聚谷氨酸及其在药品、化妆品、食品和水处理中的应用的制作方法

专利名称：：聚谷氨酸及其在药品、化妆品、食品和水处理中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体而言，本发明涉及一种聚谷氨酸，其均一性佳，可广泛用于药品、化妆品、食品以及水处理等应用中。另外，本发明还涉及所述聚谷氨酸的制备方法及其应用等。
背景技术：
：聚谷氨酸类多肽作为具有增稠、成膜、保湿的水溶性无毒(可生物降解)的多肽产物，可以应用于药品、化妆品、食品以及水处理等方面。现有的聚谷氨酸类多肽包括两类一类是完全由L-谷氨酸聚合形成的聚谷氨酸，例如中国专利申请CN1607962A、CN101300267A等所公开的，可作为药品、化妆品、食品的载体或添加剂，但是这类聚谷氨酸完全由卜谷氨酸聚合形成，化学合成难以达到动辄上万道尔顿(D)的分子量，而通过基因工程表达，这类完全相同氨基酸残基重复的多肽的表达量无法难以提高，也没有提高其表达量的文献公开报道；另一类是由L-谷氨酸和D-谷氨酸交替聚合而产生的Y_聚谷氨酸，如中国专利申请N1464864A、CN1556859A、CN1644677A、CN1974432A、CN101061867A等所公开的，其可由芽孢杆菌发酵产生，但是由于并非是直接通过编码基因表达产生的多肽，而是一系列蛋白质产生的结果，因此其发酵产生的Y-聚谷氨酸大小并不均一，多分散性在2-5之间(参见食品工程，2009(1):23-26)，也就是说，如果在均一性要求高的领域(如，医药)应用时，需要将发酵产生大大小小的Y-聚谷氨酸混合物进一步提纯保留特定分子量的产物，这样不但成本高昂，而且使得对于最终保留的特定分子量的Y-聚谷氨酸的实际产率低很多。为了克服现有技术的缺陷，本发明人经过艰苦的研究，抛弃了以上两种聚谷氨酸的结构，设计了一种能够基因工程高产量制备出的均一的新聚谷氨酸多肽序列，为推广应用该多肽打下了基础，更令人意外地，这种多肽尽管本身没有抗肿瘤活性，但在与紫杉醇缀合的条件下能够显著增强紫杉醇的抗肿瘤活性，而且这种多肽仍旧具有清除水体中重金属的效能。
发明内容本发明的要解决的技术问题在于提供一种能够基因工程高产量制备出的均一的新聚谷氨酸多肽序列，从而能够满足大量较低成本的聚谷氨酸产品应用于均一性要求高的领域的要求。另外，本发明还要解决的技术问题在于提供其制备方法、其制备的中间体(如核酸、载体、宿主细胞等)以及其应用和应用的产品。具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种聚谷氨酸，其氨基酸序列a)如序列表中的序列2所示；或b)是对序列表中的序列2所示的序列添加、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。在本文中，如未特别指出，术语"聚谷氨酸"、"聚谷氨酸多肽"和"富含聚谷氨酸的多肽"可以互换使用。本发明的第一个方面的聚谷氨酸的氨基酸序列可以是在序列表中的序列2所示的序列的基础上添加、缺失或取代一个或几个(优选一个至五个，更优选一个至三个)氨基酸残基而得的氨基酸序列，并且仍旧能够基因工程高产量制备出的均一的聚谷氨酸、仍旧能够在与紫杉醇缀合的条件下能够显著增强紫杉醇的抗肿瘤活性、和/或仍旧具有清除水体中重金属的效能。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。目前已经存在可以检验聚谷氨酸功能的实验方法，必要时也可根据本发明实施例所述的具体实验方法从经添加、缺失或取代的氨基酸序列中选出。在本发明的第一个方面中，优选所述聚谷氨酸的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。在第二个方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明第一个方面所述的聚谷氨酸。本发明的核酸分子，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的核酸分子或其片段。这些序列一旦获得，可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸分子。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如序列表中的序列l所示。该优选序列优化了在大肠杆菌的表达，使得在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达比例可以占到总蛋白的25%。在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的核酸分子。本文中的术语"重组表达载体"、"表达载体"，有时仅称"载体"，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第三个方面所述的载体，或者所述细胞已用本发明第二个方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适4当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。优选本发明的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。该优选宿主细胞与序列1所示的核苷酸序列配合，能高效表达本发明的聚谷氨酸。在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述聚谷氨酸的方法，其包括，用本发明第四个方面所述的宿主细胞表达本发明第一个方面所述的聚谷氨酸，然后分离纯化所述聚谷氨酸。在第六个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸。通常，组合物中还可以包括至少一种其它载体，例如生理盐水、缓冲液、和/或去离子水。其中，组合物可以是药物组合物、化妆品、食品、或水处理添加剂。例如，本发明优选提供一种药物组合物，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸作为活性药物载体，更优选其中所述活性药物是紫杉醇。又如，本发明优选提供一种化妆品，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸作为化妆活性成分的载体。又如，本发明优选提供一种食品，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸作为功能性食品成分的载体。又如，本发明优选提供一种水处理添加剂，其包含本发明第一个方面所述聚谷氨酸作为重金属离子的吸附剂，更优选其中所述是Pb离子。在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述聚谷氨酸在制备药物、化妆品、食品、或水处理添加剂中的应用。本发明取得的有益效果有表达量高；均一性佳；能够显著增强紫杉醇的抗肿瘤活性；和/或，保留了具有清除水体中重金属的效能。图1为为聚谷氨酸表达菌株培养液的SDS-PAGE电泳图，其中左侧泳道上样的是分子量标记(从上至下依次为66kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD);泳道1上样的是用IPTG诱导前的培养液；泳道2上样的是用IPTG诱导后的培养液。图2为经纯化的聚谷氨酸的SDS-PAGE电泳图，其中左侧泳道上样的是分子量标记(从上至下依次为从上至下依次为66kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD);中间和右侧泳道分别上样的是两个不同批次得到的经纯化的聚谷氨酸。为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。具体实施例方式以下实施例所述实验方法，没有具体说明的，按照《分子克隆实验指南》(2002年，第三版，科学出版社)、《细胞实验指南》(2001年，科学出版社)等实验手册所述的方法进行，或者根据实验中具体用到的试剂、仪器的厂商所提供的说明书或手册来进行。实施例1.聚谷氨酸表达载体的构建与表达为了有利于聚谷氨酸在大肠杆菌中的表达，我们根据自己的经验设计了在大肠杆菌中优化表达的聚谷氨酸基因序列，其如序列2所示，并通过商业渠道委托上海生工公司人工合成该基因序列。在得到该购买的合成的基因序列后，我们通过如下PCR反应在以上合成的序列两端分别引入EcoRI和Xhol酶切位点以及肠激酶切点上游引物序列3;下游引物序列4;PCR体系:H2034iiL，10XPCR缓冲液5iiL，25mMMgS042iiL，2mMdNTP5iiL，上游引物(稀释成50uM浓度)1yL，下游引物(稀释成50uM浓度)1yL，合成的聚谷氨酸基因(稀释成10ng/uL浓度)1iiL，KODPLUSDNA聚合酶(Toyoba)1iiL，总体积50iiL;PCR条件首先94t:变性5分钟，然后25个循环(每个循环为94°C30秒，50°C30秒，68°C30秒)，最后68°C2分钟。然后，在琼脂糖凝胶上电泳PCR扩增产物，割胶回收约400bp大小的核酸片段。用EcoRI和Xhol分别双酶切该回收的PCR产物和pET28a+质粒(可购自Invitrogen公司)，将酶切后的PCR产物和pET28a质粒用T4连接酶连接，构建成聚谷氨酸表达载体pET28-pGlu后转化大肠杆菌DH5a细胞(可购自ATCC)。取转化的大肠杆菌DH5a细胞抽提质粒，经测序检测序列克隆有聚谷氨酸正确序列后，将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)(可购自ATCC)中，由此得到聚谷氨酸表达菌株。取聚谷氨酸表达菌株接种到LB液体培养基lOOmL中，在37。C振摇培养6小时后，加入10uL的lmol/LIPTG进行诱导，于37。C继续培养4小时。诱导前后各取菌液50yL，用12%SDS-PAGE电泳。电泳结果如图1所示，诱导后在15kD左右的位置上有明显的聚谷氨酸表达条带，其表达量占菌体蛋白总量的25%以上，表明我们选用的核酸序列(序列2)、表达载体(pET28-pGlu)和宿主菌(大肠杆菌BL21(DE3))已经构成了原核高效表达系统。实施例2.聚谷氨酸的分离纯化对实施例1中诱导培养的菌体进行分离纯化操作，收获纯化的聚谷氨酸以供进一步实验使用。具体步骤为用10mL50mM浓度的Tris-HCl(pH8.0)裂解液重悬1克菌体，冰上超声破碎。4摄氏度10，000转/分钟离心20分钟，收集沉淀。然后，沉淀用3倍体积(30mL)的含2M尿素的裂解液彻底洗涤，4t:10000转/分钟离心IO分钟，弃上清，用3倍体积的含8M尿素的裂解液彻底溶解，4t:10000转/分钟离心弃去沉淀。将得到的包涵体裂解液用Q-S印haroseFastFlow柱(购自GE公司)纯化，先后用A液(含8mol/L尿素、25mmol/LTris—HCl(pH9.0)、lmmol/LEDTA禾Plmmol/LDTT)和B液(0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素、25mmol/L、Tris-HCl(pH9.0)、lmmol/LEDTA禾Plmmol/LDTT)进行梯度洗脱，280nm紫外监测，洗脱至不再出峰，分步收集洗脱液，进行SDS-PAGE，收集15kD的洗脱液。然后将收集的洗脱液过S印hedexG-25柱(购自GE公司)脱去洗脱液中的盐离子。然后，根据厂商说明书的指导，在20。C、20mMTris-HCl(pH7.6)，100mMNaCl的条件下，用1yl的rEK(重组肠激酶，可购自上海生工公司)跟聚谷氨酸(带有载体上的部分序列)反应8小时。然后，将反应液流经鳌合有Ni的NTA柱(购自Merck公司)以防止混入未酶切完全的蛋白。最后，将上一步的流出液lml过Q-S印haroseFastFlow柱纯化，条件是以50mMTris-HCl缓冲液平衡，用0至lmol/LNaCl梯度洗脱，收集含聚谷氨酸的洗脱峰。经过以上步骤的纯化，得到的纯化的聚谷氨酸的SDS-PAGE电泳结果如图2所示，在两个不同批次纯化试验得到的结果中，纯化的聚谷氨酸纯度均在95%以上，而且分子量均一性好，结果重复性佳。实施例3.聚谷氨酸_紫杉醇缀合物的制备及其药物应用将实施例2制备的聚谷氨酸23g加入到圆底烧瓶中，加入N，N-二甲基甲酰胺180ml搅拌10分钟，然后加入紫杉醇14.33g和N，N_二甲基氨基吡啶0.4g搅拌10分钟。在2(TC下缓慢滴加N，N-二异丙基碳二亚胺(在l小时内加入2.4g)并搅拌，然后搅拌3小时。反应混合物冷却至5t:l(TC并保持该温度，然后滴加10%(w/w)的氯化钠冷溶液0.5L。完成加入氯化钠溶液之后，滴加lmol/L的盐酸溶液直至反应物的pH值达到2.5(约需盐酸溶液20ml)，在5°Cl(TC搅拌30分钟，然后过滤收集沉淀出来的聚谷氨酸_紫杉醇缀合物。将沉淀用水洗涤3次，在冻干机中冷冻干燥24小时。然后，粉碎干燥后的固体块，悬浮于500ml乙腈中)并搅拌2小时，然后过滤，并用乙腈洗涤沉淀2次。沉淀在真空下干燥24小时后，得到聚谷氨酸_紫杉醇缀合物28.7g，根据1HNMR(d6匿S0)，聚谷氨酸-紫杉醇缀合物中紫杉醇的含量为36重量％。然后进行如下动物实验6周龄的裸鼠左肋侧皮下注射接种1(f个人肺癌MAD109细胞(可购自ATCC，美国)。接种后第6天，裸鼠随机分组，不同组的小鼠每天分别1次单独腹腔注射lmL空白对照溶剂PBS、lmL紫杉醇(剂量为10mg/kg)、lmL聚谷氨酸(剂量为16mg/kg)和lmL聚谷氨酸-紫杉醇缀合物(剂量为10mg/kg，以紫杉醇计)。记录肿瘤的生长情况，利用长X宽X高计算体积表示肿瘤的大小，结果如表3.l所示。结果表明，尽管聚谷氨酸本身没有治疗活性，但是聚谷氨酸_紫杉醇缀合物仍旧具有治疗活性，而且使用聚谷氨酸_紫杉醇缀合物相对于使用紫杉醇对于肿瘤抑制的短时期内的临床治疗效果无显著差异，但是令人意想不到的是，在给药12天以后对肿瘤生长的抑制作用显著增强。表3.1不同给药方案实施后小鼠肿瘤的体积<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4.聚谷氨酸的水处理应用将实施例2制备的聚谷氨酸2g溶于lmol/LNaOH溶液中，调整pH至6.0并定容至100ml，由此配制成2X(w/v)的聚谷氨酸钠溶液，然后加入去离子水稀释成0.016%(w/v)的聚谷氨酸钠溶液。取Pb(N03)2和去离子水制备浓度分别为0.10、0.15、0.20、0.30、0.40和0.50mmol/L的Pb(N03)2溶液，各取15ml分别与25ml0.016%(w/v)的聚谷氨酸钠溶液混合，然以10X的Na0H溶液调整pH至pH6.0，加去离子水定容至50ml。静置30分钟完成螯合，然后使用截留分子量为10kD的超滤膜(购自南京凯米科技有限公司)超滤。质谱检测滤过液中的Pb含量，结果如表4.l所示。结果表明，尽管本发明的聚谷氨酸没有形成传统Y-聚谷氨酸的交联沉淀物，但是仍旧保持了吸附Pb离子等有害重金属离子的能力。表4.1不同浓度的Pb(N03)2溶液经聚谷氨酸处理前后的Pb离子浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉聚谷氨酸多肽〈400>2MetGluGluGluGluGluGluAspGluGluGluGluGluGluProPro151015GluGluGluGluGluGluArgGluGluGluGluGluGluHisThrGlu202530GluGluGluGluGluAspGluGluGluGluGluGluGinGinGluGlu354045GluGluGluGluHisGluGluGluGluGluGluProCysGluGluGlu505560GluGluGluLeuGluGluGluGluGluGluAsnHisGluGluGluGlu65707580GluGluAlaGluGluGluGluGluGluCysHisGluGluGluGluGlu859095GluArgGluGluGluGluGluGluPheAspGluGluGluGluGluGlu100105110ArgGluGluGluGluGluGluAspGly115120〈210>3〈211>42〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>上游引物〈400>3ttggaattcgacgacgacgacaagatgg3ggaagaggaggag〈210>4〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>下游引物〈400>4ttgctcgagttaaccgtcttcctcc422权利要求一种聚谷氨酸，其氨基酸序列a)如序列表中的序列2所示；或b)是对序列表中的序列2所示的序列添加、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。2.权利要求1所述的聚谷氨酸，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示。3.—种核酸分子，其编码权利要求1或2所述的聚谷氨酸。4.权利要求3所述的核酸分子，其核苷酸序列如序列表中的序列l所示。5.—种载体，其含有权利要求3或4所述的核酸分子。6.—种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求5所述的载体，或者所述细胞已用权利要求3或4所述的核酸分子转化或转染。7.制备权利要求1或2所述的人肝再生增强因子的方法，其包括，用权利要求6所述的宿主细胞表达权利要求1或2所述的聚谷氨酸，然后分离纯化所述聚谷氨酸。8.—种组合物，其包含权利要求1或2所述的聚谷氨酸。9.权利要求8所述的组合物，其为药物组合物、化妆品、食品、或水处理添加剂。10.权利要求1或2所述的聚谷氨酸在制备药物、化妆品、食品、或水处理添加剂中的应用。全文摘要本发明公开了一种聚谷氨酸，其氨基酸序列如序列表中的序列2所示，或是对序列表中的序列2所示的序列添加、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列，可用于药品、化妆品、食品以及水处理等应用中。另外，本发明还公开了所述聚谷氨酸的制备方法及其应用等。文档编号A61K47/42GK101717432SQ20091015432公开日2010年6月2日申请日期2009年11月26日优先权日2009年11月26日发明者王利忠申请人:王利忠