专利名称：具有免疫增强活性和抗肿瘤活性的来自奇果菌的低分子量物质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从“舞茸(Maitake)”菇(奇果菌(Grifola))的菌丝体或子实体 中提取和分级的具有提高的免疫增强活性和抗肿瘤活性的低分子量的蛋白质-葡聚糖复 合物。
背景技术：
一种从奇果菌的菌丝体或子实体中提取的具有β-1，6-连接的葡萄糖作为主 链，以β_1，3-连接的葡萄糖作为支链的多糖(葡聚糖)和以β-1，3-连接的葡萄糖 作为主链，以β_1，6-连接的葡萄糖作为支链的多糖(葡聚糖)已知具有免疫增强活 性(日本专利公开(Kokai)No. 59-210901Α(1984)(专利文献1)；日本专利公开(Kokai) No. 9-238697Α(1997)(专利文献 2)) 此外，制备抗癌物质的方法也是已知的，其中“舞茸”(贝叶奇果菌(Grifola frondosa)) ,"Tonbimaitake"(巨大奇果菌(Grifola gigantea))，或者"Masutake”(硫磺 多孔菌(Laetiporus sulphureus))用热水来提取，提取物减压浓缩，以使得产物经历用有 机溶剂的沉淀步骤、除去低分子量物质的透析步骤和用脂溶性有机溶剂提取的除去杂质步 骤的组合(日本专利公开(Kokoku)No. 43-16047B(1968)(专利文献3))。由专利文献1、2和3公开的传统技术获得的葡聚糖_蛋白质复合物的实例是高分 子量葡聚糖-蛋白质复合物，其分子量为大约1，000，000。当在细胞水平上考察其详细的 免疫增强活性机理时，复合物具有大分子量的事实意味着其主要的活性结构不能被明确说 明。此外，由于这种葡聚糖-蛋白质复合物具有高分子量，它们不能经静脉内施用。本发明人以前进行的研究目的是在舞茸的热水提取物中找到具有例如免疫增强 活性、抗癌活性等活性的低分子量物质。结果，他们成功的得到了一种具有10，000-150，000 分子量的葡聚糖-蛋白质复合物(日本专利公开(Kokai)No. 2007-31665A(专利文献4))。但是处理这样的具有10，000-150，000的分子量的非常大的葡聚糖-蛋白质复合 物很不方便。专利文献1 日本专利公开(Kokai)No. 59-210901A (1984)专利文献2 日本专利公开(Kokai) No. 9-238697A (1997)专利文献3 日本专利公开(Kokoku) No. 43-16047B (1968)专利文献4 日本专利公开(Kokai)No. 2007-31665A
发明内容
本发明要解决的技术问题本发明的目的是开发一种具有卓越的免疫增强活性和抗肿瘤活性的低分子量的 来自舞茸的物质，其优选被用作药品、食品或饮料、和饲料的原料。解决技术问题的手段
本发明人将舞茸的热水提取物分级，从而新得到一种包含蛋白质_葡聚糖复合物 (其中蛋白质的比例要大于葡聚糖的比例)的具有5000或更低的分子量的物质，其在结构 上不同于常规所知的葡聚糖_蛋白质复合物(其中葡聚糖的比例要大于蛋白质的比例)。然 后，他们发现，这样的物质具有促进建立的T辅助1型人细胞系(THP-I)和小鼠脾细胞体外 生长和增殖的活性。由此，本发明人完成了包含具有免疫增强活性的低分子量蛋白质-葡 聚糖复合物的物质的纯化，其在分子量和蛋白质含量方面明显不同于专利文献1，2，3和4 所公开的物质。本发明涉及以下(1)-(7)(1) 一种具有免疫增强活性和抗肿瘤活性的物质，其包含蛋白质_葡聚糖复合物， 所述复合物在蒽酮反应和茚三酮反应中显示阳性结果，所述物质通过包含下列1)_4)的步 骤来制备1)用水热提取奇果菌的菌丝体或子实体的步骤；2)将醇加入到得到的水溶性提取物级分至终体积浓度为10 % -80 %，将得到的溶 液在1°C -40°c的温度下静置，除去浮在溶液上或者溶液中，或者粘附在容器壁表面的物质 以及其中形成的沉淀物的步骤；3)从经步骤2)后得到的包含醇的水溶性级分中除去醇，并经阴离子交换柱层析 从得到的水溶性级分中收集被吸附的级分的步骤；4)经将吸附的级分进行分子筛分离，收集分子量为5000或更低的级分的步骤；(2)根据(1)所述的具有免疫增强活性和/或抗肿瘤活性并包含蛋白质_葡聚糖 复合物的物质，其中蛋白质与葡聚糖的比为85 15-99.5 0.5；(3)根据(1)或⑵所述的具有免疫增强活性和/或抗肿瘤活性并包含蛋白 质-葡聚糖复合物的物质，其中的奇果菌为“舞茸”(贝叶奇果菌(Grifola frondosa)), "Shiromaitake(Grifola albicans Imaz.), 或 者“猪 茶，，(Dendropolyporus umbellatus)；(4) 一种免疫增强剂或抗肿瘤剂，其包含(1)、(2)和(3)中任一项所述的包含蛋 白质_葡聚糖复合物的物质作为活性成分；(5) 一种化疗佐药，其包含⑴、(2)和(3)中任一项所述的包含蛋白质_葡聚糖 复合物的物质作为活性成分；(6) 一种食品或饮料，其包含(1)、(2)和(3)中任一项所述的包含蛋白质_葡聚 糖复合物的物质；以及(7) 一种宠物食品、牲畜饲料或者宠物食品或牲畜饲料的添加剂，其包含(1)、(2) 和(3)中任一项所述的包含蛋白质-葡聚糖复合物的物质。以下更详细的描述本发明。本发明中的术语“蛋白质_葡聚糖复合物”涉及一种包含蛋白质和葡聚糖的物质。 该物质包含主要由蛋白质组成，并且蛋白质和葡聚糖的比为如上述(2)所述的99.5 0.5 的物质。本发明中，可以使用所有类型的奇果菌，包含“舞茸”(贝叶奇果菌(Grifola frondosa))、“Shiromaitake，，(Grifola albicans Imaz.)，“猪 等” (Dendropolyporus umbellatus)等。新鲜的奇果菌可以直接使用或者必要的时候将其切块后使用。干的奇果菌也可以直接使用，或者必要时切块后使用，或者以粉末的形式使用。用水热提取处理在50°C _135°C下进行，时间为15分钟_3小时。对于快速提取， 提取可以在压力下于100°c或更高的温度下进行，例如，在1-2个大气压、约110°C到125°C 的压力罐中进行15-60分钟。使用蒸馏水，纯净水，离子交换水，自来水等作为水。每重量份干奇果菌，使用约 2-50体积份的水。如果使用新鲜的奇果菌，每重量份奇果菌，使用约2-20体积份的水。作为加入到用水热提取得到的提取物中的醇，可使用甲醇，乙醇，丙醇等。这样的 醇被加入到提取物中直至终体积浓度为10-80%。而且，可以使用含有0-50%水的醇。在 加入醇之后，得到的溶液被静置1-25小时，由此出现了浮在溶液上或溶液中或附着到容器 壁表面的物质。随后经过滤，移液，离心或用网状材料滤出从溶液收集这些物质。经上述步骤之后，将醇从得到的包含醇的水溶性级分中除去。通过阴离子交换柱 层析，从得到的水溶性级分中收集被吸附的级分。为了进行阴离子交换层析，使用通常所用 的阴离子交换树脂，如强碱性离子交换树脂和弱碱性离子交换树脂。然而，优选使用化学和 物理稳定的且具有大的离子交换容量的高渗透性树脂。将吸附的级分通过常规方法洗脱并进行分子筛分离。由此，可以收集到一种具有 5000或更低分子量的低分子量级分。作为分子筛分离的手段，可以使用凝胶过滤层析、超 滤、透析等。作为凝胶过滤材料，可以使用广泛用于常规目的的材料，如葡聚糖基、琼脂糖 基、纤维素基或丙烯酰胺基材料。同样，对于超滤、透析等，多种装置是可商业上获得的。可 以使用适当的装置。希望选择本发明人发现的具有5000或更低分子量的级分。然而，取决于装置，可 接受的分子量变化范围可以是士20%。在这个范围内，能够达到期望的目标。此外，分子量 的下限优选500或更高。通过上述得到的本发明的目标产物描述如下。外观无色至微黄色液体溶解性溶于水、醇溶液、碱溶液、酸溶液和二甲亚砜水性溶液的性质中性至弱酸性显色反应在蒽酮反应和茚三酮反应中呈阳性分子量5，000或更低经柱层析纯化的结果表明，本发明中得到的具有免疫增强活性和抗肿瘤活性的物 质中蛋白质与葡聚糖的比在85 15-99.5 0.5的范围内。该比例会随用作起始原料的 奇果菌的质量以及提取和纯化的条件而发生适量的变化。本发明的蛋白质_葡聚糖复合物是一种具有免疫增强活性和抗肿瘤活性的物质。 因此，它可以作为免疫增强剂或抗肿瘤剂施用给人类或动物，或者可以与化疗剂例如抗肿 瘤剂或抗生素联合使用(即，以化疗佐药的方式)以给人类或动物施用。此外，这种物质还 可以添加到食品或饮料、宠物食物、牲畜饲料等中。当本发明的物质用作药品或兽药时，由于具有低分子量并能溶于水或醇中，其可 以制备成多种剂型。剂型的实例包括用于口服的溶液、糖浆、片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊和药 丸；用于肠胃外给药的肠胃外注射剂、滴液、栓剂、外用制剂、滴鼻剂和滴眼剂。本发明的物 质显著有利于药品的开发。
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本发明的物质来自奇果菌，其已经用作食品多年，因此具有很高的安全性。因此， 本发明的物质可以食品或饮料的形式使用或者与食品或饮料混合。本发明中所用的术语 “食品或饮料”不仅限于日常消费的饮料如牛奶和果汁以及加工食品。这样的食品或饮料的 实例包括所有类型的食品，其中包括普通的食品和饮料如所谓的健康食品、保健功能食品 如有营养功能声明的食品和特种保健用途的食品，药用辅助食品，特殊用途食品如老年人 食品和病人食品。本发明的效果根据本发明所述的通过分级奇果菌的热水提取物得到的，具有5000或更低分子 量的新的蛋白质-葡聚糖复合物，显示了免疫增强活性和抗肿瘤活性。它可以用作免疫增 强剂、抗肿瘤剂或用于包括抗生素或抗肿瘤剂的化疗用佐药。此外，这样的来自奇果菌的高安全性的物质是一种非常常见的食品，不但可被用 于药品和兽药，也可以被用于食品或饮料、饲料和宠物食品。或者，与它们进行混合。本说明书包含了本申请的优先权文件日本专利申请No. 2008-032935的说明书和 /或附图中所公开的部分或全部内容。
图1显示了细胞增殖活化检测的结果。细胞增殖活化率通过以下公式得到 细胞增殖活化率(％ )=处理组的吸光度(Abs. 450nm/Abs. 650nm) /对照组的吸光度 (Abs. 450nm/Abs. 650nm)X100图2显示了产生的IL-12和IFN-γ的量。本发明的最佳实施方式下文中，本发明将参考以下实施例进行具体描述。(1)提取方法用1. 5L蒸馏水在110 °C -125 ！下热提取干舞茸(贝叶奇果菌(Grifola frondosa))的子实体(150g) 15-60分钟。将乙醇加入到500ml得到的可溶级分中，直至终 体积浓度为10% -80%。将得到的溶液在1°C -40°C下静置12小时左右，由此产生了粘性 的褐色物质漂浮在溶液上或溶液中或粘附在容器壁表面上。在通过移液等收集所述物质之 后，收集通过更进一步的离心步骤除去沉淀物质得到的包含醇的水溶性级分。通过除去醇， 从溶液中得到水溶性级分。然后通过阴离子交换柱层析(DEAE-Sephadex)收集被吸附的级 分。通过将溶液进行凝胶过滤层析(S印hadex或者Cellulofine)得到一种具有THP-I细 胞增殖活性的级分。这种物质在蒽酮反应和茚三酮反应中显示阳性结果。然后，将这种物 质通过柱色谱纯化，发现蛋白质与葡聚糖的比(在复合物中)为85 15-99.5 0.5。通过凝胶过滤层析对分子量进行分析的结果发现，分子量为5，000或更低。由本 发明得到的物质显示了紫外吸光度而没有可见光吸光度。(2)细胞增殖活化测试(体外)小鼠脾细胞在5% CO2的条件下在37°C用所述物质培养18小时。图1显示了细 胞增殖活化率(％)。用上述(1)中得到物质处理的组显示了比对照组更强的小鼠脾细胞 增殖促进效果。(3)抗肿瘤测试
上述(1)中得到的物质和作为对照的普通盐溶液，分别对Balb/cA小鼠腹膜内施 用七次，在Balb/cA小鼠中已经以250μ Ι/kg体重的量植入结肠26癌。检测该物质对肿瘤 的生长活性。得到的结果列在表1中。表 权利要求
一种具有免疫增强活性和抗肿瘤活性的物质，其包含蛋白质 葡聚糖复合物，所述复合物在蒽酮反应和茚三酮反应中显示阳性结果，所述物质通过包含下列1) 4)的步骤来制备1)用水热提取奇果菌(Grifola)的菌丝体或子实体的步骤；2)将醇加入到得到的水溶性提取物级分至终体积浓度为10％ 80％，将得到的溶液在1℃ 40℃的温度下静置，除去浮在溶液上或者溶液中，或者粘附在容器壁表面的物质以及其中形成的沉淀物的步骤；3)从经步骤2)后得到的包含醇的水溶性级分中除去醇，并经阴离子交换柱层析从得到的水溶性级分中收集被吸附的级分的步骤；4)经将吸附的级分进行分子筛分离，收集分子量为5000或更低的级分的步骤。
2.根据权利要求1所述的具有免疫增强活性和/或抗肿瘤活性并包含蛋白质_葡聚糖 复合物的物质，其中蛋白质与葡聚糖的比为85 15-99.5 0.5。
3.根据权利要求1或2所述的具有免疫增强活性和/或抗肿瘤活性并包含蛋白 质-葡聚糖复合物的物质，其中的奇果菌为“舞茸(Maitake) ”(贝叶奇果菌(Grifola frondosa))，“Shiromaitake，，(Grifola albicans Imaz·)，或者“猪等(Choreimaitake)，，( Dendropolyporus umbellatus)。
4.一种免疫增强剂或抗肿瘤剂，其包含权利要求1、2和3中任一项所述的包含蛋白 质_葡聚糖复合物的物质作为活性成分。
5.一种化疗佐药，其包含权利要求1、2和3中任一项所述的包含蛋白质-葡聚糖复合 物的物质作为活性成分。
6.一种食品或饮料，其包含权利要求1、2和3中任一项所述的包含蛋白质_葡聚糖复 合物的物质。
7.一种宠物食品、牲畜饲料或者宠物食品或牲畜饲料的添加剂，其包含权利要求1、2 和3中任一项所述的包含蛋白质-葡聚糖复合物的物质。
全文摘要
本发明公开了一种来自舞茸菇(Maitake mushroom)的物质，所述物质与常规糖-蛋白质复合物相比较低的分子量，以及与常规糖-蛋白质复合物不同的结构，而且还具有免疫刺激活性和抗癌活性。这种来自舞茸菇的低分子量物质通过以下步骤1)-4)来制备1)用热水提取舞茸菇的菌丝体或子实体；2)将醇加入到步骤1)提取的水溶性级分中使得醇的终浓度按体积计为10％-80％，将得到的混合物在1℃-40℃下静置，除去浮在溶液表面或溶液中的物质，粘附在容器壁表面的物质以及在溶液中形成的沉淀物；3)从前述步骤产生的含醇的水溶性级分中除去醇以获得水溶性级分，并将水溶性级分进行阴离子交换层析，并收集被吸附的级分；以及4)将被吸附的级分经历分子筛分离，并收集分子量为5000或更低的级分。
文档编号A61K38/00GK101981060SQ20098011047
公开日2011年2月23日 申请日期2009年2月13日 优先权日2008年2月14日
发明者儿玉典子, 难波宏彰 申请人:株式会社雪国舞茸