专利名称：：人wnk4基因的单核苷酸多态性及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明属分子生物学和医学领域。涉及人WNK4基因的单核苷酸多态性及其用途。具体涉及人WNK4基因(WNK4gene)的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymor-phism,SNP)及其与原发性高血压相关性的检测。本发明还涉及检测该SNP位点的方法和试剂盒。
背景技术：
：高血压是一种常见的心血管疾病。据调查，在发达国家的发病率达25%。近年来，在我国发病率也在上升，以北京市为例，高血压发病率已高达20%。在老年人群中，高血压发病率更高。研究提示，原发性高血压是由环境因素和遗传因素相互作用所引起的多基因、多因素的疾病，其遗传率达到62%。人类高血压相关基因可以简单地分为两大类，即促高血压基因和抗高血压基因，正常人二类基因表达处于相对平衡状态，不会出现血压的明显变化。但是在遗传背景下当高血压相关基因表达失平衡，会导致与血压维持相关的血管活性多肽失平衡，促血管收缩因素作用增强，而促血管舒张因素作用减弱，这样就使体内维持血压处于正常水平的动态平衡被打破，导致高血压的出现。近二十余年来，有关高血压治疗的研究更多地集中在对血压的控制和对靶器官的保护，并已取得突飞猛进的发展。但是，这些手段并不能从根本上控制血压，目前对人类内源性抗高血压基因的研究还很少，因此，研究内源性抗高血压机制是今后高血压防治研究的主要方向之一，具有重要的研究价值和应用前景，如果通过调节内源性抗高血压机制治疗高血压病，将会促进我国生物医疗技术的发展，并为我国每年节省巨大的医疗费用。现有技术公开了WNK4基因编码的是WNK家族(丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)的蛋白激酶，该激酶是肾细胞紧密连接复合体(tightjunctioncomplex)中的一员，其主要功能是调节氯化钠重吸收与钾离子分泌的平衡，该基因突变可导致主要表现为高血压的常染色体显性遗传疾病假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldostero-nismtypeII，PHAII)[Nguyen-Van-TamJS,AlanWH.TheEpidemiologyandClinicalimpactofpandemicinfluenza[J].Vaccine,2003,21:1762-1768.]。而且WNK4基因已被定位于高血压易感位点17ql2_21上[CassandraDSalgado,BarryMFarr,KeriKHall,etal.Influenzaintheacutehospitalsetting[J].TheLancetInfectiousDisease,2002,2:145-155.WorldHealthOrganiza-tionInfluenzaVaccines[J]WklyEpidemiolRec,2002,77229-240]，因此WNK4基因是原发性高血压的候选基因之一。虽然已有许多关于WNK4基因多态性与原发性高血压的研究，但迄今为止，尚无证实rs2290041位点(mRNA2902位C/T)与原发性高血压相关性的报道。
发明内容本发明的目的是提供原发性高血压易感基因，具体涉及人WNK4基因的单核苷酸多态性及其用途。尤其是人WNK4基因(rS2290041)单核苷酸多态性在检测原发性高血压及早期诊断高血压中的用途。本发明发现和证明了WNK4基因rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro)与高血压密切相关，而且发现了它的新功能WNK4基因rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro)的改变将导致高血压的发病风险升高，其中关联研究结果显示，在WNK4基因mRNA2902位C—T在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P<0.05)，该SNP多态性可改变转录因子结合位点。本发明所述的WNK4基因的详细序列可参见登录号为rs2290041的核苷酸序列(可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，全长是4147bp(SEQIDN0:17)。本发明人对WNK4基因中的编码区221bp区域进行了测序。图1显示了WNK4rs2290041(mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro)的一种SNP基因型的测序结果。本发明的进一步目的是提供检测原发性高血压易感基因试剂盒及方法。1、本发明提供了一种检测高血压易感基因的试剂盒，其包括WNK4基因的单核苷酸多态性和特异性扩增WNK4基因的引物。本发明另一优选例中，所述的试剂盒，它还含有下列的试剂与突变部位结合的探针。本发明中，所述的试剂盒中，所述的单核苷酸多态性是rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro)，其中，核苷酸位置编号基于SEQIDNO17/18。本发明另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro)其中，核苷酸位置编号基于SEQIDN0:17。本发明提供了检测样品中是否存在WNK4基因的单核苷酸多态性的方法，其包括步骤(a)用WNK4基因特异性引物扩增样品的WNK4基因，得到扩增产物；和(b)检测扩增产物中是否存在选自下列的单核苷酸多态性rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro)其中，核苷酸位置编号基于SEQIDNO17/18。本发明中，所述的单核苷酸多态性是mRNA2902位C—Τ。本发明中，检测WNK4基因的rs2290041的基因型也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。WNK4基因的rs2290041的基因型可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。本发明提供的检测样品中是否存在WNK4基因的单核苷酸多态性的方法，可用于对个体的高血压易感性进行诊断，它包括步骤检测该个体的WNK4基因rs2290041位点的基因型及与普通人群存有的差异，以此判断该个体患高血压的发病风险是否高于普通人群，带有T基因型的个体高血压的发病风险显著高于普通人群。本发明一优选例中，检测的是WNK4基因rs2290041位点的基因型。本发明一优选例中，所述的差异是选自下列的单核苷酸多态性rs2290041(WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro)其中，核苷酸位置编号基于SEQIDN0:17/18。本发明WNK4基因rs2290041位点的多态性可用于高血压的个性化治疗时的参考。在使用本发明WNK4基因rs2290041位点的多态性时，还可同时参考使用其他治疗高血压的药剂。本发明更进一步提供了一种药物组合物，它含有安全有效的本发明WNK4蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。所述载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的WNK4蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于普哺乳动物，其中该安全有效剂量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册(NewYorkCoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。图1显示了WNK4rs2290041(mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro)的一种SNP基因型的测序结果。图2是WNK4基因rs2290041位点基因型的检测结果。图3是本发明实施例2的20例的测序结果截图。具体实施例方式实施例1荧光PCR检测一、实验材料7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液(TaqManEXPressMasterMix)由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。二、引物及探针设计与合成以WNK4基因14外显子部分序列为模板，使用PrimerExpressTM2.0软件分析TaqMan引物和探针位点，并由美国应用生物系统公司(ABI)定制合成。检测用引物WNK4基因rs2290041上游引物序列5'-GAGTGCAGAGTGGAGTCTCCCTAATC-3‘WNK4基因rs2290041下游引物序列5'-CTCACTGGCTGTGATGACTGTGG-3‘荧光探针WNK4基因rs2290041荧光探针1:5'-VIC-AGGCTAGAGAGGGGACTA-TAMRA-3‘WNK4基因rs2290041荧光探针2:5'-FAM-AGGCTAGGGAGGGGACTA-TAMRA-3‘三、样本检测实验共检测735例高血压病例和486例正常对照人群，每例收集血样标本约2ml，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计(INFINIGEN公司)检测。按如下表1体系进行荧光PCR扩增，最后用SDS2.3扫描并聚类分析。表1384孔板(ul)TaqManEXPress25MasterMix(2X)20Xworkingstockof0.25SNPGenotypingAssaygDNA(3ng/ul左右)Z25反应总体积5__标准反应_AmpliTaqGoldEnzyme活化PCR反应(40轮)__持续变性退火/延伸1min@95°C__10sec@95__30sec@60°C_四、型检测结果基因组DNA抽提的检测结果所有样本的基因组DNA符合检测要求(260/280>1.8，浓度>lOng/ul，如图2所示样本766号的检测结果)表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2用测序法检测原发性高血压易感基因WNK4基因的rs2290041位点。挑选上述高血压病例-对照组样本各10例进行测序判断rS2290041的基因型。一、实验方法PCR测序引物仍采用上述荧光PCR用引物，扩增的产物经纯化后直接测序。测序的仪器是ABI公司的3130x1遗传分析仪，用sequenceanalysis5.2分析软件进行分析，结果用chromas也可以查看。二、实验结果显示，20例的测序结果与7900荧光PCR的基因型分析结果完全一致。三、WNK4基因rs2290041基因型和高血压易感的关联分析1^(4基因1^2290041在高血压病人和对照中分布的比较采用1说乂2检验.用SPSS软件进行统计分析。表3是检测结果及SPSS软件分析结果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求一种检测样品是否存在WNK4基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤(a)用WNK4基因特异性引物扩增样品的WNK4基因，得到扩增产物；和检测扩增产物中是否存在选自下列的单核苷酸多态性(b)rs2290041，WNK4，mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro，其中，核苷酸位置编号基于SEQIDNO17/18。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是mRNA2902位C—T。3.一种检测高血压易感基因的试剂盒，其特征在于，它包括WNK4基因的单核苷酸多态性和特异性扩增WNK4基因的引物。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，它还含有下列的试剂与突变部位结合的探针。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是rs2290041，WNK4,mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro，其中，核苷酸位置编号基于SEQIDNO17/18。6.WNK4基因的单核苷酸多态性在制备诊断个体的高血压易感性制剂中的用途，其中，所述的用途是检测该个体的WNK4基因rs2290041位点的基因型与普通人群的差异。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的差异是选自下列的单核苷酸多态性rs2290041，WNK4，mRNA位置2902位C/T；蛋白质氨基酸位置961Ser/Pro，其中，核苷酸位置编号基于SEQIDNO:17/18。8.—种药物组合物，它含有安全有效的所述的WNK4蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。全文摘要本发明属分子生物学和医学领域，涉及人WNK4基因的单核苷酸多态性及其用途。尤其涉及人WNK4基因的单核苷酸多态性及其与原发性高血压相关性的检测。本发明还涉及检测该SNP位点的方法和检测高血压易感基因的试剂盒。本发明可用于检测个体的WNK4基因rs2290041位点的基因型，为判断该个体患原发性高血压的发病风险是否大于普通人群提供参考数据。文档编号A61P9/12GK101805784SQ20091019857公开日2010年8月18日申请日期2009年11月10日优先权日2009年11月10日发明者吴海,李志忠,温绍君,谢毅申请人:首都医科大学附属北京安贞医院;复旦大学