持续释放的含有泊洛沙姆的药物组合物的制作方法

专利名称：持续释放的含有泊洛沙姆的药物组合物的制作方法
持续释放的含有泊洛沙姆的药物组合物交叉引用本申请要求2008年2月22日提交的流水号为12/036,139的美国专利申请的优先 权，所述申请以引用的方式全文纳入本文中。
背景技术：
本发明涉及热敏性、热可逆性药物组合物。具体地，本发明涉及由泊洛沙姆 (poloxamer)配制而成的持续释放的、可凝胶化(热敏性)的肉毒毒素药物组合物。药物组合物是含有至少一种活性成分(例如肉毒毒素)以及例如一种或多种赋 形剂、缓冲剂、载体、稳定剂、防腐剂和/或填充剂并适于对患者给药以达到所需的诊 断结果或治疗效果的制剂。本文公开的药物组合物具有诊断、治疗、美容和/或研究用 途。为储存稳定和使用方便，可将药物组合物配制成可在对患者给药前用合适的流 体——例如盐水或水——重溶的冻干(即冷冻干燥)或真空干燥的粉末。或者，可将所 述药物组合物配制成即用水溶液或悬浮液。药物组合物可含有蛋白质活性成分。遗憾的 是，蛋白质活性成分非常难以稳定(即保持在生物活性损失最小的状态下)，从而导致在 含蛋白药物组合物的配制、重溶(如果需要)过程中以及在其使用之前的储存过程中蛋白 的损失和/或蛋白活性的损失。稳定问题可因蛋白的变性、降解、二聚作用和/或聚合 作用而产生。多种赋形剂例如白蛋白和明胶已被用于尝试稳定药物组合物中存在的蛋白 活性成分，并取得了不同程度的成功。此外，冷冻保护剂例如醇已用于在冻干的冷冻条 件下减少蛋白变性。热敏性药物组合物——其形成原位凝胶——是已知的。参见例如美国专利 5,278,201。泊洛沙姆是聚(环氧乙烷)、聚(环氧丙烷)和聚(环氧乙烷)的无毒嵌段 共聚物(PEO-PPO-PEO)。某些泊洛沙姆表现出可逆的热凝胶化。因此，在低温下配制 并注射的蛋白和泊洛沙姆的溶液会在温度升至体温时形成凝胶。随后，所述蛋白从所述 凝胶中缓慢释放出来。已用模型蛋白药物α “胰凝乳蛋白酶和乳酸脱氢酶制备了包含22 重量％浓度的泊洛沙姆407的可凝胶化、热可逆性制剂(Stratton L.，etal.，Drag delivery matrix containing native proteinprecipitates suspended in a poloxamer gel, J Pharm Sci 86 (9)； 1006-1010，September 1996)。已经制备了某些黏附蛋白和泊洛沙姆127的制剂。(Huang K., et al.，Synthesis and characterization of self assembling blockcopolymers containing adhesive moieties, Polymer Preprints 2001, 42(2)，147-148)。此外，泊洛沙姆 188 和 泊洛沙姆407已被用作蛋白药物组合物中的赋形剂。(Jeong B.，et al., Thermosensitive sol-gel reversiblehydrogels，Adv Drug Del Rev, 54(1) ； 37-51, January 17, 2002)。公布 的专利申请WO 2007/041664公开了包含肉毒毒素和泊洛沙姆188的药物组合物的应用。肉毒毒素已用于多种治疗和美容目的，包括治疗颈部张力障碍、眼睑痉挛、斜 视、痉挛、头痛、多汗症、膀胱过动症、鼻炎、夜磨牙症、前列腺肥大、弛缓不能、肛 门痉挛、Oddi括约肌功能失常、痤疮、震颤、小儿脑瘫、面部皱纹。
市售的含肉毒毒素的药物组合物包括可购自美国加利福尼亚州欧文的阿勒根公 司的、100单位小瓶分装并在用前需用0.9%氯化钠重溶的冻干粉末形式的BOTOX (A 型肉毒毒素神经毒素与人血清白蛋白和氯化钠的复合物)；可购自英国伯克郡的易普森 公司的、用前需用0.9%氯化钠重溶的粉末形式的DYSPORT (包含肉毒杆菌A型毒 素凝血素与人血清白蛋白和乳糖的复合物的制剂)；和MYOBLOC (—种可购自美国加 利福尼亚州南圣弗朗西斯科的Solstice Neurosciences公司的、包含B型肉毒毒素、人血清 白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠且pH为约5.6的注射液)。肉毒毒素是一种用于加入到药物制剂中的大分子蛋白(A型肉毒毒素复合物的分 子量为900kD)，并具有易破坏和不稳定的固有性质。所述毒素复合物的大小使其比较小 的、复合程度低的蛋白更易被破坏和不稳定，由此，如要维持肉毒毒素稳定性，就要对 制剂进行复合制备并解决这些问题。因此，肉毒毒素稳定剂必须能够与所述毒素以不使 所述毒素分子变性、分裂或解毒，或者导致所述毒素复合物中的非毒素蛋白解离的方式 相互作用。作为已知最致命的生物学产品，在制备含肉毒毒素的药物组合物的所有步骤中 都要强调异常安全性、精确度和准确度。因此，肉毒毒素稳定剂自身不应具有毒性或难 以使用，从而不加重已经很严格的含肉毒毒素的药物组合物的配制要求。由于肉毒毒素是第一种(由美国食品和药物管理局在1989年)批准用于注射 以治疗人类疾病的微生物毒素，因此必须开发用于肉毒毒素的培养、大量生产、药物制 剂的制备和应用的特殊方案，并必须获得批准。重点考虑的是用于注射的毒素纯度和剂 量。必须进行培养生产和纯化，从而使所述毒素不与任何可能(即使以痕量)污染最终产 物并导致患者出现异常反应的物质接触。这些限制要求在不使用动物肉制品的简单培养 基中培养，并通过不涉及合成溶剂或树脂的方法纯化。使用酶、各种交换剂——例如存 在于色谱柱和合成溶剂中的那些——制备毒素可导致污染并因此不属于优选配制步骤。 此外，A型肉毒毒素在40°C以上的温度下易于变性，在气/液界面上形成气泡时丧失毒 性，并在氮气或二氧化碳的存在下变性。稳定A型肉毒毒素尤其困难，因为A型肉毒毒素由分子量约150kD的毒素分子 与分子量约750kD的非毒素蛋白非共价结合构成。所述非毒素蛋白被认为保持或帮助稳 定毒性赖以存在的二级或三级结构。用于稳定非蛋白或相对较小蛋白的方法或方案不适 于解决肉毒毒素复合物——例如所述900kD A型肉毒毒素复合物的一一稳定化所固有的 问题。因此尽管所述A型毒素和非毒素蛋白在pH 3.5-6.8非共价结合在一起，然而在弱 碱性条件(pH > 7.1)下，肉毒毒素中非常不稳定的约150kD的神经毒性组分会从所述肉 毒毒素复合物中释放出来。Xeomin 是Merz Pharmaceuticals(德国、法兰克福)出售的 一种含有神经毒素组分A型肉毒毒素的药物组合物的商标名。在某些实例中，已知肉毒毒素在用作治疗药物时以不同速度和距离从注射位置 转移，有时导致在目标肌肉中失去作用。固体肉毒毒素植入物是已知的。参见例如美国专利6,306,423、6,312,708中示例 性固体植入物和应用的讨论。此外，肉毒毒素在粘性载体例如透明质酸中的制剂也是已 知的(2007年12月12日提交的流水号为11/954,629和11/954,602的美国申请)。需要包含稳定化的肉毒毒素的生物相容的、可凝胶化(热塑性)的药物组合物，从而可将所述组合物以液体形式给药，但在给药后形成持续释放的凝胶；从而将所述毒 素的作用集中在一起并控制所述毒素的释放以增强每剂药的效果。

发明内容
本发明满足了这一需求并提供了一种可凝胶化、热可逆性、热塑性肉毒毒素药 物组合物，所述组合物可作为液体给药并形成凝胶，在给予所述药物组合物后，所述肉 毒毒素从所述凝胶中持续释放。此外，本发明还提供另一优点，即赋予所述组合物热可 逆特性的化合物还可稳定所述药物组合物中存在的肉毒毒素。在一个实施方案中，本发明提供由泊洛沙姆配制而成的热塑性热可逆性肉毒毒 素药物组合物。重要的是，除了向所述药物组合物提供热可逆、热塑特性以外，泊洛沙 姆还可用于稳定所述肉毒毒素。本文使用的下列术语具有如下含义。“约”是指用其限定的项、参数或术语包括所述项、参数或术语的值上下加减 10%的范围。“给药”或“给予”是指给(即给予)受试者药物组合物的步骤。本文公开 的药物组合物通过例如肌内(i.m.)给药、皮内给药、皮下给药、鞘内给药、腹膜内给药 (i.p.)、局部(经皮)和植入(即缓释装置)给药途径而“局部给药”。“肉毒毒素”是指(1) 一种由肉毒杆菌产生的神经毒素，以及由非梭菌重组制备的肉毒毒素(或其 轻链或重链)；(2)肉毒毒素血清型 A、B、C、D、E、FiPG;(3) 一种肉毒毒素复合物(即300、600和900kDa复合物)以及纯化肉毒毒素的 神经毒素组分(约150kDa)；或者(4) 一种修饰的肉毒毒素，(用PEG)聚乙二醇化、嵌合、重组、杂合、野生型 肉毒毒素，肉毒毒素构建体，内肽酶、化学修饰的肉毒毒素(聚乙二醇化肉毒毒素)和保 留了在细胞内抑制乙酰胆碱从细胞释放的能力的靶标改变的肉毒毒素。“完全不含”(即，术语“由...组成”)是指在所使用的仪器或方法的检测范 围内，该物质不能被检测或不能证实其存在。“基本不含”(或“基本由...组成”)是指只能检测到痕量的该物质。“修饰的肉毒毒素”是指与天然肉毒毒素相比，其至少一个氨基酸缺失、被修 饰或置换的肉毒毒素。此外，所述修饰的肉毒毒素可为重组生产的神经毒素，或重组制 备的神经毒素的衍生物或片段。修饰的肉毒毒素保留了天然肉毒毒素的至少一种生物学 活性，例如与肉毒毒素受体结合的能力或抑制神经递质从神经元中释放的能力。修饰的 肉毒毒素的一个实例为具有一种肉毒毒素血清型(例如血清型A)的轻链和另一种肉毒毒 素血清型(例如血清型B)的重链的肉毒毒素。修饰的肉毒毒素的另一个实例为与神经递 质例如P物质偶联的肉毒毒素。“药物组合物”是指其中活性成分可为梭菌神经毒素例如肉毒毒素的制剂。术 语“制剂”是指除梭菌神经毒素活性成分以外，在所述药物组合物中还存在至少一种其他成分。因此，药物组合物是一种适合用于对受试者例如人类患者进行诊断、治疗或美 容(即通过肌内或皮下注射，或通过贮库或植入物的插入，或局部施用)的制剂。所述药 物组合物可处在冻干或真空干燥状态下；可为用盐水或水重溶所述冻干或真空干燥药物 组合物后形成的溶液；或者，可为不需重溶的溶液。如上所述，药物组合物可为液体或 固体，例如真空干燥的固体。药物组合物的组成成分可被包括在单一组合物中(即除任 何所需的重溶液体以外，所有组成成分在最初合成所述药物组合物时就存在)，或者作为 两组分系统存在，例如用稀释剂例如盐水重溶的真空干燥组合物，所述稀释剂含有不存 在于最初合成的药物组合物中的成分。两组分系统提供了允许加入在长期储存下与所述 两组分系统的第一种组分不完全相容的成分的优点。例如，所述重溶载体或稀释剂可包 括防腐剂，防腐剂在使用期内例如冷冻储存的一周内提供抵抗微生物生长的充分保护， 但在两年冷冻储存期内不存在，在所述冷冻储存期内防腐剂可能降解所述毒素。不能与 梭菌毒素或其他成分长时间相容的其他成分可以此方式加入；即在将要使用时加入到第 二种溶剂(即所述重溶液体)中。“持续释放”是指药物组合物(例如包含泊洛沙姆的药物组合物)所含的治疗剂 (即肉毒毒素)在约5天到约1年的一段时间内从所述药物组合物中释放出来。“稳定剂”(或“初级稳定剂”)是帮助保持或维持蛋白(例如肉毒毒素)的生 物学结构(即三维构象)和/或生物学活性的化合物。一种药物组合物中可包含一种以上 的稳定剂。稳定剂的实例为表面活性剂、聚合物、多元醇、泊洛沙姆、白蛋白、明胶、 海藻糖、蛋白质、糖、聚乙烯吡咯烷酮、N-乙酰基色氨酸(“NAT”)、辛酸盐(即辛 酸钠)、聚山梨醇酯(即P80)、氨基酸、和二价金属阳离子如锌离子。药物组合物还可 包括防腐剂例如苄基醇、甲酚、苯甲酸、苯酚、对羟基苯甲酸酯类和山梨酸。“稳定”或“稳定化”是指一种活性药物成分(“API”)在稳定所述API的 化合物的存在下保留其至少20%、最多至100%生物学活性(该活性可通过体内LD5tl或 ED5tl量度测定为效力或毒性)。例如，(1)在从原液或储液配制连续稀释液时，或者(2) 在用盐水或水重溶已在约_2°C或更低温度下储存6个月至4年的冻干或真空干燥的含肉 毒毒素的药物组合物时，或者(3)对于已在约2°C至约8°C下储存6个月至4年的水溶液 形式的含肉毒毒素的药物组合物，重溶的或水溶液形式的药物组合物中存在的肉毒毒素 (在有稳定所述API的化合物的存在下)所具有的效力或毒性比该生物学活性肉毒毒素在 引入所述药物组合物之前的效力或毒性强约20%，最高至约100%。“基本不含”是指以不足所述药物组合物重量的的水平存在。“治疗剂”是指当对患者给药时具有治疗、美容和/或研究用途或益处的活性药 物成分(API)。例如，所述治疗剂可为例如留族化合物、抗生素或蛋白质。“热塑性的”与“热敏性的”同义，是指化合物或组合物在低温下(约0°C至约 IO0C )为液体或低粘度溶液(即在25°C和约0.1/秒的剪切速率下粘度小于500cps)，但在 较高温度下(约30°C至约40°C，例如在约37°C下)粘度较高(即在25°C和约0.1/秒的剪 切速率下粘度小于10,000cpS)。在具体实施方案中，公开了包含生物学活性肉毒毒素和热塑性泊洛沙姆的热塑 性、热可逆性药物组合物，其中所述泊洛沙姆稳定所述肉毒毒素，从而使所述肉毒毒素 在体内从所述药物组合物中释放时保留其生物学活性。所述肉毒毒素选自A、B、C1,D、E、F和G型肉毒毒素，优选以长时间持续作用著称的A型。示例的热可逆性泊洛 沙姆为泊洛沙姆407，例如可从美国新泽西州帕西帕尼的BASF公司获得的名为F-127的 泊洛沙姆407。在某些实施方案中，泊洛沙姆可以所述药物组合物的约15重量％到约25重量％ 的浓度存在。在一个具体实施方案中，所述热可逆性、热塑性药物组合物包含生物学活性A 型肉毒毒素和热塑性泊洛沙姆407，所述泊洛沙姆407以所述药物组合物的约15重量％到 约25重量％的浓度存在，其稳定所述肉毒毒素，从而使所述肉毒毒素在体内从所述药物 组合物中释放时保留其生物学活性。本文还公开了一种治疗医学或美容病症的方法，所述方法包括将一种热塑性、 热可逆性药物组合物给予患者的步骤，所述药物组合物包含生物学活性肉毒毒素和热塑 性、热可逆性泊洛沙姆，由此所述泊洛沙姆稳定所述肉毒毒素，从而使所述肉毒毒素在 体内从所述药物组合物中释放时保留其生物学活性，并且所述药物组合物以液体形式给 药并在给药后变为凝胶，以在给药后在体内提供从所述组合物中释放的治疗量的肉毒毒 素至少一周。所述热可逆性、热塑性泊洛沙姆为泊洛沙姆407并以所述药物组合物的约 15重量％到约25重量％的浓度存在。在某些方法中，在给药步骤之前或之后，将一个冷 却或加热元件(例如，热的或冷的垫、瓶，冰袋或温水袋等)置于给药部位上以温暖或冷 却所述部位，从而在对患者给药后在原位降低或升高所给予的热塑性、热可逆性药物组 合物的粘度。可这样治疗的示例性医学病症包括眉间皱纹、鱼尾纹、嘴角纹、鼻唇线、抬头 纹或它们的任意组合。其他示例性医学或美容病症包括治疗膀胱过动症、多汗症、良性 前列腺增生和张力障碍中的至少一种，其中所述肉毒毒素选自A、B、C1^ D、E、F和 G型肉毒毒素。如上所述，优选的肉毒毒素为A型肉毒毒素。在具体实施方案中，所述A型肉毒毒素以约5单位到约2750单位的量存在于所 述热可逆性、热塑性药物组合物中。要给药的肉毒毒素的总量(单位)由主治医师确定。本文还公开了一种制备热可逆性、热塑性、可凝胶化的药物组合物的方法，包 括如下步骤在低于约37°C的温度下将热塑性泊洛沙姆溶解在溶剂中，向所述溶剂中的 泊洛沙姆加入肉毒毒素并混合，以使所述肉毒毒素在其中完全分散。在具体些实施方案 中，所述泊洛沙姆可以所述药物组合物的约15重量％到约25重量％的浓度存在，从而制 得所述热塑性、可凝胶化的药物组合物。在一种制备所述热可逆性、热塑性、可凝胶化的药物组合物的具体方法中，使 用A或B型肉毒毒素。加入的示例量可为约1到约2,000单位的A型肉毒毒素或约50 到约25,000单位的B型肉毒毒素，以对有需要的患者给药。所述方法还可包括加入添加 剂——例如以进行防腐或稳定——以形成最终的热塑性、可凝胶化的药物组合物。在具 体实例中，制备所述热塑性、可凝胶化的药物组合物的方法使用的溶剂为水或盐溶液， 制备所述热塑性、可凝胶化的药物组合物的方法在温度低于约37°C或例如约0°C到约8°C 的冷室中进行。还公开了治疗医学或美容病症的方法，包括将热可逆性、热塑性药物组合物给 予患者的步骤，所述药物组合物包含生物学活性肉毒毒素和热可逆性、热塑性泊洛沙姆，其中所述泊洛沙姆稳定所述肉毒毒素并在室温下(例如人类通常习惯环境下的温 度，例如从约17°C到约25°C)为凝胶。给药前，在低于室温下冷却所述药物组合物以降 低其粘度(液化)，然后吸入注射器中并注射到患者体内，所述热塑性药物组合物在患者 体内凝胶化，以递送治疗量的肉毒毒素，所述治疗量的肉毒毒素在给药后在体内从所述 组合物中释放至少一周。在具体实施方案中，所述热塑性泊洛沙姆为泊洛沙姆407，并以 所述药物组合物的约15重量％到约25重量％的浓度存在。所述热塑性药物组合物为热可逆性的，即其粘度可基于温度升高和/或降低并 且是可逆的。例如，所述热可逆性、热塑性泊洛沙姆例如约20%重量的泊洛沙姆407 (并 因此获得的热塑性药物组合物)可在第一个温度下具有第一种粘度(例如在约0到约16°C 下为约0厘泊(cP))，使其温度升高以使其粘度升高至比所述第一种粘度高的第二种粘度 (例如在约18到约22°C下为约50cp到约6000cp)，并且是可逆的，例如使其温度降低以 例如使其粘度相对所述第二种粘度降低。泊洛沙姆407在组合物中的重量％的变化会改 变组合物的粘度/温度谱。本文所述的每个和全部特征，以及两个或更多个所述特征的每个和全部组合都 包括在本发明的范围之内，只要所述组合中包括的特征不相互抵触。
具体实施例方式发明人已经发现了肉毒毒素的新的热可逆性贮库药物组合物(制剂)。本发明 基于某些热可逆性泊洛沙姆与肉毒毒素具有显著相容性这一发现。可对这些贮库系统进 行热操作(注射前及注射后)以控制所述肉毒毒素的转移与分布。肉毒毒素和泊洛沙姆 407的结合物不是已知的。本发明范围内的制剂以液体形式给药，并且聚合物在局部给药的位点原位地凝 胶化(固化)。本发明的一个实施方案可包含PEO-PPO-PEO三嵌段共聚化合物，也称为嵌段 式普郎尼克类(pluranic)或泊洛沙姆，所述化合物在某些浓度下可形成热可逆性凝胶， 所述凝胶可以在注射后粘度迅速升高的低粘度液体形式给药(例如通过注射)。所获得 的高粘度基质有粘性，是可生物降解和生物相容的，并在给药后形成释放肉毒毒素的贮 库，从而提供一种持续或延长释放药物的递送系统。以这种方式可使用较低剂量的肉毒 毒素。这种药物组合物可以预混形式或者作为简单重溶载体或如通过使用双腔注射器在 给药时结合的若干组分进行给药。发明人已发现肉毒神经毒素在泊洛沙姆例如泊洛沙姆407中非常稳定。这是意 料不到的，因为这些毒素具有复杂的结构特性。例如，必须保持三个独立的蛋白结构域 (结合、转移、酶促)以维持裸露的150kD毒素的生物学活性。表面活性剂的离液序列 高并因此通常会破坏蛋白构象。因此发现这些分子与表面活性剂之间具有相容性是意料 不到的。所述900kD毒素是与神经毒素相关蛋白(NAP)——其稳定所述150kD蛋白—— 复合的蛋白复合物。预计表面活性剂会破坏所述蛋白复合物，从而破坏所述复合物的稳 定和/或使所述150kD毒素部分变性。用于本发明的热可逆性泊洛沙姆可通过以下方式明显稳定存在于所述药物组合 物中的神经毒素活性成分例如肉毒毒素
(1)降低所述肉毒毒素与表面的粘附(通常称为“粘性”)，所述表面包括重溶 所述药物组合物的实验室玻璃器皿、容器、管形瓶的表面以及用于注射所述药物组合物 的注射器的内表面。所述肉毒毒素与表面的粘附可导致肉毒毒素的损失和所容纳的肉毒 毒素的变性，这两种情况都会降低存在于所述药物组合物中的肉毒毒素的毒性；(2)减少所述肉毒毒素的变性和/或所述肉毒毒素与存在于所述肉毒毒素复合物 中的其他非毒素蛋白的解离，所述变性和/或解离活性可因存在于所述药物组合物中(即 冻干或真空干燥前)和重溶的药物组合物中的肉毒毒素的低度稀释而发生；(3)减少在所述药物组合物的制备、加工和重溶时发生的pH和浓度的较大变化 的过程中肉毒毒素的损失(即由于变性或与所述复合物中的非毒素蛋白的解离)；(4)将所述毒素固定在高粘度载体上；和(5)通过提供有利的微环境而保护所述毒素免于升高的生理温度(约37°C)和pH 的有害影响。本文公开的由泊洛沙姆提供的5种类型的肉毒毒素的稳定化作用使所述肉毒毒 素得到保护和维持，并为存在于药物组合物中的毒素保留了天然毒性。本发明还包括向稀释剂或制剂本身加入防腐剂，从而可使贮存延长。优选的防 腐剂是含有苯甲醇的防腐盐水。本发明的热可逆性药物组合物可使用常规给药方式给药。在本发明的具体实施 方案中，将所述组合物通过皮内、肌内或皮下方式给予患者。此外，本发明的组合物可 与一种或多种镇痛剂或麻醉剂一起给药。本发明组合物的最有效的给药方式和剂量方案取决于要治疗的病症的类型、严 重程度和进程，患者的健康情况和对治疗的反应，以及治疗医师的判断。因此，所述组 合物的给药方法和剂量可根据各个患者进行调整。含有肉毒毒素其他血清型的组合物可含有不同剂量(单位量)的肉毒毒素。例 如，可在组合物中以比含A型肉毒毒素的组合物更大的剂量(约50X)提供B型肉毒毒 素。在本发明的一个实施方案中，B型肉毒毒素可以约l_150U/kg的量给药。B型肉毒 毒素还可以最多至20000U(小鼠单位，如上所述)的量给药。在本发明的另一实施方案 中，E型或F型肉毒毒素可以约0.1-150U/kg的浓度给药。此外，在含有多于一种类型 的肉毒毒素的组合物中，每种类型的肉毒毒素可以以比单一肉毒毒素血清型通常使用的 剂量相对较小的剂量提供。实施例以下实施例详尽地解释本发明的具体实施方案，而非意图限制本发明的范围。在下面的实施例中，使用熟知的小鼠半数致死剂量试验(“MLD50试验”)以测 定从制备的泊洛沙姆制剂中释放的肉毒毒素的效力。根据情况，“效力”可指所述肉毒 毒素恢复的效力或者所述肉毒毒素在冻干之前的效力。恢复的效力与重溶效力、恢复效 力以及与重溶后的效力同义。MLD50试验以肉毒毒素的小鼠50%致死剂量或"LD50" 来确定其效力。因此，一个单位(U)的肉毒毒素被定义为腹膜内注射后杀死在试验开始 时每只重17-22g的雌性Swiss Weber小鼠组中50%小鼠的肉毒毒素的量(即LD5tl)。所 述MLD50试验是一种用于测量重溶的肉毒毒素或重溶的肉毒毒素制剂的效力的有效方 法。将每只小鼠置于仰卧位置，头倾斜向下，然后用肉毒毒素在生理盐水中的若干连续稀释液之一、使用25-27号3/8" -5/8"针头以约30度的角度向右下腹部进行腹膜内注 射。记录每种稀释液在随后72小时内的死亡率。以1.33倍剂量间隔制备最少6种稀释 液，每个剂量组中通常使用10只动物(因此共使用60只小鼠)。同时进行两个对照标准 试验(额外使用60只小鼠)。制备所述稀释液从而使浓度最高的稀释液在注射小鼠中产 生至少80%的死亡率，并且浓度最低的稀释液在注射小鼠中产生不高于20%的死亡率。 最少必须有四种符合所述死亡率的单调递减范围的稀释液。所述单调递减范围开始于不 低于80%的死亡率。在所述四个或更多单调递减死亡率中，两个最大的和两个最小的死 亡率必须是递减的(即不相等)。在注射后3天观察期内50%小鼠死亡的稀释液被定义 为包含1单位(IU)肉毒毒素的稀释液。已开发了改良的MLD50试验，其使用1.15倍剂 量间隔的更少(5种而不是6种)的稀释液并且对于检测的每种稀释液使用更少的小鼠(6 只而不是10只)。实施例1肉毒毒素-泊洛沙姆407制剂进行了制备并测定多种肉毒毒素_泊洛沙姆制剂的实验。在每种所制备的制剂 中使用的肉毒毒素都为冻干的BOTOX 。在每种所制备的制剂中使用的肉毒毒素的量 都为100单位的A型肉毒毒素(BOTOX )。在此实施例中使用的泊洛沙姆为来自BASF的泊洛沙姆407 (Lutrol F-127)。在 每种制剂中，泊洛沙姆407都以占最终制剂20重量％ (wt% )的量使用。泊洛沙姆407 以干粉的形式提供，它是亲水性非离子表面活性剂，是由被一个疏水嵌段(聚丙二醇)隔 开的两个亲水嵌段(聚乙二醇)构成的三嵌段共聚物。所述两个PEG嵌段的长度为约 101个重复单元，而所述丙二醇嵌段的长度为约56个重复单元。在合适的浓度下，泊洛 沙姆407的溶液在冷藏环境下为液体，但在室温和更高温度下为凝胶(例如在约37°C下为 凝胶)。因此泊洛沙姆407可重溶为易于通过针头的低粘度液体或以该形式储存，但随后 在注射到哺乳动物体内后随着温度的升高而胶凝成贮库。由于这些理想的物理性质以及 特殊的毒素相容性，因此选择泊洛沙姆407用于在此实施例制备的制剂中。每种制剂都通过如下方法制备将所述固体(重申泊洛沙姆407以干粉的形 式提供)在大离心管中与水或盐水合并(在约2到约8°C的冷室中)，并用磁力搅拌棒混 合直至完全溶解。将所述溶液置于约4到约15°C下储存直至注射/使用。然后通过用注射器向含 有100单位(U)的A型肉毒毒素(BOTOX )的小瓶中注入冷溶液而将所述毒素重溶。然后将样品加热至37°C直至凝胶化以模拟注射到温暖的体内的情形。值得注意的是，发明人测定出所述热可逆性制剂可用15-25重量％的泊洛沙姆 407 (Lutrol F-127,可从BASF获得)制备而没有明显减弱所需的如下制剂特性(1)热塑 性，和(2)生物学活性肉毒毒素从所制备制剂中的持续释放。如下所述，制备了 26种不同的热可逆性泊洛沙姆制剂。所制备的26种制剂的 每一种都包括20重量％的泊洛沙姆407和100单位的A型肉毒毒素(BOTOX ):1.含20%泊洛沙姆407的SWFI(注射用无菌水)的溶液2.含20%泊洛沙姆407的0.9%氯化钠的溶液3.含20%泊洛沙姆407的经防腐(苯甲醇)的0.9%氯化钠的溶液
4.20%泊洛沙姆407与5%泊洛沙姆1885.20%泊洛沙姆407与3%吐温6.20%泊洛沙姆407与5%蔗糖7.20%泊洛沙姆407与5%葡聚糖8.含20%泊洛沙姆407的IOmM组氨酸(pH 7)溶液9.含20 %泊洛沙姆407的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)10.含20%泊洛沙姆407的磷酸盐缓冲盐溶液(pH 7)11.20%泊洛沙姆407与20%丙二醇12.20%泊洛沙姆407与10%聚乙二醇13.20%泊洛沙姆 407 与 20mM Tris 缓冲液(pH 7)14.20%泊洛沙姆407与3%豆蔻酸异丙酯15.20%泊洛沙姆407与5%聚乙烯吡咯烷酮16.20%泊洛沙姆407与3%乳糖17.20%泊洛沙姆407与3%海藻糖18.20%泊洛沙姆407与0.5%人血清白蛋白19.20%泊洛沙姆407与0.5%人血清白蛋白、900ugNaCl20.20%泊洛沙姆407与0.5%重组人血清白蛋白21.20%泊洛沙姆407与0.5%明胶22.20%泊洛沙姆407与0.5%重组明胶23.20%泊洛沙姆407与0.5%透明质酸24.20%泊洛沙姆407与0.5%胶原25.20%泊洛沙姆407与2%羟丙甲基纤维素26.20%泊洛沙姆407与2%卵磷脂为确定活性肉毒毒素从26种热可逆性泊洛沙姆制剂的每一种中都释放出来，使 用荧光底物SNAP-25结合HPLC测量了轻链活性。用所述底物孵育的样品产生一种可通 过RP-HPLC分离并通过荧光检测的裂解产物。裂解产物的量与酶活成比例。可在注射前和/或注射后通过将热袋或冷袋置于目标部位(注射过的和/或未注 射的)对泊洛沙姆407进行进一步处理以实现所需效果。还可将其他组分加入所述制剂以 改变性质(例如导致凝胶化温度的升高/降低)。还可加入改变摩尔渗透压浓度和pH (缓 冲剂)的成分。给药可以是局部给药而不是注射给药；例如，在经皮递送方案中，所述 制剂可含有穿透促进剂，并可结合以器具，例如带有其他穿透特征的贴片，例如磨料或 显微操作针。所述制剂中还可包括防腐剂。还可包括着色剂例如可药用的染料以在应用 之前和之后更好地观察所述物质。实施例2、泊洛沙姆-^mmmmmn^mm^一名48岁的男性被诊断出患有肌肉痉挛病症例如颈部张力障碍。将约50到约 500单位的A型肉毒毒素(例如BOTOX )与实施例ι中的制剂2(含20%泊洛沙姆 407的0.9%氯化钠的溶液)混合，并通过肌内注射给药。所述制剂释放治疗量的肉毒毒 素达1个月。在1-7天内，所述肌肉痉挛病症的症状得以缓解并且所述症状的缓解持续约6个月。实施例3泊洛沙姆_肉毒毒素药物组合物的应用一名22岁的女性拜访其医生以报告并治疗其不可控制和过度的腋窝流汗，这在 医学上称为腋汗。在对她产生的汗液进行重量分析后，她被诊断为患有多汗症。将约100单位的A型肉毒毒素(例如BOTOX )与实施例ι中的制剂12(20% 泊洛沙姆407与10%聚乙二醇)混合，并通过肌内注射给药到腋窝多汗部位(通过Minor 碘淀粉试验测定)。注射后，将一个冰袋置于注射部位，冷却所述部位并使所注射的热可 逆性泊洛沙姆-肉毒毒素药物组合物粘度变小，使得主治医师可按摩注射部位，使得所 注射的组合物可更均一地散布。在7天内，过度腋窝流汗减少并且观察到该症状缓解持 续8个月。实施例4泊洛沙姆_肉毒毒素药物组合物的应用一名38岁的女性向她的皮肤科医师报告她不能再忍受她的眉间皱纹(由皱眉肌 和/或降眉间肌的收缩引起的眉间的动态皱纹)，它们已经造成了她的惊恐。她的皮肤科 医师决定用泊洛沙姆-肉毒毒素药物组合物来治疗她。将约500单位的B型肉毒毒素与实施例1中的制剂25(20%泊洛沙姆407与2% 羟丙甲基纤维素)混合，并通过肌内注射直接给药到皱眉肌和降眉间肌中。将所需治疗 部位以外的部位预加热(使用加热垫以逐渐温暖不注射的部位，例如从约37到约43°C， 以使温度相对注射部位升高)以防止药物转移到不注射的部位中。在约7天内，该患者 报告她的眉间皱纹已经减少并且眉间的皮肤更加平滑。所述皱纹的减轻持续约4个月。类似地，可将O.lmL含有约2单位A型肉毒毒素(BOTOX )的另一制剂注射 到皱眉肌和降眉间肌中的约5个注射位置中的每个位置，总剂量为每0.5mL的热可逆性泊 洛沙姆_肉毒毒素药物组合物约10单位。一个额外步骤是，在向所述肌肉注射之后或之 前，可将热垫置于注射位置上以温暖该部位。因此，如果这样放置热垫，那么注射的泊 洛沙姆_肉毒毒素药物组合物可比仅在体温下注射更快地凝胶化。所述热垫可为例如约 37到约43°C。也可将所述热垫置于注射过的或待注射的部位上，然后温暖至例如约37 约 43 0C ο实施例5、泊洛沙姆-^mmmmmn^mm^一名78岁的男性被带去看他的泌尿科医师，其抱怨不能忍住尿液任何稍长一点 的时间。他的泌尿科医师确定该患者失禁并患有膀胱过动症(OAB)，并且他的逼尿肌应 注射泊洛沙姆-肉毒毒素药物组合物。将约250单位的A型肉毒毒素(BOTOX)与实施例1中的制剂2(含20%泊洛沙 姆407的0.9%氯化钠的溶液)混合(约250单位毒素加入约IOmL制剂2中)。使用软 性膀胱镜和标准膀胱壁注射装置(局部麻醉剂、润滑剂等)，泌尿科医师在沿侧壁但避开 三角区和顶部的10个位置(25单位/位置)对该患者的膀胱壁进行注射。在7天内，该 患者报告他能够一次忍住他的尿液达多个小时并且每次的尿量达到之前的两倍以上。该 患者报告不再失禁约7个月。
还可对膀胱壁注射含有其他类型肉毒毒素的实施例1中的制剂(1-26)中的任一 种，例如使用约5mL到约30mL的实施例1制剂注射约50到约15,000单位的B型肉毒毒 素。可将所述泊洛沙姆_肉毒毒素药物组合物注射到膀胱壁的约5到约50个注射位点， 这由主治医师确定并可视需要包括或不包括三角区。实施例6泊洛沙姆_肉毒毒素药物组合物的应用一名67岁的男性因前列腺肥大而患有慢性尿潴留。在对他的医师报告后，决定 让该患者接受泊洛沙姆-肉毒毒素药物组合物的前列腺给药，以缓解其尿潴留并治疗良 性前列腺增生。将约200单位的A型肉毒毒素(BOTOX)与4mL实施例1中的制剂2(含 20%泊洛沙姆407的0.9%氯化钠的溶液)混合，经会阴注射到前列腺的2个侧叶中(每 叶100单位)。约7天后，该患者报告排尿得以改善。他的医师注意到在此次治疗后，该患者 的排尿后残留体积和膀胱压力下降。这些有益效果持续约6个月，并且医师注意到该患 者的前列腺体积减小而且未报告有副作用。也可使用B型肉毒毒素(例如MYOBLOC)， 例如每个注射位置约250到约1000单位。本文公开的本发明的药物组合物具有许多优点，包括如下这些1.制备的所述药物组合物可不含任何血液制品例如白蛋白，并因此不含任何血 液制品感染因子例如朊病毒。2.所述药物组合物具有相当于或优于目前可获得的药物组合物所达到的稳定性 和毒素效力高恢复百分比。3.毒性降低，如通过肌内或静脉内给药所测定的。4.抗原性降低。本文引用了多种出版物、专利和/或参考文献，它们的内容以引用的方式全文 纳入本文中。尽管本发明已经就某些优选方法进行了详细描述，然而在本发明范围内的其他 实施方案、形式和修改也是可能的。例如，多种稳定化多糖和氨基酸也在本发明的范围 内。因此，下列权利要求的精神和范围不应限于上述优选实施方案的描述。
权利要求
1.一种热可逆性、热塑性药物组合物，包含(a)生物学活性肉毒毒素；和(b)热塑性泊洛沙姆，其中所述泊洛沙姆稳定所述肉毒毒素，从而使所述肉毒毒素在 体内从所述药物组合物中释放时保留其生物学活性。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述肉毒毒素选自A、B、Cl、D、E、F和G型肉毒毒素。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述肉毒毒素为A型肉毒毒素。
4.权利要求1的药物组合物，其中所述泊洛沙姆为泊洛沙姆407。
5.权利要求1的药物组合物，其中所述泊洛沙姆可以所述药物组合物的约15重量％ 到约25重量％的浓度存在。
6.一种热可逆性、热塑性药物组合物，包含(a)生物学活性A型肉毒毒素；和(b)热塑性热可逆性泊洛沙姆407，其中所述泊洛沙姆以所述药物组合物的约15重 量％到约25重量％的浓度存在并稳定所述肉毒毒素，从而使所述肉毒毒素在体内从所述 药物组合物中释放时保留其生物学活性。
7.一种治疗医学或美容病症的方法，所述方法包括将一种热可逆性、热塑性药物组 合物给予患者的步骤，所述药物组合物包含生物学活性肉毒毒素和热可逆性、热塑性泊 洛沙姆，其中(a)所述热可逆性热塑性泊洛沙姆稳定所述肉毒毒素，从而使所述肉毒毒素在体内从 所述药物组合物中释放时保留其生物学活性；(b)所述药物组合物以液体形式给药并在给药后变为凝胶；以及(c)在给药后治疗量的肉毒毒素在体内从所述组合物中释放至少一周。
8.权利要求7的方法，其中所述热可逆性、热塑性泊洛沙姆为泊洛沙姆407并以所述 药物组合物的约15重量％到约25重量％的浓度存在。
9.权利要求8的方法，其中治疗所述医学或美容病症包括治疗眉间皱纹、鼻唇线、鱼 尾纹、嘴角纹和抬头纹中的至少一种。
10.权利要求8的方法，其中治疗所述医学或美容病症包括治疗膀胱过动症、多汗 症、良性前列腺增生和张力障碍中的至少一种。
11.权利要求8的方法，其中所述肉毒毒素选自A、B、Cl、D、E、F和G型肉毒
12.权利要求8的方法，其中所述肉毒毒素为A型肉毒毒素。
13.权利要求8的方法，其中所述肉毒毒素为A型肉毒毒素并以约5单位到约2750单 位的量存在于所述热可逆性、热塑性药物组合物中。
14.权利要求7的方法，还包括在给药步骤之前或之后，将冷却或加热元件置于给药 部位上以温暖或冷却所述部位的步骤，从而在患者中在原位降低或升高所给予的热可逆 性、热塑性药物组合物的粘度。
15.一种制备热可逆性、热塑性、可凝胶化的药物组合物的方法，包括如下步骤a)在低于约37°C的温度下将热可逆性、热塑性泊洛沙姆溶解在溶剂中直至溶解；和b)向所述溶剂中的热可逆性、热塑性泊洛沙姆中加入肉毒毒素并混合，以使所述肉毒毒素在其中完全分散，其中所述泊洛沙姆以所述药物组合物的约15重量％到约25重 量％的浓度存在，从而制得所述热塑性、可凝胶化的药物组合物。
16.权利要求15的方法，其中所述热可逆性、热塑性泊洛沙姆为热塑性泊洛沙姆407。
17.权利要求15的方法，其中所述肉毒毒素为A型或B型肉毒毒素，并且加入量为 约1到约2,000单位的A型肉毒毒素或约50到约25,000单位的B型肉毒毒素。
18.权利要求15的方法，还包括加入添加剂以进行防腐或稳定的步骤，以形成最终的 热可逆性、热塑性、可凝胶化的药物组合物。
19.权利要求15的方法，其中所述溶剂为水或盐溶液，并且制备所述热可逆性、热塑 性、可凝胶化的药物组合物的方法在温度低于约37°C的冷室中进行。
20.—种热可逆性、热塑性、可凝胶化的药物组合物，所述组合物通过权利要求15的 方法制备。
21.一种治疗医学或美容病症的方法，所述方法包括如下步骤将热可逆性、热塑性药物组合物给予患者，所述药物组合物包含生物学活性肉毒毒 素和热可逆性、热塑性泊洛沙姆，其中所述热可逆性、热塑性泊洛沙姆稳定所述肉毒毒 素并在室温下为凝胶，其中，在低于室温下冷却所述药物组合物以降低所述药物组合物 的粘度；然后将所述粘度降低的药物组合物吸入注射器中并将所述药物组合物注射到患 者体内，随后所述药物组合物在患者体内凝胶化，以递送治疗量的肉毒毒素，所述治疗 量的肉毒毒素在给药后在体内从所述组合物中释放至少一周。
22.权利要求21的方法，其中所述热可逆性、热塑性泊洛沙姆为泊洛沙姆407并以所 述热可逆性、热塑性药物组合物的约15重量％到约25重量％的浓度存在。
23.权利要求22的方法，其中所述医学或美容病症的治疗包括对眉间皱纹、鼻唇线、 鱼尾纹、嘴角纹和抬头纹中的至少一种给药。
全文摘要
本发明描述了一种热可逆性、热塑性药物组合物，其包含肉毒毒素和生物相容的泊洛沙姆，所述泊洛沙姆赋予所述组合物热可逆性并另外稳定所述肉毒毒素。所述药物组合物可以液体形式给予患者，并在给药后凝胶化为持续释放的药物递送系统，所述生物学活性肉毒毒素从该递送系统中释放多日从而使所述药物集中形成贮库并控制释放以增强每剂药的治疗效果。
文档编号A61K9/08GK102014951SQ200980114054
公开日2011年4月13日 申请日期2009年2月11日 优先权日2008年2月22日
发明者T·J·亨特 申请人:阿勒根公司