专利名称：一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸及应用，属 于免疫学和生物技术药物的交叉研究领域。具体涉及一种具有免疫调节作用的化合物， 即一种抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸，在临床上可用于Thl和/或 Thl7过度激活的自身免疫性和其它炎症性疾病。本发明还具体的涉及该免疫调节性寡聚 脱氧核苷酸的作用机制，即抑制STATl，3，4(STATs， Signal transducer and activator oftranscription)的磷酸化。
背景技术：
免疫系统的过度激活和持续的炎症反应导致了各种自身免疫性疾病和炎症性疾 病的发生。T淋巴细胞是介导特异性免疫应答的主要免疫细胞，按照其功能不同可以分为多 种亚群，其中Thl/Th2和Thl7/CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)细胞功能失衡被证实参与多 种自身免疫性疾病的启动和发展。 早年的许多研究指出Thl细胞及其相关的细胞因子所介导的炎症反应和组织损 伤在自身免疫性疾病的发病机制中起了至关重要的作用。例如Thl细胞的过继转输加剧了 l型糖尿病和自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发生，多发性硬化(MS)患者给予Thl关键性的 细胞因子IFN-Y会使病情加剧。另外一些慢性炎症性疾病如动脉粥样硬化也被认为是Thl 占优势的疾病。 然而，IFN- Y作为Thl的效应分子，在IFN- Y缺陷鼠或IFN_ Y R缺陷鼠无IFN_ Y 信号，仍可发生自身免疫病，甚至对自身免疫病更易感。这说明除Thl细胞外还有其他Th 细胞亚群参与诱导自身免疫病。新近证实这是一种能特异性产生IL-17的Th细胞亚群，被 命名为Thl7细胞。Thl7代表一类不同于Thl或Th2的CD4+Th细胞亚群，具有很强的促炎 症作用，并与多种自身免疫病的发生和发展有关。EAE和胶原诱导的关节(CIA)传统上被 认为由IL-12诱导Thl细胞介导，近年在上述疾病模型中均发现IL-17含量增高，过继转输 Thl7诱发严重的EAE，而IL-17-/-小鼠表现出对上述疾病的明显抵抗，证实上述疾病实际 上主要由Thl7诱导。此外，Thl7介导的炎症反应还参与了哮喘、炎症性肠病和器官移植排 斥反应等疾病的发生。 现在普遍认为Thl和Thl7均参与了自身免疫的炎症过程，它们单独或协同诱导炎 症反应和组织损伤的过程。因此在继Thl之后，Thl7成为抗炎和免疫调节治疗的新靶点。
寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxy皿cleoside， ODN)对免疫系统有着复杂的作 用。研究表明，人工合成的包含有非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)基序的寡聚脱氧 核苷酸(CpG-ODN)可以剌激B细胞、NK细胞等增殖、成熟，促进Thl型细胞因子的分泌。而 包含TTAGGG序列的0DN(0DNA151)不仅可以抑制CpG-ODN诱导的免疫剌激作用，而且可以 通过调节T细胞亚群的分化改善多种自身免疫性疾病的进展和预后，因此被称之为抑制性 ODN(Su卯ressive ODN)。研究发现，抑制性0DNA151可以与STAT1和STAT4结合并阻止其磷酸化，从而抑制下游转录因子T-bet (Thl细胞分化特征性转录因子)的表达，而对Th2细 胞分化的信号通路STAT6-GATA3没有影B向，因此可用于治疗Thl细胞占优势的自身免疫性 疾病。我们的研究发现，应用抑制性00脆151在体干预八。0￡-/-自发性动脉粥样硬化小鼠， 可以显著抑制STAT1/4和T-bet通路，抑制Thl细胞功能而减少动脉粥样硬化斑块面积。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核 苷酸(ODN)，即调节性ODN(regulatory oligodeoxy皿cleoside)。此调节性ODN能有效的 抑制IFN- y的分泌，抑制Thl的转录因子STATl和STAT4，从而调节Thl的分化；此调节性 ODN还能有效的抑制IL-17的分泌，抑制Thl7的转录因子STAT3的磷酸化，从而调节Thl7 的分化。本发明还具体提供该免疫调节性寡聚脱氧核苷酸的作用机制，即抑制STAT1，3，4 的磷酸化。 本发明的技术方案本发明提供了一种抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱 氧核苷酸-ODN R01，它包含序列表〈210>1所示的核苷酸序列。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-0DNR01 ，能抑 制STAT1、 STAT4的磷酸化而调节Thl细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为 TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG 。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNROl，能 抑制STAT3的磷酸化而调节Thl7细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为 TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG 。所述的根据权利要求1所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷 酸-ODN ROl，经过硫代修饰增加其在细胞内的稳定性，或使用其它核酸载体，如脂质体或多 价阳离子聚合物，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。
所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNROl，可应用在体 外调节Thl和Thl7细胞的分化。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNROl，可应用于筛 选其它的免疫调节剂。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-0DNR01的应用，其 安全有效剂量与药学上可接受的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN ROl的药物组合物。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-0DNR01在治疗和/ 或预防下列表1和表2所述的多种疾病中的应用
表1部分Thl占优势的疾病
Crohn's病
胰岛素依赖性糖尿病
幽门螵旋杆菌感染
实验性自身免疫性神经炎
自身免疫性甲状腺炎
实验室自身免疫性脑脊髓炎/多袁性硬化
动脉粥样硬化
急性冠脉综合征
慢性心力衰竭 表2部分已明确的Thl7来源的细胞因子起致病作用的疾病
实验室自身免疫性脑脊髓炎/多赏性硬化(IL-17, IL-21) 胶原诱导性关节炎(IL-17, IL-21) 慢性结肠炎(IL-17) 系统性红斑狼疮(IL-21) 银屑病(IL-17) 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-0DNR01的应用，包括 给有需要的患者施用治疗或预防有效量的所述的核苷酸序列或其药用组合物。
本发明的优点免疫反应介导的炎症性损伤实际上是一种免疫失衡，包括T细胞 亚群功能的失衡，本发明的调节性ODN通过调节Thl和Thl7的分化，以恢复免疫失衡，因 此优于特异性的细胞因子拮抗剂。该ODN与哺乳动物端粒区的结构类似，与其他免疫调节 剂相比对人体更安全。在我们自行设计的几种调节性ODN中，ODN ROl对Thl和Thl7的抑 制作用最强，对STAT1，3，4的磷酸化的抑制作用也是最强的，并且优于ODN A151，也就是说 ODN ROl能更好的调节Thl和Thl7的分化。
图1是G-tetrad和G-quadruplex的结构。富含鸟嘌呤的单链DNA在一定的条 件下可以形成G-quadruplex的结构，这是一种热力学和动力学性质都很稳定的四链体 DNA结构，G-quadruplex的基本结构单位即是G-tetrad。 G-tetrad由鸟嘌呤通过分子间 Hoogsteen氢键形成，M+代表单价阳离子，稳定G-tetrad的结构。 图2是ODN ROl的结构。ODN ROl通过分子间Hoogsteen氢键形成G-quadruplex。
图3是调节性0DN抑制IFN- y的分泌。用ConA活化脾细胞，与ODN共培养，ELISA检测上清中IFN- y的浓度，以此筛选我们自行设计的几种调节性ODN。
图4是调节性ODN抑制IL-17的分泌。用ConA活化脾细胞，与ODN共培养，ELISA检测上清中IL-17的浓度，以此筛选我们自行设计的几种调节性ODN。 图5， 6， 7是ODN R01在极化条件下抑制Thl分化。用ConA活化脾细胞，在Thl (以IL-12, anti-IL-4诱导Thl的分化)极化条件下与ODN共培养。用ELISA和流式细胞术(FACS)进行检测。 图5是ODN R01抑制Thl分化的ELISA结果。 图6是ODN R01抑制Thl分化的FACS散点图。a为同型对照，b为空白对照，c为0DN1612，d为ODN ROl， e为0DNA151。 图7是ODN ROl抑制Thl分化的FACS结果的数据统计，Thl细胞(IFN- y +CD4+) /CD4+T细胞的比例。 图8， 9， 10是ODN ROl在极化条件下抑制Thl7的分化。用ConA活化脾细胞，在Thl7(以IL-6， IL-21, IL_23， TGF-P 1， anti-IL_4， anti-IFN-y诱导Thl7的分化)极化条件下与ODN共培养，用ELISA和FACS进行检测。
图8是ODN ROl抑制Thl7分化的ELISA结果。 图9是ODN ROl抑制Thl7分化的FACS散点图。a e为流式细胞术散点图a为同型对照，b为空白对照，c为0DN1612， d为ODN A151， e为ODNROl。 图10是ODN ROl抑制Thl7分化的FACS结果的数据统计，Thl7细胞(IL-17+CD4+) /CD4+T细胞的比例。 图ll是ODN R01抑制STAT1，3，4的磷酸化。将小鼠的脾细胞与ODN共孵育lh，再分别用IFN-y，IL-12或IL-6剌激20min，使STATl，3，4磷酸化。然后用Western blot检测STATlph°7STATl， STAT4ph°x/STAT4， STAT3ph°x/STAT3的表达水平。 图12是ODN ROl抑制STATl， 3， 4磷酸化的半定量分析。将Western blot图片用Totallab 100图像分析软件分析后，将各组磷酸化蛋白的水平与对照组对比，以其相对表达水平来进行统计学分析。 注*表示P < 0. 05， **表示P < 0. 0具体实施例方式
本发明提供了一种抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-0DN ROl，它包含序列表〈210>1所示的核苷酸序列。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNROl，能抑制STAT1、 STAT4的磷酸化而调节Thl细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG 。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNROl，能抑制STAT3的磷酸化而调节Thl7细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG 。 所述的根据权利要求1所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN ROl，经过硫代修饰增加其在细胞内的稳定性，或使用其它核酸载体，如脂质体或多价阳离子聚合物，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNROl，可应用在体
外调节Thl和Thl7细胞的分化。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNROl，它应用于筛 选其它的免疫调节剂。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-0DNR01的应用，其 安全有效剂量与药学上可接受的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN R01的药物组合物。 所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-0DNR01的应用，包括
给有需要的患者施用治疗或预防有效量的所述的核苷酸序列或其药用组合物。 本发明中所提到的寡聚脱氧核苷酸可用各种该领域常用的oligo DNA合成方法合
成。该ODN是鸟嘌呤丰富的序列，倾向于形成G-quadruplex的结构(图1)。该ODN经过硫
代修饰使其在细胞内稳定，防止细胞内的核酸酶降解。本发明还包括用其它核酸载体如脂
质体或多价阳离子聚合物等，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。 实验报告一 调节性ODN抑制Thl和Thl7的分化 Thl细胞及其分泌的细胞因子能启动级联的促炎性反应，导致持续的自身免疫性 组织损伤。ODN A151能选择性的减少Thl型细胞因子的产生，并促进Th2型的免疫应答。 这是因为抑制性ODN能阻断IFN- y和IL-12介导的信号通路，从而阻止初始CD4+T细胞向 Thl细胞分化。虽然抑制性0DN不能直接促进Th2的分化，IFN-y的产生减少强烈的促进 了 Th2型的免疫应答。0DNA151通过通过调节体内Thl/Th2的平衡，抑制病理性的过度炎症 反应，已被证明能有效的预防和治疗Thl型的某些自身免疫性疾病。 Thl7主要介导防御胞外病原微生物的感染，参与自身免疫和炎症反应。IL-17是 一种致炎因子，它可以通过诱导其他炎症细胞因子如IL-6，TNF-a以及趋化因子如MCP-1， MIP-2等的表达，介导炎症细胞到局部的浸润及组织损伤，通过不同机制发挥致炎作用。给 实验性自身免疫性眼葡萄膜炎的小鼠腹腔注射0DNA151，能明显缓解病情，并且能抑制抗原 特异性的淋巴细胞分泌IFN-y以及IL-17和IL-22。 ODN A151作为一种免疫调节剂已被 成功的用于多种疾病模型，其有效性除了通过Thl介导以外，也可能是通过Thl7介导。ODN 究竟是否能影响Thl7的分化，目前还无这方面的研究。 本研究采用我们自行设计的几种寡聚核苷酸序列，通过体外实验，探讨其能否调 节Thl及Thl7的分化。
1材料与方法
1. l实验动物 材料清洁级近交系C57BL/6J小鼠，雄性，6-8周龄，体重22g左右。由华中科技大
学同济医学院动物实验动物中心提供。 1. 2主要仪器流式细胞仪FACS Calibur型，Becton Dickinson,美国
全自动酶标仪ELX800型，Bio-tek，美国
1. 3主要试剂 ODN :化学合成，全链硫代磷酸化修饰，PAGE纯化，invitrogen，其序列为
调节性0DN 0DN R01 TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG (SEQ ID NO:l)
调节性ODN ODN R02 TTTAGGGTTAGGGTTAGGG (SEQ ID NO :2)
调节性ODN ODN R03 TCAGGGTCAGGGTCAGGGTCAGGG (SEQ ID NO :3)
调节性ODN ODN R04 TAAGGGTAAGGGTAAGGGTAAGGG (SEQ ID NO :4)
阳性对照ODN A151 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
阴性对照0DN1612 GCTAGAGCTTAGGCT
诱导分化细胞因子 a)小鼠IL-12，小鼠IL-6，小鼠IL-21，人TGF-P l，均购自P印roTech，英国。
b)小鼠IL-23，小鼠anti-IL-4，小鼠anti-IFN-y ，均购自ebioscience，美国。
细胞因子ELISA检测试剂盒IFN-y ， IL-17A， Bender,德国。
流式细胞术检测 a)抗体FITC标记的抗小鼠CD4单抗，PE标记的抗小鼠IFN_ y单抗，IL_17单抗，相应的同型对照抗体，均购自ebioscience,美国。 b)剌激剂及膜抑制剂佛波醇乙酯(PMA)，离子霉素(Ionomycin)，莫能霉素(Mo體sin)，均购自BD Pharmingen，美国。
c)FACS破膜剂BD Biosciences,美国。
d)FACS固定剂ebioscience，美国。
1. 4细胞培养 取C57BL/6J小鼠脾脏用密度梯度离心法分离单个核细胞，分为未剌激组，空白对照组，0DN1612组，ODN A151组，ODN R01 R04组，除未剌激组外均以ConA 2. 5 ii g/ml剌激，后6组分别加入相应的ODN 5iiM，如有必要，IL-12 10ng/ml， anti-IL-410ug/ml诱导Thl的分化，以IL-650ng/ml， IL-21 50ng/ml， IL-23 50ng/ml， TGF-P 1 2. 5ng/ml，anti-IL-410ii g/ml， anti-IFN-y 10 ii g/ml i秀导Thl7的分化。细胞置于37°C、5% C02培养72小时，收集上清用于细胞因子ELISA检测。
1. 5细胞培养上清细胞因子ELISA检测 IFN-y (灵敏度7.8pg/ml)，IL-17A(灵敏度7. 8pg/ml):根据试剂盒说明书进行检测。每个样本设置3个复孔，于酶标仪450nm波长处测光密度值；根据标准曲线测出标本细胞因子含量。 1. 6流式细胞术检测Thl细胞和Thl7细胞 分另lj将小鼠脾细胞在Thl(IL-1210ng/ml， anti-IL-410ii g/ml)和Thl7(IL_650ng/ml，IL_2150ng/ml，IL_2350ng/ml，TGF_P 12. 5ng/ml，anti_IL_410ii g/ml，anti-IFN- y 10 y g/ml)的极化条件下进行培养。剌激剂及分组情况同上，细胞置于37°C 、5% C02培养72小时。培养的细胞以PMA 50ng/ml， Ionomycin 1 y g/ml再剌激，同时加入蛋白转运抑制剂Monensin 1 y g/ml，置于37°C 、5% C02再培养4h。收集细胞后，依次进行表面抗原染色(FITC标记的抗小鼠CD4单抗)，将细胞固定，破膜，进行胞内细胞因子染色(PE标记的抗小鼠IFN-y单抗，IL-17单抗)。流式细胞仪上应用Cell Quest软件进行分析。
1. 7统计学分析采用SPSS13. 0统计软件，数值变量以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者行Student NewmanKeuls(S-N-K)检验，方差不齐者行Games-Howell检验。P < 0. 05为差异具有显著性意义，P < 0. 01为差异有极显著性意义。
2结果 2. 10DN R01降低Thl型细胞因子的分泌C57BL/6J小鼠的脾细胞在ConA剌激下， 与ODN共孵育后ELISA检测培养上清液中细胞因子。在我们自行设计的几种ODN中，ODN ROl， R03， R04与对照组相比，均能抑制Thl细胞因子的分泌，明显减少上清中IFN-y含 量，ODN R02的作用不明显。其中ODN ROl的抑制作用最强(ROlvs对照100. 04±26. 24vs 495. 77±102. 46pg/ml，P < 0. 01)，且比ODN A151(254. 00±71. 42pg/ml，P < 0. 01)的作用 更明显，而ODN 1612对细胞因子的分泌没有明显作用(见图3)。 2. 20DN ROl降低Thl7型细胞因子的分泌用同样的方法检测ODN处理后细胞培养 上清液中IL-17的含量。我们同样发现ODN ROl， R03， R04与对照组相比，均能抑制Thl7 细胞因子的分泌，明显减少上清中IL-17含量，ODN R02的作用不明显。其中ODN ROl的 抑制作用同样最强(ROl vs对照11. 30±2. 20vs 36. 89±5. 13pg/ml， P < 0. Ol)，且优于 0DNA151(22. 51 ±5. 08pg/ml，P < 0. Ol)，而ODN 1612对细胞因子的分泌没有明显作用(见 图4)。 2. 30DN ROl抑制Thl的分化由于ODN ROl能明显减少IFN- y禾P IL-17的分 泌，且其抑制作用优于ODN A151，因此我们选择0DN ROl进行深入研究，探讨其在极化条 件下对T细胞分化的影响。用IL-12, anti-IL-4诱导Thl的分化，与ODN共孵育，ELISA 检测上清中IFN-y的浓度。与中性的培养条件一样，ODN ROl能明显减少IFN-y的分 泌(302. 09±32. 98vs 1582. 44± 158. 69pg/ml， P < 0. 01，见图5)。同时用流式细胞术检 测Thl细胞的比例，其结果与ELISA—致，ODN ROl能明显减少CD4+IFN-y +细胞的比例 (5. 33±1.38vs 2. 65±3. 21%， P < 0. Ol，见图6，7)。另外ODN ROl对Thl分化的抑制作 用比ODN A151更明显(ELISA :302. 09±32. 98vs627. 99±139. 01pg/ml， P < 0. 05 ;FACS : 5. 33±1.38vs 10. 02±1. 24%， P < 0. 05)。 2. 40DN ROl抑制Thl7的分化为了进一步阐明ODN ROl对Thl7细胞分化的影响， 用IL-6， IL-21, IL-23, TGF-P 1， anti-IL-4， anti-IFN-y诱导Thl7的分化，与ODN共孵 育，ELISA检测上清中IL-17的浓度。与中性的培养条件一样，ODN ROl能明显减少IL-17 的分泌(315. 79±76. 66vs 1830. 73±537. 35pg/ml，P < 0. 01，见图8)。同时用流式细胞术 检测Thl7细胞的比例，其结果与ELISA —致，ODN ROl能明显减少CD4+IL-17+细胞的比例 (5. 01±1.59vs 19. 96±4. 15%， P < 0. 05，见图9， 10)。同样，与ODN A151相比，ODN ROl 对Thl7有更好的抑制作用(ELISA :315. 79±76. 66vs 1003. 53±159. 12pg/ml， P < 0. 05 ; FACS :5. 01 ±1. 59vs 9. 95±2. 20%， P < 0. 05)。 实验报告二调节性ODN通过抑制STATl， 3， 4的磷酸化调节Thl和Thl7细胞分化
细胞因子通过JAK-STAT信号途径促进Th细胞的分化，IL-12和IFN_ y分别通过 激活STATl和STAT4促进Thl的分化，而IL6-STAT3信号通路则通过调节Thl7特异性的转 录因子ROR y t促进Thl7的分化。0DNA151进入细胞后能诱导胞浆中STATl和STAT4向内 涵体中移行，并直接与其绑定，抑制二者的磷酸化，从而揭示了 ODN A151调节Thl分化的具 体机制。在我们自行设计的几种ODN中，ODN ROl不仅能抑制Thl和Thl7的分化，且作用 强于ODN A151，我们推测它也可能是通过STAT途径起作用。
1材料与方法
1. 1实验动物 材料清洁级近交系C57BL/6J小鼠，雄性，6-8周龄，体重22g左右。由华中科技大
学同济医学院动物实验动物中心提供。 1. 2主要试剂 STATlph°7STATl， STAT4ph°x/STAT4， STAT3ph°x/STAT3 (Cell SignalTechnology)，GADPH抗体(碧云天)，山羊抗兔IgG，兔抗小鼠IgG(signalway antibody,美国)，ECL发光试剂盒(pierce,美国) 1. 3Western blots检测STATsph°7STATs 取C57BL/6J小鼠脾脏用密度梯度离心法分离单个核细胞，与ODN共同孵育lh，分别用IFN- y ， IL-12或IL-6剌激20min，使STAT1， STAT3， STAT4磷酸化。裂解细胞提取蛋白，进行Western blots分析，检测STATlph°x/STATl， STAT3ph°x/STAT3， STAT4ph°x/STAT4的表达水平。 1. 4图像分析 Totallab 100图像分析软件进行图像分析分别以STATlph°x/STATl， STAT3ph°7STAT3， STAT4ph°7STAT4，与GADPH条带的吸光面积积分比值来评定STATlph°x/STATl，STAT3ph°7STAT3， STAT4ph°x/STAT4蛋白表达水平。 1. 5统计学分析统计学分析采用SPSS13. 0统计软件，数值变量以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者行Student NewmanKeuls(S-N-K)检验，方差不齐者行Games-Howell检验。P < 0. 05为差异具有显著性意义，P < 0. 01为差异有极显著性意义。
2结果ODN R01抑制STATl， 3， 4的磷酸化 ODN A151通过抑制STATl， 3， 4的磷酸化发挥免疫调节作用。0DNR01与ODN A151一样，均能抑制磷酸化STAT1，3，4的表达，而0DN1612对磷酸化STATs的表达无影响。所有ODN均不影响非磷酸STATs的表达。将Western blots结果用totallab 100软件进行分析，ODN ROl处理组磷酸化蛋白的表达水平明显低于阴性对照组(P < 0. 01)，亦低于ODNA151 (P < 0. 05)。这可能就是ODN ROl能更好抑制Thl和Thl7分化的原因(见图11， 12)。
讨论 T淋巴细胞介导的免疫反应在感染、炎症、自身免疫和肿瘤等疾病中起重要作用。Thl7和Thl介导的免疫应答在外来病原体入侵时起保护作用，然而在自身免疫和许多慢性炎症性疾病中，Th17和Thl分泌的炎性因子则会介导组织损伤，加剧病情的进展，甚至成为其迁延不愈的原因之一，因此T淋巴细胞成为免疫调节治疗的重要靶点。人们曾尝试各种方法调节Thl/Th2之间的平衡，下调病理性Th优势应答，促进向保护性Th优势应答类型的转变。近年来随着对Thl7认识的不断深入，尤其是它在炎症反应及自身免疫性疾病中的作用引起了广泛关注。治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应的西罗莫斯和环孢素A均能抑制Thl7的分化，而青蒿素衍生物S M905和半乳凝素-9治疗胶原诱导性关节炎也被认为以抑制Thl7为基础，用来治疗银屑病，类风湿性关节炎，Crohn' s病的IL-17的单克隆抗体AIN457已经进入II期临床试验，Thl7已经成为了药物治疗的新靶点。
治疗性核酸作为一种新型的生物技术药，发展势头良好。反义核酸，DNA疫苗，小分子干扰RNA， Decoy核酸均已进入临床研究，部分药物已投入使用。而近年来具有免疫调节作用的寡聚核苷酸也受到越来越多的关注。细菌DNA中非甲基化的CpG基序具有免疫剌激活性，能激活机体的天然免疫和适应性免疫应答。CpG ODN作为一种免疫增强剂已被用于感染，肿瘤，哮喘，过敏等疾病的治疗，并且作为疫苗的佐剂使用。例如抗肿瘤药物CpG ODN0blimersen(Genasense/G3139 ;Genta Inc)已经完成了 III期临床试验，正在申请投入使用。与之相对应的便是具有免疫抑制作用的su卯ressive/inhibitory 0DN，0DN A151是其典型代表。ODN A151中的TTAGGG基序是哺乳动物端粒区中的典型序列，当组织损伤时便从细胞中释放出来。人工合成的包含这种基序的ODN能下调促炎性细胞因子尤其是Thl型细胞因子的产生。这种抑制性0DN已被用于CpG诱导的炎症性关节炎，CIA，EAE，狼疮肾炎，内毒素性休克，实验室自身免疫性眼葡萄膜炎等动物模型的治疗，均取得了良好的疗效。我们的研究也表明抑制性ODN能减小ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积。抑制性0DN对于自身免疫性疾病及慢性炎症性疾病表现了良好的治疗前景。 本发明所述之调节性ODN具有与ODN A151相似的免疫调节作用。我们的体外实验表明ODN R01通过抑制STAT1，4的磷酸化调节Thl的分化，抑制STAT3的磷酸化调节Thl7的分化，并且抑制作用更优于0DNA151。因此有理由相信ODN R01作为一种免疫调节剂可被应用于Thl和Thl7起致病性作用的各种自身免疫性和慢性炎症性疾病。
STATs是胞浆中的 一类转录因子家族，哺乳动物的STAT蛋白包括STAT 1 ， 2 ， 3 ， 4 ，5a，5b和6，参与细胞的增殖，分化和凋亡。STAT蛋白能够被多种配体激活，尤其是细胞因子和生长因子，在T细胞的分化中起着举足轻重的作用。除了参与Thl7分化的调节以外，STAT3在肿瘤细胞中能够被组成性的活化，进而转录激活编码凋亡抑制剂，细胞周期调节剂和血管生成诱导剂的基因的表达，促进肿瘤的生长，目前已有很多种靶向STAT3的抗肿瘤药物，其中包括一种G-quartet 0DN(GQ-0DN，其序列为GGGCGGGCGGGCGGGC)。这种GQ-ODN靶向作用于STAT3的SH2结构域，抑制STAT3被活化的受体复合物募集以及二聚化，从而抑制STAT3的活化。GQ-ODN已被成功的用于前列腺癌，乳腺癌，头颈部肿瘤等多种动物模型。这种GQ-ODN也是鸟嘌呤丰富的序列，通过Hoogsteen氢键形成四链体DNA的结构。本发明所述的ODN R01也具有类似的结构，在我们的研究中也证实ODN R01能抑制STAT3的磷酸化。因此作为靶向STAT3的药物ODN R01还可用于肿瘤的治疗。
本发明可在治疗和/或预防下列表1和表2所述的多种疾病中的应用
表1部分Thl占优势的疾病
Crohn's病
胰岛素依赖性糖尿病
幽门螺旋杆菌感染
实验性自身免疫性祌经炎
自身免疫性甲状腺炎
实验室A身免疫性脑脊髓炎/多发性硬化
动脉粥样硬化
急性冠脉综合征
慢性心力衰竭 表2部分已明确的Thl7来源的细胞因子起致病作用的疾病
实验室自身免疫性脑脊髓炎/多发性硬化(IL-17, IL-21) 胶緣诱导性关节炎(IL-17，IL-21) 慢性结腸炎(IL-17) 系统性红斑狼疮U.L-21) 银屑病(IL-17) SEQUENCE LISTING 〈110〉华中科技大学同济医学院附属协和医院 程，翔 廖，玉华 夏，霓 肖，宏 唐，婷婷 严，欣欣 谢，江娇 姚，瑞 廖，梦阳 〈120〉 一种抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸 〈160>4 〈170>PatentIn version 3.5 〈210>10124]〈211>20
0125]〈212>DNA
0126]〈213>Artificial Sequence
0127]〈220>
0128]<223>免疫调节性寡聚脱氧核苷酸
0129]〈400〉1
0130]tegggtEiggg tegggteggg
0131]〈210>2
0132]〈211>19
0133]〈212>DNA
0134]〈213〉Artificial Sequence
0135]〈220〉
0136]〈223〉免疫调节性寡聚脱氧核苷酸
0137]〈400>2
0138]tttagggtta gggttaggg
:0139]〈210>3
:0140]〈211>24
:0141]〈212>DNA
:0142]〈213>Artificial Sequence
:0143]〈220〉
:0144]〈223〉免疫调节性寡聚脱氧核苷酸
:0145]〈400>3
:0146]tcagggtcag ggtcagggtc aggg
:0147]〈210>4
:0148]〈211>24
:0149]<212>DNA
:0150]〈213〉Artificial Sequence
:0151]〈220〉
:0152]〈223〉免疫调节性寡聚脱氧核苷酸
:0153]〈400>4t朋gggtaag ggtaagggtt Eiggg
权利要求
一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸，其特征在于它包含序列表<210>1所示的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN R01，其特征在于能抑制STATl、STAT4的磷酸化而调节Thl细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其 核苷酸序列为TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG。
3. 根据权利要求1所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸，其特 征在于能抑制STAT3的磷酸化而调节Thl7细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为 TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG 。
4. 根据权利要求1所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸，其特征 在于经过硫代修饰增加其在细胞内的稳定性，或使用其它核酸载体，如脂质体或多价阳离 子聚合物，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。
5. —种权利要求1 4之一所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷 酸的应用，其特征在于所述寡聚脱氧核苷酸序列在体外调节Thl和Thl7细胞的分化。
6. —种权利要求1 4之一所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷 酸的应用，其特征在于它应用于筛选其它的免疫调节剂。
7. —种权利要求1 4之一所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷 酸的应用，其特征在于安全有效剂量与药学上可接受的包含权利要求1 4之一所述的抑 制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸的药物组合物。
8. —种权利要求1 4之一所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷 酸的应用，其特征在于所述的寡聚脱氧核苷酸序列在治疗和/或预防下列表1和表2所述 的多种疾病，以及其它尚在研究中的Thl7起致病作用的自身免疫性疾病和炎症性疾病中 的应用部分Thl占优势的疾病Crohn' s病胰岛素依赖性糖尿病幽门螺旋杆菌感染实验性自身免疫性神经炎自身免疫性甲状腺炎实验室自身免疫性脑脊髓炎/多发性硬化动脉粥样硬急性冠脉综合征慢性心力衰竭；部分已明确的Thl7来源的细胞因子起致病作用的疾病 实验室自身免疫性脑脊髓炎/多发性硬化(IL-17, IL-21) 胶原诱导性关节炎(IL-17, IL-21) 慢性结肠炎(IL-17) 系统性红斑狼疫(IL-21) 银屑病(IL-17)。
9. 如权利要求8所述的抑制Thl和Thl7分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸的应用，其特征在于该方法包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的权利要求1 4之一所述 的核苷酸序列或其药用组合物。
全文摘要
本发明提供一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸及应用，它包含序列表<210>1所示的核苷酸序列为TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG，能抑制STAT1、STAT4的磷酸化而调节Th1细胞分化，能抑制STAT3的磷酸化而调节Th17细胞分化。经过硫代修饰增加其在细胞内的稳定性，或使用其它核酸载体，如脂质体或多价阳离子聚合物，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。所述的寡聚脱氧核苷酸的安全有效剂量与药学上可接受的药物组合物可在多种免疫性疾病中应用，以恢复免疫失衡，优于特异性的细胞因子拮抗剂。该ODN与哺乳动物端粒区的结构类似，与其他免疫调节剂相比对人体更安全。
文档编号A61P3/10GK101701218SQ20091027256
公开日2010年5月5日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者严欣欣, 唐婷婷, 夏霓, 姚瑞, 廖梦阳, 廖玉华, 程翔, 肖宏, 谢江娇 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院