蛋白浓度 测定(用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量)，若总蛋白浓度不小于3mg/ml 时，即符合要求。(5)稀释将步骤(4)制得的黄花蒿花粉变应原浸提液用50mM pH6. 0的磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液稀释成体积比1 1至1 100000000范围内的多个浓度的制剂，加入 体积比1 1的甘油(使其终浓度为50% (ν/ν))，再加入苯酚(使其终浓度为0.25% (w/ ν))。(6)除菌使用0. 22 μ m的无菌微孔滤膜进行过滤除菌，分装、灌封，制得黄花蒿花 粉变应原舌下含服剂成品。分别命名黄花蒿花粉变应原舌下含服剂6号 1号，总蛋白浓 度依次为 500μ g/ml、100y g/ml、20y g/ml、4y g/ml、0. 8μ g/ml、0. 16μ g/ml。实施例2黄花蒿花粉变应原皮肤点刺液的制备步骤(1)-(4)同实施例1，但在超滤浓缩时使用150mM pH7. 0的磷酸氢二钠-磷酸
二氢钠缓冲液替换浸提缓冲液。(5)稀释将步骤⑷制得的黄花蒿花粉变应原浸提液用150mM pH7. 0的磷酸氢 二钠-磷酸二氢钠缓冲液稀释成总蛋白浓度为1200yg/ml，加入体积比1 1的甘油(使 其终浓度为50% (ν/ν))，再加入苯酚(使其终浓度为0. 2% (w/v))0(6)除菌使用0. 22 μ m的无菌微孔滤膜进行过滤除菌，分装、灌封，制得黄花蒿花 粉变应原皮肤点刺液成品，点刺液成品的总蛋白浓度为600 μ g/ml。实施例3大籽蒿花粉变应原皮下注射剂的制备(1)脱脂准确称取干燥的大籽蒿花粉，按质量体积比1 4加入丙酮，连续搅拌 脱脂2小时，再静置30分钟，去掉上层丙酮，重复上述脱脂过程4次；将脱脂后的固体铺平， 于通风厨中干燥，至呈干粉状，且没有丙酮气味。(2)浸提将步骤(1)得到的脱脂花粉与50mM pH8. 0的磷酸氢二钠_磷酸二氢钠 缓冲液二者以1 30 (W/V)比例，4°C连续搅拌浸提48小时；4°C，IOOOOr. p.m.离心30分 钟，收集上清液；先后使用普通滤纸、0. 45 μ m微孔滤膜依次过滤，除去小颗粒物质，得到粗 提液。(3)浓缩将步骤(2)得到的粗提液用截留孔径为3kD的超滤膜进行超滤，反复加 入IOOmM pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液替换浸提缓冲液(超滤3次)，除去小分子色素 等杂质，最终使粗提液体积浓缩6倍，得到大籽蒿花粉变应原浸提液。(4)蛋白浓度测定对步骤(3)得到的大籽蒿花粉变应原浸提液进行总蛋白浓度
10测定(用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量)，若总蛋白浓度不小于3mg/ml 时，即符合要求。(5)稀释将步骤⑷制得的大籽蒿花粉变应原浸提液用IOOmM pH5. 0的柠檬 酸-柠檬酸钠缓冲液稀释成体积比1 1至1 100000000范围内的多个浓度的制剂，加 入甘油(使其终浓度为45% (ν/ν))，再加入苯酚(使其终浓度为0.25% (w/v))。(6)除菌使用0. 22 μ m的无菌微孔滤膜进行过滤除菌，分装、灌封，制得大籽蒿花 粉变应原皮下注射剂成品。分别命名大籽蒿花粉变应原皮下注射剂4号 1号，总蛋白浓 度依次为 1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、lng/ml。实施例4北艾花粉变应原舌下含服剂的制备(1)脱脂准确称取干燥的北艾花粉，按质量体积比1 4加入丙酮，连续搅拌脱 脂2小时，再静置30分钟，去掉上层丙酮，重复上述脱脂过程4次；将脱脂后的固体铺平，于 通风厨中干燥，至是干粉状，且没有丙酮气味。(2)浸提将步骤(1)得到的脱脂花粉与50mM pH8. O的磷酸氢二钠_磷酸二氢钠 缓冲液二者以1 30 (W/V)比例，4°C连续搅拌浸提48小时；4°C，IOOOOr. p.m.离心30分 钟，收集上清液；先后使用普通滤纸、0. 45 μ m微孔滤膜依次过滤，除去小颗粒物质，得到粗 提液。(3)浓缩将步骤(2)得到的粗提液用截留孔径为3kD的超滤膜进行超滤，反复加 入200mM pH6. 4的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液替换浸提缓冲液(超滤3次)，除去小分 子色素等杂质，最终使粗提液体积浓缩6倍，得到北艾花粉变应原浸提液。(4)蛋白浓度测定对步骤(3)得到的北艾花粉变应原浸提液进行总蛋白浓度测 定(用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白含量)，若总蛋白浓度不小于3mg/ml 时，即符合要求。(5)稀释将步骤(4)制得的北艾花粉变应原浸提液用200mM pH6. 4的磷酸氢二 钠-磷酸二氢钠缓冲液稀释成体积比1 1至1 100000000范围内的多个浓度的制剂， 加入甘油(使其终浓度为55% (ν/ν))，再加入山梨酸钾(使其终浓度为0.15% (w/v))。(6)除菌使用0. 22 μ m的无菌微孔滤膜进行过滤除菌，分装、灌封，制得北艾花粉 变应原舌下含服剂成品。分别命名北艾花粉变应原舌下含服剂5号 1号，总蛋白浓度依 次为 300μ g/ml、100y g/ml、10y g/ml、l μ g/ml、0. 1 μ g/ml。实施例5北艾花粉变应原皮肤点刺液的制备步骤(1)-(4)同实施例4，但在超滤浓缩时使用200mM pH5. 4的乙酸-乙酸钠缓冲 液替换浸提缓冲液。(5)稀释将步骤(4)制得的北艾花粉变应原浸提液用200mM pH5. 4的乙酸-乙酸 钠缓冲液稀释成总蛋白浓度为800yg/ml，加入体积比1 1的甘油(使其终浓度为50% (ν/ν))，再加入苯酚(使其终浓度为0. 3 % (w/v))。(6)除菌使用0. 22 μ m的无菌微孔滤膜进行过滤除菌，分装、灌封，制得北艾花粉 变应原皮肤点刺液成品，点刺液成品的总蛋白浓度为400 μ g/ml。实施例6蒿属花粉变应原生物活性的测定(一)总变应原活性的测定将待测蒿属(如北艾)花粉变应原制剂与蒿属花粉标准血清库(浙江我武生物科技有限公司提供)中的血清等体积混合(100μ1 + 100μ1)，同时用该标准血清库中的血 清作为对照，在37°C温箱温育1小时，然后取出静置于4°C冰箱中过夜(9 12小时)。将 4°C过夜后的样品转移至已灭菌的玻璃试管内，用UnicaplOO仪器(瑞典法玛西亚公司)测 定其slgE的相对含量(根据瑞典法玛西亚公司的Immimo CAP诊断系统，Unicap自动体外 检测过敏原系统说明书操作)。蒿属花粉标准血清库中血清测得的slgE相对含量为78. 29 KUA/L。标准血清库中的血清含有针对变应原的特异性IgE(SlgE)。待测品中的变应原活 性成分会与血清中的slgE结合生成复合物，使血清中游离的slgE浓度降低，再用Unicap 系统检测血清中slgE的含量。待测品中变应原活性越高，血清与待测品作用后，其slgE浓 度就会降得越低。此时用Unicap系统检测会发现血清中游离的slgE会相应减少，通过比 较待测品加入前后血清中slgE浓度的变化就可以得到待测品中的总变应原活性。在血清 中slgE未被待测品中变应原完全结合的情况下，此过程中总变应原活性与血清中slgE浓 度的降低程度是正相关的。根据slgE的抑制率可以得到待测品中的总变应原活性，slgE的 抑制率越高，待测品中总变应原活性越高。( 二)主要变应原含量的测定使用蒿属花粉主要变应原蛋白1含量测定试剂盒(由中资汉脉(北京)生物技术 有限公司生产)，按照其附带的说明书操作。需要说明的是，蒿属花粉主要变应原蛋白1含 量测定试剂盒中的捕获抗体是针对蒿属花粉(包括黄花蒿、大籽蒿、北艾等)主要变应原蛋 白1共同的抗原表位产生的单克隆抗体，因此，该试剂盒可以检测蒿属不同种花粉的主要 变应原蛋白1的含量。实施例7长期稳定性试验考察考察样品实施例1制备的黄花蒿花粉变应原舌下含服剂6号(下表中记作样品1-6)、1 号(下表中记作样品1-1)；实施例2制备的黄花蒿花粉变应原皮肤点刺液(下表中记作样品2)；实施例3制备的大籽蒿花粉变应原皮下注射剂4号(下表中记作样品3-4)；实施例4制备的北艾花粉变应原舌下含服剂5号(下表中记作样品4-5)、1号 (下表中记作样品4-1)；实施例5制备的北艾花粉变应原皮肤点刺液(下表中记作样品5)；对照1 用coca，s液(5. Og氯化钠、2. 75g碳酸氢钠，加纯化水至1000ml)浸提后 得到黄花蒿花粉变应原浸提液，加入体积比1 1的甘油(使其终浓度为50% (ν/ν))，再 加入苯酚(使其终浓度为0.25% (w/v))，并用0.22 μ m的无菌微孔滤膜进行过滤除菌。该 制剂的总蛋白浓度为500μ g/ml ；对照2 步骤(1)_(4)同实施例4，但在超滤浓缩时使用生理盐水替换浸提缓冲液。 再用生理盐水稀释上述得到的北艾花粉变应原浸提液，加入甘油(使其终浓度为55% (ν/ ν))，再加入山梨酸钾(使其终浓度为0.15% (w/v))，并用0. 22 μ m的无菌微孔滤膜进行过 滤除菌。该制剂的总蛋白浓度为300 μ g/ml ；试验条件2°C 8°C ；试验抽样时间点在试验第3、6、9、12、18、24、36个月取样检测；
考察项目pH值(结果见表1)、总变应原活性(结果见表2)、主要变应原蛋白1含 量(结果见表3)，其中，“-”代表未检出有意义的数值。表1 PH值的检测结果 表2总变应原活性的检测结果 注以0天时的总变应原活性为100%，其它时间测定的数值与0天时的数值对 比，进行比值分析(百分数)，检测不同时间点总变应原活性的变化。表3蒿属花粉主要变应原蛋白1含量测定结果(yg/ml) 实施例8黄花蒿花粉变应原舌下含服剂的临床疗效(一)黄花蒿花粉变应原皮肤点刺试验1.点刺试剂盒的组成1)黄花蒿花粉变应原皮肤点刺液(实施例2制备得到)；2)阳性对照(1. 7mg/ml的磷酸组胺溶液，溶剂为甘油与150mM pH7. 0的磷酸氢二 钠-磷酸二氢钠缓冲液的等体积混合液，并加入终浓度0.2% (w/v)的苯酚)；3)阴性对照(甘油与150mM pH7. 0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的等体积混 合液，并加入终浓度0.2% (w/v)的苯酚)。2.点刺操作步骤1)诊断前先用酒精清洁前臂掌侧皮肤；2)将黄花蒿花粉变应原皮肤点刺液，阴性对照、阳性对照自上而下各滴一滴于清 洁后的皮肤上，两液滴间距离3 5cm，以防止反应红晕相互融合；3)点刺时，绷紧皮肤，将点刺针透过液滴，垂直刺入皮肤，对每种试液用一个新的 点刺针；4)2 3分钟后用棉签拭去皮肤上的残留液，注意不要混合相邻液滴；5)点刺后10 20分钟，观察试验结果。阳性反应的皮肤会呈现风团和红晕这2 种现象，用油性笔描绘风团及红晕四周边线。风团是指皮肤接触过敏原后出现的高于皮肤 的扁平隆起，周围有红晕。若阳性结果风团明显，就比较风团面积，如果风团不明显，可以比 较红晕面积；6)比较风团面积最简便的方法是目测，以阴性对照风团或红晕面积做校正，比较黄花蒿花粉变应原皮肤点刺液与阳性对照风团或红晕的面积，若黄花蒿花粉变应原皮肤点 刺液风团和红晕面积为阳性对照面积的25%以上，即可判断该患者黄花蒿花粉变应原点刺 试验阳性，可以考虑使用特异性免疫治疗(脱敏治疗)；7)如需要比较精确的风团面积，可用透明胶带将油性笔描绘的圈转移到毫米心电 图纸上，通过比较黄花蒿花粉变应原皮肤点刺液与阳性对照的风团所占格子数来确定该患 者对黄花蒿变应原过敏反应强度，最后将检测结果记录到点刺试验记录本上。3.结果判断如果点刺部位皮肤呈现风团或红晕，即为阳性反应；根据黄花蒿花粉变应原皮肤 点刺液与阳性对照所致风团面积比判定反应级别 比值为阳性对照风团0 25%或与阴性对照相同者为(一)； 比值为阳性对照风团26% 50%者为(+)； 比值为阳性对照风团51% 100%者为(++)； 比值为阳性对照风团101 200%者为(+++)； 比值为阳性对照风团200%以上者为(++++)。( 二 )黄花蒿花粉变应原舌下含服剂的临床疗效1.病例挑选花粉症病人共83例病程3年以上，且经上述过敏原皮肤点刺试验证明为对 黄花蒿花粉过敏(++以上)。其中，男39例，女44例，年龄最大54岁，最小8岁，平均年龄 35岁。2.药物用法与用量治疗药物黄花蒿花粉变应原舌下含服剂(实施例1制备得到)具体总蛋白浓度 依次为黄花蒿花粉变应原舌下含服剂1号(0. 16yg/ml)、2号(0. 8 μ g/ml)、3号(4 μ g/ ml)、4 号(20 μ g/ml)、5 号(100 μ g/ml)、6 号(500 μ g/ml)。用法(舌下含服)滴于舌下，含1 2分钟左右后吞服，每日1次。用量第1天舌下含服黄花蒿花粉变应原舌下含服剂1号1滴，第2天1滴，第3 天2滴，第4天2滴，第5天3滴，第6天3滴，第7天4滴，第8天4滴，第9天5滴，第10 天5滴；第11天 第20天舌下含服黄花蒿花粉变应原舌下含服剂2号，每天的剂量与黄花 蒿花粉变应原舌下含服剂1号相同；第21天 第30天舌下含服黄花蒿花粉变应原舌下含 服剂3号，每天的剂量与黄花蒿花粉变应原舌下含服剂1号相同；第31天 第40天舌下含 服黄花蒿花粉变应原舌下含服剂4号，每天的剂量与黄花蒿花粉变应原舌下含服剂1号相 同；第41天 第50天舌下含服黄花蒿花粉变应原舌下含服剂5号，每天的剂量与黄花蒿花 粉变应原舌下含服剂1号相同；第51天开始舌下含服黄花蒿花粉变应原舌下含服剂6号维 持至治疗结束，每天舌下含服2滴。注意事项一般在过敏症状(花粉症症状)轻微时开始治疗。1号 5号是递增剂 量，6号是维持剂量。若服用后24小时内有症状加重反应，次日剂量宜减少3级(如正用6 号者，改用3号；若仍在初始治疗阶段，则次日剂量减少至最小剂量，耐受后再逐渐递增。)疗程治疗满半年者共32例；治疗满1年者共27例；治疗满2年者共24例。3.疗效判断临床控制与治疗前比，花粉期(8 10月)花粉症的鼻部、眼部症状或花粉过敏性哮喘明显减轻达2个花粉季节以上。显效与治疗前比，花粉期(8 10月)花粉症的鼻 部、眼部症状或花粉过敏性哮喘减轻达2个花粉季节以上；或者明显减轻但经历时间不足2 个花粉季节。好转与治疗前比，花粉期(8 10月)花粉症症状或花粉过敏性哮喘稍减轻。 无效与治疗前比，花粉期(8 10月)花粉症症状或花粉过敏性哮喘无变化或者加重。4.结果83例患者治疗后临床控制43例(占51. 8% )，显效26例(占31. 3% )，好转11 例(占13. 3% )，无效3例(占3. 6% )，总有效率(临床控制+显效)为83. 1 %。并且，结 果还显示，脱敏治疗时间越长，有效率越高。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的宗旨、要点和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附 权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
一种稳定的液体药物组合物，其特征在于，该液体药物组合物包含治疗有效量或诊断有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的pH 5.0～7.0的缓冲液、以及药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的液体药物组合物，其特征在于，所述液体药物组合物是由治 疗有效量或诊断有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲液、以及药 学上可接受的载体组成的。
3.根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述液体药物组合物的剂 型选自口服剂、注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、或皮肤点刺剂。
4.根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述蒿属花粉变应原选自 北艾花粉变应原、黄花蒿花粉变应原、大籽蒿花粉变应原或其组合。
5.根据权利要求1或2所述的液体药物组合物，其特征在于，所述pH5. 0 7. 0的缓 冲液选自磷酸氢二钠_柠檬酸缓冲液、柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠_磷酸二氢钠 缓冲液、或乙酸-乙酸钠缓冲液。
6.根据权利要求5所述的液体药物组合物，其特征在于，所述pH5.0 7.0的缓冲液 选自pH 5. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 6. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH 6. 4磷酸 氢二钠_柠檬酸缓冲液、PH 5. 0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH 6. 0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲 液、pH 6. 4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH 7. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、pH 5. 0乙酸-乙酸钠缓冲液、或pH 5. 4乙酸-乙酸钠缓冲液。
7.一种制备权利要求1所述稳定的液体药物组合物的方法，其特征在于，包括如下步 骤将治疗有效量的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的PH 5. 0 7. 0的缓冲液、以及药学上可 接受的载体混合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤a)以蒿属花粉为原料，将花粉脱脂、浸提、浓缩，制得蒿属花粉变应原浸提液；b)将步骤a)所得的蒿属花粉变应原浸提液用缓冲有效量的pH5. 0 7. 0的缓冲液 稀释成体积比1 1至1 100000000范围内的制剂；再加入药学上可接受的载体，过滤除 菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述步骤a)中，所述浸提过程中使用 PH值为7. 5 8. 9的缓冲液浸提；所述浓缩过程中使用缓冲有效量的 >pH5. 0 7. 0的缓冲 液替换浸提缓冲液。
10.权利要求1所述稳定的液体药物组合物在制备治疗或诊断由蒿属花粉引起的过敏 性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种稳定的液体药物组合物，它包含治疗有效量或诊断有效量的的蒿属花粉变应原、缓冲有效量的pH 5.0～7.0的缓冲液、以及药学上可接受的载体。所述液体药物组合物的剂型优选口服剂、注射剂、舌下含服剂、气雾剂、鼻腔剂、或皮肤点刺剂。本发明还提供了制备该液体药物组合物的方法。本发明提供的液体药物组合物可以用来治疗或诊断由蒿属花粉引起的各类过敏性疾病，其在过敏性疾病诊断、治疗领域有广阔的应用前景和临床价值。
文档编号A61P11/02GK101905022SQ200910147470
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者李勤 申请人:浙江我武生物科技有限公司