原发性肝细胞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物的制作方法

专利名称：：原发性肝细胞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物的制作方法
技术领域：
：本发明属于肿瘤诊断及防治领域，具体涉及一种原发性肝细胞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物。
背景技术：
：原发性肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在消化系统恶性肿瘤中位居第三位，仅次于胃癌和食管癌。我国每年大约有30万人死于原发性肝细胞癌，占世界肝癌死亡人数的50%。值得注意的是，世界各地原发性肝细胞癌发病率均有上升趋势。原发性肝细胞癌的主要临床表现为肝区的胀痛或钝痛，晚期会出现黄疸，临床诊断主要依靠临床表现和血清甲胎蛋白的浓度，但具有典型临床表现的病例往往已经到晚期，且根据血清甲胎蛋白浓度难以鉴别良恶性肝病，给原发性肝细胞癌的早期诊断和治疗带来很大的难度。肝细胞癌早期一般采用手术切除治疗，中晚期大多采取多种方法联合治疗，主要有化学治疗、放射治疗和肝移植。由于原发性肝细胞癌对放疗和化疗不敏感，而肝移植又受限于供体肝短缺，造成肝癌病人的5年生存率很低。因此，探索新的治疗原发性肝细胞癌的方法势在必行，而肝细胞癌的基因治疗正成为目前的探索热点。在成年哺乳动物中，磷酸甘油酸变位酶以二聚体形式存在，其亚单位有B和M两种，分别由不同的基因编码，分子量都为30kD。磷酸甘油酸变位酶有三种同工酶，BB型、丽型和MB型。BB型同工酶(即通常所说的PGAM1)存在于成人脑、肝脏和肾脏中，为脑型同工酶；丽型同工酶(即通常所说的PGAM2)存在于骨骼肌和心肌中，为肌肉型同工酶；MB型同工酶仅存在于心肌。磷酸甘油酸变位酶l(PGAM1)是糖酵解过程中的关键酶，在2，3-二磷酸甘油酸帮助下，催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸。到目前为止，未见有通过检测人磷酸甘油酸变位酶l基因表达水平来实现早期诊断原发性肝细胞癌的诊断试剂及试剂盒的相关报道，也未见有通过降低其表达水平达到防治原发性肝细胞癌的目的的相关报道。本领域目前需要提供新的原发性肝细胞癌的诊断尤其是早期诊断的检测产品以及防治药物。
发明内容本发明所要解决的技术问题是目前原发性肝细胞癌难以诊断尤其是难以早期诊断和防治本发明解决技术问题的技术方案是针对上述不足，提供一种可以早期诊断原发性肝细胞癌疾病的诊断试剂。其中，上述的可检测人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平的试剂包括能特异扩增人磷酸甘油酸变位酶1基因的mRNA的PCR引物。进一步的，上述能特异扩增人磷酸甘油酸变位酶l基因的mRNA的PCR引物为如下引物对正义链SEQIDNO.15'-GCACCCACTCCCTTCATACAAT-3';反义链SEQIDNO.25'-ACGCAGGTTACATTCGTCTTCC-3'。其中，上述可检测人磷酸甘油酸变位酶l基因的翻译水平的试剂也可以包括人磷酸甘油酸变位酶l的多克隆抗体或单克隆抗体。使用时，这些多克隆抗体或单克隆抗体上最好耦联有标记物，所述的标记物可为同位素标记物或荧光标记物。本发明同时提供了能检测人磷酸甘油酸变位酶l基因表达水平的试剂在制备原发性肝细胞癌检测试剂盒或生物芯片中的用途。本发明还提供了一种可以早期诊断原发性肝细胞癌的诊断试剂盒或生物芯片。该原发性肝细胞癌诊断试剂盒或生物芯片含有上述的诊断试剂。本发明还提供了能降低人磷酸甘油酸变位酶l基因的表达水平的药物在制备防治原发性肝细胞癌的药物组合物中的用途。本发明的第二个目的是提供一种用于治疗原发性肝细胞癌的药物，该药物能降低人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平或翻译水平。进一步的，上述能降低人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平或翻译水平的药物可以是化学药、中药、化学药物组合物、中药组合物或生物制品中至少一种。进一步的，上述的生物制品是针对人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子(发夹状RNA分子)或能表达人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子的载体。其中，上述的人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子具有SEQIDNO.7所述的核苷酸序列其中，能表达上述shRNA分子的载体包括下述核苷酸序列SEQIDNO.5所示的正义链SEQIDNO.6所示的反义链本发明的第三个目的是提供一种筛选治疗原发性肝细胞癌的药物的方法，该方法包括以5下步骤a、建立原发性肝细胞癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平或翻译水平；c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平或翻译水平显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。本发明各技术方案的建立是主要基于对原发性肝细胞癌发生发展相关蛋白的开创性研究，采用SILAC技术同位素标记人肝癌细胞株H印G2，然后与人正常肝细胞株L02按照蛋白量1:l混合，接着SDS-PAGE电泳分离总蛋白，切取蛋白条带，胶内酶解，再通过质谱分析鉴定出原发性肝细胞癌相关蛋白候选分子。共筛选出63个差异蛋白，其中51个在癌组织中上调，12个下调。对鉴定出的差异蛋白进行了功能分析和归类，并首次确定人磷酸甘油酸变位酶l为原发性肝细胞癌相关蛋白候选分子。本发明还进一步应用免疫组织化学技术研究人磷酸甘油酸变位酶l在原发性肝细胞癌中的表达，功能研究提示与原发性肝细胞癌密切相关的人磷酸甘油酸变位酶l能应用于临床诊断、预后判断及药物开发中。正是在上述大量的开创性研究的基础上，发明了将上述人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平或翻译水平作为检测目标的原发性肝细胞癌诊断试剂及试剂盒；同时也发明了以上述人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平或翻译水平作为耙标的筛选治疗原发性肝细胞癌药物的方法；还发明了能通过降低人磷酸甘油酸变位酶l基因的表达水平防治原发性肝细胞癌的药物，比如人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子和能表达人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子的质粒。本发明有益效果在于本发明原发性肝细胞癌诊断试剂可以在早期有效诊断原发性肝细胞癌疾病，大大提高了患者的生存率；本发明原发性肝细胞癌诊断试剂只需要少量肝组织即可进行有效诊断；本发明原发性肝细胞癌诊断试剂能反映患者的肝细胞癌的分化情况，有利于医生选择适合的药物及方法对患者进行针对性治疗。本发明防治原发性肝细胞癌疾病的药物，尤其是人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子、能表达人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子的载体等药物可以有效防治原发性肝细胞癌，为临床原发性肝细胞癌疾病用药提供了一种新的选择。本发明筛选防治原发性肝细胞癌疾病的药物的方法，为寻找防治原发性肝细胞癌疾病的药物提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。6图l是构建的shRNA质粒结构图。图2是裸鼠肿瘤体积测量结果图，纵坐标为肿瘤体积，横坐标为治疗天数。图3是人磷酸甘油酸变位酶l干扰效率图。图4是免疫组化分析结果图，是Ki-67在肿瘤组织中的表达结果，纵坐标为Ki-67表达阳性细胞百分率。图5是TUNEL检测结果图，纵坐标为TUNEL表达阳性细胞百分率；图6为TUNEL检测的结果图片。具体实施例方式下面结合附图通过具体实施方式对本发明做进一步的描述，并不因此将本发明仅限制在所述的实施例范围之中。实施例一人磷酸甘油酸变位酶l与原发性肝细胞癌发生发展关系的初步确定1.细胞来源及培养条件人肝癌细胞株H印G2购买自ATCC(美国标准菌种收藏所，AmericanTypeCultureCollection)，而人正常肝细胞株L02购买自中国细胞培养中心(ChinaCellCultureCenter)。H印G2在DMEM培养，其中，在DMEM中补加10。/。胎牛血清、107U/L青霉素和10mg/L链霉素，而L02在RPMI1640培养。培养条件均为37。C，5%C02浓度。2.试剂来源细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)相关试剂胎牛血清购自Hyclone公司；SDS-PAGE相关试剂DC蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad公司；考马斯亮蓝R-250购自Merck公司；酶解及质谱分析相关试剂胰蛋白酶TrypsinGold购自Promega公司；乙腈(ACN)，三氟乙酸(TFA)，碳酸氢胺，甲酸均为色谱纯级，购自Sigma公司；基质a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)购自Sigma公司。3.方法3.l细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)H印G2培养于含有稳定同位素标记的L-赖氨酸(13(]615N4)的SILAC培养基。SILAC培养基即以不含L-赖氨酸的DMEM为基础，补加10%胎牛血清、1(/U/L青霉素、10mg/L链霉素和100mg/L稳定同位素标记的L-赖氨酸(13(]615N4)(纯度98%)形成的培养基。当标记的L-赖氨酸完全掺入到蛋白质中时，收集细胞，生理盐水洗涤3次，-S(TC保存。L02培养于常规的RPMI1640，也收集细胞，生理盐水洗涤3次，-S(TC保存。3.2SDS-PAGE电泳分别向H印G2和L02加入适当体积的RIPA裂解液裂解细胞，涡旋混匀415min，冰浴下超声数次，使裂解液清亮，14000rpm，4°C，15min，取上清。DC蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度后，H印G2和L02按照蛋白量1:l的比例混合。制备浓度分别为12。/。和5。/。的SDS-PAGE分离胶和浓縮胶(表l)。然后在样品中加入l/4体积5XSDS上样缓冲液，IO(TC，5min，接着13000rpm，5min，取上清。每孔蛋白上样量为60Ug，并加上未染蛋白Marker。电泳时起始电压80V，待溴酚蓝进入分离胶后，调整为120V，至溴酚蓝到达距离底部边缘lcm时停止电泳。取出凝胶，考马斯亮蓝R-250染色。表15%浓缩胶与12%分离胶配制方法<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.3胶内酶解(1)双蒸水洗胶2-3次，以除去残留的乙醇和乙酸；(2)用刀片将蛋白条带切成lmi^大小的胶粒，盛于0.6mlEP管中；(3)脱色:加入100ul100mMNH4HC03/50%ACN，37。C摇床脱色45分钟，去上清，重复2次，直到胶粒完全脱色；(4)脱水:加IOOulACN，IO分钟后吸出ACN，真空干燥胶粒；(5)酶解:每管加12.5ng/ul的胰酶10-20ul，4"C放置1小时，然后吸去多余胰酶，加入15ul的40mMNH4HC03/10。/。ACN覆盖胶粒，37。C酶解过夜；(6)提肽:将酶液转移到新EP管中，胶粒中加入50-80ul50%ACN/5%TFA，20。C，功率70%，超声15min，然后短暂离心，合并上清；再加入20-50ul50%ACN/5%TFA，重复1次，合并上清；(7)干燥提肽液室温真空干燥成5ul。3.4LC-MS/MS进行蛋白鉴定和定量胰蛋白酶消化得到的多个肽段通过液相色谱(LC)而得到分离。分离肽段进入一级质谱，离子源将分子转化成离子，均带上2个正电荷，然后经过电磁场分离，获得肽段的质荷比(m/z)谱，即肽质量指纹谱。从一级质谱产生的肽段中选择丰度在前十位的母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列4.结果及分析质谱数据解谱使用ProteinLynx2.2.5软件，从原始的MS/MS谱中产生PKL格式的数据文件，在Mascot检索系统(http:〃w豐.matrixscience.com)内以Swiss-Prot为数据库进行检索。每次检索时，根据输入的PKL数据，数据库将根据其与库内储存数据进行匹配，得到若干候选蛋白分子，并根据MOWSE得分多少排序，并产生一个及格线。最高分超过及格线者认为检索结果有意义，未达及格线则认为检索无结果。得分高低表示匹配性高低，即可能性的大小。理想的检索结果应为第一候选蛋白得分较高，其他候选蛋白得分较低(低于及格线)，二者分数相差较大，并且该蛋白肽段匹配数目较多，氨基酸序列覆盖率较高，则该检索结果可靠性较高。检索出全部候选蛋白之后，使用MassLynxV4.0软件计算在H印G2与L02中表达差异在2倍以上的蛋白。根据上述方法，鉴定出63个差异蛋白，其中，在癌细胞中上调51个，下调12个。这63个差异蛋白的生物功能分布情况如下代谢34.9%，信号转导12.7%，结构成分7.9%，其他44.5%。对癌相关蛋白进行后续验证的候选分子的选择，按以下标准〔1〕在人肝癌细胞株H印G2与人正常肝细胞株L02之间差异显著，MassLynxV4.0分析软件计算表达差异应在2倍以上；〔2〕在人肝癌细胞株H印G2与人正常肝细胞株L02中，分别表达恒定，且表达量较高；〔3〕差异重复性好，重复至少应在4次以上；〔4〕质谱检测信号强，信噪比高；〔5〕信息学检索，MOWSE得分较高，可靠性理想；〔6〕功能检索提示该蛋白应具有较重要生理功能，且目前在癌症研究领域文献报道较少，与原发性肝细胞癌的基础研究与临床实践尚无确切联系。则该蛋白与原发性肝细胞癌的相关性具有一定临床意义。9根据以上标准，在63个鉴定出的差异蛋白中，确定人磷酸甘油酸变位酶l(PGAM1)作为癌相关蛋白候选分子。该蛋白在肝癌细胞与正常肝细胞中表达恒定，差异明显，二者表达差异为6倍；质谱鉴定结果理想，匹配肽段8个，氨基酸序列覆盖率38%，M0WSE得分172;该蛋白序列含氨基酸254个，序列覆盖率为38%，匹配4个肽段，分别为第66-83、163-176、181-191、196-251位氨基酸。实施例二人磷酸甘油酸变位酶l为原发性肝细胞癌发生发展相关蛋白的验证采用RT-PCR和WesternBlot方法对人磷酸甘油酸变位酶l在原发性肝细胞癌与正常肝组织间的表达差异在转录水平和翻译水平进行验证。1.原发性肝细胞癌及正常肝组织标本来源本实施例选用的54例原发性肝细胞癌组织标本于2007年4月6月采集自四川大学华西医院肝胆外科接受手术治疗的原发性肝细胞癌患者。患者年龄分布在3466岁之间，平均年龄为44.8士8.5岁，所有患者术前未经化疗、放疗，术后病理诊断明确，临床资料齐备。21例正常肝组织标本于同期采集自该院接受手术治疗的肝囊肿或肝内胆管结石患者，患者年龄分布在3957岁，平均年龄为45.4士5.7岁。所有患者临床资料齐备。54例癌组织标本均为原发性肝细胞癌，其中高分化ll例，中分化28例，低分化15例；手术-病理分期为I期14例，n期2i例，m期9例，iv期io例。肝细胞癌分期参照uicc(国际抗癌联合会)2002年第六版的标准，病理组织学分级参照EdmondsonSteiner分级标准。组织标本切下后，PBS液反复清洗，去除血污及坏死组织，滤纸吸干，切为0.5cm直径大小组织块，以冻存管分装，标记，迅速保存于液氮备用。2.试剂来源RT-PC財目关试剂TrizolReagent购自Invitrogen公司；Oligo(dT)、MgCl2、dNTPmix、RNaseInhibitor、AMV-OptimizedTaq、AMVRTaseXL等购自TaKaRa公司。WesternBlot相关试剂羊抗人磷酸甘油酸变位酶l单克隆抗体购自Abcam公司；小鼠抗人e-actin单克隆抗体购自SantaCruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗羊IgG与羊抗小鼠IgG(二抗)购自北京中衫金桥生物技术有限公司；蛋白质预染Marker购自MBI公司；PVDF膜购自AmershamBiosciences公司；Tween-20购自北京中衫金桥生物技术有限公司。3.转录水平人磷酸甘油酸变位酶l的表达差异验证3.1RT-PCR引物序列设计与合成设计RT-PCR引物，并送英骏(Invitrogen)生物技术有限公司合成，具体见表2(其中，GAPDH为看家基因，其作为内参，确保上样量一致)。表2RT-PCR引物序列及产物片段大小基因名称引物序列产物bp人磷酸甘油酸变位Ki正义琏5"_GCACCCACTCCCTTCATACMT-3;(则IDNO."303反义链5，-ACGCAGG1TACATTCGTCniCC-3'(SEQIDNO.2)GAPDH正义链5'-ACCACAGTCCATCCCATCAC-3'(SEQIDNO.3)352反义链5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(SEQIDNO.4)3.2组织总RNA提取(Trizol法)从液氮中取出25mg组织样品，迅速于液氮下充分研磨至粉末，置于O.5mlTrizol试剂中，反复吹打以裂解组织细胞，室温下静置5分钟。加入O.1ml氯仿，剧烈振荡，室温下静置2分钟，4°C，12000g离心15分钟。取上层水相，加入0.25ml异丙醇，室温静置10分钟，4°C，12000g离心10分钟。弃上清，加入0.5ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，4°C，7500g离心5分钟。弃上清，自然干燥，以RNase-free水溶解RNA。取少量进行1%琼脂糖电泳鉴定，紫外分光光度计检测浓度、纯度，分装后-8(TC保存备用。RNA纯度根据A260nm/A280nm比值判定，比值小于l.6提示有蛋白杂质，1.6-1.8提示含有DNA，在1.8-2.0之间提示RNA纯度较高，无降解、无杂质。本实施例中提取的RNA的A260nm/A280nm比值为1.93，因此，其纯度较高，无降解、无杂质。3.3cDNA第一链的合成取本实施例3.2提取的总RNA2yl(1.5yg/yl)，经RNase-freeDNase消化除去可能存在的痕量DNA后，与lylOligo(dT)(0.5yg/yl)混合，加RNase-free水定容至12Ul，混匀后65。C水浴5分钟使二级结构变性，立即置冰浴冷却。然后按以下反应体系(表3)45。C逆转录30分钟，95。C5分钟灭活AMV-RTaseXL，立即置冰浴冷却。-201:保存合成的cDNA。表3RNA逆转录反应体系试剂体积Olig。(dT)1[il10mHdlJTPmix1[ilRNaseInhibitor(40U/[il)0.5[il丽RTaseXL(5绑l)0.5[il5XFirstStrandBufferDTT(O.lM)2[ilRWA模板2[ilRHsse—freeWater9[ilTotal203.4PCR反应取上述合成的cDNA5u1为模板进行PC財广增。反应体系50yl，如表4;反应条件如表5表4PCR反应体系试剂体积10XPCRBuffer5[il4[ilAMV"0ptiniizedTaq1[il上游引物(20[iM)1[il下游引物(20[iM)1[ilcDNA5[ildNTPmix(2.5ni)RNase-freeWater29inTotal50in12表5PCR反应条件步骤温度，'c吋间，分钟循环次数起始变性9421变性940.5退火5430②501延伸721.5最终延伸7251注退火温度为人磷酸甘油酸变位酶1;②为GAPDH3.5图像及结果分析PCR反应结束后，取部分产物进行1%琼脂糖电泳，紫外光下扫描成像。使用QuantityOne4.6分析软件对图像进行分析，以扩增产物条带的光密度值(Density)，相对于GAPDH反映该基因在RNA水平的表达。如表6所示，54例原发性肝细胞癌组织人磷酸甘油酸变位酶1表达强度平均为113.4±29.7;对应的21例正常肝组织表达强度为24.2±3.6，在癌组织中该基因mRNA表达为正常组织中的4.68倍，有显著性差异(t检验，P<0.01)。结果显示，相对于正常组织，人磷酸甘油酸变位酶l的mRNA在癌组织中为高表达，证明了人磷酸甘油酸变位酶l为原发性肝细胞癌发生发展相关蛋白。表6RT-PCR检测人磷酸甘油酸变位酶1nraiA表达基因原发性肝细胞癌正常肝T/NP值'人磷酸甘油酸变位酶1113.4±29.724.2±3.64.68P<0.01注表达强度以光密度值表示；T:原发性肝细胞癌；N:正常肝；*f检验4.翻译水平人磷酸甘油酸变位酶l的表达差异验证4.l组织总蛋白样品制备从液氮中取出25mg组织样品，迅速于液氮下充分研磨至粉末，置于400ulModifiedRIPA组织裂解缓冲液，涡旋混匀。冰浴下超声数次，使裂解液清亮，然后14000rpm，4°C，15min，取上清，标记，置-8(TC保存，备用。4.2SDS-PAGE电泳制备浓度分别为12。/。和5。/。的SDS-PAGE分离胶和浓縮胶(表l)。以提取的组织总蛋白为样13品，以结构蛋白e-actin作为内参，上样前用DC蛋白测定试剂盒对样品进行蛋白浓度测定，以确保上样量的一致性。然后在样品中加入1/4体积5XSDS上样缓冲液，IO(TC，5min，接着13000rpm，5-10min，取上清。每孔蛋白上样量为30yg，并加上预染蛋白Marker。电泳时起始电压80V，待溴酚蓝进入分离胶后，调整为120V，至溴酚蓝到达距离底部边缘lcm时停止电泳，取出凝胶，切角作记号。4.3转膜依据胶的大小剪取滤纸6片和PVDF膜1张，将膜浸泡纯甲醇3-5秒，接着将膜、滤纸和凝胶置于转移缓冲液中平衡10min。然后按顺序装配转移三明治负极一〉海绵一〉3层滤纸一〉胶一〉膜一〉3层滤纸一〉海绵一〉正极。将三明治置于转移槽内，冰浴下100V，转膜lh。结束后取出杂交膜，切角作记号。4.4免疫杂交与显色TBS室温洗膜5min后，置于25ml封闭缓冲液中4。C孵育过夜。分别加入l:1000稀释的羊抗人磷酸甘油酸变位酶l抗体和l:500稀释的小鼠抗人e-actin抗体，37。C孵育2h。TBST漂洗3次后，分别加入l:10000稀释的HRP标记兔抗羊IgG和羊抗小鼠IgG，37。C孵育2h，TBST漂洗3次，再用TBS漂洗1次。化学发光法检测将试剂盒中两种溶液按l:l比例混合，均匀涂抹于膜正面，5min后，曝光，冲洗。4.5图像及结果分析将胶片扫描成像后，使用QuantityOne4.6分析软件对图像进行分析，以显色条带的光密度值(Density)，相对于P-actin反映该蛋白的表达情况。统计结果显示与正常肝组织相比，66.7%的原发性肝细胞癌的人磷酸甘油酸变位酶1为高表达。具体结果如表7所示，54例原发性肝细胞癌组织人磷酸甘油酸变位酶1表达强度平均为93.6±3.8;对应的21例正常肝组织表达强度为21.7士3.1，在癌组织中该蛋白表达为正常组织中的4.3倍，有显著性差异(t检验，P<0.01)。此结果与RT-PCR结果所示的差异趋势一致，在翻译水平上证明了人磷酸甘油酸变位酶l为原发性肝细胞癌发生发展相关蛋白。表7WesternBl。t检测人磷酸甘油酸变位酶1蛋白表达<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注表达强度以光密度值表示；T:原发性肝细胞癌；N:正常肝；*/楦验实施例三免疫组化分析人磷酸甘油酸变位酶l在原发性肝细胞癌与正常肝组织上的表达1.组织样品来源石蜡标本来自四川大学华西医院肝胆外科。54例原发性肝细胞癌组织标本和21例正常肝组织标本相关情况已在实施例二叙述。2.试剂来源EnVision+辣根过氧化物酶(HRP)免疫组化染色系统购自德国汉堡的DakoCytomationGmbH公司，其中包括过氧化物酶封闭液(PeroxidaseBlock)、辣根过氧化物酶标记多聚物结合羊抗兔IgG(LabelledPolymer-HRPANTI-RABBIT)、底物缓冲液(SubstrateBuffer)、DAB染色液(DAB+Chromogen)。山羊抗人磷酸甘油酸变位酶l抗体购自Abcam公司。3.方法3.1组织处理取新鲜组织厚度不超过5mm，10%中性福尔马林固定24小时以上，冲水12-24小时后，梯度酒精(75%—〉85%—〉95%—〉100%)脱水，再二甲苯处理，石蜡浸泡，最后石蜡包埋。3.2组织切片石蜡组织块做3-4um连续切片5张，裱于APES预处理的载玻片上，65。C烤片2小时，置4"C长期保存。每例标本均取一张切片进行常规HE染色。3.3免疫组化染色(1)6(TC烤片2小时，二甲苯脱蜡两次，每次10分钟；(2)梯度酒精水化100%—〉95%—〉85%—〉75%，每次2分钟，蒸馏水洗涤两次，每次5分钟；(3)抗原修复柠檬酸钠缓冲液淹没切片，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却，然后PBS洗涤两次，每次5分钟；(4)3%过氧化氢室温避光封闭10分钟，然后PBS洗涤2次，每次5分钟；(5)正常血清封闭滴加正常兔血清，37°C，20分钟；(6)孵育一抗滴加l:150稀释的山羊抗人磷酸甘油酸变位酶1抗体，置湿盒中4'C孵育过夜，然后PBS漂洗15分钟；(7)孵育二抗滴加辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊的抗体，置湿盒中37。C孵育40分钟。PBS洗涤2次，每次5分钟；(8)DAB显色滴加新配置DAB显色液，镜下控制显色(5-10分钟)，适时终止，然后自来水充分冲洗；(9)苏木素复染室温，30秒，自来水冲洗返蓝15分钟；卿梯度酒精脱水85%，2分钟一〉95%，2分钟一〉100%，2次，5分钟，然后二甲苯透明，两次，每次5分钟，最后中性树胶封片。每批实验均设立阴性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。4.图像分析与结果判定人磷酸甘油酸变位酶l免疫组化阳性染色主要表现为显微镜下细胞浆内出现棕黄色颗粒沉着。使用ECLIPSEE600图像采集系统采集图像，采用半定量综合积分法进行结果判定。半定量综合积分法按细胞显色有无及深浅计分O分为无色，l分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；按显色细胞所占比例计分0分<5%，1分5-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分>76%。两者乘积即为该切片积分，O分为阴性(一)，l-3分为弱阳性(+)，4-7分为阳性(++)，8-12分为强阳性(+++)。所有切片均为盲法判定。从图像分析结果可以看出，人磷酸甘油酸变位酶l在正常肝组织表达较弱，在原发性肝细胞癌组织中则表达较强，且主要为胞浆表达。根据半定量综合积分法，该蛋白在正常肝组织表达阴性(一)为19%(4/21)，弱阳性(+)为81%(17/21)，阳性(++)和强阳性(+++)均为O例；在原发性肝细胞癌组织表达阴性(一)为O例，弱阳性表达为33%(18/54)，阳性为26%(14/54)，强阳性为41%(22/54)(表8)，二者表达有显著性差异(P<0.01)。正常肝组织积分总分为48，平均分2.29士1.02;原发性肝细胞癌组织为428，平均分7.93士2.58，二者表达有显著性差异(P<0.01)。此结果显示该蛋白在原发性肝细胞癌组织中表达显著高于正常肝组织，与实施例二的结果一致。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注T:原发性肝细胞區；N:正常肝；4检验，P<0.01。5.人磷酸甘油酸变位酶l与肝细胞癌病理组织学分级关系的分析54例原发性肝细胞癌标本中，参照EdmondsonSteiner分级标准，高分化11例，中分化28例，低分化15例。根据半定量综合积分法，该蛋白在高分化肝细胞癌组织表达阴性为O，弱阳性为73%(8/11)，阳性为18%(2/11)，强阳性为9%(1/11)，积分总分为63，平均分5.73±2.46;中分化肝细胞癌组织表达阴性为O，弱阳性为36%(10/28)，阳性为39%(11/28)、强阳性为25%(7/28)，积分总分为217，平均分7.75±2.68;低分化肝细胞癌组织表达阴性和弱阳性均为0，阳性为7%(1/15)、强阳性为93%(14/15)，积分总分为148，平均分9.87±3.17(表9)。表9人磷酸甘油酸变位龍l与肝细胞區病理组织学分级关系分级例数-++++++a总分平均分b高分化11073%(8/11)18%(2/11)9%(1/11)635.73±2.46中分化28036%(10/28)39%(11/28)2177.75±2.68低分化15007%(1/15)93%(14/15)148注3列联表/:检验，P<0.01;''单向方差分析，P<0.05;LSD-f检验，F<0.01(高与中；高与低；中与低)；0分为(一)，1-3分为(+)，4_7分为(++),8-12分为(+++)'统计分析显示随组织分化程度降低，该蛋白的表达有升高趋势，故认为人磷酸甘油酸变位酶l的表达与病理组织学分级具有关联性(列联表xS检验，P<0.01)。积分统计也显示高分化组与中分化组，高分化组与低分化组，中分化组与低分化组表达均有显著差异(LSD-t检验，P<0.01)。实施例四本发明原发性肝细胞癌诊断试剂、诊断试剂盒及生物芯片的制备及检测效果在实施例一和实施例二创造性地确定了人磷酸甘油酸变位酶l与原发性肝细胞癌的关系后，将耦联有标记物的人磷酸甘油酸变位酶l蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体或者能特异扩增人磷酸甘油酸变位酶l基因的mRNA的PCR引物作为主要原料即可制得到本发明原发性肝细胞癌诊断试剂、诊断试剂盒及生物芯片。用实施例二的引物对(SEQIDNO.1、SEQIDN0.2所示序列)和RT—PCR所需的其他常规试剂体系制得本发明原发性肝细胞癌诊断试剂盒。使用该试剂盒并用实施例二的方法检测受试人的肝组织细胞中人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平，如果受试人的肝组织细胞中的人磷酸甘油酸变位酶l基因的转录水平比正常水平明显偏高，则病受试人很可能已患有原发性肝细胞癌疾病；通过比较免疫组化染色强度(与表9中数据比较)，即可初步判断患者原发性肝细胞癌分化阶段，即高、中、低分化。实施例五本发明防治原发性肝细胞癌的药物的制备及筛选本实施例以特异性针对人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA的表达质粒作为待制备和筛选的防治原发性肝细胞癌的药物。短发夹shRNA的表达质粒构建根据人磷酸甘油酸变位酶l(PGAM1基因序列见SEQIDNO.8，编码区为39-803bp，其17编码的氨基酸序列见SEQIDNO.9)的cDNA序列，设计特异性针对PGAMl序列370-389bp的短发夹shRNA序列，如下所示正义链〔SEQIDNO.5〕5'卡ACCGtTGAAGATCTGGAGGCGC7T";7^&1^GCGCCTCCAGATCTTCACC777T77§-3'反义链〔SEQIDNO.6〕3'~^CACTTCTAGACCTCCGCGA^77CTCTCGCGGAGGTCTAGAAGTCGAMU^CTAG|-5'序列结构BbsI+正义链+^^承反义链+芽##"^631^I以TTCAAGAGA为发夹环，TTTTTT为转录终止信号。无序序列GTTCTCCGAACGTGTCACGT为阴性对照(NC)。含卡那霉素耐药基因的pGPU6/GFP/Neo质粒通过BbsI和BamHI双酶切线性化，在T4DNA连接酶的催化下，与退火形成的寡核苷酸双链连接。连接产物转化感受态细胞DH5a，并挑选阳性克隆，按标准方法扩增质粒载体，并分别用BamHI和PstI酶切鉴定。阳性重组载体能被BamHI切开，而不能被PstI切开。收集酶切鉴定正确的重组质粒进行测序，结果表明构建成功，获得了PGAM1-shRNA表达载体(质粒结构如图l所示；上海吉玛制药技术有限公司提供)。构建的该表达载体所表达的人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子具有SEQIDNO.7所述的核苷酸序列2.动物模型建立、药物筛选与药效确认每只健康雌性BALB/C裸鼠(由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室提供，裸鼠年龄6-8周；未生育；重量18-20克)右肋下注射含有2X106H印G2细胞的100n1PBS悬液。几天后，当瘤体直径达到O.6cm左右时，裸鼠随机分为4组，每组5只。未处理组(PBS):PBS100yl;月旨质体组(Lipo):脂质体Lipofectamine200012.5yg/100ylPBS;阴性对照组(NC):无序载体5yg/100ylPBS;PGAM1-shRNA组(PGAM-shRNA):PGAM1-shRNA载体5yg/100ylPBS。质粒与脂质体比例为1:2.5。以上处理均为尾静脉注射，每2天一次。第10次注射后2天处死裸鼠。治疗的副作用，如体重，食欲和行为等也同时记录。2.l肿瘤体积测量与组织学分析肿瘤体积在接种后每2天测量一次直至裸鼠被处死，按以下公式计算0.52X最长径X最短径2。剥离的肿瘤以中性福尔马林固定，石蜡包埋，并切片进行HE染色，在显微镜下观察进行组织学检测。结果当对裸鼠进行了10次注射后处死裸鼠，瘤体被剥离称重。虽然各组肿瘤初始体积相同，但经过治疗后，各组肿瘤体积生长产生了明显差异，如图2所示。虽然PGAMshRNA没有实现对肿瘤的完全抑制，但是与其他各组相比，其肿瘤生长得到了显著抑制。PBS组，月旨质体组和阴性对照组，平均体积分别为505.65±40.14，405.58±40.23，350.2315±34.16mm3。而PGAMl-shRNA处理组体积仅为212.71±24.28mm3，较其他各组减少40-58%(P<0.05)。对肿瘤进行免疫组化分析也证实，在PGAMl-shRNA组PGAMl的表达显著下降，与各对照组相比，处理组PGAMl表达下降75。/。以上(P<0.01)，如图3所示。2.2免疫组化分析为检测细胞的增殖，进行了Ki-67的免疫组化分析。试验分组及处理同前，抗体采用羊抗人Ki-67抗体。结果分析方法在5个随机视野中，计算核阳性细胞的百分比。为检测细胞的凋亡，还进行了TUNEL实验，试验分组及处理同前，TUNEL试验采用常规方法。结果如图4所示，PBS组，脂质体组和阴性对照组中Ki-67表达阳性细胞百分率分别为85.7±7.6，84.2±6.7，80.1士6.4;而sPGAM1-shRNA处理组则为27.5±6.4(P<0.01)。表明PGAM1-shRNA处理引起显著的细胞增殖抑制。在TUNEL检测中(计数结果见图5，染色照片见图6)，PBS组，脂质体组和阴性对照组中TUNEL阳性细胞百分率分别为4.6±1.9，7.1±3.4，11.4±5.8。而PGAMl-shRNA处理组则为52.2士8.7(P<0.01)，显著高于其他各组。此外，在PBS组，脂质体组和阴性对照组之间，细胞凋亡未发现明显差异，提示脂质体与阴性对照载体对肿瘤生长无显著影响。说明本发明PGAMl-shRNA能够显著地引发肿瘤细胞调亡。为判断以上处理是否有潜在的毒副作用，治疗期间观察了裸鼠可能的毒性反应，在体重，食欲和行为等方面，均未发现显著异常。对裸鼠肝，肾，心脏，肺等器官的石蜡切片进行组织学观察，也未见病理学改变。这些结果显示通过shRNA抑制PGAMl表达，可显著抑制体内肿瘤细胞增殖与促进细胞凋亡，并导致肿瘤生长抑制，没有明显毒副作用，即本发明能表达人磷酸甘油酸变位酶l的shRNA分子的载体可以有效治疗原发性肝细胞癌疾病。而本发明筛选防治原发性肝细胞癌药物的方法也是能有效筛选防治原发性肝细胞癌疾病的药物。19SEQUENCELISTING〈110>四川大学〈120>原发性肝细胞癌诊断试剂、试剂盒及防治药物〈130>A090221k〈160>9〈170>Patentlnversion3.4〈210>1〈211>22〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>1gcacccactcccttcatacaat22〈210>2〈211>22〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>2acgcaggttacattcgtcttcc22〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>3accacagtccatgccatcac20〈210>4〈211>20〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>4tccaccaccctgttgctgta20〈210>5〈211>58〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>5caccggtgaagatctggaggcgcttcaagagagcgcctccagatcttcaccttttttg58〈210>6〈211>58〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>621gatccaaaaaaggtgaagatctggaggcgctctcttgaagcgcctccagatcttcacc58〈210>7〈211>47〈212>RNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>7ggugaagaucuggaggcgcuucaagagagcgccuccagaucuucacc47〈210>8〈211>1762〈212>DNA〈213>Homosapiens〈220>〈221>CDS〈222>(39)..(803)〈400>8gctaatcccagtcggtgccgcatccccagcccgccgccatggccgcctacaaactg56MetAlaAlaTyrLysLeu15gtgctgateeggcacggcgagagegcatggaacctggagaaccgcValLeulieArgHisGlyGluSerAlaTrpAsnLeuGluAsnArg101520ageggctggtacgacgccgacctgageccggcgggccacgaggagSerGlyTrpTyrAspAlaAspLeuSerProAlaGlyHisGluGlu253035aagcgcggcgggcaggcgetacgagatgetggctatgagtttgacttc104Phegcg152Alaate20022LysArgGlyGlyGinAla40tgcttcaccteagtgcagCysPheThrSerValGin5560etagatgecattgatcagLeuAspAlalieAspGin75cacHisetcaatLeuAsnactgetThrAlatatgatTyrAsp120aacateAsnlie135ccctecProSertggaatTrpAsngagGlugcaAla105gtcValagtSertgtCysgaa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