专利名称：胰高血糖素受体拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及胰高血糖素受体多肽拮抗剂，其抑制激素胰高血糖素与其受体的结 合。更具体地，本发明涉及抑制胰高血糖素与其受体结合的高亲和力胰高血糖素受体抗体 或其Fab片段，以及它们用于治疗或预防哺乳动物物种中II型糖尿病(NIDDM)以及相关疾 病的用途。
背景技术：
胰高血糖素是由胰腺α-细胞应答于低血糖水平而产生的29个氨基酸的肽激素。 胰高血糖素与肝细胞表面上的膜相连的胰高血糖素受体结合，其引发G蛋白信号转导级 联，活化细胞内环AMP并导致通过重头合成(葡萄糖异生)和糖原分解(糖原分解)释放 葡萄糖。Unson等人公开了针对对应于大鼠受体的两个细胞外部分的合成肽产生的多克隆 抗体。在所公开的测定中，发现针对126-137和206-219氨基酸残基产生的多克隆抗体在 大鼠肝膜中阻断胰高血糖素与受体的结合(Unson等人，PNAS，第93卷，第310-315页，1996 年1月)。Buggy等人公开了据说在体外测定中与胰高血糖素竞争受体的激素结合位点的单 克隆抗体的制备。(Buggy等人，Horm. Metab. Res. 28(1996)215-219)。在所公开的测定中， 命名为CIV395. 7A的抗体识别人和大鼠胰高血糖素受体，但不识别小鼠受体。为了开发用 于人体治疗的抗体，通常需要进行在有效的大鼠和/或小鼠动物模型中临床前疗效和安全 性研究。因此，提供能够结合大鼠、小鼠和人形式的胰高血糖素受体的临床前治疗性抗体候 选非常有利于治疗性抗体的药物开发，并且是非常想要的。Wright等人公开了称为hGR_2F6的单克隆抗体以及其Fab片段的氨基酸序列。已 在小鼠中产生了针对人胰高血糖素受体的此抗体，并在公开的测定中描述为对此受体的竞 争性拮抗剂(Wright等人，Acta Cryst. (2000) D56，573-580)。本申请人发现hGR_2F6仅以 低亲合性结合胰高血糖素受体的大鼠和小鼠形式，在糖尿病大鼠体内模型中发现高剂量的 hGR-2F6也不具有治疗效力。具体地，在大鼠模型中此抗体不能以任何统计显著性降低血清 葡萄糖(blood serum glucose,未公开)。本申请人认识到需要提供以高亲和力结合胰高血糖素受体并由此抑制胰高血糖 素与其结合的治疗性单克隆抗体，从而提供对糖尿病的有效治疗，优选对II型糖尿病和相 关疾病的有效治疗。此外，为了允许抗体的临床前药物开发，显然希望提供可结合人、大鼠 和小鼠形式胰高血糖素受体的单克隆抗体，从而允许要进行的必须的临床前安全性和疗效 研究。
发明内容
本发明涉及新型单克隆抗体或其Fab片段，其能够以高亲和力特异性结合人、大 鼠和小鼠来源的天然胰高血糖素受体。此外，本发明人提供了不但结合多种来源胰高血糖
5素受体的单克隆抗体或其Fab片段，而且第一次提供了在降低血清葡萄糖方面显示体内效 力的结合胰高血糖素受体的单克隆抗体。在第一方面中，本发明涉及Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体，其中 该Fab片段能够结合人、大鼠和小鼠胰高血糖素受体，并以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素 与各个受体的结合。在另一个出人意料的发现中，本发明人第一次提供了能够特异性结合胰高血糖素 受体的抗体或其Fab片段，其能够显著增加体内GLP-I血清浓度。本领域中已知提高的 GLP-I血清水平增强β -细胞功能，降低胰高血糖素分泌并延迟胃排空，被认为高度有利于 II型糖尿病和相关病症的治疗。在第二方面中，本发明涉及包含有效量的本发明Fab片段或人源化单克隆抗体， 以及可药用赋形剂的药物组合物。在第三方面中，本发明提供了治疗I型或II型糖尿病以及人体中实现重量减轻的 方法，其中该方法包括向有此需要的患者施用有效量的本发明Fab片段或人源化单克隆抗 体。本发明的第四个方面包括用作药物的本发明Fab片段或人源化单克隆抗体。本发明的第五方面涉及本发明Fab片段或人源化单克隆抗体在制备用于治疗或 预防I型或II型糖尿病，或在人体中实现重量减轻的药物中的用途。发明详述本发明涉及Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体，其中该Fab片段能 够结合人、大鼠和小鼠胰高血糖素受体，并以低于50ηΜ的Ki抑制胰高血糖素与各个受体的
纟口口。本发明还提供了除了针对人、大鼠和小鼠来源的胰高血糖素受体之外还能够以高 亲和力结合食蟹猴(cynomologous monkey)胰高血糖素受体的单克隆抗体。优选地，该Fab 片段或包含该Fab片段人源化单克隆抗体因此还以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与食蟹 猴胰高血糖素受体结合。优选地，Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体具有低 于30nM的对每种提及(named)的胰高血糖素受体的Ki，更优选低于20nM，更优选ΙΟηΜ。更 优选地，该Fab片段具有低于20nM的对大鼠、小鼠和食蟹猴受体的体外Ki，以及低于5nM的 对人受体的体外Ki。更优选地，该Fab片段的Ki，尤其针对人胰高血糖素受体的，为0. InM 至15nM，最优选1至ΙΟηΜ。本发明的Fab片段或包含该Fab片段人源化单克隆抗体优选具有至少IOOnM的对 人和大鼠胰高血糖素受体的功能性结合亲和力(Kb)。更优选的Fab片段或包含该Fab片段 的人源化单克隆抗体具有至少50nM的，更优选至少IOnM的对这些受体的功能性结合亲和 力。在最优秀的实施方案中，该Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体具有1至 IOnM的对人和大鼠胰高血糖素受体的功能性结合亲和力。在一个特别出人意料的发现中，本申请人注意到体内接触具有本发明该结合性能 的该Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体之后，血清GLP-I以很快的速率增加， 血清血糖(serum blood glucose)以很快的速率降低。为了使这一有利效果最大化，优选该 Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体不显著结合GLP受体，即Ki大于5000nM。序列说明
SEQIDNO1至22表示表1的轻链和1重链CDR
SEQIDNO23至30表示本文所述的优选人构架区域
SEQIDNO31和32是人GluR的氨基酸和cDNA序列
SEQIDNO33和34是大鼠GluR的氨基酸和cDNA序列
SEQIDNO35和36是小鼠GluR的氨基酸和cDNA序列
SEQIDNO37和38是食蟹猴(Cyno)GluR的氨基酸和cDNA序列
SEQIDNO39和40是实施例1 (Abl)的可变区氨基酸序列
SEQIDNO41和42是实施例2(Ab2)的可变区氨基酸序列
SEQIDNO43和44是实施例3 (Ab3)的可变区氨基酸序列
SEQIDNO45和46是实施例4 (Ab4)的可变区氨基酸序列
SEQIDNO45和47是实施例5 (Ab5)的可变区氨基酸序列
SEQIDNO45和48是实施例6 (Ab6)的可变区氨基酸序列
SEQIDNO45和49是实施例7 (Ab7)的可变区氨基酸序列
SEQIDNO50表示优选的K轻链IgG4恒定区。
SEQIDNO51表示优选的重链CHl恒定结构域。
SEQIDNO52表示优选的经修饰人IgG4Fc区。
SEQIDNO53至55表示优选的轻链⑶R。
SEQIDNO56至68表示优选的重链ιCDR。
SEQIDNO59和60是实施例I(Abl)的轻链和·t链蛋白质序列。
SEQIDNO61和62是实施例2(Ab2)的轻链和·t链蛋白质序列。
SEQIDNO63和64是实施例3 (Ab3)的轻链和·t链蛋白质序列。
SEQIDNO65和66是实施例4 (Ab4)的轻链和·t链蛋白质序列。
SEQIDNO65和67是实施例5 (Ab5)的轻链和·t链蛋白质序列。
SEQIDNO65和68是实施例6 (Ab6)的轻链和·t链蛋白质序列。
SEQIDNO65和69是实施例7 (Ab7)的轻链和·t链蛋白质序列。
SEQIDNO70和71是实施例I(Abl)的轻链和·t链DNA序列。
SEQIDNO72和73是实施例2 (Ab2)的轻链和·t链DNA序列。
SEQIDNO74和75是实施例3 (Ab3)的轻链和·t链DNA序列。
SEQIDNO76和77是实施例4 (Ab4)的轻链和·t链DNA序列。
SEQIDNO76和78是实施例5 (Ab5)的轻链和·t链DNA序列。
SEQIDNO76和79是实施例6 (Ab6)的轻链和·t链DNA序列。
SEQIDNO76和80是实施例7 (Ab7)的轻链和·t链DNA序列。
定义 在本文中也称为“GluR”的“胰高血糖素受体”属于G蛋白偶联受体2类家族，其由 长氨基端细胞外结构域、7个跨膜部分和细胞内C端结构域组成。胰高血糖素受体在肝细胞 表面上显著表达，在那里它们结合胰高血糖素并将由此提供的信号转导进细胞内。本领域 中已经分离并公开了编码大鼠和人来源的胰高血糖素受体的DNA序列(EP0658200B1)。也 分离并测序了小鼠和食蟹猴同源物(Burcelin等人，Gene 164(1995)305-310) ；McNally等 A, Peptides 25(2004) 1171-1178)。
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本文中所使用的有关本发明抗体或其Fab片段活性的术语“抑制”表示显著拮抗 胰高血糖素受体生物学活性的能力。此能力由本文所述的[125I]胰高血糖素结合测定所计 算的Ki值反应。本文所用的针对本发明单克隆抗体的术语“人源化”表示具有至少人构架和恒定 区(CL、CH结构域(例如CHI、CH2、CH3)和铰链)以及来源于胰高血糖素受体结合抗体的 CDR的抗体。人构架包含对应于人种系序列以及具有体细胞突变的序列的构架。人构架和 恒定区可以完全是人的，或者可与天然序列相差一个或多个氨基酸取代、末端和中间添加 和缺失，等等。CDR可来源于一个或多个在任何抗体构架的背景中结合本申请中胰高血糖素 特异性受体的CDR。例如，本发明的人源化抗体的CDR可来源于在小鼠抗体构架背景中结合 胰高血糖素受体的CDR，然后经改造结合在人构架背景中结合胰高血糖素受体。术语“单克隆抗体”表示来源于单拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或 噬菌体克隆，并且不表示其产生的方法。优选地，本发明单克隆抗体以纯的或基本上纯的群 体存在。本文所用的针对本发明抗体的术语“体内效力”表示抗体在人或动物模型中赋予 积极生物学效应的能力。优选地，体内效力表示，与对照应答相比，响应于本发明的抗体 而对于显示血糖升高的动物使葡萄糖正常化的作用。患糖尿病的Zucker糖尿病肥胖大 鼠(ZDF)模型(Horm Metab Res. 2005年2月；37 (2) :79_83)可适用于评估体内效力，其 中体内效力优选表示动物暴露于< 30mg/kg剂量的本发明人源化抗体后100%血糖正常 化。更优选地，体内效力表示动物暴露于< 15mg/kg剂量的抗体后100%血糖正常化，优选 ^ 10mg/kg剂量的抗体后100%血糖正常化，更优选0. 1至5mg/kg剂量的抗体后100%血 糖正常化。在最优选的实施方案中，体内效力用来表示在糖尿病ZDF大鼠模型中动物暴露 于1至3mg/kg剂量的本发明人源化抗体后100%血糖正常化。术语“葡萄糖正常化”表示ZDF大鼠模型中血浆葡萄糖值低于120mg/dL，优选110 至 120mg/dL 的范围内。可根据 Etgen 等人，(Metabolism 2000 ；49(5) :684_688)测定血浆 葡萄糖，或者根据 D，Orazio 等人(Clin. Chem. Lab. Med. 2006 ；44 (12) 1486-1490)由全血
葡萄糖浓度转化计算得出。本文使用的“Fab片段”表示在可变区内的抗体分子的部分，其含有轻链和重链 CDR以及除了 CL和CHl结构域之外的构架序列的氨基酸残基。重链的3个⑶R在本文中称为“⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3 ”，轻链的3个⑶R称为 “CDRL1、CDRL2和CDRL3”。每个结构域的氨基酸分配(assignment)根据公知规定(Kabat φ A, Ann. NY Acad. Sci. 190 382-93 (1971) ；Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991))。抗原结合结构域或者抗原结合结构域的CDR可来源于 其他非人物种，包括但不限于兔、小鼠、大鼠或仓鼠(hamster)。本发明人鉴定了可联合用于制备抗体Fab片段的重链和轻链⑶R序列，其表现出 特别高的小鼠、大鼠、食蟹猴和人来源的胰高血糖素受体亲和力。FAb片段优选包含；(i)轻链 CDRLl :S X S S S V S Y X1 HSEQ ID NO 53(ii)轻链 CDRL2 :T T S X2 L A HSEQ ID NO 54(iii)轻链 CDRL3 :X3 X4 R S T X5 P P TSEQ ID NO 55
(iv)重链 CDRHl :G D D I T S G Y X6 X7SEQIDNO56
(ν) 1!链 CDRH2 :Υ I S Y S G S T X8Y X9P S L K SSEQIDNO57
(vi)重链 CDRH3 :P P X10 Y Y G F G P Y A X11 D YSEQIDNO58其中
X = Y或 AX6=W或H
X1 = M 或 IX7=N、D 或 E
X2 = N 或 YV=Y、Q、S或 V
X3 = Q 或 LX9=N、S 或 I
X4 = Q 或 WXlO=G或A
X5 = L 或 IXll=M或L
优选地，本发明的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体包含下列CDR最优选地，X为Y或A A1为I ;X2为Y ;X3为Q或L ;X4为Q或W ;X5为L或I ;X6为 W或H ;X7为D或E ;X8为Y、Q、S或V ;X9为S ；X10为G或A ；X11为L。更优选地，X为A夂为 I ;X2 为 Y ；X3 为 Q ;X4 为 Q ;X5 为 L ;X6 为 H ;X7 为 D 或 E ;X8 为 Y、Q 或 S ；X9 为 S ；X10 为 G 或 A ； X11 为 L0
序列
CDRLl 1 2 S A
CDRL2 1 2 T T
CDRL3 1 2 Q Q
CDRHl 1 2 G D
CDRH2 1 2 Y I
CDRH3 1 2
3 4 S S 3 4 S Y 3 4 R S 3 4 D I 3 4 S Y 3 4 G Y
5 6 7 8 9 10 SVSYIH 5 6 7 LAH 5 6 7 8 9 TLPPT 5 6 7 8 9 10 TSGYHD 5 6 7 8 9 10 SGSTYY 5 6 7 8 9 10 YGFGPY
个、两个或三个选自下列的氨基酸取代
11121314SPSL11121314ALDY
K S
P P
其中该Fab片段具有 CDRLl :A2Y、I9M ； CDRL2 :Υ4Ν ； CDRL3 :Q1L、Q2W、L6I ； CDRHl :H9W、D10E、D10N； CDRH2 :Y9Q、Y9S、Y9V、S11N、S11I ； CDRH3 :G3A、L12M。
更优选地，该Fab片段包含一个、两个或
-水
卜氨基酸取代，其选自⑶RHl =DlOE ；
CDRH2 :Y9Q、Y9S ；CDRH3 :G3A。 本发明的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体优选包含选自下列的 CDR
⑴具有 SEQ ID NO 2 的 CDRLl ；SEQ ID NO 4 的 CDRL2 ；SEQ IDNO 7 的 CDRL3 的 轻链；和具有 SEQ ID NO 11 的 CDRHl ；SEQ ID NO 15 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 21 的 CDRH3 的
重链；(ii)具有 SEQ ID NO 1 的 CDRLl ；SEQ ID NO 4 的 CDRL2 ；SEQ IDNO 6 的 CDRL3 的 轻链；和具有 SEQ ID NO 10 的 CDRHl ；SEQ ID NO 16 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 20 的 CDRH3 的
重链；(iii)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQID NO 8 的 CDRL3 的轻链；和具有 SEQ ID NO 11 的 CDRHl ；SEQ IDNO 15 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 21 的 CDRH3 的
重链；(iv)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQ IDNO 6 的 CDRL3 的 轻链；和具有 SEQ ID NO 12 的 CDRHl ；SEQ ID NO 15 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 21 的 CDRH3 的
重链；(ν)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQ IDNO 6 的 CDRL3 的 轻链；和具有 SEQ ID NO 12 的 CDRHl ；SEQ ID NO 17 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 21 的 CDRH3 的
重链；(vi)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQ IDNO 6 的 CDRL3 的 轻链；和具有 SEQ ID NO 12 的 CDRHl ；SEQ ID NO 15 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 22 的 CDRH3 的 重链；以及(vii)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQ IDNO 6 的 CDRL3 的轻链；和具有 SEQ ID NO 13 的 CDRHl ；SEQ ID NO 18 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 22 的 CDRH3
的重链。尤其希望，本发明的抗体在低血浆浓度下显示体内效力。在ZDF大鼠模型中，应在 30mg/kg剂量下，优选低于15mg/kg，更优选低于5mg/kg，再优选0. 1至5mg/kg范围内，观察 到体内效力。最优选地，本发明抗体以约1至3mg/kg的剂量在ZDF大鼠模型中实现100% 葡萄糖正常化。已经发现，尤其优选的本发明抗体能够在3mg/kg的低剂量下在ZDF大鼠模 型体内显示100%葡萄糖正常化。因此本发明优选包含Fab片段或含有该Fab片段的人源 化单克隆抗体，其中该Fab片段包含(i)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQ IDNO 6 的 CDRL3 的 轻链；和具有 SEQ ID NO 12 的 CDRHl ；SEQ ID NO 15 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 21 的 CDRH3 的
重链；(ii)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQ IDNO 6 的 CDRL3 的 轻链；和具有 SEQ ID NO 12 的 CDRHl ；SEQ ID NO 17 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 21 的 CDRH3 的
重链；(iii)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQID NO 6 的 CDRL3 的轻链；和具有 SEQ ID NO 12 的 CDRHl ；SEQ IDNO 15 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 22 的 CDRH3 的
重链；或者(iv)具有 SEQ ID NO 3 的 CDRLl ；SEQ ID NO 5 的 CDRL2 ；SEQID NO 6 的 CDRL3 的 轻链；和具有 SEQ ID NO 13 的 CDRHl ；SEQ IDNO 18 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 22 的 CDRH3 的重链。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克 隆抗体，其中该Fab片段包含具有SEQ ID NO 3的CDRLl ；SEQ ID NO :5的CDRL2 ;SEQ ID NO 6 的 CDRL3 的轻链；以及具有 SEQID NO 12 的 CDRHl ；SEQ ID NO 17 的 CDRH2 ；SEQ ID NO 21的⑶RH3的重链。已经发现，包含此实施方案的Fab片段的抗体与该类型中其他类 似抗体相比，在长时期内保持体内效力中具有特别有利的性能。本发明的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体优选包含人来源的轻 链和重链可变构架区。此外，多种不同的人构架序列可单独或组合用于本发明人源化免 疫球蛋白的基础。优选地，本发明Fab片段或人源化单克隆抗体的构架区是人来源的或者 基本上人来源的(至少95%、97%或99%人来源)。人来源构架区的序列可经由其网址 http://imgt. cines. fr/textes/IMGTindex/FR. html ^tH g ImMunoGenetics(IMGT) 得自 Marie-Paule Lefranc，Gerard Lefranc,Academic Press2001, ISBN 012441351 的The immunoglobulin Factsbook0 例如种系轻链构架区可选自A11、A17、A18、A19、A20、A27、 A30、LI、L1I、L12、L2、L5、L15L6、L8、012、02 和 08，种系重链构架区可选自VH2_5、VH2-26、 VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH 1-18, VH 1-69, VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和 VH5-5I。本文公开的特异性抗体可用作模板或亲本抗体以制备其他本发明抗体。在一种方 法中，亲本抗体CDR嫁接于与该亲本抗体构架具有高序列同一性的人构架。新构架的序列 与亲本抗体对应构架的同一性一般为至少80%、至少85%或至少90%。此嫁接物可导致与 亲本抗体相比结合亲和力降低。如果是这种情况，则根据Queen等人，[Queen，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,2869(1991)]公开的特定标准，在某些位置将该构架回复突变为亲 本构架。可使用的其他方法包括，例如Jones等人，Nature, 321 =522(1986) ；Riechmann等 人，Nature, 332 :323_327 (1988) ；Verhoeyen 等人，Science, 239 1534 (1988)。最优选地，本发明的Fab片段或包含该Fab片段的人源化单克隆抗体包含下列轻 链构架(FR)序歹Ij =FRlSEQ ID NO 23 ；FR2 SEQ ID NO 24 ；FR3SEQ ID NO 25 ；FR4SEQ ID NO 26 ；以及重链可变构架序列:FR5SEQ ID NO 27 ；FR6SEQ ID NO 28 ；FR7SEQ ID NO 29 ； FR8SEQ IDNO 30 ；其中轻链可变序列排列为 FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4 以及重 链可变序列排列为 FR5-CDRH1-FR6-CDRH2-FR7-CDRH3-FR8。本申请人出人意料地发现，在通过使用体外竞争性胰高血糖素结合测定预测胰高 血糖素受体拮抗性抗体体内效力时，Fab片段的亲和力的确与体内效力正相关。相反地，完 全抗体与胰高血糖素受体的结合亲合力(Ki)不一定是体内效力的有效预测物。因此，制备 具有本文所追求的有利性能的单克隆抗体的方法优选地包括选择在使用异源表达的胰高 血糖素受体基因的体外竞争性胰高血糖素结合测定中，以低于50nM的Ki与每个胰高血糖 素受体结合的Fab片段。更优选地，该方法包括选择具有低于30nM的对每种胰高血糖素受 体的体外Ki的FAb片段，更优选低于20nM，更优选ΙΟηΜ。更优选地，通过低于20nM的针对 大鼠、小鼠和食蟹猴受体的体外Ki以及低于5nM的针对人受体体外Ki选择该Fab片段。更 优选地，所选Fab片段的Ki，尤其针对人胰高血糖素受体的，为0. InM至15nM，最优选1至 IOnM0然后，可将此方法鉴定的Fab片段适当地表达为完整抗体，用以通过本领域中通常已 知方法的治疗性用途。应了解，应用本发明的教导，本领域技术人员可使用常规方法，例如位点定向诱变，以取代本文公开的特定CDR和构架序列中的氨基酸，在这种情况下产生来源于本文提 供的序列的其他可变区氨基酸序列。可将最多全部20种可选天然氨基酸引入特定取代位 点。然后，本文上述定义的体外选择方法可适当地用于筛选这些附加可变区氨基酸序列，以 得到具有所要求保护的交叉反应性的Fab片段和指示体内效力的本申请人已发现的体外 Ki。以这种方法，鉴定适于根据本发明制备人源化抗体的其他Fab片段。优选地，在本文公 开的一个或每个骨架序列中，构架中的氨基酸取代限于一个、两个或三个位置。优选地，在 一个或每个⑶R中，⑶R中的氨基酸取代限于一至三个位置，更优选进行一个或每个⑶R中 一个或两个氨基酸位置的取代。另外优选地，在重链可变区的CDR中的一个或两个氨基酸 位置进行氨基酸取代。最优选地，在CDRH2中的一个或两个氨基酸位置进行氨基酸取代。使用本文所示抗体作为亲本抗体，将CDR与构架取代相组合以制备本发明的可选 抗体的合适方法由Wu等人，J. Mol. Biol.，294 151-162提供。如本文所使用的，免疫球蛋白的Fc部分指两个重链的抗体恒定区，其通过非共价 相互作用和二硫键相连。Fc部分可包含绞链区，并通过CH2和CH3结构域扩展到抗体的C 端。Fc部分还可包含一个或多个糖基化位点。本发明的单克隆抗体可具有选自任意免疫 球蛋白类型IgA、IgD、IgG、IgM和IgE的重链恒定区。优选地，本发明抗体含有来源于人 IgG4Fc区域的Fc部分，因为与其他IgG亚类相比其结合和补体因子的能力降低。更优选地， 本发明抗体的IgG4Fc区域含有进一步降低效应子功能的取代[Issacs等人，(1996)Clin. Exp. Immunol. 106 :427_433]。这些取代可选自233位残基的脯氨酸取代谷氨酸、234位残 基的丙氨酸或缬氨酸取代苯丙氨酸、以及235位残基的丙氨酸或谷氨酸取代亮氨酸(EU编 号，Kabat,E.A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版 U. S. Dept. of Health and Human Services,Bethesda,MD,NIH Publication no. 91-3242)。 这些残基对应于SEQ ID NO 52的15、16和17位以及SEQ IDNO 67的235、236和237位。 另外，通过在297位残基(EU编号)用Asn取代Ala去除IgG4Fc区域中的N连接糖基化位 点，其对应于SEQ IDNO 52的79位，这是确保在人源化抗体背景中去除残余效应子活性的 另一个方法。另外，用于本发明人源化单克隆抗体的IgG4Fc部分优选含有稳定重链二聚体形 成并防止形成半_IgG4Fc链的取代。此构建物由下列组成由脯氨酸取代的228位的丝氨 酸(EU编号)(SEQ ID NO 52中的第10位氨基酸残基)。本文该抗体的IgG4衍生的Fc部 分中还可缺失天然分子中存在的C端赖氨酸残基(SEQ ID NO 52的229位；缺失的赖氨酸 称为des-K)。最优选的IgG4Fc部分由SEQ ID NO 67的221位至448位氨基酸提供。本发明还涉及编码本发明抗体的分离核酸序列；包含该核酸的一个或多个载体， 任选有效连接转化了该载体的宿主细胞识别的控制序列；包含该载体的宿主细胞；产生本 发明抗体或Fab片段的方法，其包括培养宿主细胞使得该核酸表达，以及任选地从宿主细 胞培养基回收抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明Fab片段或人源化单克隆抗体的 药物组合物。本发明的药物组合物还可包含可药用载体。在该药物组合物中，本发明的Fab 片段或人源化单克隆抗体是活性成分。优选地，该药物组合物包含纯的或基本上纯的本发 明Fab片段或人源化单克隆抗体的群体。用于治疗用途的组合物是无菌的，可以冻干，任选 地与合适稀释剂一起提供。
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本发明的另一个实施方案包括宿主细胞或细胞培养物，其为下列的接受者 (receptor)本发明任何分离多核苷酸或者包含编码本发明HCVR、LCVR、单克隆抗体或Fab 片段的序列的任何一个或多个重组载体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，由于天然、 偶然或有意突变和/或变化，该后代不一定是与初始母细胞完全相同的(形态或总DNA补 体)。宿主细胞包括用一个或多个重组载体或表达本发明单克隆抗体或其轻链或重链的多 核苷酸体内或体外转化、转导或感染的细胞。包含本发明重组载体的宿主细胞(有或没有 稳定引入宿主染色体)也可称为“重组宿主细胞”。用于本发明的优选宿主细胞是CHO细 胞、NSO细胞、HeLa、SP2/0细胞或COS细胞。用于本发明的其他宿主细胞包括植物细胞、酵 母细胞、其他哺乳动物细胞和原核细胞。本发明涵盖产品，其包括包装材料和在该包装材料内包含的本发明Fab片段或人 源化单克隆抗体，其中该包装材料包括包装说明书，其显示该Fab片段或人源化单克隆抗 体在患者体内中和GluR或降低GluR活性水平。牛物学测定胰高血糖素警体(GlucR)膜制备从表达克隆人、小鼠、食蟹猴或大鼠胰高血糖素受体的293HEK细胞制备用于结合 研究的膜制备物。每个克隆细胞系首先以悬浮培养物形式培养，冷冻的细胞沉淀重悬于4°C 下的膜制备物缓冲液，其由25mM Tris, pH7. 5, ImM MgCl2, CompleteK无EDTA蛋白酶抑制剂 片(Roche AppliedScience)禾口 20U/ml DNase I (Sigma Chemical Company)组成。用电动 特弗隆玻璃Potter-Elvehjem勻浆器，使用25个冲程(stroke)对细胞进行勻浆，然后以 1800x g在4°C离心15分钟。收集上清，将沉淀重悬于膜制备缓冲液中，再次勻浆和离心。 将第二次上清与第一次上清合并，以1800x g再次离心15分钟至澄清。将澄清的上清转移 到高速离心管，以25000x g在4°C下离心30分钟。膜沉淀(P2)重悬于膜制备缓冲液(无 DNA酶)，将其等分，在干冰上速冻并保存于-80°C待用。使用闪烁亲近测定法(ScintillationProximity Assay, SPA)的 ￡mI]胰高血糖
素结合调整竞争性受体/配体结合实验以适于闪烁亲近测定法(SPA)形式。在透明 底的不透明96孔微板进行孵育。将化合物在结合缓冲液中连续稀释3倍，该缓冲液由 下列组成25mM Hepes, pH 7. 4,2. 5mM CaCl2, ImMMgCl2,0· 1 % 无脂肪酸 BSA，0· 003 % 吐 温-20和CompleteK无EDTA蛋白酶抑制剂片。在来自每种受体制备物的结合缓冲液中稀 释P2膜(如上制备)，然后添加至稀释的化合物，之后添加0. 15mg的麦胚凝集素(WGA) SPA珠(GE Healthcare)，其之前用1 %无脂肪酸BSA封闭，以及0. 15nM[125I]-胰高血糖素 (Perkin-Elmer) 0用粘合密封带密封平板，颠倒混合，在室温下孵育12小时。在PE Life and Analytical Sciences Trilux Microbeta平板闪烁计数器上对与受体结合的放射性 (非常接近于WGA SPA珠)进行定量，表示为每分钟计数(CPM)。测定不加入化合物情况下 的总结合，通过加入IuM胰高血糖素(Lilly Research Labs)测定非特异性结合。IuM终浓 度的无标记胰高血糖素能够完全抑制[125I]-胰高血糖素结合至背景水平。rmn胰高血糖素结合数据分析通过用各个CPM值减去非特异性结合并除以总结合信号将化合物浓度曲线的原 始CPM数据转换为百分比抑制，也针对非特异性结合进行修正。使用四参数(曲线最大值、曲线最小值、IC5tl、峰斜率)非线性回归规则(XLFit版本3. 0 Activity Base, IDBS)分析 数据。在每个接受物种的测定中，根据方程[Ki = IC5tl/(1+D/Kd)]从绝对IC5tl值计算由竞 争剂抑制放射性配体结合确定的平衡解离常数Ki，其中D等于实验中所用放射性配体的浓 度，Kd等于[125I]胰高血糖素平衡结合亲和常数。胰高血糖素刺激cAMP功能件拮抗剂测定使用相同克隆大鼠、小鼠、食蟹猴和人胰高血糖素接受者-293HEK细胞系，由亚最 大剂量胰高血糖素对细胞内cAMP增加的剂量依赖性抑制确定功能性拮抗剂活性。用来自 Perkin Elmer(6760625R)的扩增荧光接近勻菜测定(α 筛选)(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay,Alpha Screen)进行细胞内 cAMP 水平的定量。简言之,细 胞内产生的cAMP与生物素化cAMP-链霉亲和素涂布的供体珠竞争与涂布的抗cAMP抗体受 体珠的结合。随着细胞内cAMP水平的增加，破坏受体珠-生物素化cAMP-供体珠复合物的 出现。在含有Mg+2和Ca+2的HBSS中的IOmMH印es，pH 7. 4和0. 25mM IBMX中进行功能性 测定。以2500个细胞/孔和来自试剂盒的1单位/孔生物素化cAMP以20ul总体积悬浮 克隆胰高血糖素接受者-293HEK细胞。在室温下将细胞与20ul 3倍连续稀释的化合物或 用作标准曲线的3倍连续稀释的cAMP —起预孵育。通过添加20ul300pM胰高血糖素(3X) 开始反应，此剂量足以产生90 %的最大细胞内cAMP。室温下避光60分钟后，通过加入30ul 裂解缓冲液停止反应，该缓冲液由含有每孔各1单位试剂盒供体和受体珠的IOmM Hepes, ρΗ7· 4中的1% IGEPAL CA630 (Sigma)和0. 1 %无脂肪酸BSA(Gibco)制成。将平板包在铝 箔中，以使得供体和受体珠避光，在Titertek摇床上以中速混合30秒。在室温下孵育过夜 后，在Packard Fusion -α设备上读取平板。功能性cAMP活性的数据分析根据cAMP标准曲线将α筛选单位转换为每孔产生的皮摩尔cAMP。将化合物存在 时产生的皮摩尔cAMP转换为单独使用亚最大剂量胰高血糖素的最大应答％。在每个实验 中，确定产生皮摩尔cAMP的50%应答所需的胰高血糖素浓度。此EC50浓度用于将批次间 结果归一化为Kb，其中Kb = (EC50化合物)/[1+(所用的pM胰高血糖素/以pM计的胰高 血糖素剂量应答的EC50)]。使用四参数(曲线最大值、曲线最小值、IC5tl、峰斜率)非线性 回归规则(XLFit版本3. 0 Activity Base, IDBS)分析数据。
实施例如本领域已知的制备并纯化抗体实例Ab-l、Ab-2、Ab-3、Ab-4、Ab-5、Ab_6和Ab_7。 用使用最佳预定轻链/重链载体比分泌抗体的表达系统或者编码轻链(在SEQ ID N0:70、 72、74、76中显示)和重链(在SEQ ID NO :71、73、75、77、78、79、80中显示)的单一载体系 统瞬时或稳定转染合适宿主细胞，例如HEK 293 EBNA或CH0。使用许多常用方法中的任意 方法纯化抗体分泌入其中的澄清培养基。例如，可便利地将培养基应用到已用适合缓冲液 例如磷酸缓冲盐水(PH7. 4)平衡的A蛋白或G蛋白Sijpharose FF柱。清洗该柱，以除去非 特异性结合成分。洗脱所结合的抗体，例如，通过PH梯度(例如0. IM磷酸钠缓冲液，pH 6.8 至0. IM柠檬酸钠缓冲液pH 2.5)。检测抗体级分，例如通过SDS-PAGE，然后汇集。根据预 定用途，任选地进行进一步纯化。可使用常见方法浓缩和/或除菌过滤抗体。可通过常见 方法有效除去可溶聚集体和多聚体，所述方法包括大小排阻层析、疏水性相互作用层析、离子交换层析或羟磷灰石层析。在这些层析步骤之后，抗体的纯度大于99%。可立即将产物 冷冻于70°C，或者冻干。在大肠杆菌中实现Fab表达，其中Fab分子分泌进周质空间。通过渗透休克破坏 细胞壁，在IMAC柱上纯化含有His标签的Fab。表1给出了本发明抗体实例中所用的CDR组合。完整抗体轻链将下述间隔三 个轻链⑶R的轻链构架序列和轻链恒定区(SEQ ID N0:53)相组合；构架1(SEQ ID NO 23) -CDRLl-构架 2 (SEQ ID NO 24) -CDRL2-构架 3 (SEQ ID NO 25) -CDRL3-构架 4 (SEQ ID NO 26) ο重链构架序列间隔三个重链CDR，构架5 (SEQ ID NO 27)-CDRHl-构架6 (SEQ ID N0:28)-CDRH2-构架7(SEQ ID NO :29)-CDRH3-构架 8 (SEQ ID NO :30)，随后是重链 CHl 恒 定区(SEQ ID NO :51)，之后是Ab的Fc结构域，在Fab片段中不含(SEQ ID N0:52，其中Xltl =P ；Xi5 = E ；X16 = A ；X17 = A ；X79 = N ；X229 =无)。表1:
权利要求
Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab片段能够结合人、大鼠和小鼠胰高血糖素受体，并以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与各个受体的结合。
2.根据权利要求1的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所述Fab 片段以低于50nM的Ki抑制胰高血糖素与食蟹猴胰高血糖素受体结合。
3.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所 述Fab片段包含⑴轻链 CDRLl :S XSSSVSY X1 H(ii)轻链CDRL2 :T T S X2 L A H(iii)轻链CDRL3 :X3 X4 R S T X5 P P T(iv)重链CDRHl :G D D I T S G Y X6X7 (ν)重链 CDRH2 :Υ I S Y S G S T X8Y X9P S L K S (vi)重链 CDRH3 :P P X10 Y Y G F G P Y A X11 D Y 其中X=Y或AX6 = W 或 HXi=M或IX7 = N、D 或 EX2=^YX8 = Y、Q、S 或 VX3=Q或LX9 = N、S 或 IX4=Q或WX10 = G 或 AX5=WlX11 = M 或 L0
4.根据权利要求3的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中X= AX6 = HXI= IX7 = D 或 E X2 = Y X8 = Y、Q 或 S X3 = Q X9 = SX4 = QXlO = G 或 AX5 = LXll = L。
5.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所 述Fab片段包含下列⑶R序列CDRLl 123456789 10 SASSSVSYIH CDRL2 12 3 4 5 6 7 TTSYLAH CDRL3 123456789 QQRSTLPPT CDRHl 123456789 10 GDDITSGYHD CDRH2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 YISYSGSTYY S P S L K S CDRH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14SEQ ID NO 53 SEQ ID NO 54 SEQ ID NO 55 SEQ ID NO 56 SEQ ID NO 57 SEQ ID NO 58PPGYYGFGPY A L D Y 其中所述Fab片段具有选自下列的一个、两个或三个氨基酸取代 CDRLl :A2Y、I9M ； CDRL2 :Υ4Ν ； CDRL3 :Q1L、Q2W、L6I ； CDRHl :H9W、D10E、D10N ； CDRH2 :Y9Q、Y9S、Y9V、S11N、S11I ； CDRH3 :G3A、L12M。
6.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所 述Fab片段包含⑴轻链 CDRLl :SASSSVSYIH(ii)轻链CDRL2 :T T S Y L A H(iii)轻链CDRL3 :QQRSTLPPT(iv)重链CDRHl :GDDITSGYHD (ν)重链 CDRH2 :YISYSGSTYYSPSLKS (vi)重链 CDRH3 :PPGYYGFGPYALDY(SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 6) (SEQ ID NO 12) (SEQ ID NO 15) (SEQ ID NO :21)。
7.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所 述Fab片段包含(i)轻链 CDRLl :SASSSVSY][H(SEQIDNO3)(ii)轻链 CDRL2 :T T S Y L A H(SEQIDNO5)(iii)轻链 CDRL3 :Q Q R S T L P )τ(SEQIDNO6)(iv)重链 CDRHl :G D D I T S G YH D(SEQIDNO12)(ν)重链 CDRH2 :YISYSGSTQYSPSLKS(SEQIDNO=17)(vi)重链 CDRH3 :PPGYYGFGPYALDY(SEQIDNO21)。
8.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人述Fab片段包含⑴轻链 CDRLl :SASSSVSY][H(SEQIDNO3)(ii)轻链 CDRL2 :T T S Y L A H(SEQIDNO5)(iii)轻链 CDRL3 :Q Q R S T L P )τ(SEQIDNO6)(iv)重链 CDRHl :G D D I T S G YH D(SEQIDNO12)(ν)重链 CDRH2 :YISYSGSTYYSPSLKS(SEQIDNO15)(vi)重链 CDRH3 :PPAYYGFGPYALDY(SEQIDNO22)。
9.根据权利要求1或2的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体，其中所 述Fab片段包含⑴轻链 CDRLl :SASSSVSYIH(ii)轻链CDRL2 :T T S Y L A H(iii)轻链CDRL3 :QQRSTLPPT(iv)重链CDRHl :GDDITSGYHE (ν)重链 CDRH2 :YISYSGSTSYSPSLKS(SEQIDNO3)(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)(SEQIDNO13)(SEQIDNO18)(vi)重链 CDRH3 :PPAYYGFGPYALDY(SEQ ID NO 22)。
10.根据权利要求1至9中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆 抗体，其中所述Fab片段包含轻链可变构架区构架ISEQID NO 23 ；构架2SEQ ID NO 24 ； 构架3SEQ ID NO 25 ；构架4SEQID NO 26 ；和重链可变构架区构架5SEQ ID NO 27 ；构架 6SEQ IDNO 28 ；构架 7SEQ ID NO 29 ；构架 8SEQ ID NO :30。
11.人源化单克隆抗体，其包含(i)SEQID NO 65的两条轻链和SEQ ID NO 66的两条重链；(ii)SEQID NO 65的两条轻链和SEQ ID NO 67的两条重链；(iii)SEQID NO 65的两条轻链和SEQ ID NO 68的两条重链；或(iv)SEQID NO 65的两条轻链和SEQ ID NO 69的两条重链。
12.包含核酸序列的载体，所述核酸序列编码权利要求1至11中任一项的Fab片段或 包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体。
13.包含异源多核苷酸序列的宿主细胞，所述异源多核苷酸序列编码权利要求1至11 中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗体。
14.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含所 述Fab片段的人源化单克隆抗体，以及可药用赋形剂。
15.治疗I型或II型糖尿病或在人体中实现重量减轻的方法，其中所述方法包括向有 此需要的人患者施用有效量的根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含所述Fab 片段的人源化单克隆抗体。
16.根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含所述Fab片段的人源化单克隆抗 体，其用作药物。
17.根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含Fab片段的人源化单克隆抗体， 其用于治疗I型或II型糖尿病或者实现在人体中减轻重量。
18.根据权利要求1至11中任一项的Fab片段或包含Fab片段的人源化单克隆抗体在 制备用于治疗I型或II型糖尿病，或者实现在人体中减轻重量的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及胰高血糖素受体多肽拮抗剂，其抑制激素胰高血糖素与其受体的结合。更具体地，本发明涉及抑制胰高血糖素与其受体结合的高亲和力胰高血糖素受体抗体或其Fab片段，以及它们用于治疗或预防哺乳动物物种中II型糖尿病(NIDDM)以及相关疾病的用途。
文档编号A61K39/395GK101983208SQ200980110713
公开日2011年3月2日 申请日期2009年3月17日 优先权日2008年3月27日
发明者A·I·科里特科, B·J·翁代克, R·L·小米利肯 申请人:伊莱利利公司