制备噬菌体混合物的方法以及该噬菌体混合物在抗生素抗性葡萄球菌治疗中的用途的制作方法

专利名称：制备噬菌体混合物的方法以及该噬菌体混合物在抗生素抗性葡萄球菌治疗中的用途的制作方法
制备噬菌体混合物的方法以及该噬菌体混合物在抗生素抗 性葡萄球菌治疗中的用途细菌感染引发多种疾病，其中一些疾病是致命的。很多细菌感染已成功地通过开 发抗生素得以抗击。然而，大量使用不同抗生素已经导致出现经常不仅对一种抗生素有抗 性而是对多种抗生素有抗性的细菌。如此高抗性的细菌菌株越来越多地引发严重的问题， 特别是发生在医院中，因为在医院中即使在医师实施治疗时病人也可能被这样的菌株感 染。如果该菌株对于大多数的通常所用的抗生素具有抗性，这将引起特别严重的疾病，其后 果经常是死亡。在本发明的范围内，请求保护一种抗击细菌的可选手段。存在多种攻击植物和动 物且经常引发严重的疾病的病毒，同样地，也存在特异地攻击细菌的病毒。这些病毒被称为 噬菌体。它们通常对于特定类型的细菌是特异的且经常连接至细菌细胞壁上那些通常发生 养分(例如糖等)吸收的区域。噬菌体的吸收发生在细菌细胞壁上，噬菌体将它们的核苷 酸注入到细菌中。核苷酸在细菌中进行复制并形成噬菌体特异蛋白质。当细菌细胞中有足 够的噬菌体核苷酸的拷贝数和充足的噬菌体蛋白质时，它们溶解细菌细胞且释放大量已形 成的噬菌体进入环境中。然后又可以开始感染的循环。发现噬菌体用于治疗特定疾病的用途已有几十年。该抗击细菌的方法在东欧 国家中得以显著发展。在WO 2004/052274中记载了生产噬菌体组合物的方法，该噬菌 体组合物可以用于细菌感染的治疗中且特别地用于治疗由绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引发的细菌感染。在该申请中，用半固体培养基来培养噬菌体。WO 97/39111 记载了生产具有宽宿主谱(a widespectrum of hosts)的噬菌体的方法以及该噬菌体在治 疗中的用途。在W001/50866中公开了用于消灭在各种固体表面上的细菌的噬菌体混合物 (cocktail of bacteriophage)，例如在手术室中或甚至在牲畜棚(facilities forhousing livestock)禾口屠宰场中。US 2004/0247569记载了含有噬菌体的医药组合物，该噬菌体可以使多种抗生素 抗性细菌失活，例如肠球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、假单胞菌等。WO 2006/047870记载了吸附在基质(matrix)上的固定的噬菌体组合物。0，Flaherty等人， 在 Applied and Environmental Microbiology [2005]，pp. 1836-1842 中描述了 抗葡萄 球菌属噬菌体K和其用于控制来自医院的抗生素抗性葡萄球菌的用途。WO 2007/148919 记载了金黄色葡萄球菌特异的噬菌体以及其在抗击感染中的用途。Capparelli等人，在 Antimicrobialagents and Chemotherapy [2007], pp. 2675-2773 中记载了噬菌体 Msa 和其 在小鼠模型中对抗金黄色葡萄球菌的用途。Rashel等人，在JID[2007]，pp. 1237-1247中 记载了对内溶素的克隆，该内溶素是来自噬菌体OMRll的分解肽聚糖(ρ印tidoglycan)的 酶。本发明涉及生产噬菌体混合物(mixture of bacteriophage)的方法，其中，首先 使葡萄球菌属菌株与可以溶解葡萄球菌的噬菌体在预培养(preculture)中生长，然后进 一步在主培养(main culture)中繁殖(!^production)。然后组合大量所述噬菌体以形成 混合物。
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所用的噬菌体混合物包括至少两种，优选至少三种不同的噬菌体的血清型 (serotype of bacteriophage)，该噬菌体特异地溶解葡萄球属菌种的细菌。噬菌体株优选 使用来自肌病毒科(Myoviridae)和短尾病毒科(Podoviridae)的噬菌体。本发明的一个重要方面是如下事实使用大量不同的噬菌体，该噬菌体都具有 可以溶解葡萄球菌的共同属性。具体来说，所用的噬菌体必须溶解涉及疾病和对于人类 和/或动物是致病条件的葡萄球菌。作为特别优选，本发明所用的噬菌体溶解葡萄球菌， 且具体来说是金黄色葡萄球菌菌株，其对于抗生素是有抗性的且具体来说是对甲氧西林 (methicillin)具有抗性的。本发明的一个重要方面是大量不同的噬菌体存在于噬菌体混 合物中。这些噬菌体可以是特异溶解金黄色葡萄球菌菌株的噬菌体，但是它们也可以是溶 解其他类型细菌的噬菌体，虽然这种噬菌体株仅优选用于补充属于至少两种不同血清型的 噬菌体的混合物。用于本发明所述方法的噬菌体可以是有特征明确的噬菌体或者是来源于野生分 离株。为此目的，使用一般的噬菌体分离方法并且从合适的来源开始，首先通过和葡萄球菌 属菌株联合生长使噬菌体增多然后将其用于本发明的方法中。在本发明的方法中，出于安全原因，优选金黄色葡萄球菌的甲氧西林敏感菌株用 于繁殖噬菌体。在医院经常会出现的问题感染就是由金黄色葡萄球菌的甲氧西林抗性菌株所引 起的，其经常缩写为MRSA。然而，优选用于繁殖噬菌体混合物的是金黄色葡萄球菌的甲氧西 林敏感性菌株(MSSA)。根据布达佩斯条约，优选的菌株现在存放在德国微生物和细胞培养 物保藏中心(German Collectionof Microorganisms and Cell Cultures)，登陆号为 DSM 18421。根据本发明的用于繁殖噬菌体的金黄色葡萄球菌菌株的特别重要的优点在 于，大量下述毒力因子(Virulence factor)不存在于该菌株中。以下是位于移动元件 (transferrable element)上白勺毒素决定M (toxin determinant)tst 161/93sea 619/93seb 62/92sec 1229/93sed 1634/93see FRJ918eta 1437/100eta, etb 1004/00IukS-IukF 3925/02cna 2773/03seg N315seg 和 seh 2773/03.在优选的实施方式中，上述毒力因子全部不存在于所用的菌株中。由此，毒力因子不会从用于繁殖的菌株转移到噬菌体上，从这个方面来说噬菌体 的繁殖是特别安全的。
根据本发明的用于繁殖的菌株的另一个优点在于即使在多次传代之后菌株中繁 殖的噬菌体的特性也不会改变。根据本发明为了生产噬菌体混合物，第一步使所用的金黄色葡萄球菌菌株的预培 养物生长。当该细菌达到合适的光密度时，添加待繁殖的噬菌体，调整预培养物中的细菌与 噬菌体的比率至大约IO5 IO2细菌比1个噬菌体。然后使预培养物和噬菌体生长直到细菌开始溶解。将含有噬菌体的预培养物添加 到葡萄球菌的主培养物中，优选调整比率使得存在的细菌显著过量。特别优选的范围是对 于每个噬菌体大约有50 1000个细菌。上述过剩获得如下结果所有存在于预培养物中 的噬菌体均找到合适的细菌并在该细菌中进行繁殖。噬菌体比细菌的比率也指已知的MOI (感染复数(multiplicity of infection)) 值。在优选的实施方式中，预培养中和主培养中的MOI值是10_6 1。在本发明的方法中，通常在大小合适的发酵罐中实施主培养。在发酵罐中，可以连 续地控制单个环境参数例如供气(air infeed)、pH、养分的添加等。在优选的实施方式中， 在减少供气的条件下进行主培养物的生长，且PH也优选维持在范围5. 8 7. 8。在发酵之后，噬菌体通常通过下述步骤从发酵液中获得通过第一次离心和/或 过滤掉发酵培养基从而分离除掉来源于已溶解的细菌的细胞组分。在这种情况下，优选 通过一个或多个过滤器(filter)过滤上清液，选择孔径从而使得在第一次过滤时任何可 能存在的细菌无法通过过滤器。这些过滤器的孔径优选的范围为0. 1 Ι.Ομπι，优选为 0. 1“111 0.5“111，更优选为0. Ιμπι 0. 45 μ m，最优选为0. 1 0. 2 μ m。由于噬菌体的大 小更小，因此噬菌体可以通过这个尺寸的过滤器。然而，必须注意的是，所使用的过滤器是 尽可能不会吸附噬菌体的过滤器，这是因为如果噬菌体吸附在过滤器上，这可能导致过滤 器变得阻塞以及使噬菌体的产率变差。在进一步的步骤中，优选对含有噬菌体的溶液进行渗滤从而使得噬菌体不能通过 小孔从而在溶液中浓缩。噬菌体的浓度可以快速地利用微生物测定的标准方法来测定。所 述溶液优选含有每毫升至少IOkiPFU' s (噬斑形成单位(plaque-forming unit))的浓度。在本发明的范围内，使用至少两种或更多种噬菌体的混合物。优选按照下述方法 生产此类混合物首先通过所用的每一种噬菌体来生产含有确定噬菌体浓度的溶液，然后 以需要的比率混合所述溶液。浓缩的噬菌体可以属于相同的噬菌体分类(class)或甚至 属于不同的噬菌体分类。在特别优选的实施方式中，噬菌体混合物由肌病毒科的两种不同 种类的噬菌体组成。特别优选，一方面噬菌体混合物具有KP3类型的噬菌体和/或鉴定为 MP13.3的噬菌体。除此之外，混合物也可以包括其它合适的噬菌体。2006年10月18日两种优选的噬菌体存放在Brunswick的德国微生物和细胞培养 物保藏中心[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH]。给予 噬菌体株MP13. 3的登录号为DSM 18722以及给予命名为KP3的噬菌体株的登录号为DSM 18723。按照布达佩斯条约进行存放。按如下的方式生产噬菌体混合物，首先每个噬菌体株单独地在宿主细菌中进行繁 殖。在纯化每种噬菌体制剂并测定其滴度(titre)之后，制备混合物，在这种情况下，在单 个噬菌体之间的比率可在1 10 10 1的范围内变化。优选所用的混合物由大约同等 比例的两种噬菌体组成，每一种的比例均基于噬斑形成单位。其它分别繁殖的噬菌体株也可以添加入所述的混合物中。根据本发明的噬菌体混合物可以经受合适的进一步处理从而用作药剂 (medicament)。在这些阶段中，必须注意不使所述噬菌体失活。优选添加保护物质例如增 稠物质，例如甘油或聚乙二醇。当药剂以液体形式给药时，此类添加剂是优选。在另一优选的实施方式中，根据本发明的噬菌体混合物具有稳定剂，特别优选人
血清清蛋白。在优选的实施方式中，根据本发明的噬菌体混合物以如下方式用作药剂，至少还 有一种酶添加到噬菌体溶液中，所述酶对于噬菌体溶液的效率具有协同效应。讨论的所述 酶可能本身是杀菌的。因此可以使用细胞溶素(Iysin)，例如溶菌酶，其来自不同的来源，换 言之来自噬菌体、来自细菌(内溶素(endolysinshexolysins)或来自其他来源。任选地， 可以使用例如分离自鸡蛋的溶菌酶，其可以溶解细菌的细胞壁，特别是革兰氏阳性细菌。同 样可以有利地使用属于蛋白酶和/或肽酶组的其它酶。在这种情况下，一个举出的例子是 木瓜蛋白酶(papain)。最后，酶也可以是核酸酶或氨基葡萄糖苷酶，虽然其本身不是直接杀 菌的，但是可以起到协助噬菌体的作用。在特别优选的实施方式中，上述酶是蛋白酶沙雷菌蛋白酶 (proteaseserralysin)，其由菌株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)生产。另一个优 选的酶是核酸酶Benzonase或链球菌DNA酶α (dornase α )。在实施例7中，公开了该组合 在生物基质(唾液)中的优良特性。如果以不同方式应用本发明的噬菌体混合物，对混合物进行冷冻干燥 (Iyophilised)可能对其是有利的。在这样情况下，可以添加非常合适的保护组分例如各种糖。可以以溶液、酊剂(tincture)、药膏或外用药水(lotion)的方式应用本发明的药 剂。在另一优选的实施方式中，此类药剂除含有噬菌体混合物之外，还含有优选对革兰氏阳 性细菌有效的抗生素。这种组合的背景如下所述事实上通过本发明的噬菌体混合物溶解 甲氧西林抗性细菌。然而同时其目的还在于阻止任何其它可能存在的且对抗生素没有抗性 的细菌再一次活跃(flourish)。因为抗生素抗性经常编码在葡萄球菌的质粒上，本身是抗 生素敏感的细菌可以吸收溶解细菌的质粒。这种现象可以通过优选的组合来阻止。本发明的噬菌体混合物优选用于生产用来治疗因抗生素抗性金黄色葡萄球菌菌 株所引发的感染的药剂。在优选的实施方式中，上述这些感染出现在皮肤或粘膜上。本发 明的噬菌体混合物可以容易地且有效地治疗这些感染。在这种情况下，存在的优点是噬菌 体混合物不必通过静脉注射和/或肌内注射进行给药。而可以简单地以溶液、粉末、喷雾或 药膏的方式施用于受感染区域。根据本发明的噬菌体混合物一方面可以用于治疗已存在的感染。然而，根据本发 明的另一方面，噬菌体混合物也可以用于预防由抗生素抗性葡萄球菌属菌株引起的感染危 险。在这种情况下，预防地使用噬菌体混合物。在格外特别优选的实施方式中，本发明的噬 菌体混合物可以治疗地使用也可以预防地使用，特别是对于治疗肺感染或避免肺感染的危 险。肺经常承受增加的感染危险，这是因为细菌，特别是抗生素抗性细菌可以容易地通过呼 吸和换气设备找到进入肺的路径。本发明的噬菌体混合物的另一优选的应用领域是用于眼睛。如果发生这类感染，
6噬菌体混合物以滴眼剂(eye drop)的方式进行给药。本发明的方法显示在

图1流程图中。在根据本发明方法的优选实施方式中，添加Benzonase至含有噬菌体的溶液中。 主要来源于溶解的葡萄球菌的高分子量DNA通过Benzonase进行裂解，从而使得不需担心 传染性或可能的葡萄球菌DNA片断的重组(recombination)。另一方面，所述Benzonase对 于噬菌体溶液的粘性(viscosity)有有益效果。因此优选在微量过滤(microfiltration) 之前或在渗滤之后添加Benzonase。如果添加了 Benzonase，建议在通过离子交换色谱法进 行纯化之后还进行凝胶色谱。通过该手段除去仍然存在的Benzonase残余物。Benzonase 的分子量介于30000 40000道尔顿之间。因此可取的是，用于凝胶色谱法的色谱柱材料 具有针对约100000道尔顿的空隙体积(void volume)，优选约50000道尔顿的空隙体积。添加Benzonase的另外的显著优点在于增加了离子交换色谱法中的产率。换言 之，丧失的噬菌体更少，这是因为对与核苷酸络合(complexing)存在有益效果从而提高了 产率。本发明的另一优选方面是可以通过添加人血清清蛋白来稳定噬菌体悬浮液 (suspension)。可以是从人血浆中得到的人血清清蛋白。然而，在这种情况下，必须除去任 何病毒的污染物。任选地，可以使用通过重组过程生产的人血清清蛋白来避免病毒污染物 的危险。在另一优选的实施方式中，通过添加Mg2+浓度介于0. 1 IOOmM(优选介于1 IOmM)的镁离子以稳定噬菌体溶液。在格外特别优选的实施方式中，通过添加镁离子和人血 清清蛋白来实现稳定。通过以下实施例对本发明进行说明。实施例1 在发酵罐中生产噬菌体1. 1微生物用于发酵的细菌噬斑测试细菌噬菌体1. 2营养培养基a) APS LB 发酵液称量出20g已制好的培养基(Becton Dickinson，批号430510)，溶解在去离子水 中并添加去离子水至1升的终体积。以这样的方式生产的培养基的天然PH大约是6. 8且
MRSA M. 03. 02. 0028，从 Freiburg 的 Daschner 教授处 获得的菌株的冷冻培养物。按照布达佩斯条约，菌株 已存放在德国微生物和细胞培养物保藏中心，编号为 18421。
金黄色葡萄球菌M. 03. 02. 0008,从Freiburg的 Daschner教授处获得。按照布达佩斯条约，菌株已存 放在德国微生物和细胞培养物保藏中心，编号为DSM 18421。
初始噬菌体I，经无菌过滤 浓度:lX1010PFU/ml
已分别生长的两种噬菌体株KP3 (DSM 18723)和 MP13. 3 (DSM 18722)。不需要进行调节。121°C对培养基灭菌20分钟，然后放置于室温环境(室温为20-22°C )。b) APS LB发酵液(发酵)称量出20g现成的培养基(见上)和2. 5g MgS04 (Roth, pro analysi)，溶解在去离 子水中并添加去离子水至1升的终体积。121°C在培养基准备器(MediaPr印preparatory) 对培养基灭菌20分钟，然后直接注入已灭菌的培养瓶中。c) LB 培养基10g来自酪蛋白的胰蛋白胨(Roth，微生物用)，5g氯化钠(Roth, proanalysi)和 酵母提取物(Roth，细菌用)溶解在去离子水中并添加去离子水至1升的终体积。为了配制固体营养培养基，添加15g琼脂/每升(Roth，高纯度)。121°C对培养基 灭菌20分钟。琼脂平板保存在室温下。用于检测的平板是在所述条件下已保存最多为一 个星期的平板。d) Vogel-Johnson 琼月旨(Vogel-Johnson agar)将58g已制好的培养基(Merck)溶解在1升热的去离子水中，然后在121°C灭菌 20分钟。冷却培养基至大约50°C，然后添加0. 24g/l的亚碲酸钾(无菌过滤溶液)。将培 养基注入到培养皿(Petri dish)中，所述培养皿在超净工作台(clean bench)中干燥30 分钟然后在4°C保存。e)LB顶层琼脂l.Og来自酪蛋白的胰蛋白胨，0.5g 氯化钠，0. 8g 琼脂，溶解于去离子水中，添加去离子束使混合物为100ml，然后在121°C灭菌20分钟。 维持在60°C的干燥箱内直到使用。1. 3缓冲液a) 0.85% 氯化钠将0. 85g氯化钠溶解在去离子水中并添加去离子水至100ml的终体积。在121°C 对所述缓冲液灭菌20分钟。b)噬菌体缓冲液20mM Tris(pH 7. 4), (Roth, ultra quality),lOOmM 氯化钠，lOmM MgS04X7H20,由无菌贮存液和无菌去离子水配制。保存于室温。c) 1M NaOH将40. 01g NaOH (Roth)溶解在去离子水中并添加去离子水至1升的终体积。在 121°C对溶液灭菌20分钟和然后维持于室温。d) pH(calibrating solution) pH 4. 01 (Mettler Toledo)pH 7. 00 (Mettler Toledo)e)氧气探针(p02探针，测量培养基中的氧气分压)对p02探针进行标定，首先在任务栏中按下标定按钮然后在接下来的窗口中按下 p02按钮。在这种情况下，将温度值调节至室温或输入溶液的温度。
f)光密度探针0D探针未标定，但是对于特定的培养基在每次新运行时简单地调节至0。因为所 述探针还没有线性化，没有必要和由分光光度计(photometer)测量的0D_进行外部比较。g)pH 的测量在测量之前打开pH计并调节所需要的温度。检查pH计的标定状态和如有必需则 参照厂商说明书进行标定。探针从3M的KC1溶液中取出并用去离子水冲洗干净。用纸巾 擦干探针并保持在待测量的溶液中。可以通过振动或搅拌溶液来加速测量过程。记下所测 量的数值，从溶液中拿出探针并用70%的乙醇进行彻底地冲洗，然后用去离子水进行冲洗， 用纸巾擦干并放回到3M的KC1的溶液中。1. 5细菌菌株的生长-从-80°C的冷冻室中取出准备用于发酵的1.1中特定的菌株的冷冻甘油培养物 并在超净工作台中解冻。-将2接种环细胞原料接种至20ml的APSLB培养基中并在37°C和200rpm振动 条件下进行过夜温育。1.6 发酵-从37°C操作的振动培养箱中取出培养基。-取出0.1ml用于光密度的测量，1份培养物用9份培养基进行稀释 (0. 9mlAPS-LB+0. lml培养物)，测量出的0D_的平均值为1. 363。-用挠性管抽取(flexiblewithdrawal tubing)培养基样品并加入到Eppi (= Eppendorf公司制备的反应容器)中。每份500 u 1平铺在LB琼脂和Vogel-Johnson琼脂 上并在37°C过夜温育。1.7调整过夜的培养物的0D至8.0-将培养物(culture)和培养基(medium)在无菌Falcon管中混合并用无菌培养 基稀释调节光密度至约8.0。1.8细菌/噬菌体的温育-在Eppi，s中用噬菌体缓冲液稀释待使用的噬菌体(1.1)至2X 10_2(终体积= 2ml的2X10—2稀释液)-当容器中的温度稳定时，将15ml的经调节的细菌培养物和2ml噬菌体在Falcon 管中混合并在37°C温育20分钟。-通过针头抽吸细菌和噬菌体的混合物到20ml的注射器中，并通过隔膜注入培养
瓶盖中。-搅拌3分钟之后，测定用于发酵的第一个测量值。1.9CFU/ml 的测定-调整培养基的0D至8.0并按照以下表格进行移液，形成稀释倍数(factor)为 10的稀释液系列表1
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权利要求
用于制备噬菌体混合物的方法，在该方法中，分别繁殖至少两种不同的噬菌体株，其中葡萄球菌属菌株与噬菌体株中的每一种在预培养中生长，所述噬菌体株可以溶解葡萄球菌，然后在主培养中进一步繁殖，之后进行纯化，随后混合所述不同的株，其特征在于使用的噬菌体混合物包括至少两种不同的噬菌体血清型，所述噬菌体特异地溶解葡萄球属菌种的细菌，以及用于繁殖所述噬菌体的细菌菌株是金黄色葡萄球菌的甲氧西林敏感菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述金黄色葡萄球菌的甲氧西林敏感菌株 的登录号为DSM 18421。
3.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于将在预培养中生长的细菌和噬 菌体的混合物添加至葡萄球菌预先生长的培养物中，调整噬菌体比细菌的比率使得MOI值 为0. 01 1。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述噬菌体的纯化包括离子交 换色谱法和/或用Benzonase进行处理。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于所述噬菌体混合物含有登录号 为DSM 18722的噬菌体MP13. 3和登录号为DSM 18723的噬菌体KP3。
6.噬菌体混合物，其特征在于所述噬菌体具有每微克蛋白质至少IO8噬斑形成单位的 比活。
7.根据权利要求6的噬菌体混合物，其特征在于所述混合物含有分别具有每微克蛋白 质至少IO8PFU比活的噬菌体MP13. 3 (DSM 18722)和/或噬菌体KP3 (DSM 18723)。
8.根据权利要求6或7所述的噬菌体混合物，该噬菌体混合物通过权利要求1 6中 任一项所述的方法获得。
9.药剂，其特征在于所述药剂含有权利要求6 8中任一项所述的噬菌体混合物。
10.根据权利要求9所述的药剂，其特征在于所述药剂还含有对于革兰氏阳性细菌有 效的抗生素。
11.根据权利要求9或10所述的药剂，其特征在于所述药剂还含有酶，所述酶选自细 胞溶素、蛋白酶、肽酶、核酸酶和/或氨基葡萄糖苷酶和/或稳定噬菌体的物质，其选自人血 清清蛋白和/或Mg2+离子。
12.根据权利要求6 8中任一项所述的噬菌体混合物用于制备药剂的用途，所述药剂 用来治疗由抗生素抗性葡萄球菌所引发的感染。
13.根据权利要求6 8中任一项所述的噬菌体混合物用于制备药剂的用途，所述药剂 用来预防治疗以预防由抗生素抗性葡萄球菌所引发的感染。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其特征在于所述感染是皮肤和/或粘膜的感
15.根据权利要求12或13所述的用途，其特征在于所述感染由对多种抗生素具有抗性 的葡萄球菌所引发。
全文摘要
本发明涉及用于制备噬菌体混合物的方法，在该方法中，分别繁殖至少两种不同的噬菌体株，其中葡萄球菌属菌株与噬菌体株中的每一种在预培养中生长，所述噬菌体株可以溶解葡萄球菌，然后在主培养中进一步繁殖，之后进行纯化，随后混合所述不同的株，其中，使用的噬菌体混合物包括至少两种不同的噬菌体血清型，所述噬菌体特异地溶解葡萄球菌种的细菌。
文档编号A61P31/04GK101977616SQ200980110033
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月13日 优先权日2008年3月20日
发明者罗伯特·F·米勒 申请人:菲托莱恩有限责任公司