专利名称：一种新型glp-1衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，涉及一种具有GLP-I活性的GLP-I衍生物及其制 备和应用。
背景技术：
糖尿病是世界性疾病，发展迅速，对人类危害巨大。2007年全球约2. 46亿人患糖 尿病，预计到2025年，全世界糖尿病患者将增加到3. 8亿。根据2007年的中华医学会的调 查，我国城市和城镇20岁以上的人群中糖尿病患病率为约10%，并且患者年龄还呈现出日 趋低龄化的趋势。在糖尿病患者中，接近90%患者为II型糖尿病，不能单独使用胰岛素进 行治疗。伴随着糖尿病患者的激增，对其和相关并发症的治疗开销也随之巨幅增长，对我国 带来劳动力巨大损失。糖尿病已成为我国重要的公共卫生问题。近年来对GLP-I及其类似物研究进展很快，应用于糖尿病治疗取得了较好的疗 效。GLP-I是进食后由远端回肠、结肠和直肠的L细胞分泌释放的一种31氨基酸的多肽 激素，在体内有两种活性形式GLP-l(7-36)及GLP-I (7-37)，两者具有相同的生物学活性。 GLP-I的促胰岛素分泌作用是依赖于血液中葡萄糖浓度，使用GLP-I治疗糖尿病不会产生 低血糖，因此具有较高的安全性，因此在治疗II型糖尿病方面具有较好的前景。但是，天然GLP-I在体内极易被二肽基肽酶IV (DPPIV)降解，脱去N端的 His7-Ala8。被DPPIV降解后，GLP-1成为无活性形式的GLP-1 (9-36)，为GLP-1受体拮抗剂， 抑制GLP-I活性。其体内静脉注射半衰期仅为5min。由于GLP-I的半衰期极短，大大限制 了其在临床上的应用，因此急需寻找更为长效的具有临床价值的GLP-I类似物。目前GLP-I研究的主要方向之一是通过对GLP-I结构进行氨基酸定点突变改造， 使其能够抵抗DPPIV降解，以达到延长药物体内药效的目的。DPPIV催化的降解反应具有严 格的底物特异性，由于GLP-I存在His7-Ala8结构，因此GLP-I极易被降解。本专利申请人的在先发明专利申请中已经提出一种GLP-I衍生物及其制备方法， 详见发明专利申请(申请号2006100M355.X ；发明名称一种人胰高血糖素样肽_1衍生 物及其制备和应用)。该发明专利申请所提供的GLP-I衍生物存在以下缺点，如第2位氨 基酸在体内仍然极易被DPPIV降解失去活性。因此，为了更好地保留GLP-I衍生物的活性， 提高抗DPPIV降解能力，需要进一步开发其他长效GLP-I衍生物。本发明正是克服上述技 术缺陷，对该第2位氨基酸进行改造，将N端第2位Ala突变为Gly、Thr, Val等，从而延缓 其降解速率，显著提高其抗DPPIV降解的能力。经改造后的本发明GLP-I衍生物，其半衰期 可延长至原来5倍左右。
发明内容
本发明涉及的GLP-I 指 GLP-I (7-37)，其序列(kq ID No. 1)为His-Ala-Glu_Gl y-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe -A1a-Trp-Leu-Va1-Lys-G1y-Arg-G1y。
本申请人的在先发明专利申请(申请号2006100M355.X;发明名称一种人胰 高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用)中所提出GLP-I衍生物，是指mGLP-1 (7-38)，其 序列 Geq ID No. 2)为His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Xaa,其中 Xaa32是Cys，Ala, Gly, His, Ser和Thr中的任何一个氨基酸。本发明所解决的技术方案，是提供一种GLP-I衍生物，该衍生物具有分子结构式 cGLP-1 (7-38)，即kq ID No. 3。本专利申请中以cGLP_l表示本发明GLP-I衍生物。其序 列为:His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Xaa ；其中，Xaa2 是 Gly，Thr 或 Val中的任何一个氨基酸，Xaa32是Cys。本发明提供的GLP-I衍生物，该衍生物具有分子结构式CGLP-I (7-38)，即kq ID No. 3,其序列为:His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gl y-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Xaa ；其中 Xaa2 是 Gly, Xaa32 是 Cys0上述衍生物不仅保持了天然GLP-I在体内的活性，还显著延长了体内药效时间， 具有良好的临床应用价值。此外，该衍生物可通过DNA重组技术或固相化学合成制备，技术 成熟，适宜普及使用。本发明提供利用DNA重组技术制备上述衍生物的方法。本发明GLP-I衍生物重组 制备方法，包括步骤(1)合成包含GLP-I衍生物氨基酸编码序列的融合基因片段。按GLP-I衍生物的 氨基酸编码序列，合成GLP-I衍生物氨基酸编码序列的长度为729bp的融合基因片段，即 Seq ID No. 4 ；其中，n535 = n536 = g，n537 = c ；其中，该片段含有硫氧还蛋白、六聚组氨 酸、肠激酶位点、GLP-I衍生物基因、终止密码子TAA、限制性内切酶^CbaI和HindIII位点；(2)构建含有GLP-I衍生物基因的重组表达载体。用限制性内切酶)(ba I和 HindIII双酶切，插入带有卡那霉素抗性标记的质粒pET28a(+)中，构建得到含有GLP-I衍 生物基因的重组表达载体pET28a(+)-cGLP-1 ；(3)将含有GLP-I衍生物基因序列的表达载体转入原核宿主细胞，比如，原核宿主 细胞大肠杆菌，获得基因工程菌株；
(4)将基因工程菌株液体发酵，获得含GLP-I衍生物融合蛋白的湿菌体；(5)将湿菌体破壁，从上清液中分离获得含GLP-I衍生物融合蛋白的粗品；(6)用肠激酶裂解融合蛋白，经纯化、冷冻干燥制得GLP-I衍生物纯品。以上步骤(3)中的基因工程菌可以是携带重组质粒的大肠杆菌DH5ci，BL21(DE3) 或 BLR(DE3)。通过DNA重组技术生产GLP-I衍生物，成本低，产量高。本发明的另一技术方案是提供GLP-I衍生物在制备治疗糖尿病的药物中作药物 活性成分的应用。本发明的另一技术方案是提供含有有效量GLP-I衍生物以及药学可接受的成分 的组合物。本发明的GLP-I衍生物优选以无菌冻干物形式储存，在给药前与合适的等渗溶液混合，其中含有药学上可接受的成分如甘露醇、氯化钠等，然后可通过静脉注射或皮下注射 等方式给药。
以下附图用于阐述本发明的技术方案，附图中以cGLP-1表示本发明GLP-I衍生 物。图1 质粒pET28a(+)-cGLP-1的构建，其中该质粒含本发明GLP-1衍生物。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步详述本发明。说明书及以下实施例中所用质粒、菌体等， 以及未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行，可按商品供货商所建议的条件进行。实施例1本申请人的在先发明专利申请(申请号2006100M355. X ；发明名称一 种人胰高血糖素样肽-1衍生物及其制备和应用)中所提出GLP-I衍生物的氨基酸序列，如 Seq ID No. 2，其中 Xaa32 = Cys0实施例2本发明GLP-I衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No. 3，其中Xaa2 = Gly, Xaa32 = Cys0实施例3本发明GLP-I衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No. 3，其中Xaa2 = Thr， Xaa32 = Cys0实施例4本发明GLP-I衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No. 3，其中Xaa2 = Val, Xaa32 = Cys0实施例5DNA重组技术制备本发明的GLP-I衍生物，该衍生物的分子结构式为 cGLP-1 (7-38)，如实施例 2 所示，即 Seq ID No. 3，其中 Xaa2 = Gly，Xaa32 = Cys ；步骤(1)，按GLP-I衍生物的氨基酸编码序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，通过PCR 方法合成以下长度为 729bp 的片段，艮口 Seq ID No. 4 :gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60catatgagcg ataaaattat tcacctgact gacgacagtt ttgacacgga tgtactcaaa 120gcggacgggg cgatcctcgt cgatttctgg gcagagtggt gcggtccgtg caaaatgatc 180gccccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgt tgcaaaactg 240aacatcgatc aaaaccctgg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtat cccgactctg 300ctgctgttca aaaacggtga agtggcggca accaaagtgg gtgcactgtc taaaggtcag 360ttgaaagagt tcctcgacgc taacctggcc ggttctggtt c tggccatat gcaccatcat 420catcatcatt cttctggtct ggtgccacgc ggttctggta tgaaagaaac cgctgctgct 480aaattcgaac gccagcacat ggacagccca gatctggacg acgacgacaa gcatnnngaa 540ggcaccttta ccagcgatgt gagcagctat ctggaaggcc aggccgccaa agaatttatt 600gcctggctgg tgaaaggcag aggctgttga taaccatggc tgatatcgga tccgaattcg 660agctccgtcg acaagcttgc ggccgcactc gagcaccacc accaccacca ctgagatccg 720gctgctaac 729其中，n535 = n536 = g，n537 = c ；其中，该片段含有硫氧还蛋白、六聚组氨酸、肠激酶位点、GLP-I衍生物基因、终止 密码子TAA以及限制性内切酶Xba I和HindIII位点；
步骤O)，上述融合基因片断以限制性内切酶)(ba I和HindIII双酶切并纯化回 收，以限制性内切酶)(ba I和HindIII双酶切大肠杆菌质粒pET28a(+)并纯化回收大片断， 二者混合后加入T4DNA连接酶，16°C连接2-6小时，构建得到含有GLP-I衍生物基因序列的 重组质粒 pET28a(+)-cGLP-l ；步骤(3)，重组质粒pET28a(+)-cGLP-l与大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞混合，冰 浴15-30分钟，42 °C水浴热激60-90秒，37°C培养30-45分钟，菌液涂布含30ug/mL卡那霉 素的LB固体平板，37°C培养12-16小时后出现的菌落即为含有GLP-I衍生物基因序列的基 因工程菌株；步骤，含有GLP-I衍生物基因序列的基因工程菌株在含30ug/mL卡那霉素的 LB液体培养基中培养至0D600nm = 0. 6-0. 8，加IPTG至终浓度0. 5-0. 8mmol/L，37°C诱导 3-5小时，离心收集湿菌体；步骤(5)，菌体重悬于IDA-O缓冲液，冰浴中超声破碎，离心后收集上清进行镍离 子螯合亲和层析，收集含GLP-I衍生物融合蛋白的洗脱组分，采用截留分子量为IOkD的 Amicon Ultra_15超滤离心管将蛋白脱盐、浓缩至3mg/mL以上，得到含有GLP-I衍生物融合 蛋白的粗品；步骤(6)，在GLP-I衍生物融合蛋白粗品中加入肠激酶，23_25°C裂解8-16小时，反 应混合液再进行镍离子螯合亲和层析，收集流穿液，冷冻干燥获得GLP-I衍生物。实施例6DNA重组技术制备本发明GLP-I衍生物，该衍生物的分子结构式为 cGLP-1 (7-38)，如实施例 3 所示，即 kq ID No. 3，其中 Xaa2 = Thr, Xaa32 = Cys ；步骤(1)合成的kq ID No. 4 基因片段中，n535 = a, n536 = n537 = c ；其余步骤同实施例5。实施例7DNA重组技术制备本发明的GLP-I衍生物，该衍生物的分子结构式为 cGLP-1 (7-38)，如实施例 4 所示，即 kq ID No. 3，其中 Xaa2 = Val，Xaa32 = Cys ；步骤(1)合成的kq ID No. 4 基因片段中，n535 = n537 = g, n536 = t ；其余步骤同实施例5。实施例8GLP-1衍生物的降血糖作用。实验材料与方法雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司提供)；16%葡萄糖溶液；0.9% NaCl 溶液；GLP-I ；cGLP-1，具有实施例2所述GLP-I衍生物的结构；血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司出品)。雌性健康昆明小鼠禁食16小时，分为4组(n = 10)。1，生理盐水对照组；2，GLP-I 给药对照组；3 4，cGLP-1给药组，具体的序列结构是实施例2中所述的结构。GLP-I给 药对照组2腹腔注射0. 4ug的GLP-I ；cGLP-1给药组3腹腔注射0. 4ug的cGLP-1 (7-38)； cGLP-1给药组4腹腔注射3. 2ug的cGLP-1 (7-38)；记此时为零时刻。1组于0. 5、1. 5、3. 5、 5. 5,7. 5小时给予200uL 16%葡萄糖溶液，分别于1、2、4、6、8小时进行小鼠尾静脉取血 10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度；2组于0. 5,1. 5小时给予200uL 16%葡萄糖溶液，分别于1、2小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度；3组于0. 5,1. 5,3. 5、 5. 5小时给予200uL 16 %葡萄糖溶液，分别于1、2、4、6小时进行小鼠尾静脉取血IOul，用血 糖测试仪测定血糖浓度；4组于3. 5、7. 5小时给予200uL 16%葡萄糖溶液，分别于4、8小时 进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度。结果如下表所示，所示数值均为n= 10的均值，所示降糖率按如下方法计算降糖 率(％)=(生理盐水对照组血糖值-给药组血糖值)/生理盐水对照组血糖值。与生理 盐水对照组小鼠相比，在给药后1小时，cGLP-1和GLP-I均能显著降低小鼠血糖，且cGLP_l 的降血糖幅度更大；在给药后2小时，GLP-I的降血糖作用已不显著，而cGLP-1可在6 8 小时内显著降低小鼠血糖，体内药效时间比GLP-I延长。结果表明，按本发明GLP-I衍生物 cGLP-1表现出比GLP-I更加长效的降血糖活性。表cGLP-1的降血糖作用
降糖率(％)
组别 -
Ih2h4h6h8h
100000230.311. 5000368. 353. 740.920.904--67. 5-25. 2实施例9GLP-1衍生物mGLP-1和本发明GLP-1衍生物cGLP-1的降血糖作用比较。实验材料与方法雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海斯莱克实验动物有限公司提供)；16%葡萄糖溶液；0.9% NaCl 溶液；mGLP-1，具有实施例1所述GLP-I衍生物的结构；cGLP-1，具有实施例2所述GLP-1衍生物的结构；血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司出品)。雌性健康昆明小鼠禁食16小时，分为3组(η= 10)。1，生理盐水对照组；2，mGLP_l 给药对照组，具体的序列结构是实施例1中所述的结构；3，cGLP-1给药组，具体的序列结构 是实施例2中所述的结构。mGLP-1给药对照组2腹腔注射0. 4ug的mGLP-1 ；cGLP-1给药 组3腹腔注射0. 4ug的cGLP-1 (7-38)；记此时为零时刻。1组于1. 5,3. 5,5. 5,7. 5小时给 予200uL 16%葡萄糖溶液，分别于2、4、6、8小时进行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪 测定血糖浓度；2组于1. 5、3. 5、5. 5小时给予200uL 16%葡萄糖溶液，分别于2、4、6小时进 行小鼠尾静脉取血10uL，用血糖测试仪测定血糖浓度；3组于1. 5,3. 5,5. 5,7. 5小时给予 200uL 16%葡萄糖溶液，分别于2、4、6、8小时进行小鼠尾静脉取血IOul，用血糖测试仪测 定血糖浓度。结果如下表所示，所示数值均为n= 10的均值，所示降糖率按如下方法计算降糖 率(％)=(生理盐水对照组血糖值-给药组血糖值)/生理盐水对照组血糖值。与生理盐水对照组小鼠相比，在给药后2 4小时，mGLP-1和cGLP_l均能显著降低小鼠血糖，且 cGLP-1的降血糖幅度更大；在给药后6小时，mGLP-1的降血糖作用已不显著，而cGLP_l仍 然能够显著降低小鼠血糖，体内药效时间比mGLP-1延长。结果表明，按本发明GLP-I衍生 物cGLP-1表现出比按背景技术公开的mGLP-1更加长效的降血糖活性。表mGLP-1和cGLP-Ι的降血糖作用比较
权利要求
1.一种GLP-I衍生物，其特征在于，该衍生物具有分子结构式CGLP-I (7-38)，即％(1 ID No. 3 ；其中，)(aa2是Gly, Thr或Val中的任何一个氨基酸，Xaa32是Cys0
2.如权利要求1所述的GLP-I衍生物，其中，所述是Gly。
3.如权利要求2所述GLP-I衍生物的重组制备方法，其特征在于，包括步骤(1)按GLP-I衍生物的氨基酸编码序列，合成GLP-I衍生物氨基酸编码序列的长度为 729bp的融合基因片段，即kq ID No. 4 ；其中，n535 = n536 = g, n537 = c ；其中，该片段 含有硫氧还蛋白、六聚组氨酸、肠激酶位点、GLP-I衍生物基因、终止密码子TAA、限制性内 切酶Xba I和HindIII位点；(2)用限制性内切酶)(baI和HindIII双酶切，插入带有卡那霉素抗性标记的质粒 pET28a (+)中，构建得到含有GLP-I衍生物基因的重组表达载体pET28a (+) -cGLP-1 ；(3)将含有GLP-I衍生物基因序列的表达载体转入原核宿主细胞大肠杆菌，获得基因 工程菌株；(4)将基因工程菌株液体发酵，获得含GLP-I衍生物融合蛋白的湿菌体；(5)将湿菌体破壁，从上清液中分离获得含GLP-I衍生物融合蛋白的粗品；(6)用肠激酶裂解融合蛋白，经纯化、冷冻干燥制得GLP-I衍生物纯品。
4.如权利要求2所述GLP-I衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中的基因工程菌 是携带重组质粒的大肠杆菌DH5 α，BL21 (DE3)或BLR (DE3)。
5.如权利要求1或2所述的GLP-I衍生物在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性 成分的应用。
6.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的按权利要求1或2所述的GLP-I 衍生物，以及药学可接受的成分。
全文摘要
本发明公开一种新型GLP-1衍生物，该衍生物具有分子结构式cGLP-1(7-38)即Seq ID No.3，其中Xaa2是Gly，Thr和Val中的任何一个氨基酸。该衍生物通过DNA重组技术制备，具有长于GLP-1的半衰期，适合于在制备治疗糖尿病的药物中作该药物的活性成分。
文档编号A61P3/10GK102108097SQ20091024734
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者包志宏, 吴自荣, 杨利, 汪洋, 蒋子威, 黄静 申请人:上海海泰药业有限公司, 华东师范大学